AKTIVITAS PENGHAMBATAN Bacillus sp. TERHADAP Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Pseudomonas syringae pv. glycines, DAN Pseudomonas fluorescens
KARTIKA FINDY
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
ABSTRAK KARTIKA FINDY. Aktivitas Penghambatan Bacillus sp. terhadap Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Pseudomonas syringae pv. glycines, dan Pseudomonas fluorescens. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan ALINA AKHDIYA. Penyakit leaf blight yang disebabkan oleh bakteri patogen tanaman X. oryzae pv. oryzae dan P. syringae pv. glycines dapat mengakibatkan kematian terhadap tanaman. Pengendalian bakteri patogen tanaman dapat dilakukan dengan menggunakan agen pengendali hayati seperti P. fluorescens ataupun senyawa antimikrob. Tujuan dari penelitian ini adalah mempelajari kemampuan penghambatan dan waktu optimum produksi senyawa antimikrob isolat-isolat Bacillus sp. terhadap bakteri patogen tanaman X. oryzae pv. oryzae, P. syringae pv. glycines, dan bakteri biokontrol P. fluorescens. Sebanyak 31 isolat yang berhasil diisolasi dari tanah hutan diuji aktivitas antimikrobnya terhadap bakteri uji dengan metode double layer. Sebanyak 13 isolat menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap Staphylococcus aureus, Eschericia coli, dan X. oryzae pv. oryzae, 8 isolat mampu menghambat P. fluorescens A, 9 isolat mampu menghambat P. fluorescens B, dan 8 isolat mampu menghambat P. syringae pv. glycines. Isolat Bacillus sp. F13 memiliki kecepatan penghambatan yang efektif dan efisiensi terhadap semua bakteri uji dan dibuktikan dengan uji kompetisi dalam kultur campuran. Spektrum aktivitas penghambatan isolat tersebut luas karena dapat menghambat bakteri Gram positif dan Gram negatif. Hasil uji kompetisi dalam kultur campuran menunjukkan isolat tersebut memiliki penghambatan terutama terhadap P. syringae pv. glycines dan X. oryzae pv. oryzae dengan persen penghambatan mencapai 100%. Aktivitas senyawa antimikrob yang dihasilkan oleh isolat Bacillus sp. terhadap bakteri uji dihasilkan pada fase akhir logaritmik pertumbuhan.
ABSTRACT KARTIKA FINDY. Antimicrobial Activity of Bacillus sp. to Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Pseudomonas syringae pv. glycines, and Pseudomonas fluorescens. Supervised by IMAN RUSMANA and ALINA AKHDIYA. Leaf blight disease caused by bacterial plant pathogen such as X. oryzae pv. oryzae and P. syringae pv. glycines had deathly effect to plants. The pathogens can be controlled by biological control using P. fluorescens or antimicrobial substances. The research studied the inhibition ability and production of antimicrobial substances produced by Bacillus sp. againts bacterial plant pathogen such as X. oryzae pv. oryzae, P. syringae pv. glycines, and biological control P. fluorescens. As many as 31 Bacillus sp. isolates isolated from forest soil was determined their antimicrobial activity against indicator bacteria using double layer method. The result showed that 13 isolates was able to inhibit Staphylococcus aureus, Eschericia coli, and X. oryzae pv. oryzae growth, 8 isolates could inhibit P. fluorescens A growth, 9 isolates could inhibit P. fluorescens B growth, and 8 isolates could inhibit P. syringae pv. glycines growth. Bacillus sp. F13 had the fastest inhibition and good efficiency against all indicator bacteria. Mixed culture competition test showed that this isolate had a broad spectrum inhibition activity, it was able to inhibit Gram positive and Gram negative bacteria. The isolate could inhibit growth of P. syringae pv. glycines and X. oryzae pv. oryzae up to 100%. The antimicrobial substance the isolate was produced in the late logarithmic growth phase.
AKTIVITAS PENGHAMBATAN Bacillus sp. TERHADAP Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Pseudomonas syringae pv. glycines, DAN Pseudomonas fluorescens
KARTIKA FINDY
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
Judul
Nama NRP
: Aktivitas Penghambatan Bacillus sp. terhadap Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Pseudomonas syringae pv. glycines, dan Pseudomonas fluorescens : Kartika Findy : G34051437
Disetujui Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si NIP. 19650720 199103 1 002
Alina Akhdiya, M.Si NIP. 080 130 418
Diketahui Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
Dr. Drh. Hasim, DEA NIP. 19610328 198601 1 002
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala nikmat dan anugerah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul Aktivitas Penghambatan Bacillus sp. terhadap Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Pseudomonas syringae pv. glycines, dan Pseudomonas fluorescens. Penelitian ini telah dilaksanakan dari bulan Februari sampai Mei 2009 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Terima kasih penulis ucapkan kepada bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si selaku pembimbing utama dan ibu Alina Akhdiya, M.Si selaku pembimbing kedua. Ucapan terima kasih penulis juga disampaikan kepada Anggota IR Crew yaitu Ade Satria, Puji Purwanti, Dina D, Bonardo, dan Nurlia Valestine serta kepada teman-teman seperjuangan di lababoratorium Mikrobiologi (Amarylis, Bram, Una, Meli, Yurin, Adi sasono, Hirmas). Terima kasih untuk Ibu Maya, Ibu Nana, Pak Umar, Mba Emma, Bang Jo yang telah banyak membantu dalam kegiatan penelitian serta laboran mikrobiologi (Pak Jaka, Mba Heni, dkk). Ucapan khusus untuk Bambang Padmadi yang selalu memberikan semangat. Dan pihak lain yang tidak dapat disebutkan satu-persatu terima kasih atas kebersamaannya selama penelitian dan tidak lupa kepada teman-teman biologi 42 atas kehangatan dan kekompakannya. Penghargaan setinggi-tingginya penulis sampaikan kepada kedua orang tua dan kakak tercinta atas perhatian, kasih sayang dan doanya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi para pembaca dan bagi ilmu pengetahuan khususnya bidang Biologi.
Bogor, Agustus 2009
Kartika Findy
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta, DKI Jakarta pada tanggal 20 Desember 1987 dari ayahanda Faisal Anwar dan ibunda Nenden Yulia O. Penulis merupakan anak ketiga dari tiga bersaudara. Tahun 2005 penulis lulus dari SMU Negeri 12 Jakarta dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB) pada Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA). Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah mengikuti kegiatan Praktik Lapangan di Laboratorium Mikrobiologi Rumah Sakit Islam Jakarta Pondok Kopi (RSIJPK) selama periode Juli sampai dengan Agustus 2008 dengan judul Deteksi Penyakit Tuberkulosis Di Laboratorium Klinik Rumah Sakit Islam Jakarta Pondok Kopi. Disamping itu penulis aktif menjadi pengurus Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO), staf BioWorld periode 2006/2007 dan staf Wahana Muslim HIMABIO (WMH) periode 2007/2008, asisten praktikum mata kuliah Biologi Dasar untuk mahasiswa TPB tahun ajaran 2006/2009. Penulis juga pernah menjadi pengajar “Be Expert” Biologi untuk mahasiswa TPB tahun ajaran 2008.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... ix DAFTAR TABEL .............................................................................................. ix DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................... ix PENDAHULUAN ............................................................................................... 1 Latar Belakang ............................................................................................... 1 Tujuan............................................................................................................ 1 Waktu dan Tempat Penelitian ......................................................................... 1 BAHAN DAN METODE .................................................................................... 1 Bahan............................................................................................................. 1 Metode........................................................................................................... 1 Penumbuhan dan Penyimpanan Bakteri .................................................... 1 Seleksi Isolat Bacillus sp. yang Berpotensi Menghambat Pertumbuhan Bakteri Uji ............................................................................................... 2 Uji Kompetisi ........................................................................................... 2 Waktu Optimum Produksi Senyawa Antimikrob Isolat Bacillus sp. .......... 2 HASIL ................................................................................................................. 3 Seleksi Isolat Bacillus sp. yang Berpotensi Menghambat Pertumbuhan Bakteri Uji.................................................................................................................. 3 Uji Kompetisi................................................................................................. 5 Waktu Optimum Produksi Senyawa antimikrob Isolat Bacillus sp. ................. 9 PEMBAHASAN .................................................................................................. 9 SIMPULAN ...................................................................................................... 12 SARAN ............................................................................................................. 12 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 12 LAMPIRAN ...................................................................................................... 14
DAFTAR GAMBAR 1
Halaman Zona hambat disekitar 3 koloni isolat Bacillus terpilih terhadap bakteri uji .... 4
2 Persentase penghambatan pertumbuhan bakteri uji oleh isolat Bacillus sp. A21 pada uji kompetisi ................................................................................ 6 3 Dinamika populasi bakteri uji pada uji kompetisi dengan isolat Bacillus sp. A21 .............................................................................................................. 6 4 Persentase penghambatan pertumbuhan bakteri uji oleh isolat Bacillus sp. F13 ............................................................................................................... 7 5
Dinamika populasi bakteri uji pada uji kompetisi dengan isolat Bacillus sp. F13 ............................................................................................................... 7
6 Persentase penghambatan pertumbuhan bakteri uji oleh isolat Bacillus sp. G3 pada uji kompetisi ................................................................................... 8 7
Dinamika populasi bakteri uji pada uji kompetisi dengan isolat Bacillus sp. G3 ................................................................................................................. 8
8
Aktivitas antimikrob supernatan kultur Bacillus sp. F13 selama inkubasi terhadap bakteri uji........................................................................................ 9
DAFTAR TABEL Halaman 1 Penghambatan pertumbuhan S. aureus dan E. coli oleh isolat Bacillus sp. pada media NA..................................................................................................... 3 2 Penghambatan pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae dan P. syringae pv. glycines oleh isolat Bacillus sp. pada media TSA ........................................................ 4 3
Penghambatan pertumbuhan P. fluorescens A dan B oleh isolat Bacillus sp. pada media TSA............................................................................................ 4
4 Indeks Penghambatan pertumbuhan bakteri uji oleh 3 isolat Bacillus sp. terpilih .......................................................................................................... 5
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. terhadap populasi sel bakteri uji dalam uji kompetisi ..................................................................................... 15 2
Persentase penghambatan isolat Bacillus sp. terhadap bakteri uji ............... 16
3
Populasi sel isolat Bacillus sp. dan bakteri uji dalam kontrol positif dan negatif untuk uji kompetisi .......................................................................... 17
x
4 Aktivitas antimikrob supernatan kultur isolat Bacillus sp. F13..................... 18
PENDAHULUAN Latar Belakang Xanthomonas oryzae pv. oryzae dan Pseudomonas syringae pv. glycines merupakan bakteri patogen terhadap tanaman. Kedua bakteri ini menyebabkan leaf blight, yaitu penyakit busuk daun, dimana daun mengalami bercak-bercak coklat, menjadi layu dan mati. Penyakit ini menyerang daun padi yang disebabkan oleh X. oryzae pv. oryzae (Suparyono et al 2003) dan daun kedelai yang disebabkan oleh P. syringae pv. glycines (Dirmawati 2005). Berbagai usaha penanggulangan penyakit ini telah banyak dilakukan, diantaranya dengan menggunakan bahan kimia sintetik (paraben, asam benzoat, nitrit, dan lain-lain) ataupun aplikasi pestisida berbahan dasar senyawa antibiotik (Agrep) (Asman 1996). Pengggunaan antibiotik dan bahan kimia dalam penanganan penyakit tanaman dapat menyebabkan resistensi pada bakteri, menimbulkan residu dan pencemaran lingkungan. Oleh karena itu, perlu adanya alternatif biokontrol seperti aplikasi campuran mikroba pengendali hayati. Agen pengendali hayati yang sudah sering digunakan diantaranya adalah P. fluorescens dan Bacillus subtilis (Supriadi 2006). Formulasi campuran kedua bakteri tersebut telah diaplikasikan untuk mengendalikan penyakit pustul bakteri kedelai yang disebabkan oleh X. campestris pv. glycines (Dirmawati 2005). Kemampuan Bacillus dalam mengendalikan bakteri patogen tanaman disebabkan oleh senyawa antimikrob yang diproduksinya. Menurut Irina et al. (2001), genus Bacillus sp. dapat memproduksi substansi antimikrob berupa bakteriosin dan antibiotik berupa basitrasin. Bakteriosin merupakan senyawa antimikrob polipeptida yang disintesis di ribosom dan biasanya hanya menghambat galur-galur bakteri yang berkerabat dekat dengan bakteri penghasil bakteriosin tersebut (Jack et al. 1995). Sedangkan antibiotik disintesis melalui serangkaian reaksi multi enzim yang dihasilkan selama fase pertumbuhan stasioner (Williams et al 1996). Beberapa isolat Bacillus sp. koleksi laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA IPB diketahui mampu menghambat pertumbuhan Eschericia coli dan Staphylococcus aureus (Sopyan & Findy 2007). Kedua bakteri tersebut merupakan bakteri standar uji untuk
menentukan spektrum penghambatan antimikrob terhadap bakteri Gram positif dan Gram negatif. Namun, aktivitas antimikrobnya terhadap patogen tanaman seperti X. oryzae pv. oryzae dan P. syringae pv. glycines, serta uji kompetisi dengan agen biokontrol P. fluorescens belum diketahui. Tujuan Penelitian ini bertujuan mempelajari kemampuan penghambatan dan penentuan waktu optimum produksi senyawa antimikrob isolat-isolat Bacillus sp. terhadap bakteri patogen tanaman X. oryzae pv. oryzae, P. syringae pv. glycines, dan agen biokontrol P. fluorescens. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Februari sampai dengan Mei 2009 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi FMIPA IPB. BAHAN DAN METODE Bahan Bakteri yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari 13 isolat Bacillus sp., 2 bakteri standar uji aktivitas antimikrob (E. coli dan S. aureus), 2 bakteri patogen tanaman (X. oryzae pv. oryzae dan P. syringae pv. glycines) dan 2 isolat P. fluorescens (isolat A dan B). Isolat-isolat Bacillus tersebut diisolasi dari dari tanah Wanawisata Cangkuang Sukabumi pada kegiatan Studi Lapangan jurusan Biologi pada tahun 2007. Semua isolat Bacillus sp., E. coli dan S. aureus merupakan bakteri koleksi dari Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA IPB. Sedangkan 4 bakteri lainnya diperoleh dari Laboratorium Fitopatologi, Balai BesarBioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian (BB-BIOGEN). Media nutrisi yang digunakan untuk pertumbuhan bakteri ialah Trypticase Soy Broth (TSB 30 g/l), Nutrient Agar (NA: 8 g/l NB, agar-agar 20 g/l), Trypticase Soy Agar (TSA: 30 g/l TSB, 20 g/l agar-agar), serta NA dan TSA semipadat yang dibuat dengan kandungan agar-agar 10 g/l. Metode Penumbuhan dan Penyimpanan Bakteri Isolat Bacillus sp. ditumbuhkan dan diremajakan pada media NA dan diinkubasi pada suhu ruang (29-31 ºC) selama dua hari.
2
Sedangkan bakteri uji ditumbuhkan pada media TSA atau TSB lalu diinkubasi pada suhu ruang (29-31 ºC) selama tiga hari. Stok kultur bakteri disimpan dalam refigerator pada suhu (6-8 ºC) pada media yang sama. Seleksi Isolat Bacillus sp. yang Berpotensi Menghambat Pertumbuhan Bakteri Uji Seleksi isolat Bacillus sp. dilakukan dengan uji antagonis terhadap 2 bakteri yang menjadi standar uji senyawa antimikroba (E. coli, S. aureus), 2 bakteri patogen tanaman (X. oryzae pv. oryzae, dan P. syringae pv. glycines), dan 2 isolat biokontrol (P. Flourescens A dan B). Uji dilakukan menggunakan metode double layer (Lisboa et al. 2006). Metode ini memungkinkan senyawa antimikrob yang dihasilkan dapat berfusi dengan baik pada media semipadat sehingga didapat zona bening yang terlihat jelas. Zona bening tersebut merupakan bagian media yang tidak dapat ditumbuhi oleh bakteri uji karena adanya difusi senyawa antimikrob yang dihasilkan oleh Bacillus sp. Sebanyak 500 µl (107 cfu/ml) kultur cair bakteri uji diinokulasikan ke dalam 50 ml TSA semipadat lalu dituang pada permukaan cawan TSA padat masingmasing sebanyak 10 ml. Setelah permukaan media TSA double layer memadat, isolat Bacillus sp. yang berumur dua hari ditotolkan dengan menggunakan tusuk gigi steril lalu diinkubasi pada suhu 30 ºC. Pengamatan dan pengukuran zona bening dilakukan setelah 48 jam untuk uji terhadap E. coli dan S. aureus. Sedangkan pengamatan untuk uji terhadap 4 bakteri uji lainnya dilakukan setelah 72 jam inkubasi. Indeks penghambatan dihitung dengan cara sebagai berikut: Ø zona bening – Ø koloni IP = Ø zona koloni Keterangan: Ø zona bening = diameter zona bening (cm) Ø koloni = diameter koloni (cm) Isolat-isolat yang memiliki nilai IP besar terhadap X. oryzae pv. oryzae dipilih untuk uji selanjutnya. Uji Kompetisi Uji kompetisi dilakukan dengan cara menumbuhkan masing-masing bakteri uji (X. oryzae pv. oryzae, P. syringae pv.
glycines, dan P. fluorescens) dan isolat Bacillus terpilih dalam satu kultur cair TSB. Setiap pasang bakteri uji dan isolat Bacillus sp. dibuat satu seri uji kompetisi terdiri dari 4 Erlenmeyer yang diberi nomor II-V. Sebagai kontrol negatif digunakan Erlenmeyer yang diberi nomor I, sedangkan kontrol positif dibuat pada Erlenmeyer bernomor VI. Untuk setiap bakteri uji dibuat satu kontrol negatif. Demikian pula untuk setiap isolat Bacillus sp. dibuat satu kontrol positif. Sebanyak 100 µl (107 cfu/ml) kultur bakteri uji diinokulasikan ke dalam Erlenmeyer berisi 50 ml media TSB. Pada Erlenmeyer II, III, IV, V masing-masing ditambahkan 100, 200, 400, dan 1000 µl kultur Bacillus sp. umur 48 jam sehingga diperoleh kultur campuran dengan rasio antara masing-masing bakteri uji dan Bacillus sp. 1:1, 1:2, 1:4, dan 1:10 (v/v). Kontrol negatif (I) dibuat dengan menginokulasi media yang sama dengan 100 µl bakteri uji, sedangkan untuk kontrol positif (VI) media diinokulasi dengan 100 µl Bacillus sp.. Semua kultur tersebut diinkubasi sampai 72 jam pada suhu ruang. Pada umur 24, 48, dan 72 jam dilakukan pengambilan sampel sebanyak 0.1 ml untuk dihitung populasi sel Bacillus sp. dan bakteri uji. Penghitungan populasi sel masingmasing bakteri dilakukan dengan metode cawan sebar pada media TSA. Persentase penghambatan dihitung dengan cara sebagai berikut: % Penghambatan = A–B x 100% A Keterangan: A = Populasi sel bakteri uji pada kontrol B = Populasi sel bakteri uji pada perlakuan Waktu Optimum Produksi Senyawa Antimikrob Isolat Bacillus sp. Sebanyak satu ose biakan Bacillus sp. diinokulasikan ke dalam 50 ml media TSB lalu diinkubasikan pada suhu ruang sambil dikocok pada kecepatan 94 rpm. Setelah 6 jam, diambil 2 ml kultur untuk diinokulasikan ke dalam 200 ml media TSB yang baru, lalu diinkubasi selama 72 jam. Setiap 12 jam dilakukan pengambilan kultur hingga inkubasi ke 72 jam. Kultur tersebut diambil 6.5 ml untuk pengukuran OD600 sebanyak 5 ml dan sisanya digunakan untuk uji aktivitas antimikrob yang terkandung dalam supernatan. Pemisahan supernatan dan massa sel dilakukan dengan cara
3
sentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Sebanyak 30 µl supernatan diteteskan pada kertas cakram (d=6 mm) steril lalu dibiarkan kering udara. Kertas cakram yang telah kering diletakkan pada permukaan cawan TSA double layer yang telah diinokulasi dengan bakteri uji. Kemudian cawan-cawan tersebut diinkubasi pada suhu 30 °C. Setelah 72 jam dilakukan pengukuran diameter zona bening yang terbentuk di sekitar kertas cakram. HASIL Seleksi Isolat Bacillus sp. yang Berpotensi Menghambat Pertumbuhan Bakteri Uji Seleksi untuk mengetahui potensi daya hambat isolat-isolat Bacillus sp. dilakukan dengan cara uji antagonis terhadap bakteri uji yaitu, S. aureus, E. coli, X. oryzae pv. oryzae, P. syringae pv. glycines, dan P. fluorescens (A dan B). Hasil seleksi menunjukkan 13 isolat mampu menghambat S. aureus, E. coli, dan X. oryzae pv. oryzae. E. coli dan S. aureus merupakan bakteri standar untuk pengujian aktivitas antimikrob. Penggunaan kedua bakteri tersebut bertujuan mengetahui spektrum aktivitas antimikrob Bacillus sp. yang diseleksi. Hasil uji terhadap kedua bakteri tersebut menunjukkan bahwa spektrum aktivitas antimikrob Bacillus
tersebut meliputi bakteri Gram positif (S. aureus) dan Gram negatif (E. coli). Isolat Bacillus sp. F14 memiliki daya hambat paling kuat terhadap S. aureus dengan IP 2.50. Sedangkan E. coli dihambat dengan kuat oleh isolat Bacillus sp. G2 dengan IP 5.00 (Tabel 1). Isolat Bacillus sp. F13 menghambat paling kuat terhadap X. oryzae pv. oryzae dengan IP 2.33 (Tabel 2). Dari 13 isolat Bacillus tersebut, 8 isolat mampu menghambat P. syringae pv. glycines (Tabel 2), 8 isolat mampu menghambat P. fluorescens A dan 9 isolat mampu menghambat P. fluorescens B (Tabel 3). Untuk uji selanjutnya dipilih 3 isolat yang memiliki Indeks Penghambatan (IP) paling tinggi terhadap X. oryzae pv. oryzae. Ketiga isolat tersebut adalah isolat A21, F13, dan G3 (Gambar 1). Isolat Bacillus sp. A21 mampu menghambat X. oryzae pv. oryzae, P. syringae pv. glycines, dan P. fluorescens A dan B dengan IP berturut-turut 2.00, 2.33, 4.00 dan 1.00. Isolat Bacillus sp. F13 mampu menghambat X. oryzae pv. oryzae, P. syringae pv. glycines, dan P. fluorescens A dan B dengan IP berturut-turut 2.33, 0.50, 1.00 dan 1.00. Isolat Bacillus sp. G3 mampu menghambat X. oryzae pv. oryzae, P. syringae pv. glycines, dan P. fluorescens B dengan IP berturut-turut 2.00, 0.30, dan 1.00 (Tabel 4).
Tabel 1 Penghambatan pertumbuhan S. aureus dan E. coli oleh isolat Bacillus sp. pada media NA S. aureus1
E. coli1
Isolat Ø koloni (cm)
Ø zona bening (cm)
IP ± SE
Ø koloni (cm)
Ø zona bening (cm)
IP ± SE
A11
0.50
0.80
0.60 ± 0.26
0.20
0.60
2.00 ± 0.47
A12
0.30
0.60
1.00 ± 0.24
0.30
1.00
2.33 ± 0.59
A13
0.30
0.80
1.67 ± 0.53
0.40
0.80
1.00 ± 0.09
A14
0.40
0.60
0.50 ± 0.18
0.40
0.60
0.50 ± 0.18
A21
0.30
0.80
1.67 ± 0.59
0.40
1.30
2.25 ± 0.71
A22
0.30
0.80
1.67 ± 0.59
0.30
1.00
2.33 ± 0.74
A23
0.40
0.80
1.00 ± 0.35
0.40
0.50
0.25 ± 0.44
F12
0.20
0.40
1.00 ± 0
0.20
0.40
1.00 ± 0.35
F13
0.10
0.20
1.00 ± 0
0.20
0.60
2.00 ± 0.71
F14
0.40
1.40
2.50 ± 0
0.50
0.60
0.20 ± 0.05
G2
0.50
0.80
0.60 ± 0.12
0.20
1.20
5.00 ± 0
G3
0.80
1.00
0.25 ± 0.27
0.20
0.30
0.50 ± 0
G4
0.70
1.00
0.43 ± 0.15
0.30
0.60
1.00 ± 0.35
keterangan: IP = Indeks Penghambatan; SE = standar eror (nilai rataan ± SE, n = 2); 1 = Inkubasi selama 2 hari
4
F13 F13
F13 G3
G3 A21 (a)
G3 A21
A21
(b)
(c)
Gambar 1 Zona hambat disekitar 3 koloni isolat Bacillus terpilih terhadap bakteri uji (a) X. oryzae pv. oryzae, (b) P. syringae pv. glycines dan (c) P. fluorescens B. Tabel 2 Penghambatan pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae dan P. syringae pv. glycines oleh isolat Bacillus sp. pada media TSA X. oryzae pv. oryzae2
P. syringae pv. glycines2
Isolat Ø koloni (cm)
Ø zona bening (cm)
IP ± SE
Ø koloni (cm)
Ø zona bening (cm)
IP ± SE
A11
0.30
0.70
1.33 ± 0.17
0.25
0.70
1.80 ± 0
A12
0.30
0.50
0.67 ± 0.06
0.20
0.30
0.33 ± 0.01
A13
0.40
0.60
0.50 ± 0.18
0.20
0.60
2.00 ± 0.12
A14
0.40
0.50
0.25 ± 0.44
-
-
-
A21
0.30
0.90
2.00 ± 0.35
0.30
1.00
2.33 ± 0.29
A22
0.20
0.50
1.50 ± 0.49
-
-
-
A23
0.30
0.30
1.00 ± 0.23
-
-
-
F12
0.30
0.60
1.00 ± 0.12
0.30
0.50
0.67 ± 0.24
F13
0.30
1.00
2.33 ± 0.27
0.20
0.30
0.50 ± 0.18
F14
0.20
0.35
0.75 ± 0
0.20
0.50
1.50 ± 0.53
G2
0.30
0.40
0.33 ± 0.94
-
-
-
G3
0.30
0.90
2.00 ± 0.47
0.30
0.40
0.30 ± 0.01
G4
0.20
0.50
1.50 ± 1.41
-
-
-
keterangan: IP = Indeks Penghambatan; (-) = tidak ada penghambatan; SE = standar eror (nilai rataan ± SE, n = 2); 2 = Inkubasi selama 3 hari Tabel 3 Penghambatan pertumbuhan P. fluorescens A dan B oleh isolat Bacillus sp. pada media TSA P. fluorescens A2
P. fluorescens B 2
Isolat Ø koloni (cm)
Ø zona bening (cm)
IP ± SE
Ø koloni (cm)
Ø zona bening (cm)
IP ± SE
A11
-
-
-
0.40
0.60
0.50 ± 0.18
A12
-
-
-
0.40
0.70
0.75 ± 0.09
A13
-
-
-
0.30
0.70
1.33 ± 0.12
A14
0.20
0.40
1.00 ± 0.01
0.30
0.60
1.00 ± 0.18
A21
0.20
1.00
4.00 ± 0
0.30
1.00
1.00 ± 0
A22
-
-
-
-
-
-
A23
0.70
1.00
0.43 ± 0
-
-
-
F12
0.20
0.40
1.00 ± 0.02
-
-
-
F13
0.20
0.40
1.00 ± 0
0.30
0.60
1.00 ± 0
F14
0.30
0.40
0.33 ± 0.01
0.20
0.30
0.50 ± 0.18
G2
0.80
0.90
0.13 ± 0
0.30
0.80
1.67 ± 0.12
G3
-
-
-
0.30
0.60
1.00 ± 0.09
0.40
0.60
0.50 ± 0.01
-
-
-
G4
keterangan: IP = Indeks Penghambatan; (-) = tidak ada penghambatan; SE = standar eror (nilai rataan ± SE, n = 2); 2 = Inkubasi selama 3 hari
5
Tabel 4 Indeks Penghambatan pertumbuhan bakteri uji oleh 3 isolat Bacillus sp. terpilih Isolat
S. aureus1
E. coli1
X. oryzae pv. oryzae2
P. syringae pv. glycines2
P. fluorescens B2
A21
1.67
2.25
2
2.33
4.00
F13
1.00
1.00
2.33
0.50
1.00
0.25
0.50
2.00
0.30
1.00
G3
1
keterangan: = Inkubasi selama 2 hari;
2
= Inkubasi selama 3 hari
Uji Kompetisi Uji kompetisi isolat Bacillus sp. terpilih A21, F13, dan G3 terhadap tiga bakteri uji (X. oryzae pv. oryzae, P. syringae pv. glycines, dan P. fluorescens B) dalam kultur campuran menunjukkan bahwa ketiga isolat Bacillus sp. tersebut mampu menghambat bakteri uji dengan daya hambat yang berbeda-beda. Hal ini terlihat dari populasi sel bakteri uji pada Erlenmeyer II, III, IV, dan V lebih rendah dibandingkan kontrol negatifnya (bakteri uji tanpa isolat Bacillus sp.) (Lampiran 1). Isolat Bacillus sp. A21 mampu menghambat bakteri uji pada setiap rasio inokulum dengan persen penghambatan di atas 85%. Daya hambat isolat Bacillus sp. A21 terhadap X. oryzae pv. oryzae paling kuat saat rasio inokulum 1:2. Dalam waktu 24 jam populasi sel X. oryzae pv. oryzae berkurang 97.17% (Gambar 2b) dan pada akhir pengamatan (72 jam) populasi sel X. oryzae pv. oryzae sudah tidak terdeteksi (Gambar 3a). Hasil uji kompetisi Bacillus sp. A21 terhadap P. syringae pv. glycines menunjukkan perbedaan rasio inokulum tidak berbeda nyata terhadap aktivitas penghambatan. Persen penghambatannya mencapai 100% untuk setiap rasio inokulum sampai akhir pengamatan (Gambar 3b). Daya hambat isolat Bacillus sp. A21 terhadap P. fluorescens B paling kuat saat rasio inokulum 1:1. Dalam waktu 24 jam populasi sel P. fluorescens B berkurang 96.39% (Gambar 2a) dan pada akhir pengamatan (72 jam) populasi sel P. fluorescens B berkurang sebesar 97.73% (Gambar 3c). Diantara ketiga bakteri uji tersebut, isolat Bacillus sp. A21 mampu menghambat P. syringae pv. glycines paling kuat dibandingkan dengan bakteri uji lainnya pada setiap rasio inokulum. Isolat Bacillus sp. F13 mampu menghambat bakteri uji pada setiap rasio inokulum dengan persen penghambatan di atas 85%. Daya hambat isolat Bacillus sp. F13 terhadap X. oryzae pv. oryzae paling
kuat saat rasio inokulum 1:4. Dalam waktu 24 jam populasi sel X. oryzae pv. oryzae berkurang 99.62% (Gambar 4c). Namun, saat inkubasi 48 dan 72 jam populasi sel X. oryzae pv. oryzae mengalami peningkatan untuk setiap rasio inokulum (Gambar 5a). Hasil uji kompetisi Bacillus sp. F13 terhadap P. syringae pv. glycines menunjukkan perbedaan rasio inokulum tidak berbeda nyata terhadap aktivitas penghambatan (Gambar 5b). Daya hambat isolat Bacillus sp. F13 terhadap P. fluorescens B paling kuat saat rasio inokulum 1:10 dengan persen penghambatan mencapai 100% (Gambar 4d). Dalam waktu 24 jam populasi sel P. flourescens B sudah tidak terdeteksi. Namun, ketika inkubasi ke 48 dan 72 jam, populasi sel P. fluorescens B meningkat untuk setiap rasio inokulum (Gambar 5c). Diantara ketiga bakteri uji tersebut, isolat Bacillus sp. F13 mampu menghambat P. syringae pv. glycines paling kuat dibandingkan dengan bakteri uji lainnya pada setiap rasio inokulum. Isolat Bacillus sp. G3 dapat menghambat bakteri uji pada setiap rasio inokulum dengan persen penghambatan di atas 85%. Daya hambat isolat Bacillus sp. G3 terhadap X. oryzae pv. oryzae paling kuat saat rasio inokulum 1:1 (Gambar 6a). Pada setiap inkubasi populasi sel X. oryzae pv. oryzae berkurang 98.30% (Gambar 7a). Hasil uji kompetisi isolat Bacillus sp. G3 terhadap P. syringae pv. glycines menunjukkan perbedaan rasio inokulum tidak berbeda nyata terhadap aktivitas penghambatan (Gambar 7b). Daya hambat isolat Bacillus sp. G3 terhadap P. fluorescens B paling kuat saat rasio inokulum 1:2. Persen penghambatannya sebesar 96.99% pada setiap waktu inkubasi (Gambar 6b). Diantara ketiga bakteri uji tersebut, isolat Bacillus sp. G3 mampu menghambat P. syringae pv. glycines paling kuat dibandingkan dengan bakteri uji lainnya pada setiap rasio inokulum.
6
8
90 85 80
6 4
9
Populasi sel
95
(x10 cfu/ml)
Penghambatan (% )
100
2
24
48 72 Waktu Inkubasi (jam) A21+Xanthomonas oryzae pv oryzae A21+Pseudomonas syringae pv glycines A21+Pseudomonas fluorescens B
0 0
12
24
(a) 100
Penghambatan (% )
36
48
60
72
Waktu Inkubasi (jam) 1:1 1:2 1:4 1:10
(a)
95 90
8
48 72 Waktu Inkubasi (jam) A21+Xanthomonas oryzae pv oryzae A21+Pseudomonas syringae pv glycines A21+Pseudomonas flourescens B
9
24
(x10 cfu/ml)
80
Populasi sel
85
6 4 2
Penghambatan (% )
(b) 0
100
0
12
95 90
24 36 48 60 Waktu Inkubasi (jam) 1:1 1:2 1:4 1:10
85
72
(b)
80 72
Penghambatan (% )
(c) 100
(x10 cfu/ml)
A21+Xanthomonas oryzae pv oryzae A21+Pseudomonas syringae pv glycines A21+Pseudomonas fluorescens B
8
9
48 Waktu Inkubasi (jam)
Populasi sel
24
6 4 2
95
0 90
0
85 80 24
48 72 Waktu Inkubasi (jam) A21+Xanthomonas oryzae pv oryzae A21+Pseudomonas syringae pv glycines A21+Pseudomonas fluorescens B
(d) Gambar 2 Persentase penghambatan pertumbuhan bakteri uji oleh isolat Bacillus sp. A21 pada uji kompetisi dengan rasio inokulum (a) 1:1, (b) 1:2, (c) 1:4, dan (d) 1:10. (data menunjukkan nilai rataan ± SE, n = 2).
12
24 36 48 60 Waktu Inkubasi (jam) 1:1 1:4
72
1:2 1:10
(c) Gambar 3 Dinamika populasi (a) X. oryzae pv. oryzae, (b) P. syringae pv. glycines, dan (c) P. fluorescens B pada uji kompetisi dengan isolat Bacillus sp. A21. (data menunjukkan nilai rataan ± SE, n = 2).
100
8
85 80 24
48 Waktu Inkubasi (jam)
72
6
9
90
(x10 cfu/ml)
95
Populasi sel
Pengahambatan (%)
7
4 2 0
F13+Xanthomonas oryzae pv oryzae F13+Pseudomonas syringae pv glycines F13+Pseudomonas fluorescens B
0
12
48
1:1 1:4
100
60
72
1:2 1:10
95
(a)
90
8 24
48 Waktu Inkubasi (jam)
72
F13+Xanthomonas oryzae pv oryzae F13+Pseudomonas syringae pv glycines F13+Pseudomonas fluorescens B
9
80
(x10 cfu/ml)
85
Populasi sel
Penghambatan (% )
36
Waktu Inkubasi (jam)
(a)
(b)
6 4 2 0 0
100 Penghambatan (% )
24
12
24
36
48
60
72
Waktu Inkubasi (jam) 1:1 1:2
95 90
1:4
1:10
85
(b)
80 72
(c) Penghambatan (% )
100
8 (x10 cfu/ml)
F13+Xanthomonas oryzae pv oryzae F13+Pseudomonas syringae pv glycines F13+Pseudomonas fluorescens B
6
9
48 Waktu Inkubasi (jam)
Populasi sel
24
4 2
95
0 90
0
85
12
24
36
48
60
72
Waktu Inkubasi (jam)
80 24
48 72 Waktu Inkubasi (jam) F13+Xanthomonas oryzae pv oryzae F13+Pseudomonas syringae pv glycines F13+Pseudomonas fluorescens B
(d) Gambar 4 Persentase penghambatan pertumbuhan bakteri uji oleh isolat Bacillus sp. F13 pada uji kompetisi dengan rasio inokulum (a) 1:1, (b) 1:2, (c) 1:4, dan (d) 1:10. (data menunjukkan nilai rataan ± SE, n = 2).
1:1
1:2
1:4
1:10
(c) Gambar 5 Dinamika populasi (a) X. oryzae pv. oryzae, (b) P. syringae pv. glycines, dan (c) P. fluorescens B pada uji kompetisi dengan isolat Bacillus sp. F13. (data menunjukkan nilai rataan ± SE, n = 2).
8
85
9
90
(x10 cfu/ml)
8
95
Populasi sel
Penghambatan (%)
100
6 4 2
80 24
48 Waktu Inkubasi (jam)
0
72
0
12
G3+Xanthomonas oryzae pv oryzae G3+Pseudomonas syringae pv glycines G3+Pseudomonas fluorescens B
24
36
1:1 1:4
100
72
1:2 1:10
(a)
95
8
80 24
48 72 Waktu Inkubasi (jam) G3+Xanthomonas oryzae pv oryzae G3+Pseudomonas syringae pv glycines G3+Pseudomonas fluorescens B
9
85
(x10 cfu/ml)
90
Populasi sel
Penghambatan (%)
60
Waktu Inkubasi (jam)
(a)
6 4 2 0 0
(b)
12
24
36
48
60
72
Waktu Inkubasi (jam)
100 Penghambatan (% )
48
95
1:1
1:2
1:4
1:10
90
(b)
85 80 48
72
Waktu Inkubasi (jam) G3+Xanthomonas oryzae pv oryzae G3+Pseudomonas syringae pv glycines G3+Pseudomonas fluorescens B
(c) Penghambatan (% )
100 95
8 Populasi sel (x109 cfu/ml)
24
6 4 2 0 0
90
12
24
36
48
60
Waktu Inkubasi (jam)
85 80 24
48 Waktu Inkubasi (jam)
72
G3+Xanthomonas oryzae pv oryzae G3+Pseudomonas syringae pv glycines G3+Pseudomonas fluorescens B
(d) Gambar 6 Persentase penghambatan pertumbuhan bakteri uji oleh isolat Bacillus sp. G3 pada uji kompetisi dengan rasio inokulum (a) 1:1, (b) 1:2, (c) 1:4, dan (d) 1:10. (data menunjukkan nilai rataan ± SE, n = 2).
1:1 1:4
1:2 1:10
(c) Gambar 7 Dinamika populasi (a) X. oryzae pv. oryzae, (b) P. syringae pv. glycines, dan (c) P. fluorescens B pada uji kompetisi dengan isolat Bacillus sp. G3. (data menunjukkan nilai rataan ± SE, n = 2).
72
9
1
1.5
0.75
1
0.5
0.5
0.25
0
diameter zona hambat (cm)
Log populasi sel (cfu/ml)
2
0 0
12
24 36 48 60 Waktu Inkubasi (jam) Log populasi sel diameter zona hambat
72
(a) Log populasi sel (cfu/ml)
1.5
0.75
1
0.5
0.5
0.25
0
diameter zona hambat (cm)
1
2
0 0
12
24 36 48 60 Waktu Inkubasi (jam) Log populasi sel
72
diameter zona hambat
(b) 1
1.5
0.75
1
0.5
0.5
0.25
0
0 0
12
24 36 48 60 Waktu Inkubasi (jam) Log populasi sel diameter zona hambat
(c) Gambar 8 Aktivitas antimikrob supernatan kultur Bacillus sp. F13 selama inkubasi terhadap (a) X. oryzae pv. oryzae, (b) P. syringae pv. glycines, (c) P. fluorescens B. (data menunjukkan nilai rataan ± SE, n = 2). PEMBAHASAN Seleksi untuk mengetahui aktivitas antimikrob isolat-isolat Bacillus sp. dilakukan dengan uji antagonis terhadap 6 bakteri uji yaitu, E. coli, S. aureus, X. oryzae
72
diameter zona hambat (cm)
2 Log populasi sel (cfu/ml)
Waktu Optimum Produksi Senyawa antimikrob Isolat Bacillus sp. Optimasi waktu produksi antimikrob dilakukan terhadap 3 isolat Bacillus sp. terpilih yaitu, A21, F13, dan G3. Hasil uji aktivitas antimikob supernatan kultur menunjukkan hanya supernatan Bacillus sp. F13 yang membentuk zona bening pada uji tersebut. Plot nilai OD600 dan diameter zona bening terhadap waktu inkubasi, menghasilkan kurva produksi senyawa antimikrob selama pertumbuhan Bacillus sp. F13 (Gambar 8). Pengujian aktivitas antimikrob supernatan Bacillus sp. F13 terhadap X. oryzae pv. oryzae menunjukkan bahwa diameter zona bening terbesar (d=0.38 cm) dihasilkan dari kultur yang diambil pada umur 12 jam yaitu, ketika kultur berada pada akhir fase logaritmik. Zona bening yang paling luas menunjukkan waktu produksi senyawa antimikrob yang optimum. Diameter zona bening semakin mengecil ketika kultur berada pada awal fase stasioner (12-48 jam inkubasi). Aktivitas penghambatan sama sekali tidak terdeteksi (d=0 cm) pada pengamatan berikutnya (Gambar 8a). Pengujian aktivitas antimikrob supernatan Bacillus sp. F13 terhadap P. syringae pv. glycines menunjukkan bahwa diameter zona bening terbesar (d= 0.38 cm) dihasilkan dari kultur yang diambil pada umur 12 jam yaitu, ketika kultur berada pada akhir fase logaritmik. Aktivitas penghambatan sama sekali tidak terdeteksi (d=0 cm) pada pengamatan berikutnya (Gambar 8b). Pengujian aktivitas antimikrob supernatan Bacillus sp. F13 terhadap P. fluorescens B menunjukkan bahwa diameter zona bening terbesar (d=0.06 cm) dihasilkan dari kultur yang diambil pada umur 12 jam yaitu, ketika kultur berada pada akhir fase logaritmik. Diameter zona bening tidak mengalami perubahan ketika kultur berada pada awal fase stasioner (12-48 jam inkubasi) d=0.6 cm. Aktivitas penghambatan sama sekali tidak terdeteksi (d=0 cm) pada pengamatan berikutnya (Gambar 8c).
10
pv. oryzae, P. syringae pv. glycines, P. fluorescens A dan P. fluorescens B. Aktivitas penghambatan antimikrob ketiga Bacillus sp. tersebut memiliki spektrum yang luas, karena mampu menghambat bakteri Gram positif dan Gram negatif. Aktivitas antimikrob dalam uji antagonis ditunjukkan oleh adanya pembentukan zona bening disekitar koloni Bacillus sp. Pembentukan zona bening untuk E. coli dan S. aureus membutuhkan waktu inkubasi selama 2 hari, sedangkan untuk X. oryzae pv. oryzae, P. syringae pv. glycines, dan P. fluorescens B membutuhkan waktu inkubasi 3-4 hari. Perbedaan waktu pembentukan zona bening dipengaruhi oleh kecepatan pertumbuhan bakteri uji. Koloni E. coli dan S. aureus dapat teramati dalam waktu 24 jam sedangkan koloni X. oryzae pv. oryzae, P. syringae pv. glycines, P. fluorescens A dan P. fluorescens B teramati setelah inkubasi 3-4 hari. Hal ini dikarenakan, waktu generasi E. coli dan S. aureus lebih pendek daripada X. oryzae pv. oryzae, P. syringae pv. glycines, P. fluorescens A dan B. Waktu generasi adalah selang waktu yang dibutuhkan bagi sel untuk membelah diri atau untuk meningkatkan populasinya menjadi dua kali lipat (Pelczar & Chan 2006). Waktu generasi untuk E. coli dan S. aureus adalah 15-20 menit, sedangkan waktu generasi X. oryzae pv. oryzae, P. syringae pv. glycines, dan P. fluorescens berturut-turut adalah 4-5 jam, 2.6 jam, dan 2.8 jam (Pelczar & Chan 2006; Yamasaki et al 2006; West 2005; Klaus & Peter 1997). Metode double layer merupakan metode semi kuantitatif, karena data yang dihasilkan belum dapat dijadikan sebagai ukuran yang tepat. Oleh karena itu, aktivitas antimikrob dari ketiga isolat Bacillus sp. terpilih diamati lebih lanjut dengan uji kompetisi dalam kultur cair. Pada uji kompetisi, aktivitas antimikrob dari isolat terpilih diukur berdasarkan daya hambatnya terhadap pertumbuhan populasi sel bakteri uji. Daya hambat terhadap pertumbuhan populasi bakteri uji dinyatakan dalam persen penghambatan. Penghambatan pertumbuhan bakteri uji diantaranya disebabkan oleh adanya senyawa antimikrob yang diekskresikan oleh Bacillus ke dalam kultur. Salah satu contoh antimikrob yang dihasilkan oleh genus Bacillus adalah bakteriosin megacin yang diproduksi oleh B. megaterium dan antibiotik basitrasin yang
diproduksi oleh B. subtilis (Tagg et al 1976; Williams et al 1996). Menurut Verschuere et al. (2000) penghambatan pertumbuhan tidak selalu berkaitan dengan produksi senyawa antimikrob seperti antibiotik, tetapi juga karena adanya senyawa metabolit primer atau adanya perubahan pH. Uji kompetisi dilakukan pada beberapa rasio inokulum Bacillus sp. dan bakteri uji. Dari hasil pengamatan terhadap populasi sel bakteri uji, ternyata persen penghambatan ketiga isolat Bacillus tersebut terhadap pertumbuhan bakteri uji mencapai lebih dari 85% untuk semua rasio inokulum yang dicobakan. Hasil uji kompetisi menunjukkan bahwa isolat Bacillus sp. F13, G3, dan A21 mampu menghambat X. oryzae pv. oryzae, dengan kuat berturut-turut pada saat inkubasi 24 jam (99.62%), 24 jam (98.3%), dan 72 jam (100%). Isolat Bacillus sp. F13, G3, dan A21 mampu menghambat P. syringae pv. glycines dengan kuat saat inkubasi ke 24 jam (100%). Isolat Bacillus sp. F13, G3, dan A21 mampu menghambat P. fluorescens B dengan kuat berturut-turut saat inkubasi 24 jam (100%), 24 jam (96.99%), dan 48 jam (97.73%). Hal ini menunjukkan bahwa isolat Bacillus sp. F13 memiliki efisiensi dan efektifitas dalam pengendalian patogen tanaman. Ini terkait dengan mekanisme penyebaran penyakit pada tanaman yang cepat sehingga membutuhkan pengendalian yang efektif dan efisien dalam waktu dan hasil produksi. Ketiga isolat Bacillus sp. terpilih memiliki kemampuan penghambatan yang berbeda-beda terhadap ketiga bakteri uji. Perbedaan penghambatan terlihat dari lamanya waktu inkubasi yang dibutuhkan untuk menghambat bakteri uji. Semakin lama waktu inkubasi, daya hambat isolat Bacillus sp. A21 terhadap bakteri uji semakin meningkat. Hal ini terlihat setelah akhir pengamatan selama 72 jam, populasi sel dari bakteri uji mengalami penurunan. Populasi sel P. syringae pv. glycines yang dikompetisikan dengan Bacillus sp. A21 sangat rendah selama masa inkubasi pada berbagai rasio inokulum. Sementara, X. oryzae pv. oryzae dan P. fluorescens B populasi selnya mengalami penurunan sejalan dengan lamanya waktu inkubasi. Semakin lama waktu inkubasi daya hambat isolat Bacillus sp. F13 dan G3 terhadap bakteri uji semakin menurun. Hal ini terlihat setelah akhir pengamatan selama
11
72 jam, populasi sel dari bakteri uji mengalami peningkatan. Populasi sel P. syringae pv. glycines yang dikompetisikan dengan Bacillus sp. F13 dan G3 sangat rendah selama masa inkubasi pada berbagai rasio inokulum. Sementara pada X. oryzae pv. oryzae dan P. fluoresens B populasi sel mengalami peningkatan sejalan dengan lamanya waktu inkubasi. Ketiga isolat ini tidak dapat diaplikasikan untuk formulasi campuran agen hayati dengan P. fluorescens B. Hal ini dikarenakan, ketiga isolat Bacillus sp. ini dapat menekan pertumbuhan dari P. fluorescens B. Menurut Arwiyanto et al. (2007), pencampuran mikroba agen pengendali hayati harus memiliki kompatibilitas antar isolat, ini dimaksudkan untuk mendapatkan kombinasi antar isolat yang tidak saling menghambat satu dengan yang lain. Penghambatan ketiga isolat Bacillus sp. terhadap bakteri uji menunjukkan bahwa ketiga isolat tersebut dapat diaplikasikan di lingkungan sebagai agen pengendali hayati. Agen pengendali hayati Bacillus sp. diketahui mampu mengendalikan beberapa bakteri patogen tular tanah dan mampu memacu pertumbuhan tanaman serta menghasilkan antimikrob yang dapat menekan pertumbuhan berbagai patogen tanaman (Modjo 1991). Uji aktivitas antimikrob supernatan yang dilakukan menunjukkan hanya supernatan isolat Bacillus sp. F13 yang menghasilkan zona bening. Sedangkan supernatan 2 isolat lainnya (A21 dan G3) tidak membentuk zona bening. Hal ini bukan berarti kedua isolat tersebut tidak mengekskresikan senyawa antimikrob, karena pada uji antagonis kedua isolat tersebut mampu membentuk zona bening. Bakteriosin dapat dibedakan dari antibiotik, diantaranya dari proses produksinya. Bakteriosin dihasilkan pada saat pertumbuhan bakteri mencapai fase logaritmik, sedangkan antibiotik diproduksi pada saat akhir fase stasioner (Jack et al. 1995). Plot kurva pertumbuhan terhadap aktivitas antimikrob supernatan isolat Bacillus sp. F13 menunjukkan senyawa antikmikrob diproduksi optimum pada akhir fase logaritmik. Pada B. thuringiensis produksi bakteriosin juga terjadi pada fase pertumbuhan logaritmik (Torkar & Matijasic 2003). Produksi bakteriosin butyricin oleh Clostridium acetobutyricum terjadi pada
akhir fase logaritmik (Tagg et al. 1976), sedangkan pada C. perfringen produksi bakteriosin perfringocin terjadi pada awal fase stasioner (Clarke et al. 1975). Berdasarkan informasi tersebut diduga senyawa antimikrob yang dihasilkan olah isolat Bacillus sp. F13 adalah bakteriosin. Mekanisme kerja bakteriosin dalam menghambat pertumbuhan bakteri diantaranya adalah menghambat pembentukan dinding sel target, menghambat pembentukan asam nukleat atau protein, serta membentuk pori-pori pada membran sel target sehingga permeabilitas membran sel terganggu (Williams et al. 1996). Efektivitas bakteriosin tergantung pada konsentrasi bakteriosin, kemampuan ionisasi, suhu, pH, dan fase pertumbuhan sel indikator (Hurst 1981). Uji antagonis menunjukkan luas zona bening disekitar koloni Bacillus sp. A21, F13, dan G3 bertambah diameternya sampai pada pengamatan 48 jam. Namun, setelah inkubasi 72 jam diameter zona bening menjadi lebih kecil. Hal ini diduga karena inkubasi yang dilakukan lebih dari waktu optimum produksi senyawa antimikrob dalam media. Dajani dan Wannamaker (1969) melaporkan inkubasi terlalu lama menyebabkan aktivitas bakteriosin menurun, hal ini kemungkinan disebabkan diproduksinya inaktivator dan adanya reabsorbsi terhadap senyawa antimikrob yang diproduksi sel. Selain itu, menurut Jo et al. (1996) jika waktu inkubasi diperpanjang maka aktivitas bakteriosin akan menurun karena terbebasnya protease dari sel autolisis. Bakteriosin merupakan molekul protein sehingga mudah terdegradasi oleh protease. Bakteriosin diproduksi oleh bakteri Gram positif maupun bakteri Gram negatif (Jack et al. 1995). Sebagian besar bakteriosin dihasilkan oleh bakteri Gram positif terutama paling banyak diteliti ialah dari genus Bacillus. Beberapa jenis bakteriosin yang dihasilkan oleh Bacillus diantaranya ialah coagulin yang dihasilkan oleh B. coagulans I4 (Hyronimus et al. 1998). Bakteriosin Bacillus yang telah diaplikasikan dalam bidang industri ialah bacillocin 490 yang dihasilkan oleh B. liceniformis (Martirani et al. 2002). Pada mulanya aktivitas bakteriosin dinyatakan hanya menghambat spesies spesifik tetapi beberapa bakteriosin telah dibuktikan memiliki spektrum aktivitas penghambatan
12
yang luas sehingga dapat diaplikasikan secara luas di industri (Jack et al. 1995). SIMPULAN Sebanyak 31 isolat Bacillus sp. diseleksi daya hambatnya terhadap S. aureus, E. coli, X. oryzae pv. oryzae, P. syringae pv. glycines, dan 2 isolat P. fluorescens dengan metode double layer. Tigabelas isolat diantaranya menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap S. aureus, E. coli, dan X. oryzae pv. oryzae, 8 isolat mampu menghambat P. fluorescens A, 9 isolat mampu menghambat P. fluorescens B, dan 8 isolat mampu menghambat P. syringae pv. glycines. Terpilih 3 isolat Bacillus sp. yang memiliki Indeks Penghambatan (IP) paling tinggi terhadap X. oryzae pv. oryzae. Ketiga isolat tersebut adalah A21, F13, dan G3. Isolat Bacillus sp. F13 dan G3 lebih cepat dan efektif menekan pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae dan P. syringae pv. glycines dibandingkan Bacillus sp. A21. Isolat Bacillus sp. F13, G3, dan A21 mampu menekan pertumbuhan P. fluorescens. Sehingga, ketiga isolat Bacillus tersebut tidak dapat dibuat dalam bentuk formulasi campuran dengan P. flourescens. Aktivitas antimikrob Bacillus sp. F13 menunjukkan bahwa zat antimikrob diproduksi pada akhir fase logaritmik pertumbuhan. SARAN Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk melakukan pemurnian dan karakterisasi senyawa antimikrob isolat Bacillus sp. A21, F13, dan G3, sehingga dapat ditentukan identitas senyawanya. Selain itu, perlu dilakukan uji antagonis antar ketiga Bacillus terpilih, serta pengkajian aplikasinya sebagai agen biokontrol dalam skala rumah kaca dan lapangan. DAFTAR PUSTAKA Asman A. 1996. Penyakit layu pada tanaman nilam dan cara pengendaliannya. Di dalam: Integrated Control on Main Disease of Industrial Crops. Prosiding Pertemuan Ilmiah Tahunan; Bogor, 13 14 Mar 1996. Bogor: Research Institute for Spice
and Medicinal Crops, Bogor. hlm. 284 290. Arwiyanto T, Maryudani YMS, Azizah NN. 2007. Sifat-sifat fenotik Pseudomonas fluorescens, agensia pengendali hayati penyakit lincat pada Tembakau Temanggung. J. Biodiversitas 8(2):147-151. Clarke DJ, Robson RM, and Morris JG. 1975. Purification of two Clostridium bacteriocins by procedures appropriate to hydrophobic proteins. J. Antimicrob Agent Chemother 7(2):256-264. Dajani AS, Wannamaker LW. 1969. Demonstration of bactericidal substance against beta-hemolytic streptococci in supernatant fluids of staphylococcal cultures. J Bacterial 97(5):985-991. Dirmawati SR. 2005. Penurunan intensitas penyakit pustul bakteri kedelai melalui strategi cara tanam tumpangsari dan penggunaan agensia hayati. J. AGRIJATI 1(1):710. Hurst A. 1981. Nissin advances. J. Appl Microbiol 27(3):85-123. Hyronimus B, Marrec CL, Urdaci MC. 1998. Coagulin, a bacteriocin-like inhibitory substance produce by Bacillus coagullan I4.. J. Appl Microbiol 85(4):42-50. Irina VP, Philippe B, Bernard V, Bernard F. 2001. In vitro anti-Heliobacter pylori activity of the probiotic strain Bacillus subtilis is due to secreation of antibiotics. J. Antimicrobe Agent Chemother 45(11):3156-3161. Jack RW, Tagg JR, Ray B. 1995. Bacteriosin of Gram-positive bacteria. Microb Rev. 59(2):171200. Jo YB, Kyung MB, Sung-Koo, Hong-ki J. 1996. Evaluation at optimum conditions for bacteriocin production from Lactobacillus sp. JB-42 isolated from kimichi. J Microbiol Biotechnol 6(7): 63-67. Klaus, Peter R. 1997. Pseudomonas syringae pathovars and related pathogens. Philadelphia: Lipponicott Williams & Wilkins. Lisboa MP, Bonatto D, Bizani D, Henriques JAP, Brandelli A. 2006. Characterization of a bacteriocin-
13
like substance produced by Bacillus amyloliquefaciens isolated from the Brazillian atlantic forest. Int Micobiol 9(2):111-118. Martirani L, Varcamonti M, Naclero G, Felice M de. 2002. Purification and partial characterization of bacillocin 490, a novel bacteriocin produced by a thermophilic strain of Bacillus licheniformis. Microbiol Cell Factories 1(1):1-5. Modjo HS. 1991. Usaha menjadikan pengendalian hayati terhadap patogen tumbuhan sebagai pengendalian hama terpadu. J Litbang Pertanian 26(1):9-14. Pelczar MJ, Chan ECS. Dasar-dasar Mikrobiologi. Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL, penerjemah. Jakarta: UI Pr. Terjemahan dari: Elements of Microbiology. Sopyan AS, Findy K. 2007. Bacillus sp sebagai penghasil senyawa antimikrob dari tanah hutan Wana Wisata Cangkuang [studi lapangan]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahun Alam, Institut Pertanian Bogor. Suparyono, Sudir, Suprihanto. 2003. Komposisi patotipe patogen hawar daun bakteri pada tanaman Padi stadium tumbuh berbeda. Ilmu Pertanian 22(1):45-50.
Supriadi. 2006. Analisis resiko agen hayati untuk pengendalian patogen pada tanaman. J. Litbang Pertanian 25(3):75-79. Tagg JR, Dajani AS, Wannamaker LW. 1976. Bacteriocins of Grampositive bacteria. Microbe Rev. 40(3):722-756. Torkar KG, Matijasic BB. 2003. Partial characterization of bacteriocins produced by Bacillus cereus isolate from milk and milk products. J. Food Technol 41(2):121-129. Verschuere L, Geert R, Patrick S, Willy V. 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture [ulas balik]. J Microbiol and Mol Biol 64(4):665671. West TP. 2005. Effect of carbon source on pyrimidine formation in Pseudomonas fluorescens ATCC 13525. J. Microbiol 160(4):337342. Williams RAD, Lambert PA, Singleton P. 1996. Antimicrobial Drug Action. UK: Scientific Publisher Ltd. Yamasaki Y, Murata N, Suwa T. 2006. Studies on the culture of Xanthomonas oryzae. J. Bacteriol 42(8):946-949.
LAMPIRAN
15
Lampiran 1 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. terhadap populasi sel bakteri uji dalam uji kompetisi Rataan populasi sel bakteri uji (x109 cfu/ml)* P.syringae pv. P. fluorescens B X.oryzae pv. oryzae glycines 24 F13 1:1 1 3.1 G3 1:1 2 0.9 A21 1:1 1 0.2 6.9 24 F13 1:2 4 2 G3 1:2 1 0.1 1.1 A21 1:2 3 0.1 1.5 24 F13 1:4 1.8 0.2 G3 1:4 3.5 1.2 A21 1:4 3.4 5.4 24 F13 1:10 1.7 0.1 1 G3 1:10 2.9 0.1 2 A21 1:10 2.8 0.3 5.5 48 F13 1:1 1 3.5 G3 1:1 2.5 0.9 A21 1:1 0.9 0.2 6.9 48 F13 1:2 4 0 4 G3 1:2 1 0.1 1.2 A21 1:2 2.5 0.1 1.5 48 F13 1:4 2.7 0.2 G3 1:4 3.5 1.2 A21 1:4 3 4.4 48 F13 1:10 0.5 0.1 1 G3 1:10 3.3 0.1 2 A21 1:10 2.8 0.3 4.1 72 F13 1:1 1.1 4.5 G3 1:1 3.9 0.9 A21 1:1 0.9 0.2 72 F13 1:2 4.7 6.9 G3 1:2 1 0.1 1.4 A21 1:2 2.5 0.1 72 F13 1:4 4.7 6.6 G3 1:4 3.5 1.4 A21 1:4 3 72 F13 1:10 0.8 0.1 1 G3 1:10 5.1 0.1 4.1 A21 1:10 3.1 0.3 Keterangan: * data diperoleh dari 2 pengulangan; (-) = populasi sel tidak terdeteksi
Waktu inkubasi (jam)
Isolat Bacillus sp.
Rasio inokulum
16
Lampiran 2 Persentase penghambatan isolat Bacillus sp. terhadap bakteri uji Isolat Bacillus Rasio inokulum P. fluorescens B sp. F13 1:1 96.99 G3 1:1 93.98 A21 1:1 96.39 F13 1:2 87.95 G3 1:2 96.99 A21 1:2 90.96 F13 1:4 94.58 G3 1:4 89.46 A21 1:4 89.76 F13 1:10 100 G3 1:10 91.27 A21 1:10 91.57 F13 1:1 96.99 G3 1:1 92.25 A21 1:1 97.73 F13 1:2 87.95 G3 1:2 96.99 A21 1:2 92.47 F13 1:4 91.87 G3 1:4 89.46 A21 1:4 90.96 F13 1:10 98.49 G3 1:10 90.06 A21 1:10 91.57 F13 1:1 96.69 G3 1:1 88.25 A21 1:1 97.73 F13 1:2 85.84 G3 1:2 96.99 A21 1:2 92.47 F13 1:4 85.84 G3 1:4 86.46 A21 1:4 90.96 F13 1:10 97.59 G3 1:10 84.64 A21 1:10 90.66 Keterangan: * data diperoleh dari 2 pengulangan
Waktu inkubasi (jam) 24
24
24
24
48
48
48
48
72
72
72
72
Rataan Penghambatan (%)* P. syringae pv. glycines
X. oryzae pv. oryzae
100 100 98.39 100 99.19 99.19 100 100 100 99.7 99.19 97.58 100 100 98.39 100 99.19 99.19 100 100 100 99.7 99.19 97.58 100 100 98.39 100 99.19 99.19 100 100 100 99.7 99.19 97.58
94.15 98.3 86.98 96.23 97.92 97.17 99.62 97.73 89.81 98.11 96.23 89.62 93.4 98.3 86.98 92.45 97.73 97.17 99.62 97.73 91.69 98.11 97.73 92.26 91.51 98.3 100 88.68 97.36 100 98.75 97.36 100 98.11 92.26 100
17
Lampiran 3 Populasi sel isolat Bacillus sp. dan bakteri uji dalam kontrol positif dan negatif untuk uji kompetisi Rataan populasi sel (x1010 cfu/ml)* Waktu inkubasi Bacillus sp. Bacillus sp. Bacillus sp. P.fluorescens P.syringae pv. (jam) A21 F13 G3 B glycines 24 1.44 2.36 0.8 3.32 1.24 48 1.44 2.36 1.02 3.32 1.24 72 1.72 2.36 1.02 3.32 1.24 Keterangan: * data diperoleh dari 2 pengulangan
X.oryzae pv. oryzae 5.3 5.3 5.3
18
Lampiran 4 Aktivitas antimikrob supernatan kultur isolat Bacillus sp. F13 X. oryzae pv. oryzae P. fluorescens B P. syringae pv. glycines Waktu Log jumlah inkubasi Rataan diameter Rataan diameter Rataan diameter populasi SE SE SE (jam) zona bening (cm)* zona bening (cm)* zona bening (cm)* 0 0 12 1.09 0.38 0.13 0.06 0.04 0.38 0 24 1.09 0.25 0.08 0.06 0.02 36 1.17 0.13 0.04 0.06 0.02 48 1.18 60 1.20 72 1.19 Keterangan: * data menunjukkan nilai rataan ± SE, n = 2; (-) = tidak ada penghambatan
