KONDISI OPTIMUM UNTUK PRODUKSI ENZIM MANANASE EKSTRASELULER DARI Bacillus subtilis YANG DIISOLASI DARI AIR LAUT BALI
RONY MASRI RAMADANA
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Kondisi Optimum untuk Produksi Enzim Mananase Ekstraseluler dari Bacillus subtilis yang diisolasi dari Air Laut Bali adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Mei 2014 Rony Masri Ramadana G84100032
ABSTRAK RONY MASRI RAMADANA. Kondisi Optimum untuk Produksi Enzim Mananase Ekstraseluler dari Bacillus subtilis yang diisolasi dari Air Laut Bali. Dibimbing oleh SURYANI dan NANIK RAHMANI. Enzim mananase banyak digunakan pada industri makanan, pakan, farmasi, kertas, maupun gas, namun enzim mananase dari bakteri laut masih sedikit diteliti. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperoleh kondisi optimum produksi enzim mananase dari isolat bakteri Bacillus subtilis yang diisolasi dari Laut Bali. Kondisi yang diamati berupa konsentrasi substrat locust bean gum (LBG) optimum, pH optimum, dan suhu inkubasi optimum. Kondisi optimum untuk produksi enzim tersebut ditentukan berdasarkan nilai aktivitas enzim yang dihasilkan. Pengujian aktivitas enzim dilakukan dengan menggunakan metode Dinitrosalicylic Acid (DNS). Berdasarkan hasil penelitian, diperoleh nilai aktivitas enzim tertinggi sebesar 20.978 U/mL pada jam ke-48. Bacillus subtilis dapat menghasilkan enzim mananase ekstraseluler pada kondisi optimum dengan konsentrasi substrat LBG 1%, pH media 6, dan suhu inkubasi 400C. Kata kunci: mananase, manan, optimasi, Bacillus subtilis, bakteri laut
ABSTRACT RONY MASRI RAMADANA. Optimum Condition for Production Extracellular Mannanase from Bacillus subtilis isolated from Bali’s Sea Water. Supervised by SURYANI and NANIK RAHMANI. Mannanase widely used in food, feed, pharmaceutical, paper, and gas industries, but mannanase from marine bacteria has been researched just in a few number. The objective of this research was to obtain the optimum condition for production extracellular mannanase enzyme from Bacillus subtilis isolated from Bali Sea. Conditions which have seen are optimum concentration locust bean gum (LBG) substrate, optimum pH, and optimum incubation temperature. The optimum condition for production of enzyme was determined by the value of enzyme activity. Enzime activity assays performed using the Dinitrosalicylic Acid (DNS) method. Result showed that the highest enzyme activity was 20.978 U/mL at 48 hours. Bacillus subtilis produced extracellular mannanase in optimum condition with LBG substrate concentration 1%, pH 6, and incubation temperature 400C. Keywords: mannanase, mannan, optimation, Bacillus subtilis, marine bacteria
KONDISI OPTIMUM UNTUK PRODUKSI ENZIM MANANASE EKSTRASELULER DARI Bacillus subtilis YANG DIISOLASI DARI AIR LAUT BALI
RONY MASRI RAMADANA
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
Judul Skripsi : Kondisi Optimum untuk Produksi Enzim Mananase Ekstraseluler dari Bacillus Subtilis yang diisolasi dari Air Laut Bali Nama : Rony Masri Ramadana NIM : G84100032
Disetujui oleh
Dr. Suryani, S.P, M.Sc
Nanik Rahmani, M.Si
Pembimbing I
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji syukur kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas rahmat dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan karya ilmiah yang berjudul Kondisi Optimum untuk Produksi Enzim Mananase Ekstraseluler dari Bacillus subtilis yang diisolasi dari Air Laut Bali. Penelitian ini merupakan proyek penelitian dari LIPI Cibinong atas nama Nanik Rahmani, M.Si pada laboratorium Biokatalis dan Fermentasi, Bidang Bioproses, Bioteknologi. Penulis menyadari bahwa kelancaran selama penyusunan karya ilmiah ini tidak lepas dari kontribusi beberapa pihak. Ucapan terima kasih terutama ditujukan kepada Dr. Suryani, S.P, M.Sc dan Nanik Rahmani, M.Si selaku dosen pembimbing yang telah membimbing serta memberi saran dan kritik yang membangun. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Ibu Nanik Rahmani, M.Si yang telah membantu untuk mendanai penelitian ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Pak Yopi, Mbak Lia, Mbak Kia, Mas Diki, dan Pak Awan, di Laboratorium Biorekayasa Lingkungan, Bioproses, Pusat Penelitian Biotekologi LIPI Cibinong, Bogor. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Ama, Apa, Uda, Kak Ija, Nindy, Bakhri, Nita, Nazul, Mbak Nisa dan teman-teman atas dukungan yang selalu diberikan. Penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun untuk memperbaiki isi karya ilmiah ini. Semoga tulisan ini bermanfaat dalam bidang ilmu pengetahuan khususnya biokimia serta memberikan kemaslahatan bagi masyarakat. Bogor, Mei 2014 Rony Masri Ramadana
DAFTAR ISI DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN ................................................................................................... 1 METODE ................................................................................................................ 2 Bahan dan Alat ..................................................................................................... 2 Prosedur Analisis Data ......................................................................................... 2 HASIL ..................................................................................................................... 5 Hasil Peremajaan Isolat Bacillus subtilis ............................................................. 5 Konsentrasi Optimum Substrat LBG untuk Produksi Enzim Mananase ............. 5 Kondisi pH Media Optimum untuk Produksi Enzim Mananase ......................... 6 Suhu Inkubasi Optimum untuk Produksi Enzim Mananase ................................ 8 PEMBAHASAN...................................................................................................... 9 Konsentrasi Optimum Substrat LBG untuk Produksi Enzim Mananase ............. 9 Kondisi pH Optimum Media untuk Produksi Enzim Mananase ....................... 10 Suhu Inkubasi Optimum untuk Produksi Enzim Mananase .............................. 10 SIMPULAN DAN SARAN................................................................................... 11 Simpulan ............................................................................................................ 11 Saran .................................................................................................................. 11 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................ 11 LAMPIRAN .......................................................................................................... 14 RIWAYAT HIDUP ............................................................................................... 28
DAFTAR GAMBAR 1 Hasil peremajaan Bacillus subtilis pada media padat setelah 2 hari 2 Kurva pertumbuhan Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat LBG 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, dan 2,5% 3 Aktivitas enzim mananase dari Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, dan 2,5% 4 Kurva pertumbuhan Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat LBG 1% dengan variasi pH media 5, 6, 7, 8, dan 9 5 Aktivitas enzim mananase dari Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat LBG 1% dengan variasi pH media 5, 6, 7, 8, dan 9 6 Kurva pertumbuhan Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat 1%, pH media 6, dengan variasi suhu 200C, 300C, 400C, dan 500C 7 Aktivitas enzim mananase dari Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat 1%, pH media 6, dengan variasi suhu 200C, 300C, 400C, dan 500C 8 Kurva standar manosa untuk optimasi konsentrasi substrat LBG 9 Kurva standar manosa untuk optimasi pH media dan suhu inkubasi
5 5 6 7 7 8
9 17 17
DAFTAR LAMPIRAN 1 2
Bagan Alir Penelitian Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 660 nm isolat bakteri laut Bacillus subtilis variasi konsentrasi substrat LBG 3 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 540 nm menggunakan larutan D-(+)-Manosa dengan konsentrasi yang berbeda 4 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 540 nm menggunakan larutan D-(+)-Manosa dengan konsentrasi yang berbeda 5 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 540 nm enzim mananase isolat Bacillus subtilis variasi konsentrasi substrat LBG 6 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 660 nm isolat bakteri laut Bacillus subtilis variasi pH media 7 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 540 nm enzim mananase isolat bakteri laut Bacillus subtilis variasi pH media 8 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 660 nm isolat bakteri laut Bacillus subtilis variasi suhu inkubasi 9 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 540 nm enzim mananase isolat bakteri laut Bacillus subtilis variasi suhu inkubasi 10 Contoh perhitungan aktivitas enzim mananase isolat bakteri laut Bacillus subtilis menggunakan konsentrasi substrat LBG 1% pada jam ke-0 ulangan 1 11 Hasil analisis statistik uji lanjut menggunakan duncan test
15 16 17 17 18 20 21 23 24
26 27
PENDAHULUAN Enzim mananase merupakan enzim yang dapat mengatalisis reaksi hidrolisis dari ikatan β-1,4-manosidik dari rantai manan, glukomanan, dan galaktomanan. Enzim mananase dapat digunakan dalam aplikasi teknologi enzim pada industri yang beragam seperti makanan, pakan, farmasi, kertas, maupun industri gas sebagai stimulasi maupun perlakuan awal terhadap biomassa lignoselulosa sebagai bahan untuk biofuel (Songsiriritthigul et al. 2010). Enzim mananase juga dapat digunakan untuk memecah kandungan manan yang terdapat pada limbah pertanian seperti limbah bungkil kelapa, kelapa sawit, umbi porang, dan lainnya, sehingga dapat dihasilkan manosa dan oligosakarida yang dimanfaatkan sebagai agen prebiotik, dan komponen pangan fungsional yang tinggi nilai ekonomisnya (Yopi et al. 2006). Enzim mananase bisa berasal dari mikrob, tanaman, maupun hewan. Enzim mananase yang dihasilkan dari mikrob memiliki beberapa keunggulan, diantaranya yaitu bersifat lebih ekonomis, mudah dan efisien dalam memproduksinya. Karakterisasi dan fermentasi enzim mananase dari mikrob mempunyai waktu proses yang lebih cepat dibandingkan dengan enzim dari tanaman dan hewan (Yopi et al. 2006). Mikrob yang menghasilkan enzim mananase dikenal dengan sebutan mikrob manolitik. Mikrob manolitik dapat menghidrolisis polisakarida kompleks menjadi molekul sederhana seperti mano-oligosakarida dan manosa. Enzim mananase yang berasal dari mikrob mempunyai kemampuan untuk mengikat βmanan dan aktivitas katalitik yang tinggi dalam mendepolimerisasi substrat polisakarida. Umumnya enzim mananase yang sering diteliti berasal dari mikrob darat, sedangkan enzim mananase yang berasal dari laut masih sedikit diteliti (Tanaka et al. 2009). Eksplorasi mikrob laut untuk memperkaya sumber dan lokasi dihasilkannya enzim mananase belum banyak dilakukan karena selama ini eksplorasi lebih banyak dilakukan dari mikrob darat. Karakteristik mikrob laut adalah dapat tumbuh pada konsentrasi garam yang tinggi (halofil). Penelitian yang dilakukan sebelumnya telah menghasilkan enzim mananase termofilik laut dari bakteri Rhodothermus marinus, mikrob ini diisolasi dari perairan laut yang mempunyai suhu tinggi sehingga mempunyai aktivitas enzim mananase yang cukup unik dalam mendegradasi sumber manan seperti galaktomanan pada substrat locust bean gum (LBG). Mikrob manolitik laut ini telah diketahui menghasilkan enzim mananase glikosidasi famili 26 yang bersifat termofilik yaitu tahan hingga suhu 85ºC dan optimum pada pH 5,4 (Politz et al. 2000). Beberapa penelitian lainnya mengenai enzim mananase juga telah dipublikasikan. Bakteri Bacillus sp. optimum pada pH 7,0 dan suhu 70°C (Sumardi 2005), dan Bacillus subtilis B36 optimum pada pH 6,4 dan suhu 50°C (Li et al. 2006). Optimasi untuk produksi enzim mananase yang dihasilkan dari bakteri Bacillus subtilis yang diisolasi dari Laut Bali masih belum dilakukan. Adapun tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperoleh kondisi optimum produksi enzim mananase berupa konsentrasi substrat LBG optimum, pH media optimum, dan suhu inkubasi optimum dari isolat Bacillus subtilis tersebut. Optimasi ini perlu dilakukan agar dapat diketahui kondisi optimal untuk memproduksi enzim
2 mananase, sehingga nantinya dapat dihasilkan enzim mananase dengan kualitas dan kuantitas optimum dalam mendegradasi substratnya. Hipotesis dari penelitian ini yaitu produksi enzim mananase dari Bacillus subtilis dipengaruhi oleh berbagai faktor antara lain konsentrasi substrat LBG, pH media, dan suhu inkubasi. Manfaat dari penelitian ini adalah diperolehnya kondisi optimum produksi enzim mananase sehingga dapat digunakan dalam berbagai bidang, salah satunya dalam bidang pemanfaatan limbah biomassa dari industri pertanian sebagai bahan untuk biofuel.
METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan adalah isolat Bacillus subtilis asal Laut Bali yang diisolasi pada tahun 2013 oleh Dr Yopi, peneliti dari LIPI Bioteknologi Cibinong, media kultur yang terdiri dari locust bean gum (LBG) Sigma, akuades, pepton Sigma, yeast extract (YE) Sigma, artificial sea water (ASW) Sigma, buffer fosfat Sigma, alkohol 70%, standar manosa Sigma, dan pereaksi asam dinitrosalisilat (DNS) yang terdiri atas DNS Sigma, NaOH, dan K-Na-Tartrat Sigma. Adapun alat-alat yang digunakan adalah alat-alat gelas, neraca analitik Boeco Germany, spektrofotometer Hitachi U-3900H, laminar horizontal Sanyo, pipet mikro, tabung mikro, penangas air Julabo TW20, magnetic stirrer MSH300N, vortex Bionex, incubator shaker Jica BR-43FL, dan autoklaf Tomy SX500.
Prosedur Analisis Data Peremajaan Bacillus subtilis dalam Media Padat (Yopi et al. 2006) Isolat Bacillus subtilis dari Laut Bali ditumbuhkan pada media padat yang mengandung sumber manan. Komposisi media yang digunakan ialah artificial sea water (ASW) Sigma 3.8%, yeast extract (YE) Sigma 0.1%, Pepton Sigma 0.5%, agar 1.5%, dan substrat manan locust bean gum (LBG) Sigma 0.5% dalam 100 mL aquades. Komposisi media tersebut diaduk menggunakan magnetic stirrer sampai homogen dan disterilisasi pada suhu 121ºC selama 15 menit, kemudian media tersebut dituang ke dalam cawan Petri di dalam laminar hingga memadat. Isolat Bacillus subtilis diinokulasikan ke dalam media padat dan diinkubasi selama 1 sampai 2 hari. Optimasi Konsentrasi Substrat LBG untuk Produksi Enzim Mananase Variasi konsentrasi substrat LBG yang diamati dalam optimasi untuk produksi enzim mananase ini antara lain 0.5%, 1%, 1.5%, 2% dan 2.5% yang dilarutkan dalam akuades. Setiap perlakuan dilakukan dengan 2 ulangan dan diinkubasi selama 6 hari. Optimasi untuk produksi enzim mananase dilakukan dengan mengamati parameter pertumbuhan sel (kurva pertumbuhan) dan aktivitas enzim mananase (kurva produksi enzim mananase).
3 Pembuatan Kurva Pertumbuhan (Analisis Pertumbuhan Sel) (Yopi et al. 2006) Pembuatan kurva pertumbuhan terdiri atas dua tahap, yaitu pra-kultivasi dan kultivasi. Komposisi media cair terdiri atas artificial sea water (ASW) 3.8%, yeast extract (YE) 0.1%, dan pepton 0.5% dalam 500 mL aquades. Media tersebut kemudian dibagi ke dalam dua tabung, yaitu untuk pra-kultivasi dan kultivasi yang kemudian ditambahkan substrat LBG dengan variasi konsentrasi 0.5%, 1%, 1.5%, 2% dan 2.5%. Media pra-kultivasi sebanyak 10 mL dalam labu Erlenmeyer 100 mL, sedangkan media kultivasi sebanyak 30 mL dalam labu Erlenmeyer 300 mL. Setelah disterilisasi dan didinginkan, biakan dimasukkan ke dalam media secara aseptik, kemudian isolat Bacillus subtilis pada tahap pra-kultivasi diinkubasi pada incubator shaker semalam dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 300C. Setelah tahap pra-kultivasi maka dilanjutkan dengan tahap kultivasi isolat Bacillus subtilis selama 6 hari pada incubator shaker 150 rpm pada suhu ruang. Pengambilan sampel dilakukan sebanyak 7 kali yaitu pada jam ke 0, 24, 48, 72, 96, 120, dan 144. Setiap hasil pengambilan sampel tersebut dipindahkan ke dalam 1.5 ml tabung mikro dan disimpan dalam lemari pendingin. Setelah itu dilakukan analisis pertumbuhan sel dengan pembacaan pada spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm. Pembuatan Kurva Produksi Enzim Mananase (Analisis Aktivitas Enzim Mananase) (Yopi et al. 2006) Setelah diperoleh kurva pertumbuhan, selanjutnya dilakukan uji aktivitas enzim mananase untuk mendapatkan kurva produksi enzim mananase. Enzim diperoleh dengan cara disentrifugasi kultur dengan kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4ºC. Supernatan yang diperoleh disimpan pada suhu 4ºC. Supernatan yang diperoleh digunakan sebagai sediaan enzim untuk analisis aktivitas enzim mananase. Pengukuran aktivitas enzim mananase menggunakan metode DNS (asam dinitrosalisilat). Larutan DNS sebanyak 50 ml dibuat dengan melarutkan DNS (asam dinitrosalisilat) sebanyak 0.5 gram, NaOH, 0.8 gram, dan K-Na-Tartat 15 gram ke dalam 50 ml akuades. Larutan substrat manan (LBG) dibuat sebanyak 0.5% di dalam buffer fosfat 0.05 M pH 6. Perlakuan untuk sampel adalah dengan cara menambahkan larutan enzim sebanyak 250 μL ke dalam 250 μL larutan substrat LBG 0.5%, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Setelah reaksi enzim substrat selesai, kemudian ditambahkan 750 μL DNS dan divortex agar homogen, kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 100ºC selama 15 menit, dilanjutkan dengan merendam di dalam es selama 10 menit. Perlakuan untuk kontrol adalah sebanyak 250 μL larutan buffer 0.05 M pH 6 ditambahkan ke dalam 250 μL larutan substrat LBG 0.5%, selanjutnya ditambahkan 750 μL DNS, kemudian diinkubasi selama 15 menit pada suhu ruang. Setelah itu divortex agar homogen, kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 100ºC selama 15 menit dan dilanjutkan dengan merendam di dalam es selama 10 menit. Perlakuan untuk blanko adalah sebanyak 750 μL DNS ditambahkan ke dalam 500 μL buffer fosfat 0.05 M pH 6 dan divortex agar homogen, kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 100ºC selama 15
4 menit. Blanko, sampel, dan kontrol dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Berdasarkan kurva produksi yang diperoleh, dapat diketahui konsentrasi substrat yang paling optimum yaitu yang menghasilkan aktivitas enzim mananase tertinggi. Satu unit aktivitas enzim mananase adalah banyaknya enzim yang dapat memproduksi 1 μmol manosa dalam satu menit, maka digunakan larutan D-(+)Manosa sebagai standar sehingga diperoleh kurva standar manosa, dari kurva tersebut dapat diperoleh persamaan sehingga selanjutnya dapat dilakukan perhitungan nilai aktivitas enzim. Pembuatan standar dilakukan dengan menambahkan 750 μL larutan DNS ke dalam 500 μL standar manosa, kemudian dipanaskan pada suhu 100°C selama 15 menit, dan didinginkan dalam es selama 15 menit. Optimasi pH Media dan Suhu Inkubasi untuk Produksi Enzim Mananase Variasi pH yang digunakan untuk optimasi pH media adalah 5, 6, 7, 8, dan 9. Optimasi ini dilakukan pada konsentrasi substrat optimum yang telah diperoleh sebelumnya. Pengaturan pH media dilakukan dengan cara menambahkan larutan NaOH atau HCl ke dalam media. Penentuan kondisi optimum pH media dilakukan dengan mengamati parameter pertumbuhan sel (kurva pertumbuhan) dan aktivitas enzim mananase (kurva produksi enzim mananase) seperti pada tahapan sebelumnya. Setelah diperoleh pH media optimum, selanjutnya dilakukan optimasi suhu inkubasi dengan variasi suhu 20, 30, 40, dan 500C. Optimasi suhu inkubasi untuk produksi enzim dilakukan pada konsentrasi substrat dan pH media optimum yang telah diperoleh pada tahap sebelumnya. Penentuan kondisi optimum suhu inkubasi juga dilakukan dengan mengamati parameter pertumbuhan sel dan aktivitas enzimnya. Analisis Statistik Hasil yang diperoleh dianalisis menggunakan software SAS 9.1.3. Analisis statistik yang digunakan adalah rancangan faktorial dalam Rancangan Acak Lengkap (RAL). Model rancangannya: Yijk =μ+αi+βj+(αβ)ij+εijk Yijk = nilai pengamatan pada faktor ke A (optimasi konsentrasi substrat/pH media/suhu inkubasi) taraf ke-i faktor B (lamanya inkubasi) taraf ke-j dan ulangan ke-k. µ = Rataan umum αi = pengaruh utama faktor A (optimasi konsentrasi substrat/pH media/suhu inkubasi) βj = pengaruh utama faktor B (lamanya inkubasi) (αβ)ij = pengaruh interaksi faktor A dan faktor B εijk = pengaruh acak yang menyebar normal Data yang diperoleh dianalisis dengan ANOVA (analysis of variance) pada tingkat kepercayaan 95 % dan taraf α 5%, dan dilakukan uji Duncan sebagai uji lanjut.
5
HASIL Hasil Peremajaan Isolat Bacillus subtilis Isolat Bacillus subtilis diremajakan dalam media padat substrat locust bean gum (LBG). Bakteri yang berhasil tumbuh ditandai dengan terlihatnya koloni bakteri pada media tersebut. Koloni Bacillus subtilis terlihat berwarna kuning kecoklatan, sedikit berlendir dan tumbuh pada permukaan media padat. Hasil peremajaan isolat Bacillus subtilis dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1 Hasil peremajaan Bacillus subtilis pada media padat setelah 2 hari Konsentrasi Optimum Substrat LBG untuk Produksi Enzim Mananase
Nilai OD (660 nm)
Kurva pertumbuhan dari Bacillus subtilis pada variasi konsentrasi substrat LBG 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, dan 2.5% disajikan pada Gambar 2. Berdasarkan kurva pertumbuhan yang diperoleh, terlihat bahwa nilai kerapatan optik (OD) isolat Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat LBG 0.5% dan 1% mengalami peningkatan seriring dengan bertambahnya waktu kultivasi dan kemudian mengalami penurunan pada jam ke 96 sampai jam 144. Nilai kerapatan optik tertinggi dari Bacillus subtilis pada konsentrasi tersebut adalah pada jam ke-72. Nilai kerapatan optik isolat Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat LBG 1.5%, 2%, dan 2.5% juga mengalami peningkatan seiring bertambahnya waktu, akan tetapi mengalami penurunan pada jam 72 sampai jam 144. Nilai kerapatan optik tertinggi dari Bacillus subtilis pada konsentrasi tersebut adalah pada jam ke-48. Secara umum terlihat bahwa nilai kerapatan optik tertinggi dari isolat Bacillus subtilis diperoleh pada konsentrasi 2.5% karena memiliki nilai absorban yang lebih tinggi dibandingkan dengan nilai absorban pada konsentrasi substrat lainnya. 3.00
2.50 2.00 1.50
0,5%
1.00
1%
0.50
1.50 %
0.00 0
24 48 72 96 120 144 Waktu Kultivasi (Jam) Gambar 2 Kurva pertumbuhan Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat LBG 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, dan 2.5%
6 Berdasarkan kurva tersebut dapat diketahui fase pertumbuhan bakteri. Isolat Bacillus subtilis yang ditumbuhkan pada media LBG 1%, fase adaptasinya terjadi sekitar jam ke-0 hingga jam ke-24. Fase adaptasi dari kultivasi ini tidak terlalu jelas terlihat dalam kurva, hal ini disebabkan karena isolat tersebut telah beradaptasi dengan media cair pada proses pra-kultivasi. Jam ke-24 sampai dengan jam ke-72 merupakan fase log. Sekitar jam ke-72 sampai jam ke-96 menunjukkan fase stasioner. Sedangkan jam ke-96 sampai jam ke-144 menunjukkan fase kematian. Pengukuran aktivitas enzim mananase menggunakan kurva standar dengan persamaan garis y=0.0023x - 0.0872 (Lampiran 3). Aktivitas enzim mananase dari Bacillus subtilis pada berbagai konsentrasi substrat LBG ditunjukkan pada Gambar 3. Nilai aktivitas enzim pada konsentrasi 0.5% lebih kecil dan berbeda nyata (P<0.05) dibandingkan dengan aktivitas enzim pada konsentrasi substrat 1%, 1.5%, 2%, dan 2.5%. Nilai aktivitas enzim tertinggi pada umumnya diperoleh pada jam ke-96, pada jam ke-96 ini pertumbuhan sel memasuki fase stasioner. Nilai aktivitas enzim tertinggi diperoleh pada konsentrasi substrat 1% yaitu sebesar 14.549 U/mL, akan tetapi nilai ini tidak berbeda nyata (P>0.05) dibandingkan dengan aktivitas enzim pada konsentrasi substrat 1.5%, 2% dan 2.5%. Berdasarkan hal tersebut, konsentrasi substrat LBG yang paling optimum untuk produksi enzim mananase adalah pada konsentrasi substrat LBG 1%.
Aktivitas enzim (U/mL)
15.00 12.00 0,5%
9.00
1%
6.00
1.50% 2%
3.00
2.50%
0.00
0
24 48 72 96 120 144 Waktu inkubasi (jam) Gambar 3 Aktivitas enzim mananase dari Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, dan 2.5% Kondisi pH Media Optimum untuk Produksi Enzim Mananase Optimasi pH media dilakukan pada konsentrasi substrat optimum yang telah diperoleh pada tahapan penelitian sebelumnya, yaitu konsentrasi substrat LBG 1%. Variasi pH media yang digunakan pada penelitian ini adalah 5, 6, 7, 8, dan 9. Dasar dari penentuan rentang variasi pH tersebut adalah karena pada umumnya mikroorganisme jenis bakteri dapat tumbuh pada rentang tersebut. Berdasarkan nilai absorban pada panjang gelombang 660 nm (Lampiran 7), diperoleh hasil yang disajikan melalui kurva pertumbuhan pada Gambar 4.
7
Nilai OD (660 nm)
2.50 2.00 5
1.50
6
1.00
7
0.50
8 9
0.00 0
24 48 72 96 120 144 Waktu kultivasi (jam)
Gambar 4 Kurva pertumbuhan Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat LBG 1% dengan variasi pH media 5, 6, 7, 8, dan 9
Aktivitas Enzim (U/mL)
Terlihat bahwa nilai kerapatan optik Bacillus subtilis pada pH 9 lebih rendah dibandingkan dengan pH lainnya, sedangkan nilai kerapatan optik pada pH media 5, 6, 7, dan 8 tidak berbeda nyata (P<0.05). Bacillus subtilis pada pH media 5 dan 6 mencapai nilai kerapatan optik tertinggi pada jam ke-48, sedangkan pada pH media 7, 8, dan 9 mencapai nilai kerapatan optik tertinggi pada waktu yang lebih lama, yaitu pada jam ke-72. Berdasarkan kurva pertumbuhan ini dapat diketahui bahwa pertumbuhan sel isolat Bacillus subtilis lebih cepat pada pH media 5 dan 6 dibandingkan dengan pH media 7, 8, dan 9. Nilai kerapatan optik tertinggi diperoleh pada pH media 6. Perhitungan aktivitas enzim mananase menggunakan kurva standar dengan persamaan garis y=0.0032x - 0.072 (Lampiran 3). Hasil pengukuran aktivitas enzim mananase dengan variasi pH media 5, 6, 7, 8, dan 9 disajikan pada Gambar 5. Berdasarkan hasil tersebut diperoleh bahwa aktivitas enzim pada pH 6 berbeda nyata (P<0.05) dibandingkan dengan aktivitas enzim pada pH 5, 7, 8 dan 9. Nilai aktivitas enzim tertinggi diperoleh pada pH 6 dengan nilai sebesar 17.043 U/ml. Oleh karena itu, pH 6 merupakan pH optimum untuk produksi enzim mananase. 20.00 16.00 5 12.00
6
8.00
7
4.00
8
0.00
9 0
24 48 72 96 120 144 Waktu inkubasi (jam)
Gambar 5 Aktivitas enzim mananase dari Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat LBG 1% dengan variasi pH media 5, 6, 7, 8, dan 9
8 Suhu Inkubasi Optimum untuk Produksi Enzim Mananase Setelah diperoleh kondisi optimum konsentrasi substrat sebesar 1% dan kondisi pH media optimum adalah 6, selanjutnya dilakukan optimasi suhu pada konsentrasi substrat dan pH optimum yang diperoleh tersebut. Suhu yang divariasikan adalah 200C, 300C, 400C dan, 500C. Berdasarkan hasil yang diperoleh, terlihat bahwa Bacillus subtilis memiliki nilai kerapatan optik tertinggi pada suhu 400C (Gambar 6). Nilai kerapatan optik pada suhu 400C berbeda nyata (P<50) dibandingkan dengan suhu 200C, 300C dan 500C. Hal ini menunjukkan bahwa Bacillus subtilis merupakan bakteri yang tergolong mesofilik karena berada pada selang 30-450C. Tang et al. (2009) menyebutkan bahwa mikroorganisme yang tahan terhadap asam hidup pada suhu mesofilik yang berkisar antara 30 - 45oC. Perbedaan suhu ini juga menyebabkan terjadinya perbedaan waktu optimum pertumbuhan bakteri. Pada suhu produksi 200C terlihat bahwa pertumbuhan Bacillus subtilis sangat lambat, karena pertumbuhan bakteri yang sangat lambat ini sehingga waktu optimum dari pertumbuhan baru diperoleh pada jam ke-96. Selanjutnya pada suhu 300C pertumbuhan isolat juga lambat, akan tetapi lebih cepat jika dibandingkan dengan pertumbuhan isolat pada suhu 200C. Pada suhu tersebut Bacillus subtilis mencapai waktu optimum pertumbuhan pada jam ke-48. Sedangkan pada suhu 400C dan 500C diperoleh waktu optimum pertumbuhan pada jam ke-24. Hal ini menunjukkan bahwa suhu inkubasi akan sangat mempengaruhi pertumbuhan isolat Bacillus subtilis tersebut. Hal ini sesuai dengan Knob dan Carmona (2008) yang menyebutkan bahwa suhu merupakan faktor lingkungan yang sangat vital dalam pertumbuhan mikroorganisme.
Nilai OD (660 nm)
0.80
0.60 20
0.40
30 40
0.20
50 0.00
0
24 48 72 96 120 144 Waktu kultivasi (Jam)
Gambar 6 Kurva pertumbuhan Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat 1%, pH media 6, dengan variasi suhu 200C, 300C, 400C, dan 500C Selanjutnya dilakukan analisis aktivitas enzim menggunakan kurva standar dengan persamaan y=0.0032x-0.072 (Lampiran 3). Nilai aktivitas enzim pada suhu 200C, 300C, 400C dan 500C berbeda nyata satu sama lain (P<0.05). Nilai aktivitas enzim pada suhu 200C terlihat sangat rendah dibandingkan dengan suhu .
9 lainnya. Nilai aktivitas enzim tertinggi pada suhu 200C dan 30 0C diperoleh pada jam ke-96, sedangkan pada suhu 400C dan 500C nilai aktivitas enzim tertinggi diperoleh pada jam ke-48. Aktivitas enzim tertinggi diperoleh pada suhu 400C pada jam ke-48 dengan nilai sebesar 20.978 U/mL. Oleh karena itu, suhu 400C merupakan suhu inkubasi optimum untuk produksi enzim mananase. Aktivitas Enzim (U/mL)
20.0 16.0 20
12.0
30
8.0
40
4.0
50
0.0 0
24
48 72 96 120 144 Waktu inkubasi (jam) Gambar 7 Aktivitas enzim mananase dari Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat 1%, pH media 6, dengan variasi suhu 200C, 300C, 400C, dan 500C
PEMBAHASAN Konsentrasi Optimum Substrat LBG untuk Produksi Enzim Mananase Berdasarkan kurva pertumbuhan yang telah diperoleh sebelumnya (Gambar 2), terlihat bahwa waktu optimum pertumbuhan sel berbeda dengan waktu optimum aktivitas enzim (Gambar 3). Hasil ini menunjukkan bahwa waktu optimum enzim mananase yang dihasilkan dari Bacillus subtilis berada disekitar fase stasioner. Menurut Akando dan Ibrahim (2011), pada umumnya bakteri dari species Bacillus menghasilkan enzim pada fase eksponensial, beberapa jenis pada fase stasioner. Rahmiati (2004) juga menyatakan bahwa produksi enzim dihasilkan mulai dari fase eksponensial sampai fase stasioner. Konsentrasi substrat LBG 1% dipilih sebagai konsentrasi substrat yang paling optimum untuk produksi enzim mananase, karena pada konsentrasi tersebut diperoleh nilai aktivitas enzim tertinggi pada jam ke-96 sebesar 14,549 U/mL. Nilai aktivitas enzim mananase ini lebih tinggi dibandingkan dengan nilai aktivitas enzim yang diperoleh Sumardi (2005), yaitu sebesar 0,69 U/mL. Selain itu, alasan pemilihan konsentrasi substrat 1% sebagai konsentrasi yang paling optimum adalah karena tidak terlihat perbedaan nilai aktivitas enzim yang signifikan diantara konsentrasi lainnya (1,5%, 2% dan 2,5%). Semakin banyak molekul substrat yang tersedia, semakin sering molekul-molekul tersebut memasuki tempat aktif molekul enzim. Pada suatu keadaan tertentu, konsentrasi substrat yang banyak akan menempati semua tempat aktif pada molekul enzim. Setelah produk dilepaskan dari enzim, maka substrat yang baru akan segera
10 menempati tempat aktif enzim. Pada kondisi inilah enzim telah mengalami kejenuhan, sebanyak apapun substrat yang ditambahkan maka laju reaksi enzim tidak akan ditentukan lagi oleh jumlah substrat tersebut, akan tetapi ditentukan oleh kecepatan tempat aktif enzim tersebut mengubah substrat menjadi produk (Campbell 2002). Walaupun digunakan konsentrasi substrat yang lebih besar aktivitas enzim yang diperoleh cenderung sama. Oleh karena itulah dipilih konsentrasi substrat 1% sebagai konsentrasi substrat yang paling optimum, dan hal ini juga dapat menghemat penggunaan substrat sehingga menjadi lebih efisien.
Kondisi pH Optimum Media untuk Produksi Enzim Mananase Salah satu parameter fisik yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba adalah pH media. Pengaruh pH media terhadap mikroba adalah menginduksi perubahan morfologi pada mikroba dan juga menginduksi sekresi enzim yang dihasilkan oleh mikroba tersebut (Gupta et al. 2003). Berdasarkan hasil pengujian aktivitas enzim (Gambar 5) terlihat bahwa aktivitas enzim pada pH 9 lebih kecil dibandingkan dengan aktivitas enzim pada variasi pH lainnya. Hal ini juga sejalan dengan kurva pertumbuhan yang diperoleh sebelumnya (Gambar 4). Aktivitas enzim tertinggi diperoleh pada pH 6 jam ke-96, sebesar 17,043 U/ml. Nilai aktivitas enzim tersebut lebih tinggi dibandingkan dengan nilai aktivitas enzim dari Bacillus subtilis yang diperoleh Chuan et al. (2006), yaitu sebesar 8 U/mL. Nilai aktivitas enzim tertinggi yang diperoleh pada penelitian ini berada pada kisaran fase stasioner dari pertumbuhan isolat Bacillus subtilis tersebut. Hal ini sesuai dengan Hidayat (2005) yang menyatakan bahwa pH dapat mempengaruhi aktivitas enzim yang dihasilkan. Hasil ini sejalan dengan hasil yang diperoleh oleh Kurakake et al. (2006) yang menyebutkan bahwa pH optimum dari enzim mananase berkisar pada kondisi asam yaitu sekitar pH 3 sampai pH 6. Jiang et al. (2006) memperoleh enzim mananase dari Bacillus subtilis optimum pada pH 6. Mudau et al. (2008) memperoleh enzim mananase dari Scopulariopsis candida optimum pada pH 6. Sumardi (2007) menyebutkan bahwa enzim mananase yang dihasilkan oleh bakteri rata-rata memiliki aktivitas optimum pada pH netral atau sedikit asam. Hal ini juga sesuai dengan Puchart et al (2004) yang menyebutkan bahwa enzim mananase memiliki pH optimum pada kondisi pH sedikit asam sampai netral. Oleh karena itulah semakin basa medianya menyebabkan pertumbuhan Bacillus subtilis juga semakin rendah dan juga menghasilkan enzim dengan aktivitas yang juga rendah.
Suhu Inkubasi Optimum untuk Produksi Enzim Mananase Suhu sangat mempengaruhi kecepatan pertumbuhan mikrob, kecepatan sintesis enzim, dan kecepatan inaktivasi enzim (Knob dan Carmona 2008). Setiap mikrob termasuk bakteri mempunyai suhu optimum, maksimum dan minimum untuk pertumbuhannya. Jika suhu lingkungan lebih kecil dari suhu minimum atau lebih besar dari suhu maksimum pertumbuhannya maka aktivitas enzim akan terhenti bahkan pada suhu yang terlalu tinggi akan terjadi denaturasi enzim (Sumardjo 2006).
11 Berdasarkan hasil pengujian aktivitas enzim (Gambar 7), produksi enzim semakin meningkat dengan meningkatnya suhu, akan tetapi mengalami penurunan pada suhu 500C. Aktivitas enzim tertinggi diperoleh pada suhu 400C pada jam ke48 sebesar 20,978 U/mL. Nilai aktivitas enzim mananase ini lebih tinggi dibandingkan dengan nilai aktivitas enzim yang diperoleh Chuan et al. (2006), yaitu sebesar 8 U/mL, dan Sumardi (2005) yang hanya sebesar 0,69 U/mL. Sebelumnya telah dipublikasikan bahwa enzim mananase memiliki suhu optimum sekitar 400C (Puchart et al. 2004). Kenaikan suhu akan meningkatkan kecepatan reaksi yang dikatalisis oleh enzim, tetapi peningkatan kecepatan reaksi hanya pada kisaran suhu tertentu (Murray et al. 2003). Peningkatan kecepatan reaksi ini disebabkan oleh peningkatan energi kinetik molekul-molekul yang bereaksi. Peningkatan suhu yang lebih jauh dapat mengakibatkan energi kinetik semakin besar, sehingga dapat menyebabkan putusnya ikatan hidrogen dan hidrofobik lemah yang mempertahankan struktur sekunder-tersier dari enzim tersebut. Kenaikan temperatur melewati temperatur optimum akan menyebabkan enzim terdenaturasi dan menurunkan kecepatan reaksi enzimatis (Wuryanti, 2004).
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Berdasarkan hasil penelitian, diperoleh informasi bahwa isolat bakteri laut Bacillus subtilis memiliki nilai aktivitas enzim mananase yang cukup tinggi. Nilai aktivitas enzim tertinggi diperoleh sebesar 20.978 U/mL pada jam ke-48. Bacillus subtilis dapat menghasilkan enzim mananase ekstraseluler pada kondisi optimum dengan konsentrasi substrat LBG 1%, pH media 6, dan suhu inkubasi 400C.
Saran Perlu dilakukan permurnian dengan cara pengendapan, dilanjutkan dialisis dan kromatografi untuk memperoleh enzim mananase murni. Selain itu, juga perlu dilakukan karakterisasi enzim berupa pH, suhu, kofaktor dan inhibitor untuk mengetahui sifat enzim mananase dari Bacillus subtilis yang diisolasi dari Laut Bali tersebut.
DAFTAR PUSTAKA Akando A, Ibrahim. 2011. A potential new isolate for production of a thermostable extracellular α-amylase. Journal of Bacteriology Research. 3(8):129-137. Campbell NA et al. 2002. Biology 5th Ed. New York: Mc Graw Hill. Chuan CH, Krishnaiah K, Wong CM, Jidon Janaun. 2006. Palm kernel cake as substrate for β-mannanase production by Bacillus subtilis ATCC3366 under
12 submerged and solid state fermentations. Di dalam: Jidon, editor. Proceedings of the 1st International Conference on Natural Resources Engineering & Technology 2006; 24-25 Juli 2006; Putrajaya, Malaysia. 2073. 182-185. Gupta R, Gigras P, Mohapatra H, Goswami VK, Chauhan B. 2003. Microbialamylases: a biotechnological perspective. Journal of Process. Biochemistry. 38:1599-1616. Hidayat I. 2005. Pengaruh pH terhadap aktivitas endo-1,4-β-glucanase Bacillus sp. AR 009. Jurnal Biodiversitas. 6:242-244. Jiang Z, Wei Y, Li D, Li L, Chai P, Kusakabe I. 2006. High-level production, purification and characterization of a thermostable β-mannanase from the newly isolated Bacillus subtilis WY34. Journal Carbohydrate Polymers. 66:89-96. Knob A, Carmona E. 2008. Xylanase production by Penicillium sclerotiorum and its characterization. Journal World Applied Sciences. 4(2): 277-283. Kurakake M, Sumida T, Masuda D, Oonishi S, Komaki T. 2006. Production of galacto-manno-oligosaccharides from guar gum by and β-mannanase from Penicillium oxalicum SO. Journal Agric Food Chem. 54:7885-7889. Li et al. 2006. A mannanase from Bacillus subtilis B36: purification, properties, sequencing, gene cloning and expression in Escherichia coli. Journal Naturforsch. 61c:840-846. Mudau, Maria M, Setati, Evodia M. 2008. Partial purification and characterization of endo-β-1,4-mannanases from Scopulariopsis candida strains isolated from solar salterns. Journal of Biotechnol. 7:2283-2284. Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwel VW. 2003. Biokimia Harper. Penerjemah Hartono A. Jakarta: ECG. Terjemahan dari: Harper’s Biochemistry. Politz et al. 2000. A highly thermostable endo-(1.4)-b-mannanase from the marine bacterium Rhodothermus marinus. Journal Appl Microbiol Biotechnol. 53(28):715-721. Puchart V, Vrsanska M, Svoboda P, Pohl J, Ogel ZB, Biely P. 2004. Purification and characteritation of two forms of endo-β-1,4-mannanase from a thermotolerant fungus, Aspergilus fumigatus IMI 385709 (formerly Thermomyces lanuginosus IMI 158749). Journal Biochem Biophys Acta. 1674:239-250. Rahmiati R. 2004. Identifikasi dan isolasi kolagenase dari Vibrio sp B-30 yang ditumbuhkan dengan media TSB-YE-Salt. Jurnal Widya Agrika. 2:211217. Songsiriritthigul et al. 2010. Efficient recombinant expression and secretion of a thermostable gh26 mannan endo-1.4-β-mannosidase from Bacillus licheniformis in Escherichia coli. Journal Microbial Cell Factories. 9:20.
13 Sumardi. 2005. Isolation and characterization of mannanolytic thermophilic bacteria from palm oil shell and their mannanase enzyme production properties. Journal Biotropia. 25:1-10. Sumardi. 2005. Optimasi produksi enzim β-mananase ekstraseluler dari bakteri Geobacillus Stearothermophilus L-07. Journal Sains Tek. 11:68. Sumardi. 2007. Isolasi dan karakterisasi mananase ekstraseluler dari Fusarium oxysporum. Jurnal Sains MIPA. 13:43-48. Sumardjo D. 2006. Pengantar Kimia. Jakarta: Buku Kedokteran EGC. Tanaka et al. 2009. Cloning and characterization of a β-1.4-mannanase 5c possessing family 27 carbohydrate-binding module from marine bacterium Vibrio Sp. strain MA-138. Journal Biosci Biotech Biochem. 7(1):109-116. Tang, Chun J, Shibata A, Zhou Q, Katayama A. Effect of temperature on reaction rate and microbial community in composting of cattle manure with rice straw. Journal Of Bioscience And Bioengineering. 104(4):321-328. Wuryanti. 2004. Isolasi dan penentuan aktivasi spesifik enzim bromelin dari buah nanas (Ananas comosus L.). Jurnal KSA. 7:83-87. Yopi, Purnawan A, Thontowi A, Hermansyah H, Wijanarko A. 2006. Preparasi mannan dan mannanase kasar dari bungkil kelapa sawit. Jurnal Teknologi. 20(4):312-319.
14
LAMPIRAN
15 Lampiran 1 Bagan Alir Penelitian Optimasi Produksi Enzim Mananase (Konsentrasi substrat, pH media, suhu inkubasi)
Bacillus subtilis
Peremajaan isolat
Pra-kultivasi
Kultivasi
Pengambilan sampel Kurva Pertumbuhan
Aktivitas Enzim (Kurva Produksi)
Uji kuantitatif
16 Lampiran 2 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 660 nm isolat bakteri laut Bacillus subtilis variasi konsentrasi substrat LBG Konsentrasi Inkubasi Substrat LBG 0.50% 0 24 48 72 96 120 144 1% 0 24 48 72 96 120 144 1.50% 0 24 48 72 96 120 144 2% 0 24 48 72 96 120 144 2.50% 0 24 48 72 96 120 144
Sampel S1 S2 0.006 0.004 0.011 0.008 0.062 0.089 0.192 0.186 0.176 0.179 0.176 0.178 0.175 0.172 0.008 0.008 0.031 0.053 0.104 0.096 0.201 0.222 0.206 0.224 0.177 0.220 0.157 0.214 0.145 0.134 0.237 0.232 0.253 0.243 0.223 0.234 0.210 0.177 0.197 0.150 0.176 0.150 0.160 0.156 0.236 0.238 0.259 0.251 0.234 0.227 0.221 0.216 0.199 0.208 0.179 0.195 0.161 0.177 0.239 0.237 0.253 0.260 0.237 0.240 0.235 0.233 0.232 0.230 0.232 0.229
Rata-rata (S)
Deviasi
0.005 0.010 0.075 0.189 0.178 0.177 0.174 0.008 0.042 0.100 0.212 0.215 0.199 0.185 0.139 0.234 0.248 0.228 0.194 0.174 0.163 0.158 0.237 0.255 0.231 0.218 0.203 0.187 0.169 0.238 0.257 0.238 0.234 0.231 0.230
0.001 0.002 0.019 0.005 0.002 0.001 0.002 0.000 0.015 0.006 0.015 0.013 0.031 0.040 0.008 0.004 0.007 0.008 0.023 0.033 0.018 0.002 0.001 0.006 0.005 0.004 0.007 0.011 0.011 0.001 0.005 0.003 0.001 0.001 0.002
17 Lampiran 3 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 540 nm menggunakan larutan D-(+)-Manosa dengan konsentrasi yang berbeda Konsentrasi 50 (ppm) Aλ 540 nm 0.033
100
150
200
250
300
350
400
0.139
0.258
0.369
0.505
0.595
0.726
0.836
Aλ 540 nm
0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0
50 100 150 200 250 300 350 400 Konsentrasi (ppm)
Gambar 8 Kurva standar manosa untuk optimasi konsentrasi substrat LBG Lampiran 4 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 540 nm menggunakan larutan D-(+)-Manosa dengan konsentrasi yang berbeda Konsentrasi 50 (ppm) Aλ 540 nm 0.033
100
150
200
250
300
350
400
0.272
0.441
0.575
0.736
0.883
1.026
1.194
1.4
Aλ 540 nm
1.2
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0
50 100 150 200 250 300 350 400 Konsentrasi (ppm)
Gambar 9 Kurva standar manosa untuk optimasi pH media dan suhu inkubasi
18
Konsentrasi Sample Substrat Inkubasi S1 S2 LBG 0.50% 0 0.036 0.037 24 0.314 0.312 48 0.434 0.440 72 0.368 0.389 96 0.430 0.357 120 0.397 0.435 144 0.239 0.414 1% 0 0.082 0.096 24 0.058 0.060 48 0.094 0.092 72 0.119 0.122 96 0.130 0.137 120 0.102 0.116 144 0.102 0.099 1.50% 0 0.049 0.046 24 0.144 0.132 48 0.176 0.197 72 0.221 0.201 96 0.227 0.219 120 0.200 0.189 144 0.180 0.172
S-K
Kontrol K1
K2
0.050 0.047 0.050 0.054 0.054 0.052 0.051 0.032 0.032 0.029 0.034 0.040 0.041 0.051 0.048 0.047 0.040 0.054 0.051 0.052 0.051
0.048 0.032 0.054 0.052 0.051 0.06 0.047 0.048 0.032 0.031 0.040 0.040 0.039 0.029 0.056 0.042 0.056 0.044 0.051 0.053 0.040
S1
ppm (mg/L) S2
-0.014 -0.011 0.267 0.280 0.384 0.386 0.314 0.337 0.376 0.306 0.345 0.375 0.188 0.367 0.050 0.048 0.026 0.028 0.065 0.061 0.085 0.082 0.090 0.097 0.061 0.077 0.031 0.070 0.001 -0.010 0.097 0.090 0.136 0.141 0.167 0.157 0.176 0.168 0.148 0.136 0.129 0.132
S1
S2
31.826 154.000 204.870 174.435 201.391 187.913 119.652 59.652 49.217 66.174 74.870 77.043 64.435 51.391 22.813 52.813 65.000 74.688 77.500 68.750 62.813
33.130 159.652 205.739 184.435 170.957 200.957 197.478 58.783 50.087 64.435 73.565 80.087 71.391 68.348 19.375 50.625 66.563 71.563 75.000 65.000 63.750
mg/mL S1
S2
0.032 0.033 0.154 0.160 0.205 0.206 0.174 0.184 0.201 0.171 0.188 0.201 0.120 0.197 0.060 0.059 0.049 0.050 0.066 0.064 0.075 0.074 0.077 0.080 0.064 0.071 0.051 0.068 0.023 0.019 0.053 0.051 0.065 0.067 0.075 0.072 0.078 0.075 0.069 0.065 0.063 0.064
U/mL S1
S2
1.179 5.704 7.588 6.461 7.459 6.960 4.432 2.209 9.114 12.254 13.865 14.267 11.932 9.517 0.845 9.780 12.037 13.831 14.352 12.731 11.632
1.227 5.913 7.620 6.831 6.332 7.443 7.314 2.177 9.275 11.932 13.623 14.831 13.221 12.657 0.718 9.375 12.326 13.252 13.889 12.037 11.806
U/mL Deviasi 1.203 5.808 7.604 6.646 6.895 7.201 5.873 2.193 9.195 12.093 13.744 14.549 12.576 11.087 0.781 9.578 12.182 13.542 14.120 12.384 11.719
0.034 0.148 0.023 0.262 0.797 0.342 2.038 0.023 0.114 0.228 0.171 0.399 0.911 2.220 0.090 0.286 0.205 0.409 0.327 0.491 0.123
18
Lampiran 5 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 540 nm enzim mananase isolat Bacillus subtilis variasi konsentrasi substrat LBG
19 Lanjutan Konsentrasi Sample Substrat Inkubasi S1 S2 LBG 2% 0 0.047 0.056 24 0.129 0.137 48 0.187 0.173 72 0.219 0.200 96 0.229 0.215 120 0.190 0.186 144 0.182 0.192 2.50% 0 0.066 0.050 24 0.123 0.121 48 0.189 0.200 72 0.227 0.221 96 0.227 0.218 120 0.192 0.180 144 0.183 0.177
S-K
Kontrol
ppm (mg/L)
K1
K2
S1
S2
S1
S2
0.048 0.047 0.050 0.054 0.051 0.052 0.051 0.021 0.047 0.050 0.054 0.051 0.052 0.051
0.055 0.055 0.060 0.055 0.056 0.042 0.037 0.022 0.045 0.049 0.053 0.056 0.043 0.062
-0.001 0.082 0.137 0.165 0.178 0.138 0.131 0.045 0.076 0.139 0.173 0.176 0.140 0.132
0.001 0.082 0.113 0.145 0.159 0.144 0.155 0.028 0.076 0.151 0.168 0.162 0.137 0.115
22.188 48.125 65.313 74.063 78.125 65.625 63.438 36.563 46.250 65.938 76.563 77.500 66.250 63.750
22.813 48.125 57.813 67.813 72.188 67.500 70.938 31.250 46.250 69.688 75.000 73.125 65.313 58.438
mg/mL S1
S2
0.022 0.023 0.048 0.048 0.065 0.058 0.074 0.068 0.078 0.072 0.066 0.068 0.063 0.071 0.037 0.031 0.046 0.046 0.066 0.070 0.077 0.075 0.078 0.073 0.066 0.065 0.064 0.058
U/mL S1 0.822 8.912 12.095 13.715 14.468 12.153 11.748 1.354 8.565 12.211 14.178 14.352 12.269 11.806
S2 0.845 8.912 10.706 12.558 13.368 12.500 13.137 1.157 8.565 12.905 13.889 13.542 12.095 10.822
U/mL Deviasi 0.833 8.912 11.400 13.137 13.918 12.326 12.442 1.256 8.565 12.558 14.034 13.947 12.182 11.314
0.016 0.000 0.982 0.818 0.777 0.246 0.982 0.139 0.000 0.491 0.205 0.573 0.123 0.696
19
20 Lampiran 6 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 660 nm isolat bakteri laut Bacillus subtilis variasi pH media pH Media
Inkubasi
5
0 24 48 72 96 120 144 0 24 48 72 96 120 144 0 24 48 72 96 120 144 0 24 48 72 96 120 144 0 24 48 72 96 120 144
6
7
8
9
Sampel S1 S2 0.108 0.090 0.211 0.209 0.228 0.227 0.226 0.227 0.200 0.207 0.195 0.183 0.188 0.192 0.083 0.090 0.207 0.196 0.236 0.234 0.229 0.225 0.220 0.203 0.189 0.167 0.173 0.164 0.074 0.096 0.198 0.192 0.226 0.209 0.224 0.214 0.222 0.199 0.193 0.178 0.198 0.165 0.049 0.080 0.191 0.191 0.222 0.225 0.234 0.229 0.208 0.197 0.200 0.181 0.192 0.184 0.064 0.057 0.177 0.173 0.205 0.201 0.215 0.218 0.167 0.184 0.148 0.160 0.143 0.157
Rata-rata (S)
Deviasi
0.099 0.210 0.227 0.226 0.204 0.189 0.190 0.086 0.201 0.235 0.227 0.211 0.178 0.168 0.085 0.195 0.217 0.219 0.211 0.185 0.181 0.065 0.191 0.223 0.232 0.203 0.191 0.188 0.061 0.175 0.203 0.216 0.176 0.154 0.150
0.012 0.001 0.001 0.001 0.005 0.009 0.003 0.005 0.008 0.001 0.003 0.012 0.016 0.007 0.016 0.004 0.012 0.007 0.016 0.010 0.023 0.022 0.000 0.002 0.004 0.007 0.014 0.006 0.005 0.003 0.003 0.002 0.011 0.008 0.010
21 Lampiran 7 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 540 nm enzim mananase isolat bakteri laut Bacillus subtilis variasi pH media pH Media Inkubasi 5
6
7
0 24 48 72 96 120 144 0 24 48 72 96 120 144 0 24 48 72 96 120 144
Sample S1 S2 0.027 0.025 0.319 0.278 0.137 0.131 0.182 0.164 0.214 0.246 0.200 0.214 0.234 0.213 0.026 0.030 0.285 0.349 0.138 0.125 0.142 0.176 0.235 0.248 0.229 0.218 0.240 0.253 0.024 0.022 0.269 0.288 0.130 0.170 0.136 0.153 0.215 0.205 0.209 0.170 0.199 0.148
Kontrol K1 K2 0.015 0.015 0.024 0.018 0.024 0.019 0.034 0.037 0.026 0.037 0.021 0.036 0.030 0.027 0.018 0.018 0.022 0.020 0.011 0.011 0.014 0.020 0.018 0.020 0.021 0.021 0.030 0.027 0.015 0.013 0.021 0.019 0.021 0.037 0.022 0.028 0.024 0.017 0.034 0.015 0.030 0.021
S-K ppm (mg/L) mg/mL S1 S2 S1 S2 S1 S2 0.012 0.010 26.250 25.625 0.026 0.026 0.295 0.260 114.688 103.750 0.115 0.104 0.113 0.112 57.813 57.500 0.058 0.058 0.148 0.127 68.750 62.188 0.069 0.062 0.188 0.209 81.250 87.813 0.081 0.088 0.179 0.178 78.438 78.125 0.078 0.078 0.204 0.186 86.250 80.625 0.086 0.081 0.008 0.012 25.000 26.250 0.025 0.026 0.263 0.329 104.688 125.313 0.105 0.125 0.127 0.114 62.188 58.125 0.062 0.058 0.128 0.156 62.500 71.250 0.063 0.071 0.217 0.228 90.313 93.750 0.090 0.094 0.208 0.197 87.500 84.063 0.088 0.084 0.210 0.226 88.125 93.125 0.088 0.093 0.009 0.009 25.313 25.313 0.025 0.025 0.248 0.269 100.000 106.563 0.100 0.107 0.109 0.133 56.563 64.063 0.057 0.064 0.114 0.125 58.125 61.563 0.058 0.062 0.191 0.188 82.188 81.250 0.082 0.081 0.175 0.155 77.188 70.938 0.077 0.071 0.169 0.127 75.313 62.188 0.075 0.062
U/mL S1 S2 0.972 0.949 4.248 3.843 10.706 10.648 12.731 11.516 15.046 16.262 14.525 14.468 15.972 14.931 0.926 0.972 3.877 4.641 11.516 10.764 11.574 13.194 16.725 17.361 16.204 15.567 16.319 17.245 0.938 0.938 3.704 3.947 10.475 11.863 10.764 11.400 15.220 15.046 14.294 13.137 13.947 11.516
U/mL Deviasi 0.961 4.045 10.677 12.124 15.654 14.497 15.451 0.949 4.259 11.140 12.384 17.043 15.885 16.782 0.938 3.825 11.169 11.082 15.133 13.715 12.731
0.016 0.286 0.041 0.859 0.859 0.041 0.737 0.033 0.540 0.532 1.146 0.450 0.450 0.655 0.000 0.172 0.982 0.450 0.123 0.818 1.719
21
22 22
Lanjutan pH Media
Inkubasi
8
0 24 48 72 96 120 144 0 24 48 72 96 120 144
9
Sample S1 S2 0.014 0.019 0.320 0.337 0.107 0.144 0.138 0.146 0.202 0.196 0.152 0.227 0.235 0.182 0.016 0.021 0.276 0.208 0.097 0.107 0.129 0.141 0.199 0.174 0.160 0.211 0.186 0.194
Kontrol K1 K2 0.013 0.011 0.026 0.020 0.013 0.037 0.022 0.022 0.014 0.015 0.016 0.034 0.032 0.021 0.012 0.019 0.020 0.019 0.028 0.037 0.022 0.026 0.019 0.019 0.023 0.037 0.026 0.020
S-K S1 0.001 0.294 0.094 0.116 0.188 0.136 0.203 0.004 0.256 0.069 0.107 0.180 0.137 0.160
S2 0.008 0.317 0.107 0.124 0.181 0.193 0.161 0.002 0.189 0.070 0.115 0.155 0.174 0.174
ppm (mg/L) S1 S2 22.813 25.000 114.375 121.563 51.875 55.938 58.750 61.250 81.250 79.063 65.000 82.813 85.938 72.813 23.750 23.125 102.500 81.563 44.063 44.375 55.938 58.438 78.750 70.938 65.313 76.875 72.500 76.875
mg/mL S1 S2 0.023 0.025 0.114 0.122 0.052 0.056 0.059 0.061 0.081 0.079 0.065 0.083 0.086 0.073 0.024 0.023 0.103 0.082 0.044 0.044 0.056 0.058 0.079 0.071 0.065 0.077 0.073 0.077
U/mL S1 S2 0.845 0.926 4.236 4.502 9.606 10.359 10.880 11.343 15.046 14.641 12.037 15.336 15.914 13.484 0.880 0.856 3.796 3.021 8.160 8.218 10.359 10.822 14.583 13.137 12.095 14.236 13.426 14.236
U/mL Deviasi 0.885 4.369 9.983 11.111 14.844 13.686 14.699 0.868 3.409 8.189 10.590 13.860 13.166 13.831
0.057 0.188 0.532 0.327 0.286 2.332 1.719 0.016 0.548 0.041 0.327 1.023 1.514 0.573
23 Lampiran 8 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 660 nm isolat bakteri laut Bacillus subtilis variasi suhu inkubasi Suhu (0C)
Inkubasi
20
0 24 48 72 96 120 144 0 24 48 72 96 120 144 0 24 48 72 96 120 144 0 24 48 72 96 120 144
30
40
50
Sampel S1 S2 0.053 0.053 0.075 0.130 0.154 0.162 0.159 0.188 0.170 0.183 0.123 0.134 0.197 0.135 0.082 0.090 0.206 0.195 0.235 0.234 0.229 0.224 0.219 0.203 0.189 0.166 0.173 0.163 0.102 0.106 0.715 0.716 0.712 0.686 0.758 0.637 0.724 0.600 0.630 0.517 0.713 0.637 0.064 0.065 0.298 0.298 0.164 0.180 0.152 0.182 0.122 0.194 0.151 0.204 0.140 0.206
Rata-rata (S)
Deviasi
0.053 0.103 0.158 0.174 0.177 0.129 0.166 0.086 0.201 0.235 0.227 0.211 0.178 0.168 0.104 0.716 0.699 0.698 0.662 0.574 0.675 0.065 0.298 0.172 0.167 0.158 0.178 0.173
0.000 0.039 0.006 0.021 0.009 0.008 0.044 0.006 0.008 0.001 0.004 0.011 0.016 0.007 0.003 0.001 0.018 0.086 0.088 0.080 0.054 0.001 0.000 0.011 0.021 0.051 0.037 0.047
24
Suhu (0C) Inkubasi 20
30
40
0 24 48 72 96 120 144 0 24 48 72 96 120 144 0 24 48 72 96 120
Sample S1 S2 0.036 0.035 0.024 0.114 0.092 0.154 0.104 0.249 0.214 0.228 0.178 0.274 0.162 0.256 0.026 0.030 0.285 0.349 0.138 0.125 0.142 0.176 0.235 0.248 0.229 0.218 0.240 0.253 0.074 0.055 0.156 0.138 0.326 0.290 0.280 0.219 0.184 0.193 0.144 0.128
Kontrol K1 K2 0.021 0.029 0.019 0.025 0.018 0.020 0.023 0.029 0.025 0.021 0.035 0.028 0.023 0.029 0.018 0.018 0.022 0.020 0.011 0.011 0.014 0.020 0.018 0.020 0.021 0.021 0.030 0.027 0.013 0.015 0.015 0.011 0.025 0.010 0.025 0.010 0.019 0.022 0.020 0.014
S-K S1 0.015 0.005 0.074 0.081 0.189 0.143 0.139 0.008 0.263 0.127 0.128 0.217 0.208 0.210 0.061 0.141 0.301 0.255 0.165 0.124
S2 0.006 0.089 0.134 0.220 0.207 0.246 0.227 0.012 0.329 0.114 0.156 0.228 0.197 0.226 0.040 0.127 0.280 0.209 0.171 0.114
ppm (mg/L) S1 S2 27.188 24.375 24.063 50.313 45.625 64.375 47.813 91.250 81.563 87.188 67.188 99.375 65.938 93.438 25.000 26.250 104.688 125.313 62.188 58.125 62.500 71.250 90.313 93.750 87.500 84.063 88.125 93.125 41.563 35.000 66.563 62.188 116.563 110.000 102.188 87.813 74.063 75.938 61.250 58.125
mg/mL S1 S2 0.027 0.024 0.024 0.050 0.046 0.064 0.048 0.091 0.082 0.087 0.067 0.099 0.066 0.093 0.025 0.026 0.105 0.125 0.062 0.058 0.063 0.071 0.090 0.094 0.088 0.084 0.088 0.093 0.042 0.035 0.067 0.062 0.117 0.110 0.102 0.088 0.074 0.076 0.061 0.058
U/mL S1 1.007 0.891 1.690 1.771 3.021 2.488 2.442 0.926 3.877 11.516 11.574 16.725 16.204 16.319 1.539 12.326 21.586 18.924 13.715 11.343
S2 0.903 1.863 2.384 3.380 3.229 3.681 3.461 0.972 4.641 10.764 13.194 17.361 15.567 17.245 1.296 11.516 20.370 16.262 14.063 10.764
U/mL Deviasi 0.955 1.377 2.037 2.575 3.125 3.084 2.951 0.949 4.259 11.140 12.384 17.043 15.885 16.782 1.418 11.921 20.978 17.593 13.889 11.053
0.074 0.687 0.491 1.138 0.147 0.843 0.720 0.033 0.540 0.532 1.146 0.450 0.450 0.655 0.172 0.573 0.859 1.882 0.246 0.409
24
Lampiran 9 Hasil pembacaan spektrofotometer λ = 540 nm enzim mananase isolat bakteri laut Bacillus subtilis variasi suhu inkubasi
25 Lanjutan Suhu
Inkubasi
50
0 24 48 72 96 120 144
Sample S1 S2 0.040 0.036 0.108 0.140 0.220 0.229 0.169 0.156 0.148 0.179 0.072 0.070 0.157 0.134
Kontrol K1 K2 0.018 0.025 0.015 0.027 0.027 0.023 0.016 0.017 0.020 0.035 0.018 0.025 0.027 0.028
S-K S1 0.022 0.093 0.193 0.153 0.128 0.054 0.130
S2 0.011 0.113 0.206 0.139 0.144 0.045 0.106
ppm (mg/L) S1 S2 29.375 25.938 51.563 57.813 82.813 86.875 70.313 65.938 62.500 67.500 39.375 36.563 63.125 55.625
mg/mL S1 S2 0.029 0.026 0.052 0.058 0.083 0.087 0.070 0.066 0.063 0.068 0.039 0.037 0.063 0.056
U/mL S1 1.088 9.549 15.336 13.021 11.574 7.292 11.690
S2 0.961 10.706 16.088 12.211 12.500 6.771 10.301
U/mL
Deviasi
1.024 10.127 15.712 12.616 12.037 7.031 10.995
0.090 0.818 0.532 0.573 0.655 0.368 0.982
25
26 Lampiran 10 Contoh perhitungan aktivitas enzim mananase isolat bakteri laut Bacillus subtilis menggunakan konsentrasi substrat LBG 1% pada jam ke-0 ulangan 1 Diketahui sampel – kontrol = 0.082 – 0.032 = 0.032 y = 0.050 Persamaan garis yang diperoleh adalah y=0.0023x - 0.0872, maka y = 0.0023x - 0.0872
x=
y + 0.0872 0.0023
Sehingga x=
y + 0.0872 = 0.0023
0.050 + 0.0872 = 59.652 ppm 0.0023
Karena 1 ppm setara dengan 1 mg/L, maka 59.652 ppm =
Aktivitas Enzim =
= Ket : C
59.652 1000
= 0.05962 mg/mL
C x fp x 1000 t x BM [0.0592] x 100 x 1000 15 x 180
= konsentrasi (mg/mL)
fp = faktor pengenceran t
= waktu reaksi (menit)
BM = Bobot molekul gula pereduksi
=
2.209 U/mL
27 Lampiran 11 Hasil analisis statistik uji lanjut menggunakan duncan test Optimasi konsentrasi substrat LBG Duncan Grouping Mean N Substrat A 10.7767 14 1 A 10.6151 14 1.5 A 10.5507 14 2.5 A 10.4242 14 2 B 5.8902 14 0.5 Interpretasi: Hanya perlakuan optimasi substrat konsentrasi 0.5 % yang berbeda nyata dengan taraf faktor yang lain pada taraf nyata 5%. Optimasi pH media Duncan Grouping Mean N pH A 11.2061 14 6 B 10.4869 14 5 C B 9.9396 14 8 C 9.7992 14 7 D 9.1304 14 9 Interpretasi: Perlakuan optimasi pH 6 berbeda nyata dengan pH 5,8,7,9 pada taraf nyata 5%, perlakuan optimasi pH 5, 8, 7 tidak berbeda nyata pada taraf nyata 5%, dan perlakuan optimasi pH 9 berbeda nyata dg pH lainnya pada taraf nyata 5%. Optimasi suhu inkubasi Duncan Grouping Mean N Suhu A 12.8720 14 40 B 11.2061 14 30 C 9.9349 14 50 D 2.3008 14 20 Interpretasi: Semua perlakuan optimasi suhu berbeda nyata satu sama lain pada taraf nyata 5%.
28
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Kota Bukittinggi, Sumatera Barat, pada tanggal 23 Maret 1992 dari ayah Masrizal dan ibu Rosliana. Penulis adalah putra bungsu dari tiga bersaudara. Tahun 2010 penulis lulus dari SMAN 2 Lubuk Basung Kabupaten Agam, dan pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor program studi Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Selama masa perkuliahan, penulis pernah menjadi Ketua Divisi Bidang Keilmuan Metabolisme pada Community of Research and Education in Biochemistry (Crebs) periode 2012/2013. Penulis juga pernah aktif sebagai anggota Serambi Ruhiyah Mahasiswa FMIPA (Serum-G) periode 2011/2012 dan 2012/2013. Bulan Juli-Agustus 2013 penulis melaksanakan Praktik Lapangan di Laboratorium Biorekayasa Lingkungan, Bioproses, Pusat Penelitian Biotekologi LIPI Cibinong, Bogor. dengan judul Aktivitas Enzim Mananase dari Isolat Bakteri Laut P20.
