Dako EnVision+ System-HRP (AEC) Pro použití s myšími primárními protilátkami Kód K4004 115 mL Kód K4005 110 mL Použití In vitro diagnostikum. Tento návod platí pro výrobek Dako EnVision+ System- HRP (AEC) (Dako EnVision+ System, HRP). Tento kit je určen k používání v kombinaci s myšími primárními protilátkami dodanými uživatelem ke kvalitativní identifikaci antigenu pomocí světelné mikroskopie v normálních a patologických tkáních zalitých do parafínu, kryostaticky zpracovaných tkáních nebo buněčných preparátech. Lze použít tkáně zpracované pomocí různých fixačních prostředků, mezi něž může patřit etanol, fixační roztok B-5, Bouinův fixační roztok, vodný roztok formaldehydu a zinku a neutrální pufrovaný formalín. V části „Obecné pokyny k imunohistochemickému barvení“ nebo v části „Pokyny“ pro detekční systémy v imunohistochemických postupech naleznete následující kapitoly: (1) Princip metody, (2) Potřebný materiál, který není součástí dodávky, (3) Uchovávání, (4) Příprava vzorků, (5) Postup barvení, (6) Kontrola jakosti, (7) Odstraňování problémů, (8) Interpretace barvení, (9) Obecná omezení. Souhrnné informace a vysvětlení EnVision+ System, HRP je dvoustupňová imunohistochemická metoda barvení. Tento systém je založen na polymeru značeném křenovou peroxidázou (HRP), konjugovaném se sekundárními protilátkami. Značený polymer neobsahuje avidin ani biotin. Proto jsou eliminovány nebo výrazně redukovány nespecifické výsledky barvení, vznikající v důsledku endogenní avidin-biotinové aktivity v játrech, ledvinách, lymfatické tkáni a kryostatických řezech. Všechna činidla pro systém EnVision+ System, HRP se substrátem 3-amino-9-ethylkarbazolem (AEC+) jsou ve stavu "ready-to-use", neboli připravena k okamžitému použití. Tento systém představuje extrémně citlivou metodu a v důsledku toho jsou optimální ředění primární protilátky až dvacetkrát vyšší než ředění používaná při tradiční technice s využitím komplexu peroxidáza anti-peroxidáza (PAP) a několikrát vyšší než ředění používaná pro tradiční metody jako je ABC nebo metoda používající značený streptavidin-biotin (LSAB). Tento protokol nabízí vylepšený systém generování signálů sloužících k detekci antigenů přítomných v nízkých koncentracích nebo primárních protilátek s nízkým titrem. Primární protilátky produkované myšmi dobře reagují se značeným polymerem. Interpretace jakéhokoli pozitivního zbarvení nebo jeho nepřítomnosti by měla být doplněna morfologickými a histologickými studiemi s použitím vhodných kontrol. Principy metody Veškerá endogenní peroxidázová aktivita se potlačí inkubací vzorku po dobu pěti minut s činidlem Dako’s Peroxidase Block, blokujícím endogenní peroxidázu. Vzorek je pak inkubován se zředěnou myší primární protilátkou s vhodnými charakteristikami. Poté následuje inkubace se značeným polymerem, skládající se ze dvou po sobě následujících třicetiminutových inkubací. Je třeba si uvědomit, že pro protilátky vyžadující natrávení pomocí enzymu nebo odmaskování cílové struktury muže být potřebné prodloužit časy inkubace s primární protilátkou a značeným polymerem o 5 až 10 minut. Barvení je dokončeno po 5–30 minutách inkubace s roztokem obsahujícím substrát-chromogen 3-amino-9-ethylkarbazol (AEC)+, jejímž výsledkem je vznik červeně zbarveného precipitátu na antigenním místě. (AEC je potenciální karcinogen. Podrobnosti uvádí část Upozornění.) Dodaná činidla Kód K4004: Součástí dodávaného kitu jsou následující materiály, které stačí pro 150 tkáňových řezů při dávkování 100 µL na jeden řez: Číslo lahvičky 1 1x15 mL
MnožstvíPopis Činidlo blokující peroxidázu 0,03% peroxid vodíku obsahující azid sodný.
2
1x15 mL
Značený polymer Polymer značený peroxidázou, konjugovaný s kozími imunoglobuliny proti myším protilátkám v pufru Tris-HCl, obsahujícím stabilizační protein a antimikrobiální činidlo.
3
1x15 mL
Substrát-chromogen AEC+
Roztok 3-amino-9-ethylkarbazolu, obsahující peroxid vodíku, stabilizátory, látky urychlující chemickou reakci a a antimikrobiální činidlo. Uchovávejte při teplotě 2–8 °C.
(127908-001)
P04044CZ_01/K4004_K4005/2015.07 str. 1/6
Kód K4005: Součástí dodávaného kitu jsou následující materiály, které stačí pro 1100 tkáňových řezů při dávkování 100 µL na jeden řez: Číslo lahvičky 1 1x110 mL
MnožstvíPopis Činidlo blokující peroxidázu 0,03% peroxid vodíku obsahující azid sodný.
2
1x110 mL
Značený polymer Polymer značený peroxidázou, konjugovaný s kozími imunoglobuliny proti myším protilátkám v pufru Tris-HCl, obsahujícím stabilizační protein a antimikrobiální činidlo.
3
1x110 mL
Substrát-chromogen AEC+ Roztok 3-amino-9-ethylkarbazolu, obsahující peroxid vodíku, stabilizátory, látky urychlující chemickou reakci a a antimikrobiální činidlo. Uchovávejte při teplotě 2–8 °C.
Potřebný materiál, který není součástí dodávky Absorpční materiál pro otírání Kontrolní tkáň, pozitivní a negativní Kontrastní barvivo, na vodné bázi, jako například Mayerův hematoxylin nebo Mayerův hematoxylin modifikovaný podle Lillieho. (kód S3309) Krycí sklíčka Destilovaná voda Etanol, absolutní a 95% Světelný mikroskop (20x–800x) Média pro fixaci mikroskopického preparátu, jako například Glycergel™ Mounting Medium (kód C0563) nebo fixační médium na bázi vody Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (kód S3025) nebo bezvodé permanentní fixační médium Ultramont (kód S1964) Primární protilátky a negativní kontrolní činidlo Podložní sklíčka, potažená poly-L-lysinem nebo silanizovaná (kód S3003) Barvící lázně nebo nádobky Časovač (kde je možné nastavit 3 až 40minutové intervaly) Promývací láhve Roztok promývacího pufru Xylen, toluen nebo náhrady xylenu Potřebné doplňkové materiály, které nejsou součástí dodávky Hydroxid amonný, 0,015 mol/L, zředěný na 0,037 mol/L PAP Pen (kód S2002) Upozornění 1. Pouze pro profesionální uživatele. 2. Tento výrobek obsahuje azid sodný (NaN3 ), chemikálii, která je v čistém stavu vysoce toxická. V koncentracích, v nichž se azid sodný nachází v produktu, není klasifikován jako nebezpečný, usazeniny NaN3 však mohou reagovat s olověnými a měděnými armaturami a vytvářet vysoce výbušné oxidy kovů. Při likvidaci používejte pro výplach velká množství vody, abyste zabránili tvorbě azidů v armaturách. 1,2 3. Substrát-chromogen AEC+ je citlivý na kontaminaci mnoha oxidačními činidly, jako jsou například kovy, bakterie, prach a běžně používané laboratorní sklo. Aby nedošlo ke kontaminaci a předčasné expiraci roztoku AEC+, nevystavujte jej působení potenciálních zdrojů kontaminace a nikdy nepipetujte roztok přímo z láhve. Požadované množství roztoku nalijte do čisté nádobky a pipetujte z ní. Přebytečný roztok AEC+ nevracejte do primární nádoby pro jeho uchovávání. 4. Nepoužívejte činidla po datu expirace platném pro předepsanou metodu uchovávání. Jsou-li činidla uchovávána v jakýchkoli jiných podmínkách než je uvedeno na příbalovém letáku, musí uživatel provést jejich validaci. 5. Nenahrazujte činidla činidly z jiných šarží nebo činidly ze systémů vyráběných jinými výrobci. 6. Pokud vystavíte enzymy nebo substrát-chromogen nadměrnému osvětlení, může je to negativně ovlivnit. Neuchovávejte součásti kitu v prostředí se silným osvětlením jako například na přímém slunečním světle, ani za takových podmínek neprovádějte barvení. 7. Jiné časy inkubace a inkubační teploty než ty, které jsou zde uvedeny, mohou být příčinou chybných výsledků. Jakékoli změny tohoto charakteru musí uživatel validovat. 8. Stejně jako u jiných výrobků z biologických zdrojů i zde dodržujte správné postupy zacházení. 9. Aby nedošlo ke kontaktu s očima a kůží, používejte vhodné osobní ochranné pomůcky. 10. Nespotřebované roztoky je třeba zlikvidovat v souladu s místními, celostátními, případně federálními předpisy. 11. Bezpečnostní list (BL) je profesionálním uživatelům k dispozici na vyžádání.
Nebezpečí AEC+ Substrate-Chromogen: 5-10% Polyethylene glycol, 1-5% N-methyl-2-pyrrolidon, 0.1-1% Octová kyselina, 0.1-1% 3-amino9-ethyl carbazole H320 Způsobuje podráždění očí. H350 Může vyvolat rakovinu. (127908-001)
P04044CZ_01/K4004_K4005/2015.07 str. 2/6
P201 P202 P281 P280 P264 P308 + P313 P305 + P351 + P338 P337 + P313 P405 P501
Před použitím si obstarejte speciální instrukce. Nepoužívejte, dokud jste si nepřečetli všechny bezpečnostní pokyny a neporozuměli jim. Používejte požadované osobní ochranné prostředky. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Po manipulaci si důkladně omyjte ruce. PŘI expozici nebo podezření na ni: Vyhledejte lékařskou pomoc/ošetření. PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně vyplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. Přetrvává-li podráždění očí: Vyhledejte lékařskou pomoc. Skladujte uzamčené. Obsah a obal zlikvidujte v souladu se všemi místními, regionálními, národními a mezinárodními předpisy.
Příprava činidel Před barvením je vhodné připravit si následující činidla. Roztok promývacího pufru Doporučeným promývacím pufrem pro automatickou a manuální imunohistochemickou detekci je TBST, 0,05 mol/L, fyziologický roztok pufrovaný Tris s Tween (kód S3006). TBS, 0,05 mol/L fyziologický roztok pufrovaný Tris (kód S1968) a PBS, 0,02 mol/L fyziologický roztok pufrovaný fosfátem (kód S3024) jsou rovněž vhodné roztoky promývacích pufrů pro ruční barvení. Nedoporučuje se používat roztoky promývacích pufrů obsahující azid sodný. Azid sodný inaktivuje peroxidázu (HRP), což má za následek negativní zbarvení. Nepoužitý pufr skladujte při teplotě 2 až 8 °C. Pokud je pufr zakalen, zlikvidujte jej. Pro vypláchnutí činidla blokujícího peroxidázu, substrátu a kontrastního barviva lze použít destilovanou vodu. Primární protilátka Protilátky NP-Series “Plus” typu “ready-to-use“ jsou optimalizovány pro použití při práci s vysoce citlivými detekčními systémy Dako “Plus” a jejich použití v kombinaci s těmito systémy se doporučuje. Společnost Dako dodává rovněž koncentrované protilátky. Optimalizaci koncentrovaných protilátek zajistí koncový uživatel. Zředěné roztoky je třeba připravit za použití roztoku pro ředění protilátek Antibody Diluent (kód S0809) nebo roztoku pro ředění, který obsahuje 0,05 mol/L pufr Tris-HCI a 1% hovězí sérový albumin (BSA). Protilátky Dako N-Series typu “ready-to-use“ nejsou optimalizovány pro použití při práci s detekčními systémy Dako “plus”. Pro většinu primárních protilátek používaných při práci s tímto kitem je dostačující inkubační dobou 30 minut. Negativní kontrolní činidlo Při použití protilátek Dako NP-Series "Plus” typu "ready-to-use" se doporučuje používat jako negativní kontrolní činidla Universal Negative Control+. Tato kontrolní činidla jsou optimalizována pro použití buď v kombinaci s myšími protilátkami (kód NP015) nebo s králičími protilátkami (NP001) NP-Series “Plus” typu "ready-to-use". V ideálním případě obsahuje negativní kontrolní činidlo protilátku, která nevykazuje žádnou specifickou nebo s normálním/neimunním sérem ve stejné matrix/roztoku jako zředěná primární protilátka. Negativní stejnou podtřídu a mělo by pocházet od stejného živočišného druhu jako primární protilátka, mělo koncentraci imunoglobulinu nebo proteinu jako zředěná primární protilátka a mělo by být ředěno pomocí Čas inkubace pro negativní kontrolní činidlo by měl odpovídat času inkubace primární protilátky.
reaktivitu s lidskými tkáněmi kontrolní činidlo by mělo mít by být zředěno na stejnou stejného roztoku pro ředění.
Další informace o pozitivních a negativních kontrolách naleznete v části "Obecné pokyny k imunohistochemickému barvení". Kontrastní barvivo Barevný konečný produkt barvicí reakce je rozpustný v alkoholu. Při tomto způsobu by se vždy mělo používat barvení kontrastním barvivem na vodné bázi, jakým je například Mayerův hematoxylin nebo Mayerův hematoxylin modifikovaný podle Lillieho (kód S3309). Kontrastní barvení hematoxylinem by mělo být následováno důkladným propláchnutím destilovanou vodou a ponořením sklíček s tkání do lázně 0,037 mol/L amoniaku nebo podobného modřidla. Vodný roztok amoniaku 0,037 mol/L se připraví smícháním 2,5 mL (koncentrovaného) 15 mol/L hydroxidu amonného s 1 litrem vody. Nepoužitý 0,037 mol/L amoniak lze uchovávat při pokojové teplotě (20–25 °C) v pevn ě uzavřené láhvi po dobu maximálně 12 měsíců. Jiné postupy pro kontrastní barvení jsou uvedeny v pokynech výrobce. Fixační média Pro fixaci ve vodném médiu se doporučuje Glycergel Mounting Medium (kód C0563) nebo Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (kód S3025). Glycergel je třeba těsně před použitím zahřát na teplotu nejméně 50 °C. Je rovn ěž možné použít bezvodé permanentní fixační médium Ultramount (kód S1964). Uchovávání Činidla systému EnVision+ System, HRP uchovávejte při teplotě 2–8 °C. Nevystavujte mrazu. Nepoužívejte po datu expirace uvedeném na lahvičkách s činidly a na etiketě kitu. Změna vzhledu kteréhokoli činidla, jako například precipitace, může znamenat nestabilitu nebo zhoršení vlastností. V takovém případě nemají být činidla používána. Roztok AEC+ Substrate-Chromogen je nestabilní při teplotách vyšších než 8 °C. Používejte a uchováve jte roztok AEC+ SubstrateChromogen při teplotách v doporučeném rozmezí 2–8 °C. Tento roztok je t řeba použít ihned po vyjmutí z chladničky. Po použití jej co nejdříve vraťte na místo uchovávání do teploty 2–8 °C. Nestabilita výrobku není signalizována žádnými zřetelnými příznaky. Testujte proto současně se vzorky od pacientů i pozitivní a negativní kontroly. Pokud dojde ke zbarvení neočekávaného typu, které nelze vysvětlit odchylkami v laboratorních postupech, a máte-li podezření na problém s kitem, kontaktujte službu technické podpory společnosti Dako. (127908-001)
P04044CZ_01/K4004_K4005/2015.07 str. 3/6
Příprava vzorků Tkáňové řezy zalité do parafínu Před imunohistochemickým barvením je třeba tkáně fixovat a zpracovat. Fixace zabraňuje autolýze a hnilobě odebraných tkání, zachovává antigenní vlastnosti, zvyšuje index lomu součástí tkání a zvyšuje odolnost buněčných elementů při zpracování tkání. Postupy pro zpracování tkání zahrnují dehydrataci, odstranění dehydratačních činidel, infiltraci média pro zalévání, vlastní zalití a přípravu tkáňových řezů. Popis fixačních prostředků nejběžněji používaných při přípravě tkání pro imunohistochemické barvení je uveden v části "Obecné pokyny k imunohistochemickému barvení". Jedná se však pouze o obecné pokyny. Optimální postupy musí stanovit uživatel. Uživatel rovněž musí provést jejich verifikaci. (Specifické informace o fixaci a zpracování tkání uvádí literární odkazy číslo 3 a 4.) Postup barvení Poznámky k postupu Před použitím by si měl uživatel tyto pokyny pečlivě přečíst a seznámit se s obsahem kitu. Pro vaše pohodlí jsou zkrácené pokyny uvedeny na plastové laminované příbalové informaci. Činidla a návod dodané v rámci tohoto kitu byly vyvinuty tak, aby poskytovaly optimální výsledky. Další ředění činidel, jež jsou součástí kitu, nebo změna doby nebo teploty inkubace mohou být příčinou chybných výsledků. Láhev 1 a láhev 2 by měly být před imunologickým barvením temperovány na laboratorní teplotu (20–25 °C). Podobn ě všechny inkubace by měly být prováděny při laboratorní teplotě. Roztok substrátu AEC+ lze použít ihned po vyjmutí z chladničky. Před použitím jej není nutné temperovat na laboratorní teplotu. Po použití jej vraťte na místo uchovávání do teploty 2–8 °C. Uchováván í při teplotě nad 8 °C má negativní vliv na stabilitu roztoku sub strát-chromogen AEC+. Tkáňové řezy nesmí během barvení vyschnout. U vyschlých tkáňových řezů může dojít ke zvýšenému nespecifickému barvení. Pokud jsou sklíčka vystavena průvanu, přikryjte je. Pokud použijete prodlouženou inkubaci, umístěte tkáně do vlhkého prostředí. Citlivost systému EnVision+ System, HRP lze dále zvýšit prodloužením doby inkubace v kroku 2 a 3 o 5 až 10 minut. Protokol barvení KROK 1 PEROXIDASE BLOCK (ČINIDLO BLOKUJÍCÍ PEROXIDÁZU) Poklepáním odstraňte přebytek pufru. Pomocí materiálu, který nepouští vlákna (jako například gázové tampony nebo tampony Kimwipe) pečlivě otřete okolí vzorku, aby se odstranila zbývající tekutina a činidla zůstala pouze ve zpracovávané oblasti. Naneste takové množství činidla blokujícího endogenní peroxidázu Peroxidase Block z láhve 1, aby byl vzorek pokryt. Inkubujte po dobu 5 (±1) minut. Jemně vzorek opláchněte destilovanou vodou nebo roztokem pufru z promývací láhve (proud nesmí být namířen přímo na tkáň) a umístěte do čerstvě připravené pufrové lázně. KROK 2 PRIMARY ANTIBODY (PRIMÁRNÍ PROTILÁTKA) NEBO NEGATIVE CONTROL REAGENT (NEGATIVNÍ KONTROLNÍ ČINIDLO) Poklepáním odstraňte přebytek pufru a otřete sklíčka stejným způsobem jako v předchozím kroku. Naneste takové množství optimálně ředěné primární protilátky nebo negativního kontrolního činidla, aby byl vzorek pokryt Inkubujte po dobu 30 (±1) minut. Jemně vzorek opláchněte roztokem pufru z promývací láhve (proud nesmí být namířen přímo na tkáň) a umístěte do čerstvě připravené pufrové lázně. Pokud je nutné barvení přerušit, je možné ponechat sklíčka po inkubaci primární protilátky v pufrové lázni (krok 2) při laboratorní teplotě (20–25 °C) maximáln ě po dobu jedné hodiny při pokojové teplotě (20–25 °C), aniž by byly výsledky barvení ovlivněny. KROK 3 PEROXIDASE LABELLED POLYMER (POLYMER ZNAČENÝ PEROXIDÁZOU) Poklepáním odstraňte přebytek pufru a otřete sklíčka stejným způsobem jako v předchozím kroku. Naneste takové množství značeného polymeru z láhve 2, aby byl vzorek pokryt. Inkubujte po dobu 30 (±1) minut. Opláchněte sklíčka stejným způsobem jako v kroku 2. KROK 4 SUBSTRATE-CHROMOGEN (SUBSTRÁT-CHROMOGEN) Otřete sklíčka stejným způsobem jako v předchozím kroku. Naneste takové množství roztoku substrát-chromogen AEC+ typu “ready-to-use“ z láhve 3, aby byl vzorek pokryt. Inkubujte po dobu 5–30 minut. Jemně vzorek opláchněte destilovanou vodou z promývací láhve (proud nesmí být namířen přímo na tkáň). Použitý roztok substrát-chromogen shromažďujte v nádobce na nebezpečné materiály, aby mohl být zlikvidován náležitým způsobem. KROK 5 HEMATOXYLIN COUNTERSTAIN (KONTRASTNÍ BARVIVO) (volitelný krok) Ponořte sklíčka do lázně vodného hematoxylinu (kód S3309). Délka inkubace závisí na koncentraci použitého hematoxylinu. Jemně sklíčka opláchněte v lázni s destilovanou vodou. Ponořte sklíčka 10krát do lázně 0,037 mol/L amoniaku nebo podobného modřidla Oplachujte sklíčka v lázni s destilovanou nebo deionizovanou vodou po dobu 2–5 minut. KROK 6 FIXACE MIKROSKOPICKÉHO PREPARÁTU Vzorky lze fixovat na sklíčka a pokrýt krycími sklíčky s použitím fixačního média na bázi vody, jako je například fixační médium Glycergel Mounting Medium (kód C0563) nebo médium Faramount (kód S3025) nebo bezvodé permanentní fixační médium Ultramount (kód S1964). (127908-001)
P04044CZ_01/K4004_K4005/2015.07 str. 4/6
Poznámka: Produkt reakce AEC je rozpustný v organických rozpouštědlech, takže permanentní fixační média na bázi toluenu nebo xylenu nejsou pro použití v kombinaci s tímto produktem vhodná. Poznámka: Sklíčka lze prohlížet kdykoli. Pokud však jsou sklíčka vystavena silnému světlu po dobu jednoho týdne, mohou preparáty poněkud vyblednout. Aby bylo vyblednutí minimální, uchovávejte sklíčka v temnu při pokojové teplotě (20–25 °C). Kontrola jakosti Odlišnosti při zpracování tkání a technických postupech používaných v laboratoři uživatele mohou být příčinou signifikantní proměnlivosti výsledků, takže kromě níže uvedených postupů je nutné pravidelné provádění kontrolních vyšetření v rámci příslušného pracoviště. Další informace naleznete v pokynech týkajících se kontroly jakosti v certifikačním programu organizace College of American Pathologists (CAP) pro imunohistochemii a v literárních odkazech 5 až 7. Podrobnosti týkající se citlivosti a imunoreaktivity naleznete ve specifikacích jednotlivých primárních protilátek. Další informace o pozitivních a negativních kontrolách naleznete v části "Obecné pokyny k imunohistochemickému barvení". Interpretace barvení Pokyny týkající se interpretace naleznete v části "Obecné pokyny k imunohistochemickému barvení". Omezení Vybarvení tkání závisí na správném zacházení s tkáněmi před barvením a na jejich správném zpracování. Nesprávná fixace, zmrazení, rozmrazení, promývání, sušení, zahřátí, zhotovení řezů nebo kontaminace jinou tkání nebo tekutinou mohou být příčinou vzniku artefaktů, nahromadění protilátek nebo falešně negativních výsledků. Použití starých nebo nepufrovaných fixačních prostředků nebo vystavení tkání nadměrně vysoké teplotě (vyšší než 60 °C) v pr ůběhu zpracovávání může mít za následek sníženou citlivost pro barvení. V hemoproteinech, jako je například hemoglobin, myoglobin, cytochrom a kataláza, a rovněž v eosinofilech lze zjistit aktivitu endogenní peroxidázy nebo pseudoperoxidázy. 8,9 Tuto aktivitu lze zablokovat inkubací vzorků s činidlem blokujícím peroxidázu (Peroxidase Block, láhev č. 1 v systému EnVision+ System, HRP) po dobu pěti minut před nanesením primární protilátky. Toto činidlo lze rovněž použít pro krevní roztěry, roztěry kostní dřeně a zmrzlé tkáně. Tento postup však neodstraní červenohnědý pigment hemoproteinů. Jako alternativu lze použít roztok metanolu a peroxidu vodíku. Při použití tohoto postupu může dojít k denaturaci některých antigenů. Tkáně osob infikovaných virem hepatitidy typu B, obsahující povrchový antigen viru hepatitidy B (HbsAg), se mohou nespecificky barvit křenovou peroxidázou. 10 Pokud jsou jako sekundární antiséra v blokačních krocích použita normální a neimunní séra stejného živočišného druhu, mohou být příčinou falešně negativních nebo falešně pozitivních výsledků, způsobených autoprotilátkami nebo přirozenými protilátkami. Činidla dodaná v tomto kitu byla optimálně naředěna. Další ředění může způsobit ztrátu schopnosti detekovat antigeny. Odstraňování problémů Problém 1. Žádné sklíčko není vybarveno.
2.
3.
Slabé vybarvení všech sklíček.
Nadměrné zbarvení pozadí u všech sklíček.
Pravděpodobná příčina 1a. Činidla nebyla použita ve správném pořadí. 1b. Azid sodný. 2a. Po promytí zůstalo v řezech příliš mnoho roztoku. 2b. Sklíčka nebyla dostatečně dlouho inkubovánas protilátkami nebo se substrátem. 3a. Vzorky mají vysokou aktivitu endogenní peroxidázy. 3b. Nebyl úplně odstraněn parafín.
3c. Řezy nebyly pořádně opláchnuty. 3d. Reakce substrátu byla rychlejší než obvykle například kvůli příliš vysoké laboratorní teplotě.
(127908-001)
Navrhovaná akce 1a. Zkontrolujte aplikaci činidel. 1b. Použijte čerstvý pufr bez azidu. 2a. Jemným poklepáním odstraňte přebytek roztoku a pak otřete okolí řezu. 2b. Je třeba zkontrolovat inkubační časy.
3a. Použijte delší čas inkubace pro činidlo blokující endogenní peroxidázu Peroxidase Block z láhve 1. 3b. Použijte čerstvou xylenovou nebo toluenovou lázeň. Pokud barvíte několik sklíček současně, druhá xylenová lázeň by měla obsahovat čerstvý xylen. 3c. Používejte čerstvé roztoky pro pufrové lázně a promývání. 3d. Použijte kratší dobu inkubace pro roztok substrátchromogen.
P04044CZ_01/K4004_K4005/2015.07 str. 5/6
3e. Řezy během barvení vyschly.
3e. Použijte vlhkou komůrku. Před aplikací činidla otřete současně pouze tři až čtyři sklíčka. 3f. Nespecifická vazba činidel 3f. Použijte blokující roztok, který obsahuje irelevantní na tkáňové řezy. protein. 3g. Protilátka je příliš 3g. Použijte vyšší ředění koncentrovaná. protilátky. POZNÁMKA: Pokud nelze vznik problému připsat žádné z výše uvedených příčin nebo pokud navrhovaná nápravná akce jako řešení problému selže, obraťte se s žádostí o další pomoc na službu technické podpory společnosti Dako. Další informace o technikách barvení a přípravě vzorků lze najít v následujících pramenech: Handbook -Immunochemical Staining Methods4 (dostupné u společnosti Dako), Atlas of Immunohistology11 a Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis.12 Literatura 1. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. “Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides.” DHHS (NIOSH) Publ. No. 78–127, Current 13. August 16, 1976 2. Center for Disease Control Manual Guide – Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA. “Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts”. April 30, 1976 3. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981; 81 4. Naish SJ (ed). Handbook–immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako 1989 5. Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836 6. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24-A:4 7. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66:194 8. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35:213 9. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; 46 10. Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626 11. Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 12. Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 Doplňková literatura Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3–8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20–25 Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20–25 Bisgaard K. EnVision Plus–Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20–25
Edition 07/15
(127908-001)
P04044CZ_01/K4004_K4005/2015.07 str. 6/6
