CYTOLOGIE 3. týden Jádro a jeho komponenty Buněčný cyklus, mitosa, meiosa Ústav histologie a embryologie MUDr. Radomíra Vagnerová, CSc. Předmět: Obecná histologie a obecná embryologie – 02241 Přednášky 2. paralelka 14. a 15. 10. 2013
JÁDRO – NUCLEUS Membránou ohraničený kompartment - u eukaryotických buněk obsahuje genetickou informaci - zajišťuje jejich autoreprodukci, diferenciaci, maturaci a funkci.
jádro s hrudkovitým chromatinem
Mikrofotografie: Sbírka ÚHIEM
měchýřkovité jádro s dobře patrným jadérkem
Stavební složky (komponenty) jádra buňky v interfázi chromatin (komplex DNA a proteinů) jadérko (nucleolus) obal jádra jaderná matrix
Jádro v interfázi - chromatin (komplex DNA a proteiny), jadérko (nucleolus), jaderný obal, jaderná matrix (nukleoplasma) - nukleoskelet, Jaderný obal - dvě membrány, perinukleární cisterna, jaderné póry, lamina fibrosa (laminy – IMF, k lamina fibrosa připojené chromosomy)
Jadérko - místo syntézy rRNA a tvorby ribosomových podjednotek nukleolární organizátor (sekvence bazí DNA kódujících rRNA), pars fibrosa (iniciální ribonukleoproteinová vlákna), pars granulosa (dozrávající ribosomy),
BUNĚČNÉ JÁDRO (schema) jádro lamina fibrosa
jadérko
HC
jaderný obal
F
ribosomy EC
G
heterochromatin (HC), euchromatin (EC), pars fibrosa (F), pars granulosa (G) Schéma: Junqueira, Carneiro, Basic Histol, 2003
JÁDRO - (elektronogram) perinukleolární heterochromatin
perinukleární prostor (cisterna)
(asociovaný s nukleolem)
euchromatin (EC) heterochromatin (HC)
NUKLEOLUS marginální heterochromatin (připojený k lamina fibrosa)
EC zevní jaderná membrána (perinukleární prostor)
ribosomy připojené k zevní jaderné membráně Elektronogram: Basic Histology, Junqueira, Carneiro, 2003
JADERNÝ OBAL • Světelný mikroskop – tenká linie ohraničující jádro • Elektronový mikroskop - obal tvořený dvěma membránami - perinukleární prostor (cisterna) – mezi oběma membránami k zevní membráně mohou být připojeny polyribosomy místy je membrána napojena na zrnité ER k vnitřní membráně - připojena lamina fibrosa (LF) - tenká elektrondenzní proteinová vrstva s funkcí jaderného skeletu. Je tvořená sítí intermediárních filament (IMF) složených z laminů (proteiny), navázaných na laminové receptory vnitřní jaderné membrány. LF zajišťuje připojení chromatinových vláken k vnitřní membráně jaderného obalu pomocí asociovaných proteinů Na počátku mitosy vymizí LF a laminy se uvolňují, na konci anafáze se laminy opět uspořádají do intermediárních filament a LF plní důležitou funkci při rekonstrukci jaderného obalu v telofázi.
- jaderné póry
JADERNÝ OBAL (šipky - jaderné póry)
Hitsology, Ross and Pawlina,, 2006
JADERNÉ PÓRY - elektronogram, metoda mrazového lomu
JADERNÉ PÓRY Okrouhlé až osmihranné (oktagonální) otvory v jaderném obalu o průměru 70 až 80 nm Jaderné póry - proteinové komplexy (složené z 50 různých proteinů - nukleoporinů), které protínají jaderný obal a vytvářejí nukleární pórový komplex
Selektivní obousměrný transport látek mezi jádrem a cytoplasmou Transport iontů a malých hydrofilních molekul - prostou difusí Transport velkých molekul (velké proteiny a makromolekulární komplexy) - založen na rozpoznání specifických signálních sekvencí uvnitř jádra (nukleární lokalizační signál a nukleární exportní sekvence) receptorovými molekulami (importiny, exportiny), které realizují transport pórovým kanálem za přítomnosti GTP, který zajišťuje pro transport energii Import do jádra - histony, laminy, ribosomové proteiny, transkripční faktory, hormony (steroidy) Export z jádra - ribosomové podjednotky, mRNA, tRNA, transkripční faktory
SCHEMA JADERNÉHO PÓROVÉHO KOMPLEXU Obvod póru – 8 proteinových podjednotek - osmiboká CYTOPLASMA centrální kostra - vložena mezi cytoplasmatický a nukleoplasmový zevní jaderná prstenec membrána Do cytoplasmy vstupuje z cytoplasmatického prstence 8 krátkých proteinových fibril
proteinové fibrily subjednotka cytoplasmatického prstence centrální kostra
vnitřní jaderná membrána
subjednotka nukleoplasmového prstence
lamina fibrosa (nukleární lamina) luminální podjednotka
jaderný koš
terminální prstenec Schéma: Histology, Ross, Pawlina, 2011
centrální pór JÁDRO
Nukleoplasmový prstenec - zakotven - do koše z osmi tenkých filament připojených k terminálnímu prstenci.
Vnitřní a zevní jaderná membrána perinukleární prostor (cisterna)
granulární ER (GER)
LAMINA FIBROSA (jaderná lamina)
jaderný pór jádro nukleární lamina fibrosa - síť intermediárních filament
DNA – vlákna chromatinu
Histology, Ross, Pawlina, 2006
Obraz sítě (metoda mrazového lomu)
JADERNÁ MATRIX (nukleoplasma) Vysoce dynamická struktura - vytváří otevřený kompartment pro volnou difusi látek v jádře • Amorfní hmota - z proteinů - enzymů, metabolitů a iontů • Jaderný skelet (nukleoskelet) - síť proteinových mikrofibril o průměru 2 až 3 nm; udržuje tvar jádra a uspořádání jeho struktur
• Lamina fibrosa jaderného obalu - k ní připojené proteinové mikrofibrily nukleoskeletu
• Tvar jádra, chromatinová struktura a počet nukleolů závisí na druhu buňky a její aktivitě • DNA (genetická informace) - replikace v S fázi buněčného cyklu Počet chromosomů - somatické buňky - 46 chromosomů - 23 párů = diploidní počet - 2n (jedna sada otcovských a jedna sada mateřských chromosomů); 22 párů homologických chromosomů + 1 pár heterochromosomů (pohlavní chromosomy XY nebo XX). V buňkách ženského pohlaví zůstává trvale jeden X kondensován – sex chromatin (Barrovo tělísko) - zralé pohlavní buňky (gamety) - 23 chromosomů = haploidní počet -1n Polyploidní počet chromosomů vzniká endomitosou (megakaryocyt až 64n)
• RNA - realizace genetické informace, vzniká traskripcí z DNA - tvořena jedním polynukleotidovým řetězcem - tři druhy- mRNA, tRNA a rRNA - tvorba specifických bílkovin (enzymů)
dlouhé raménko krátké raménko
chromatidy (sesterské)
Schema stavby chromosomu v metafázi
obr. Google
centromera
Chromosomy pozorované v transmisním EM (spermatogonie 1denního laboratorního potkana)
Karyotyp (sada chromosomů) somatické buňky. Mužské chromosomy isolované z buňky v mitose. (použití speciálních fluorescenčních barviv - FISH technika)
Elektronogram – Z. Jirsová
1
6
2
7
3
8
13
14
19
20
Histology, Ross, Pawlina, 2011
4
9
15
21
5
10
11
16
17
22
XY
12
18 XX chromosom z normálního karyotypu ženy
Molekula DNA se skládá ze dvou polynukleotidových řetězců uspořádaných do dvoušroubovice Stavební jednotkou chromatinu je nukleosom složený z oktamerního histonového jádra (8 histonů - H2A, H2B, H3 a H4 – každý typ ze dvou molekul), okolo kterého je dvakrát ovinutá molekula DNA. Další segment DNA s připojeným histonem H1 tvoří spojnici s následujícím nukleosomem. Šňůra nukleosomů se dále stáčí a vytváří chromatinovou fibrilu o průměru 30 nm, která se skládá v kličky. Kličky chromatinové fibrily zakotvené do chromosomové kostry (složené z nehistonových proteinů) tvoří chromatinové vlákno interfázového jádra. Podle stupně kondensace se jeví jako heterochromatin nebo euchromatin.
H1
H1
Heterochromatin tvoří úseky silně kondesovaných chromatinových vláken. Barví se hematoxylinem a dalšími basickými barvivy, dá se prokázat Feulgenovou reakcí. Euchromatin je složen z volně uspořádaných chromatinových vláken, kde je uložena převážná část transkribovaných genů
EUCHROMATIN HETEROCHROMATIN
V profázi buněčného dělení dochází k vystupňované kondenzaci chromatinových vláken do formy chromosomů Schéma: Histology, Ross, Pawlina, 2006
metafázový chromosom
SCHEMA NUKLEOSOMU Střední část - 8 histonových molekul (H2A, H2B, H3 a H4)
centrální DNA dvakrát obtočená (obsahuje kolem 150 bazí) vázající (připojovací) DNA
Schéma: Junqueira´s Basic Histology, Mescher, 2010
Nukleosomy - dynamické struktury, uvolnění H1 a despiralisace DNA umožní přístup dalších proteinů (transkripční faktory, enzymy) k DNA H1 histon
JADÉRKO (NUKLEOLUS) - není ohraničeno membránou, je místem syntézy rRNA a tvorby ribosomových podjednotek - na koncových úsecích pouze pěti chromosomů - geny pro rRNA - v interfázi probíhá transkripce (syntéza rRNA) - počet jadérek a jejich velikost závisí na metabolické aktivitě buňky Nukleolární organizátor (NO) - DNA kódující rRNA Pars fibrosa (PF) - ribonukleoproteinová vlákénka (5 -10 nm) - obsahují primární transkripty rRNA Pars granulosa (PG) -granulární materiál ze zrajících ribosomových podjednotek. Ribosomové proteiny - syntetizovány v cytoplasmě a transportovány do jádra, ribosomové podjednotky jsou exportovány nukleárními póry do cytoplasmy. Perinukleolární heterochromatin (NAC) - chromatin asociovaný s nukleolem NE – jaderný obal, C - cytoplasma Schéma: Junqueira´s Basic Histology, Mescher, 2010
Jadérko (nukleolus)
Elektronogram: Histology, Ross, Pawlina, 2006
Pars granulosa
Pars fibrosa
Fibrilární centrum Molecular Biology of the Cell, Alberts et al., 2002
(nukleolární organizátor – DNA kódující rRNA)
Jadérko v jádru nervové buňky
Transmisní EM fibrilární centra (FC, organizátor nukleolu) a nukleolonemata
SM - barvení hematoxylin-eosin jadérko (šipka)
JADÉRKA FC
Nukleolonemata (síť z fibrilárního a granulárního materiálu)
Elektronogram: Histology, Ross, Pawlina, 2006
Wheater´s Functional Histology, 2011
BUNĚČNÝ CYKLUS Morfologické a biochemické pochody v buňkách mezi jejich vznikem a rozdělením na dvě dceřinné buňky Čtyři fáze buněčného cyklu: G1 - (presyntéza) buněčný růst, syntéza RNA a proteinů, obnovení objemu buňky, některé buňky - příprava na diferenciaci (G0) S - syntéza DNA, replikace DNA, chromosomy tvořené dvěma chromatidami G2 - syntéza RNA a proteinu (tubulin), tvorba a akumulace energie pro nadcházející mitózu M - mitosa - vznik identických dceřinných buněk se stejným množstvím chromosomů a obsahem DNA
Regulace buněčného dělení - rozhodující pro normální vývoj
mnohobuněčných organismů (ztráta kontroly může vést k nádorovému bujení)
Kontrola buněčného cyklu - CYKLINY a CYKLIN-dependentní kináza TUMOR - SUPRESOROVÉ GENY - kontrola normální buněčné proliferace
SCHEMA BUNĚČNÉHO CYKLU Restrikční uzlové body (branky) - pokračování umožňují CYKLINY a CYKLIN-dependentní kinázy (CDK)
G2 - post DNA duplikace
syntéza tubulinu příprava na vznik mitotického vřeténka
oddělování chromosomů (vznik chromatid)
NBP (neproliferující buněčná populace)
bod kontroly úplnosti replikace DNA G1 - presyntéza DNA S - replikace DNA restrikční bod
PBP (proliferující buněčná populace)
Schéma: Histology, Ross, Pawlina, 2006
MITOSA Dělení buněčného jádra s následným rozdělením buňky na dvě dceřinné buňky, geneticky identické s mateřskou buňkou
FÁZE MITOSY • Profáze - kondenzace replikovaných chromosomů ( spojené chromatidy COHESINEM – chromatin vázající protein) spojených v místě centromery; tvorba mitotického vřeténka mezi centrosomy – rozestupují se od sebe
prometafáze - dezintegrace jaderného obalu (fosforylace nukleárních laminů - intermediární filamenta lamina fibrosa) - rozpad jaderného obalu; připojení chromosomů svými kinetochorami k mikrotubulům vřeténka; nejsou patrné nukleoly
• Metafáze - centriolové páry na pólech buňky, chromosomy v ekvatoriální rovině (metafázová ploténka), párové kinetochorové mikrotubuly na každém chromosomu jsou připojeny k opačným pólům vřeténka; mizí jaderný obal (vesikuly)
pól vřeténka
PROTEINY ASOCIOVANÉ s mikrotubuly
replikovaný chromosom (sest. chromatidy)
astrální mikrotubuly (nepřipojené)
kinetochora
kinetochorové mikrotubuly
polární mikrotubuly
Molecular Biology of the Cell, Alberts et al., 2002
Pól mitotického vřeténka - centrosom (pár centriolů obklopený amorfní proteinovou matrix) - MTOC (mikrotubuly organizující centrum); mikrotubuly připojené svými (-)konci • POLÁRNÍ mikrotubuly – spojují oba póly mitotického vřeténka, mezi mikrotubuly vzájemné interakce PROTEINY ASOCIOVANÝMI s mikrotubuly (stabilisace jejich (+)konců a tím menší pravděpodobnost depolymerace); základní kostra vřeténka • KINETOCHOROVÉ mikrotubuly – po rozpadu jádra některé mikrotubuly vyrůstají svými (-)konci z MTOC centriolů a zapojují se do kinetochor - každý zreplikovaný chromosom je připojen k oběma pólům vřeténka • ASTRÁLNÍ mikrotubuly – ukotvení centrosomů k buněčné membráně
• Anafáze - cohesinová spojení mezi chromatidami se rozštěpí SEPARASOU (proteolytický enzym), oddělení sesterských chromatid anafáze A - zkracování kinetochorových mikrotubulů depolymerací od (+) konce (od kinetochory) - chromatidy směřují k opačným pólům mitotického vřeténka anafáze B - vzdalují se póly vřeténka - polární mikrotubuly polymerují, prodlužují se a klouzavým pohybem po sobě tlačí oba póly od sebe; astrální mikrotubuly pólů vřeténka táhnou póly směrem k povrchu buňky - hybné síly - mikrotubulární motorové proteiny (kinesinové motory) anafáze A i B – průběh současně anafáze A
chromosomy k opačným pólům vřeténka
Molecular Biology of the Cell, Alberts et al., 2002
anafáze B
vzdalování pólů 1 - klouzavá síla mezi polárními mikrotubuly 2 - tažná síla přímo na póly vřeténka
polymerace polárních mirotubulů na (+) konci
• Telofáze - rekonstrukce jaderného obalu (defosforylace laminů), dekondensace chromosomů, obnova jadérek
• Cytokinese - prodloužení buněk, zaškrcení uprostřed mezi póly mitotického vřeténka („štěpná brázda“); separace je způsobena pásovitým zaškrcením (aktinová filamenta, myosin)
Molecular Biology of the Cell, Alberts et al., 2002
jaderná membrána
centrioly MTOC
centroméra PROFÁZE
mikrotubuly vřeténka pól mitotického vřeténka
mikrotubuly kinetochory
PROMETAFÁZE
zbytky jaderného obalu - vesikuly
polární mikrotubuly
ekvatoriální rovina
METAFÁZE
Schéma: Stevens and Lowe, Histology, 1993
Kerr, Functional Histol, 2010
vesikuly jaderného obalu migrují k pólům
prodloužení polárních mikrotubulů
ANAFÁZE chromatidy směřují k pólům
zkrácení mikrotubulů kinetochor
dekondenzace chromosomů
TELOFÁZE
obnova jaderného obalu
centrioly CYTOKINEZE
akto-myosinové zaškrcení
Schéma: Stevens and Lowe, Histology, 1993
Kerr, Functional Histol, 2010
M
M M
M
M
M
mitotické figury - M M
mitóza (leukocyty)
M
MEIOSA - redukční dělení pohlavních buněk (gametogenese) – vznik buněk s haploidním počtem chromosomů - do každé zárodečné buňky – pouze jedna sada chromosomů z původní diploidní buňky
Meiosa I – první zrací dělení PROFÁZE I - dlouhá - pět stádií
• LEPTOTEN - kondenzace chromatinu, každý homologický chromosom - ze dvou sesterských chromatid ; chromosomy připojené k jadernému obalu • ZYGOTEN - seskupení homolog. chromosomů do párů – synapse (konjugace), vytvoření synaptonemálních komplexů mezi homologickými chromosomy homologické chromosomy
nesesterské chromatidy
počátek vzniku synaptonemálního komplexu SYNAPSE
centromera sesterské chromatidy jaderný obal
LEPTOTEN
otcovský X nebo Y chromosom mateřský X chromosom
počátek konjugace (synapse) homolog. chromosomů
centrioly
ZYGOTEN
Histol and Cell Biol. Kierszenbaum, 2007
• PACHYTEN - homologické chromosomy - po délce zcela spojeny synaptonemálním komplexem - kompletní synapse (bivalenty); COHESIN- upevňuje spojení mezi sesterskými chromatidami; rekombinační uzlíky (kolem 90 nm) - přerušení a překřížení (crossing-over) nesesterských chromatid – výměna úseků chromatid (genových lokusů); rekombinace (opětovná rekonstrukce chromatid); chiasmata (dočasná spojení míst výměny - jejich počet odpovídá počtu překřížení) • DIPLOTEN - oddělení homologických chromosomů (bivalentů) - disjunkce (desynapse) - začíná v místě centromery směrem k periferii jádra; přetrvává spojení bivalentů jedním nebo více chiasmaty v místech, kde proběhl crossing-over; přesun chiasmat ke konci chromosomu (terminalisace) - na konci stádia; replikace centriolů • DIAKINESE – kondenzace chromosomů (zkracují se, dosahují maximální tloušťky), dezintegrace jaderného obalu, uvolnění chromosomů ze spojení s jaderným obalem; tvoří se dělící vřeténko centromera
synaptonemální komplex
disjunkce (desynapse) chiasma chromosomů
crossing-over rekomb. uzlík
PACHYTEN
chiasma (morfologická representace crossing-over)
chiasma
COHESIN
DIPLOTEN
DIAKINESE
mikrotubuly vřeténka
Histol and Cell Biol. Kierszenbaum, 2007
METAFÁZE I - metafázové uspořádání chromosomů v - ekvatoriální rovině; homologické chromosomy v časné metafázi ještě spojeny chiasmaty; později uvolnění chiasmat ANAFÁZE I - homologické chromosomy - homology (spojené cohesinovými komplexy a centromérami) se od sebe oddělí činností dělícího vřeténka a putují k protilehlým pólům buňky; náhodná distribuce homologů ( mateřský nebo otcovský homologický chromosom je náhodně navázán na různém místě metafázové ploténky) do dceřiných buněk - přispívá ke genetické rozmanitosti
TELOFÁZE I – oddělení dceřiných buněk s haploidním počtem chromosomů (tvořené dvěma chromatidami) PO PRVNÍM ZRACÍM DĚLENÍ NEDOCHÁZÍ K SYNTÉZE (REPLIKACI DNA)
Meiosa II – druhé zrací dělení - nastupuje bez S fáze charakter mitózy – profáze II, metafáze II, anafáze II, telofáze II enzym SEPARASA (proteasa) rozštěpí COHESIN PROTEINOVÝ KOMPLEX mezi sesterskými chromatidami, dojde k uvolnění vazby v oblasti centromer a oddělení sesterských chromatid – vzniknou dceřiné buňky s haploidním počtem jednoduchých chromosomů - chromatid (1n) a s polovičním obsahem DNA (1d)
Při oplození - obnoví se diploidní počet chromosomů (46) - počet chromosomů nevzrůstá
PREMITOTICKÁ/MEIOTICKÁ FÁZE dva páry homologických chromosomů
MITOSA
G1 fáze
G2 fáze
MEIOSA
profáze I
profáze LEPTOTEN
ZYGOTEN PACHYTEN
DIAKINESE
metafáze I
metafáze SPERMATOGENESE
anafáze
DIPLOTEN
OOGENESE
anafáze I
MEIOSA I telofáze
telofáze I
dceřiné buňky
metafáze II
první pólové tělísko
MEIOSA II Buňky produkované mitosou - geneticky identické
spermatidy
spermie Schéma: Histology, Ross, Pawlina, 2011
druhá pólová tělíska
zralý oocyt
Buňky vzniklé meisou - geneticky specifické (jedinečné)
