Jurnal AgroBiogen 9(2):49-57
Identifikasi Molekuler Hawar Daun Bakteri (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) dan Uji Patogenisitasnya pada Galur-galur Padi Isogenik Tasliah*, Mahrup, dan Joko Prasetiyono Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Jl. Tentara Pelajar 3A, Bogor 16111 Telp. (0251) 8337975; Faks. (0251) 8338820; *E-mail:
[email protected] Diajukan: 5 Maret 2013; Diterima: 19 Juli 2013
ABSTRACT Molecular Identification of Bacterial Leaf Blight (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) and Pathogenicity Test of Rice Isogenic Lines. Tasliah, Mahrup, and Joko Prasetiyono. Identification of Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) based on molecular analysis has been introduced just few years ago. This method used some specific primers for Xoo and can be done quickly. The purposes of this research were to identify isolate Xoo originated from five locations in Indonesia and to determine the level of pathogenicity of these bacteria. Studies were conducted in the greenhouse and the Molecular Biology Laboratory of ICABIOGRAD, from 2011 to 2012. Bacterial isolates were taken from five regions in Indonesia, namely: West Sumatra, West Java, Central Java, South Sulawesi, and West Kalimantan. The specific primers of Xoo were Xoo2967, Xoo80, and Xoo. Results showed that 216 isolates could be grown to form yellow colored colonies, which belongs to a criterian for Xoo. Molecular analysis demonstrated that 189 isolates were Xoo and 27 isolates were not. Amplification of DNA of the isolates resulted a 337 bp PCR product for primer Xoo2976, 700 bp for primer Xoo80 and 534 bp for primer Xoo. Pathogenicity tests of the Xoo isolates showed xa5, Xa7, and Xa21 resistance genes were still effective againts BLB pathogens originated from those five regions, with percentage of resistance were 93.57, 77.49, and 85.37%, respectively. Keywords: Rice, Xanthomonas oryzae pv. oryzae, specifik primers, test of patogenicity.
ABSTRAK Identifikasi Molekuler Bakteri Hawar Daun (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) dan Uji Patogenisitasnya pada Galur-Galur Padi Isogenik. Tasliah, Mahrup, dan Joko Prasetiyono. Identifikasi bakteri Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) berdasarkan analisis molekuler telah diperkenalkan beberapa tahun yang lalu. Metode ini menggunakan beberapa primer spesifik untuk bakteri hawar daun khusus patovar oryzae dan dapat dikerjakan secara cepat. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi isolat Xoo dari lima wilayah di Indonesia dan mengetahui tingkat patogenisitas bakteri tersebut. Isolat bakteri diambil dari tanaman padi yang terserang bakteri hawar daun dari lima wilayah di Hak Cipta © 2013, BB Biogen
Indonesia, yakni Sumatera Barat, Jawa Barat, Jawa Tengah, Sulawesi Selatan, dan Kalimantan Barat. Primer spesifik untuk Xoo adalah primer Xoo2967, Xoo80, dan Xoo. Hasil penelitian menunjukkan bahwa sebanyak 216 isolat berhasil ditumbuhkan membentuk koloni berwarna kuning, yaitu suatu kriteria bagi Xoo dan berdasarkan analisis molekuler sebanyak 189 isolat adalah positif Xoo, dan 27 isolat bukan Xoo. Amplifikasi DNA isolat-isolat HDB tersebut menghasilkan produk berukuran 337 pb untuk primer Xoo2976, 700 pb untuk primer Xoo80, dan 534 pb untuk primer Xoo. Uji patogenisitas dari isolat-isolat Xoo menunjukkan bahwa gen resisten pada tanaman xa5, Xa7, dan Xa21 masih cukup efektif menangkal serangan penyakit hawar daun bakteri padi dari lima wilayah pertanaman padi yang menjadi target penelitian ini, dengan persentase ketahanan berturut-turut sebesar 93,57; 77,49; dan 85,37%. Kata kunci: Padi, Xanthomonas oryzae pv. oryzae, primer spesifik, uji patogenisitas.
PENDAHULUAN Penyakit hawar daun bakteri (HDB) yang disebabkan oleh Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) adalah salah satu penyakit utama pada padi sawah. Hampir seluruh daerah pertanaman padi di Indonesia telah terpapar penyakit HDB (Direktorat Perlindungan Tanaman Pangan, 2012). Daerah endemik HDB di Indonesia adalah Jawa Barat dan Jawa Tengah, dengan tingkat serangan yang beragam. Menurut data dari Direktorat Perlindungan Tanaman Pangan tahun 2011, serangan HDB pada tahun 2011 mencapai 115.257 ha dan 62 ha mengalami puso. Untuk mengenali bakteri hasil isolasi dari tanaman sakit apakah HDB atau bukan, biasanya dilakukan beberapa tahapan kegiatan yang dinamakan “Postulat Koch”. Postulat ini memerlukan waktu yang lama untuk menentukan apakah bakteri yang diperoleh adalah Xoo atau bukan (Kadir, 2009). Saat ini sudah dikembangkan deteksi secara molekuler untuk melengkapinya. Deteksi secara molekuler ini dapat dilakukan pada tahap awal isolasi bakteri dari sampel daun yang diduga terserang HDB. Deteksi secara molekuler menggunakan primer-primer spesifik untuk bakteri Xoo yang relatif lebih cepat dan akurat dalam
50
JURNAL AGROBIOGEN
mendapatkan bakteri Xoo murni (Lang et al., 2010). Beberapa primer spesifik telah dibuat oleh beberapa peneliti. Primer-primer tersebut didesain berdasarkan kajian sekuen lengkap dari beberapa isolat bakteri Xoo (Lee et al., 2005; Ochiai et al., 2005; Salzberg et al., 2008). Dari data sekuensing yang sudah terdaftar di bank gen, beberapa peneliti mendesain primer spesifik pada daerah konservatif (conserved region) dari bakteri Xoo (Onasanya et al., 2010; Furuya et al., 2012). Penggunaan primer spesifik Xoo sangat membantu untuk identifikasi HDB dalam jumlah sangat banyak. Biasanya isolat HDB berwarna kuning, namun koloni warna kuning terjadi juga pada bakteri X. oryzae pv. oryzicola (Xoc) dan kelompok Xanthomonas lainnya, seperti Pseudomonas fuscovaginae, P. syringae pv. syringae, Ralstonia solanacearum, Burkholderia andropogonis, dan Erwinia herbicola (Lang et al., 2010; Onasanya et al., 2010). Penelitian ini bertujuan untuk (1) menguji efektivitas primer spesifik untuk identifikasi dini bakteri Xoo dari lima lokasi sampling di Indonesia dan (2) menguji respon gen-gen ketahanan HDB terhadap serangan patogen Xoo dari isolat yang berasal dari lima lokasi sampling di Indonesia. Informasi ini dapat digunakan sebagai strategi untuk merakit galur-galur baru yang tahan terhadap serangan HDB di masing-masing lokasi. BAHAN DAN METODE Penelitian dilakukan di rumah kaca dan Laboratorium Biologi Molekuler, BB Biogen, mulai Agustus 2011 sampai Juli 2012. Koleksi dan Isolasi Hawar Daun Bakteri Sampel daun yang digunakan dalam penelitian ini diambil dari lima lokasi, yaitu (1) Sumatera Barat
A
VOL. 9 NO. 2
(Desa Kubu Apar dan Desa Maninjau, Kecamatan Empat Angkat Candung, Kabupaten Agam), (2) Jawa Barat (Desa Warung Nangka, Kecamatan Ciasem dan Desa Ciberes, Kecamatan Patok Beusi, Kabupaten Subang dan Desa Ciranjang, Kabupaten Cianjur), (3) Kalimantan Barat (Desa Senakin, Kecamatan Singkawang), (4) Jawa Tengah (Desa Duwet, Kecamatan Pekalongan Selatan, Kabupaten Pekalongan dan Desa Sawahan, Kecamatan Tulis, Kabupaten Batang), dan (5) Sulawesi Selatan (Desa Borong Lowe, Kecamatan Bonto Morana, Kabupaten Gowa dan Desa Batang Kaluku, Kecamatan Maros, Kabupaten Makasar). Pengambilan sampel dalam satu tempat bervariasi tergantung pada insiden serangan pada padi serta keparahannya terhadap HDB di lokasi tersebut. Pada lokasi persawahan yang terserang banyak HDB, sampel daun yang terserang diambil mengikuti pola seperti huruf “W” (Bustamam et al., 1997). Sampell daun yang telah dikumpulkan diisolasi bakterinya menggunakan media tumbuh Wakimoto Agar (WA) (Bustamam et al., 1997) pada cawan petri. Setelah single colony (koloni tunggal) (Gambar 1A dan 1B) tumbuh kemudian dipindahkan ke media WA miring untuk pemurnian. Bakteri-bakteri yang diduga adalah Xoo (yang berwarna kuning) kemudian Dianalisis secara molekuler. Bakteri yang positif setelah dilakukan analisis PCR kemudian diperbanyak dan diujikan ke tanaman dan untuk penyimpanan bakteri dalam jangka lama dilakukan dalam 5% skim milk dan disimpan di dalam freezer -20°C. Identifikasi Bakteri Xoo Menggunakan PCR Identifikasi bakteri secara molekuler menggunakan sel bakteri secara langsung sebagai template/ cetakan PCR. Primer-primer yang digunakan untuk deteksi dini bakteri Xoo secara molekuler terdiri dari 3 pasang primer spesifik untuk bakteri Xoo yakni: Xoo2976F (5’-GCCGTTTTTCTTCCTCAGC-3’) dan
B
Gambar 1. Koloni bakteri Xanthomonas oryzae pada media WA (Wakimoto Agar). A = isolat Xoo12177 diisolasi dari varietas yang tidak diketahui dari Desa Kauman, Batang, Jawa Tengah; B = isolat Xoo12-269 diisolasi dari padi IR64 dari Desa Ciberes, Patok Beusi, Subang, Jawa Barat; tanda panah menunjukkan koloni tunggal.
2013
TASLIAH ET AL.: Identifikasi Molekuler Hawar Daun Bakteri
Xoo2976R (5’-AGGAAAGGGTTTGTGGAA-GC-3’), Xoo80F (5’-GCCGCTGGAATGAGCAAT-3’) dan Xoo80R (5’-GCGTCCTCGTCTAAGCGATA-3’) (Lang et al., 2010), dan XooF (5’-TGGTAGTCCACGCCCTAAAC-3’) dan XooR (5’-CCTGAGCTACAGACCCGA-3’) (Onasanya et al., 2010). Primer Xoo2976 didesain dari Dual specificity phosphatase, catalytic domain protein. Primer Xoo80 didesain dari Hypothetic protein.
Sebanyak 100 μl suspensi bakteri dipanaskan pada suhu 98°C selama 8 menit dan disentifugasi pada 10.000 rpm selama 3 menit, supernatan tersebut digunakan sebagai cetakan DNA (Dafa’alla et al., 2000; IRRI, 1995; George et al., 1997; Furuya et al., 2012). Kondisi PCR dilakukan di dalam volume total 20 μl, yang terdiri dari 2 μl 10× bufer PCR, 0,4 μl 10μM dNTP mix, 1 μl 5 μM primer mix (F+R), 1 μl GC rich dan 1 unit enzim Taq DNA polimerase. Profil PCR dilakukan berdasarkan Lang et al. (2010), yaitu (i) denaturasi awal (initial denaturing) pada suhu 94°C selama 3 menit, (ii) denaturasi (denaturing) pada suhu 94°C selama 30 detik, (iii) penempelan (annealing) primer pada suhu 60°C selama 30 detik, (iv) perpanjangan (extention) primer pada suhu 68°C selama 2 menit, diulang sebanyak 31 kali, dan (v) perpanjangan akhir (final extension) pada suhu 68°C selama 10 menit. Hasil PCR diwarnai dengan penanda migrasi (loading dye) dan selanjutnya bersama-sama dengan 1 kb ladder sebagai penanda (marker) berat molekul, diseparasi dalam elektroforesis pada gel agarose 2% dalam bufer 1× TAE, kemudian gel agarose diwarnai dengan EtBr dan divisualisasi di bawah sinar UV pada alat Chemidoc Bio-Rad. Uji Patogenisitas Uji patogenisitas menggunakan rancangan Acak Lengkap dengan tiga ulangan. Genotipe padi yang digunakan untuk pengujian isolat bakteri terdiri dari 18 genotipe seperti tertera pada Tabel 1. Benih padi dikecambahkan di dalam cawan petri selama 10 hari, setelah itu dipindah ke dalam bak pertanaman dan dipelihara dengan pemupukan untuk masing-masing bak: SP36 0,18 g, urea 0,2555 g, dan KCl 0,045 g. Tanaman diinokulasi pada umur 30 hari setelah semai (20 hari di bak pertanaman) menggunakan isolat bakteri Xoo yang telah dimurnikan dan telah diuji secara molekuler. Sebanyak 10 isolat dari masing-masing daerah diujikan pada setiap set tanaman uji. Satu set tanaman uji (ada tiga ulangan) memerlukan dua bak, di mana setiap bak berisi sembilan genotipe padi dan masing-masing genotipe terdiri dari 10 tanaman. Perbanyakan inokulum dan inokulasi dilakukan mengikuti metode yang dikembangkan oleh Kauffman et al. (1973) dalam Goto et al. (2009). Perbanyakan inoku-
51
Tabel 1. Genotipe padi yang digunakan pada pengujian patogenisitas isolat Xoo. No. Genotipe
Gen ketahanan dan informasi genotipe
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18.
Padi genjah, Jepang Varietas populer, tidak tahan HDB Mengandung Xa7 dan Xa4 Varietas populer, tidak tahan HDB Varietas populer di Sumatera Barat Tanaman cek rentan HDB Tanaman cek rentan HDB Xa1 Xa2 Xa3 Xa4 xa5 Xa7 Xa10 Xa11 Xa14 Xa21 Varietas penerima galur isogenik IRBB
Nipponbare Ciherang Code IR64 Kuriak Putiah Cisadane Kencana Bali IRBB1 IRBB2 IRBB3 IRBB4 IRBB5 IRBB7 IRBB10 IRBB11 IRBB14 IRBB21 IR24
lum dilakukan dengan cara 1 ose koloni bakteri ditumbuhkan dalam 10 ml media NB cair, digoyang semalam pada suhu ruang. Konsentrasi inokulum bakteri yang digunakan diatur sekitar 109 sel/ml. Inokulasi dilakukan dengan cara memotong ujung daun kedua dan ketiga menggunakan gunting yang sebelumnya sudah dicelupkan ke dalam biakan bakteri dalam media nutrient broth (NB) (=clipping method). Pengamatan dilakukan 18 hari dan 25 hari setelah inokulasi (hsi) menggunakan Standard Evaluation System for Rice (IRRI, 1996). Peubah yang diamati adalah panjang area daun sakit (Disease Leaf Area) dan panjang daun total. Data tersebut digunakan untuk menghitung intensitas penyakit dari setiap genotipe yang diuji menggunakan rumus berikut: Panjang serangan (cm) Intensitas Penyakit (IP) = x 100% Panjang daun (cm) Kategori ketahanan tanaman ditentukan menggunakan standar IRRI (IRRI, 1996). 1. Sangat tahan (ST) apabila 0% bagian daun yang terserang HDB. 2. Tahan (T) apabila 1-5% bagian daun terserang HDB. 3. Agak tahan (AT) apabila 6-12% bagian daun terserang HDB. 4. Sedang (S) apabila 13-25% bagian daun terserang HDB. 5. Agak rentan (AR) apabila 26-50% bagian daun terserang HDB. 6. Rentan (R) apabila 51-75% bagian daun terserang HDB. 7. Sangat rentan (SR) apabila 76-100% bagian daun terserang HDB.
52
JURNAL AGROBIOGEN
Dari nilai rerata intensitas penyakit untuk masingmasing lokasi, dilakukan perhitungan rerata untuk kelima lokasi. Rerata untuk kelima lokasi untuk menentukan gen ketahanan (Xa) mana yang paling berperan untuk mengendalikan penyakit HDB di lokasi penelitian. Jenis gen Xa yang masih memiliki ketahanan terhadap isolat-isolat HDB dapat direkomendasikan sebagai acuan dalam merakit tanaman padi yang tahan terhadap HDB, khususnya untuk lokasi pengambilan sampel patogen HDB. HASIL DAN PEMBAHASAN Identifikasi Isolat Menggunakan Primer Spesifik Hasil isolasi bakteri dari daun padi yang terserang menghasilkan koloni yang berwarna kuning (Gambar 1). Hal ini merupakan salah satu ciri morfologi bakteri M 1
2
3
4
5 6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
VOL. 9 NO. 2
Xoo (Nino-Liu et al., 2006). Koloni bakteri Xanthomonas berwarna kuning karena mengandung xanthomodin. Setelah dilakukan proses PCR menggunakan primer spesifik untuk pv. oryzae ternyata Gambar 1A adalah Xoo, sedangkan Gambar 1B bukan Xoo. Contoh hasil amplifikasi PCR dari koloni HDB menggunakan primer spesifik khusus untuk Xoo disajikan pada Gambar 2. Tabulasi isolat HDB yang diperoleh pada penelitian ini disajikan pada Tabel 2. Hasil uji PCR dari 216 isolat bakteri yang diuji, 189 merupakan bakteri Xoo dan 27 isolat bukan bakteri Xoo. Pada primer Xoo2976, koloni yang menghasilkan pita berukuran 337 pb berarti positif bakteri Xoo (Lang et al., 2010), sedangkan yang tidak menghasilkan pita 337 pb berarti bukan bakteri Xoo. Demikian pula pada primer Xoo80 yang menghasilkan pita berukuran 700 pb dan primer Xoo yang menghasilkan pita berukuran M
20 21 22 23 24
25 26 27 28 29 30 31 32
33 34
A
337 pb Primer Xoo2976
Primer Xoo2976
Primer Xoo80
Primer Xoo80
Primer Xoo
Primer Xoo
B
700 pb
C
534 pb
Gambar 2. Pola pita hasil amplifikasi beberapa koloni HDB berwarna kuning menggunakan tiga primer spesifik untuk bakteriXoo. A = primer Xoo2976, B = primer Xoo80, C = primer Xoo; M = 1 kb DNA ladder, 1 = Xoo12-0218 (Jateng), 2 = Xoo12-0211 (Jateng), 3 = Xoo120179 (Jabar), 4 = Xoo12-0180 (Jabar), 5 = Xoo12-0200 (Jateng), 6 = Xoo12-0219 (Jateng), 7 = Xoo12-0225 (Jateng), 8 = Xoo12-0198 (Jateng), 9 = Xoo12-0224 (Jateng), 10 = Xoo12-0199 (Jateng), 11 = Xoo12-0192 (Jateng), 12 = Xoo12-0189 (Jateng), 13 = Xoo120215 (Jateng), 14 = Xoo12-0214 (Jateng), 15 = Xoo12-0217 (Jateng), 16 = Xoo12-0181 (Jabar), 17 = Xoo12-0210 (Jateng), 18 = Xoo12-0183 (Jabar), 19 = Xoo12-0178 (Jabar), 20 = Xoo12-0184 (Jabar), 21 = Xoo12-0221 (Sulsel), 22 = Xoo12-0205 (Jateng), 23 = Xoo12-0220 (Jateng), 24 = Xoo12-0212 (Jateng), 25 = Xoo12-0204 (Jateng), 26 = Xoo12-0229 (Jateng), 27 = Xoo12-0254 (Jateng), 28 = Xoo12-0233 (Jateng), 29 = Xoo12-0240 (Jateng), 30 = Xoo12-0252 (Jateng), 31 = Xoo12-0230 (Jateng), 32 = Xoo120250 (Jateng), 33 = Xoo12-0255 (Jateng), 34 = Xoo12-0236 (Jateng).
2013
TASLIAH ET AL.: Identifikasi Molekuler Hawar Daun Bakteri
53
Tabel 2. Isolat-isolat HDB dari lima lokasi di Indonesia. No. Asal hawar daun bakteri 1. Kabupaten Agam (Sumbar) 2. Kabupaten Cianjur dan Subang (Jabar) 3. Kabupaten Senakin (Kalbar) 4. Kabupaten Gowa dan Makasar (Sulsel) 5. Kabupaten Batang dan Pekalongan (Jateng)
Jumlah koloni berwarna kuning*)
Jumlah Koloni yang positif Xoo**) Koloni yang positif Xoo (%)
30 46
29 20
96,66 43,48
22 44
22 44
100 100
74
74
100
* koloni berwarna kuning menunjukkan warna koloni HDB. Seluruh koloni yang berwarna kuning digunakan sebagai cetakan PCR, ** berdasarkan PCR menggunakan primer-primer spesifik Xoo.
534 pb (Lang et al., 2010). Dari Gambar 2A, 2B dan 2C semuanya konsisten untuk sampel yang sama. Seperti sampel nomor 3, 4, 16, 18, 19, dan 20 ternyata memiliki pita yang berbeda dengan standar, sama untuk ketiga primer spesifik tersebut, sehingga isolat-isolat tersebut diduga bukan Xoo. Penggunaan primer spesifik untuk identifikasi HDB ini telah digunakan secara luas. Furuya et al. (2012) bahkan hanya memakai satu jenis primer spesifik saja, yaitu primer XO, untuk menyeleksi bakteri Xoo dari bakteri lain pada penelitian keragaman genetik HDB di Vietnam Selatan. Pasangan primer yang digunakan, yaitu primer XO-FGCATGACGTCATCGTCCTGT, XO-RCTCGGAGCTATATGCCGTGC yang didesain dari Internally transcribed spacer region of ribosomal DNA (Adachi dan Oku, 2000). Amplifikasi menggunakan primer spesifik Xoo2976 dan Xoo80 sudah dilakukan oleh Lang et al. (2010) dengan menggunakan isolat Xoo yang berasal dari beberapa negara, termasuk Indonesia. Isolat murni Xoo MAFF311018 digunakan sebagai kontrol positif. Isolat Xoo dari Indonesia yang digunakan adalah IXO16 (Ciranjang, Cianjur), IXO56 (Pusakanegara), IXO58 (Kuningan), dan IXO60. Digunakan juga banyak Isolat Xanthomonas spp. (X. oryzae pv. oryzicola/Xoc, X. axonopodis, X. campestris, X. cucurbitae, X. fragariae, X. horotum, X. translucens) dan beberapa isolat dari famili lain seperti Acidivorax avenae, Bulkholderia, Erwinia, Pseudomonas dan Ralstonia. Isolatisolat bakteri selain Xoo tersebut digunakan sebagai pembanding. Terjadi amplifikasi pada ukuran pasang basa tertentu pada isolat Xoo, dan tidak ada amplifikasi pada isolat bakteri yang bukan Xoo. Melihat konsistensi dari setiap primer spesifik Xoo untuk menyeleksi bakteri Xoo, penggunaan hanya satu primer saja mungkin cukup untuk identifikasi dini bakteri Xoo. Kemampuan primer spesifik Xoo di dalam menyeleksi HDB dari lapang cukup dapat diandalkan. Sebagai contoh untuk isolat HDB dari Kabupaten Subang (Jabar), walaupun koloninya berwarna kuning, hasil uji PCR menunjukkan ternyata
seluruh koloni dari isolat tersebut bukan bakteri Xoo. Berarti sampel daun tanaman sakit yang diambil dari daerah Subang bukan isolat Xoo, padahal daerah Subang sering dijumpai serangan HDB (Kadir, 2011). Hal ini menunjukkan di daerah Subang yang berkembang selain Xoo juga Xanthomonas spp. yang lain. Persentase tertinggi koloni berwarna kuning yang positif bakteri Xoo diperoleh dari isolat yang berasal dari Kabupaten Senakin (Kalbar), Kabupaten Gowa dan Makasar (Sulsel), dan Kabupaten Batang dan Pekalongan (Jateng) masing-masing 100%. Persentase terendah ditunjukkan oleh isolat bakteri yang dikoleksi dari Kabupaten Subang (0%). Uji Patogenisitas pada Galur-galur Isogenik dan Beberapa Varietas Padi Untuk mengetahui tingkat patogenisitasnya, isolat-isolat bakteri yang positif Xoo diuji pada galurgalur isogenik dan beberapa varietas populer serta satu varietas kontrol. Sepuluh isolat Xoo dipilih secara acak dari masing-masing lokasi. Pada penelitian, ini isolat yang digunakan berasal dari 5 lokasi, sehingga jumlah isolat Xoo yang diuji berjumlah 50 isolat. Hasil uji patogenisitas tersebut disajikan pada Tabel 3 dan Gambar 3. Hasil pengujian menunjukkan, dari 10 galur isogenik (IRBB1 s.d. IRBB21), ternyata tujuh di antaranya menunjukkan reaksi rentan dan agak rentan (Tabel 3). Dengan hasil evaluasi patogenisitas terhadap populasi Xoo merupakan langkah awal dalam program pemuliaan padi tahan penyakit HDB. Hasil evaluasi ini akan bisa dipahami struktur dan penyebaran populasi Xoo dalam kaitannya dengan resistensi tanaman padi yang ditanam di lahan pertanian. Berdasarkan data pada Tabel 3 varietas Code bereaksi tahan untuk isolat Xoo yang berasal dari kelima lokasi. Code merupakan hasil silang balik antara IR64 dengan IRBB7, sehingga Code membawa gen Xa7. Namun, ternyata Xa7 pada IRBB7 bereaksi sedang dan agak rentan pada semua isolat Xoo yang diisolasi dari kelima lokasi. Hal ini membuktikan bahwa
54
JURNAL AGROBIOGEN
VOL. 9 NO. 2
Tabel 3. Rerata hasil uji patogenisitas 50 isolat Xoo pada 10 galur isogenik dan 8 varietas padi. Asal isolat yang diuji Galur/Varietas
Nipponbare Ciherang Code IR64 Kuriak Putiah*** Cisadane Kencana Bali IRBB1 IRBB2 IRBB3 IRBB4 IRBB5 IRBB7 IRBB10 IRBB11 IRBB14 IRBB21 IR24
Sumatera Barat
Jawa Barat
Jawa Tengah
Sulawesi Selatan
Kalimantan Barat
Rerata*
Reaksi**
Rerata
Reaksi
Rerata
Reaksi
Rerata
Reaksi
Rerata
Reaksi
11,37 29,53 3,84 39,15 52,40 20,81 54,82 60,48 60,05 47,57 52,86 6,05 36,59 61,77 59,56 65,66 10,07 50,40
AT AR T AR R S R R R AR R AT AR R R R AT AR
19,44 39,14 3,18 54,82 67,89 42,98 65,77 70,40 70,03 56,89 78,14 6,72 14,82 79,88 74,89 78,55 18,34 73,67
S AR T R R AR R R R R SR AT S SR R SR S R
18,04 33,66 3,57 34,34 36,13 35,44 34,56 41,92 45,04 38,32 42,52 5,54 15,22 41,66 40,51 43,01 13,85 38,67
S AR T AR AR AR AR AR AR AR AR T S AR AR AR S AR
21,61 37,29 5,21 36,07 38,91 40,51 38,91 39,92 40,43 36,93 43,09 6,13 14,24 40,36 41,79 45,01 15,75 43,21
S AR T AR AR AR AR AR AR AR AR AT S AR AR AR S AR
30,17 42,47 4,21 48,51 71,91 29,75 63,89 85,98 82,36 71,10 74,03 7,72 31,67 83,20 84,18 90,09 15,16 73,09
AR AR T AR R AR R SR SR R R AT AR SR SR SR S R
AT = agak tahan, T = tahan, S = sedang, AR = agak rentan, R = rentan, SR = sangat rentan. * rerata intensitas penyakit (IP) (%), ** kriteria berdasarkan IRRI (2006), *** padi lokal yang dikembangkan di Sumatera Barat.
Code tidak hanya mengandung gen Xa7, namun mengandung gen ketahanan lain. Menurut Arif et al. (2008) dan Bustamam et al. (1997) IR64 memiliki gen ketahanan Xa4, maka dengan adanya kombinasi gen Xa4 dari IR64 dan Xa7 dari IRRB7 menjadikan varietas Code lebih tahan terhadap beberapa isolat Xoo dibandingkan galur IRBB7 itu sendiri. Nafisah et al. (2007) menyebutkan tanaman padi yang memiliki lebih banyak gen ketahanan Xa di dalam satu tanaman memiliki ketahanan yang lebih tinggi, sehingga tingkat ketahanan tanaman bisa lebih panjang. Gen ketahanan Xa7 dapat direkomendasikan untuk digunakan dalam pengendalian penyakit HDB di kelima lokasi pertanaman padi yang diteliti dalam penelitian ini. Dalam program pemuliaan, gen Xa7 dapat ditransfer ke varietas populer yang belum memiliki gen ketahanan HDB, seperti ke dalam varietas Ciherang, Inpari 13, Fatmawati, dan lain-lain. Untuk gen xa5 didapatkan hasil reaksi agak tahan dan tahan, yaitu di bawah 10% kerusakan setelah diuji dengan isolat-isolat dari kelima daerah. Gen xa5 pada IRBB5 ini juga bisa digunakan untuk dipindahkan ke varietas-varietas populer yang akan diperbaiki ketahanannya terhadap HDB, bahkan berdasarkan penelitian ini gen xa5 lebih efektif dibandingkan dengan gen Xa7 yang terdapat pada galur isogenik IRBB7. Untuk gen ketahanan Xa21 yang sebelumnya dilaporkan termasuk efektif, pada penelitian ini termasuk agak tahan dan sedang ketahanannya. Dari penelitian ini diduga ada kemungkinan di lapang telah terjadi
mutasi HDB sehingga muncul strain Xoo baru yang mematahkan gen ketahanan sebelumnya. Apabila rerata intensitas penyakit (IP) tiap provinsi dibuat rerata lagi, ternyata gen xa5, Xa7, dan Xa21 masih efektif di lima lokasi tersebut (Gambar 4). Persentase ketahanan pada gen tersebut berurutan sebesar 93,57; 77,49; dan 85,37%. Ketiga gen memiliki persentase yang cukup tinggi dibandingkan dengan gen yang lain. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian yang dilaporkan oleh Hifni et al. (1998) bahwa gen ketahanan yang efektif di Indonesia adalah xa5, Xa7, dan Xa21. Rentang waktu selama tahun 1997-2012 (15 tahun) membuktikan bahwa ketiga gen tersebut masih efektif untuk melawan serangan HDB jenis oryzae (Xoo). Gabungan ketiga gen ke dalam satu tanaman diharapkan bisa menjadi solusi tingkat ketahanan yang lebih lama. Xoo dikenal sebagai bakteri yang sangat mudah beradaptasi. Varietas padi yang baru dilepas biasanya hanya dapat bertahan dalam waktu 6 musim tanam terhadap serangan bakteri ini (Kadir, 2009). Gen ketahanan terhadap HDB yang efektif berbeda-beda untuk setiap lokasi suatu negara. Di Korea, Nepal, dan Vietnam, gen ketahanan Xa21 adalah yang paling efektif dibandingkan dengan gen ketahanan lainnya (Lee et al., 1999; Furuya et al., 2012). Shanti et al. (2010) melaporkan empat gen (Xa4, xa5, Xa13, dan Xa21) cukup efektif di India. Hasil penelitian ini mengindikasikan tiga gen (xa5, Xa7, Xa21) efektif di lima lokasi di Indonesia untuk mengatasi penyakit HDB.
2013
TASLIAH ET AL.: Identifikasi Molekuler Hawar Daun Bakteri A
B
E
C
55
D
K. Bali
IRBB21
IRBB7 IRBB5
Code
Gambar 3. Uji patogenisitas HDB pada beberapa galur/varietas uji. A, B, C, D = daun yang terserang HDB dari Provinsi Sumbar pada varietas Code, Ciherang, Cisadane, dan IR64; E= gejala HDB pada daun seluruh galur uji yang diinokulasi dengan Xoo11-023 yang berasal dari Sumbar (nomor 1-18 merujuk pada Tabel 1).
60 50 40 30 20
IR24 (R)
IRBB21 (R)
IRBB14 (R)
IRBB11 (R)
IRBB10 (R)
IRBB7 (S)
IRBB5 (AT)
IRBB4 (R)
IRBB3 (R)
IRBB2 (R)
IRBB1 (R)
K. Bali (R)
Cisadane (AR)
K. Putiah (R)
IR64 (AR)
Nipponbare (S)
0
Code (T)
10 Ciherang (AR)
Rerata intensitas penyakit (%)
70
Gambar 4. Histogram rerata intensitas penyakit dari lima lokasi sampling di Indonesia. T = tahan, AT = agak tahan, S = sedang, AR = agak rentan, R = rentan. Persentase ketahanan = 100% - persentase intensitas penyakit.
56
JURNAL AGROBIOGEN KESIMPULAN
Penggunaan primer spesifik Xoo2976, Xoo80, dan Xoo, sangat efektif untuk identifikasi dini bakteri X. oryzae pv. oryzae. Dari 216 isolat yang diuji, 189 isolat merupakan bakteri Xoo dan 27 isolat bukan bakteri Xoo. Uji patogenisitas dari isolat Xoo menunjukkan bahwa gen resisten pada tanaman xa5, Xa7, dan Xa21 masih cukup efektif menangkal serangan penyakit HDB padi di lima wilayah pertanaman padi yang menjadi target penelitian ini, dengan persentase ketahanan berturut-turut sebesar 93,57; 77,49; dan 85,37%. UCAPAN TERIMA KASIH Penelitian ini dibiayai oleh Proyek Program Riset Insentif Peningkatan Kapasitas Penelitian dan Perekayasa (RIPP TA 2011 dan PKPP TA 2012). Terima kasih juga disampaikan kepada Indra Kurniawan Saputra dan Ahmad Irvan Arrasyid mahasiswa S1 Biokimia, FMIPA-IPB, yang telah membantu dalam penelitian ini. DAFTAR PUSTAKA Adachi, N. and T. Oku. 2000. PCR-mediated detection of Xanthomonas oryzae pv. oryzae by amplification of the 16S-23S rDNA spacer region sequence. J. Gen. Plant Pathol. 66(4):303-309. Arif, M., M. Jaffar, M. Babar, M.A. Sheikh, S. Kousar, A. Arif, and Y. Zafar. 2008. Identification of bacterial blight resistance genes Xa4 in Pakistani rice germplasm using PCR. Afr. J. Biotechnol. 7(5):541-545.
VOL. 9 NO. 2
Goto, T., T. Matsumoto, N. Furuya, K. Tsuchiya, and A. Yoshimura. 2009. Mapping of bacterial blight resistance gene Xa11 on rice chromosome 3. JARQ 43(3):221225. Hifni, H.R. dan M.K. Kardin. 1998. Pengelompokan isolat Xanthomonas oryzae pv. oryzae dengan menggunakan galur isogenik padi IRRI. Hayati 5(3):66-72. International Rice Research Institute. 1995. DNA Fingerprinting Techniques for the Bacterial Blight Pathogen. Asian Rice Biotechnology Network (ARBN). International Rice Research Institute. Manila. 22p. International Rice Research Institute. 1996. Standard th Evaluation System for Rice. 4 edition. Philipphines. 52 p. Kadir, T.S. 2009. Menangkal HDB dengan menggilir varietas. Warta Penelitian dan Pengembangan Pertanian 31(5):1-3. Kadir, T.S. 2011. Penyakit bakteri pada padi. http:// pangan.litbang.deptan.go.id/-berita/penyakit [25 September 2013]. Lang, J.M., J.P. Hamilton, M.G.Q. Diaz, M.A.V. Sluys, M.R.G. Burgos, C.M.V. Cruz, C.B. Buell, N.A. Tiserat, and J.E. Leach. 2010. Genomics-based diagnostic marker development for Xanthomonas oryzae pv. oryzae and X. oyzae pv. oryzicola. Plant Dis. 94:311-319. Lee, B.M., Y.J. Park, D.S. Park, H.W. Kang, J.G. Kim, E.S. Song, I.C. Park, U.H. Yoon, J.H. Hahn, B.S. Koo, G.B. Lee, H. Kim, H.S. Park, K.O. Yoon, J.H. Kim, C.H. Jung, N.H. Koh, J.S. Seo, and S.J. Go. 2005. The genome sequence of Xanthomonas oryzae pathovar oryzae KACC10331, the bacterial blight pathogen of rice. Nuc. Acids Res. 33(2):577-586.
Bustamam, M., M. Yunus, A. Warsun, Suwarno, H.R. Hifni, dan T.S. Kadir. 1997. Penggunaan marka molekuler dalam perbaikan ketahanan varietas padi terhadap penyakit hawar daun bakteri di Indonesia. hlm. 174-184. Dalam S. Moeljopawiro, M. Herman, S. Saono, B. Purwantara, dan H. Kasim (eds.) Prosiding Seminar Perhimpunan Bioteknologi Pertanian Indonesia. Surabaya, 12-14 Maret 1997.
Nafisah, A.A. Daradjat, B. Suprihatno, dan T.S. Kadir. 2007. Heritabilitas karakter ketahanan hawar daun bakteri dari tiga populasi tanaman padi hasil seleksi daur ulang siklus pertama. Pen. Pert. Tan. Pangan 26:100-105.
Dafa’alla, T.H., G. Hobom, and H. Zahner. 2000. Direct colony identification by PCR-miniprep. Mol. Biol. 1:6566.
Ochiai, H., V. Inoue, M. Takeya, A. Sasaki, and H. Kaku. 2005. Genome sequence of Xanthomonas oryzae pv. oryzae suggests contribution of large numbers of effector genes and insertion sequences to its race diversity. JARQ 39:275-287.
Direktorat Perlindungan Tanaman Pangan. 2012. Serangan BLB pada Padi di Indonesia Masa Tanam 2002 s.d. 2009. Tidak dipublikasi. Furuya, N., S. Taura, T. Goto, B.T. Thuy, P.H. Ton, K. Tsuchiya, and A. Yoshimura. 2012. Diversity in virulence of Xanthomonas oryzae pv. oryzae from Northern Vietnam. JARQ 46(4):329-338. George, M.L.C., M. Bustamam, W.T. Cruz, J.E. Leach, and R.J. Nelson. 1997. Movement of Xanthomonas oryzae pv. oryzae in Southeast Asia detected using PCR-based DNA fingerprinting. Phytopathology 87(3):302-309.
Nino-Liu, D.O., P.C. Ronald, and A.J. Bogdanove. 2006. Xanthomonas oryzae pathovars: Model pathogens of a model crop. Mol. Plant Pathol. 7(5):303-324.
Onasanya, A., A. Basso, E. Somado, E.R. Gasore, F.E. Nwilene, I. Ingelbrecht, J. Lamo, K. Wydr, M.M. Ekperigin, M. Langa, O. Oyelakin, Y. Sete, S. Winter, and R.O. Onasanya. 2010. Development of combined molecular diagnostic and DNA fingerprinting technique for rice bacteria pathogens in Africa. Biotechnology 9(2):89-105. Salzberg, S.L. D.D. Sommeri, M.C. Schatzi, A.M. Philippy, P.D. Rabinowicz, S. Tsuge, A. Furutani, H. Ochiai, A.L. Delcher, D. Kelley, R. Madupu, D. Puiu, D. Radune, M. Shumway, C. Trapnell, G. Aparnas, G. Jha. A. Pandeys,
2013
TASLIAH ET AL.: Identifikasi Molekuler Hawar Daun Bakteri
P.B. Patils, H. Ishihara, D.F. Meyer, B. Szureki, V. Verdier, R. Koebnik, J.M. Dow, R.P. Ryan, H. Hirata, S. Tsuyumu, S.W. Lee, P.C. Ronald, R.V. Sontis, M.V. Sluyo, J.E. Leach, F.F. White, and A.J. Bogdanove. 2008. Genome sequence and rapid evolution of the rice pathogen Xanthomonas oryzae pv. oryzae PXO99A. BMC Genomics 9(204):1-16.
57
Shanti, M.L., V.V. Shenoy, G.L. Devi, V.M. Kumar, and P. Premalatha. 2010. Marker-assisted breeding for resistance to bacterial leaf blight in popular cultivar and parental lines of hybrid rice. J. Plant Pathol. 92(2):495501.
