Buňka V Jádro. Buněčný cyklus a buněčné dělení (mitosa).
Ústav histologie a embryologie 1. LF UK Autor: doc. MUDr. Tomáš Kučera, Ph.D. Předmět: Obecná histologie a obecná embryologie, kód B02241 Datum: 14.10.2013
JÁDRO – NUCLEUS Membránou ohraničený kompartment - obsahuje genetickou informaci
Různý počet, velikost a nukleo-plasmový poměr Syncytia
Jádro v interfázi - chromatin (komplex DNA a proteiny), jadérko (nucleolus), jaderný obal jaderná matrix (nukleoplasma) – „nukleoskelet „ Jaderný obal - dvě membrány, perinukleární cisterna, jaderné póry, fibrózní lamina (laminy, k fibrózní lamině připojené chromosomy) Jadérko - místo syntézy rRNA a tvorby ribosomových podjednotek nukleolární organizátor (sekvence bazí DNA kódujících rRNA), pars fibrosa (iniciální ribonukleoproteinová vlákna), pars granulosa (dozrávající ribosomy),
BUNĚČNÉ JÁDRO (schema) jádro lamina fibrosa
jadérko
HC
jaderný obal
F
ribosomy EC
G
jadérko
heterochromatin (HC), euchromatin (EC), pars fibrosa (F), pars granulosa (G) Schéma: Junqueira, Carneiro, Basic Histol, 2003
BUNĚČNÉ JÁDRO (elektronogram)
euchromatin (EC) heterochromatin (HC)
NUKLEOLUS marginální heterochromatin (připojený k lamina fibrosa) EC zevní jaderná membrána (perinukleární prostor) ribosomy připojené k zevní jaderné membráně Elektronogram: Basic Histology, Junqueira, Carneiro, 2003
JADERNÝ OBAL • Světelný mikroskop – tenká linie ohraničující jádro • Elektronový mikroskop - obal tvořený dvěma membránami - perinukleární prostor (cisterna) – mezi oběma membránami k zevní membráně mohou být připojeny polyribosomy místy je membrána napojena na gER k vnitřní membráně - připojena lamina fibrosa (LF) - Je tvořená sítí intermediárních filament (IMF) složených z laminů (proteiny), navázaných na laminové receptory vnitřní jaderné membrány. Na počátku mitosy vymizí LF a laminy se uvolňují, na konci anafáze se laminy opět uspořádají do intermediárních filament a LF plní důležitou funkci při rekonstrukci jaderného obalu v telofázi.
- jaderné póry
JADERNÝ OBAL (šipky - jaderné póry)
Hitsology, Ross and Pawlina,, 2006
JADERNÉ PÓRY - elektronogram, metoda mrazového lomu
JADERNÉ PÓRY Okrouhlé až osmihranné (oktagonální) otvory v jaderném obalu o průměru 70 až 80 nm Jaderné póry - proteinové komplexy (složené z 50 různých proteinů - nukleoporinů), které protínají jaderný obal a vytvářejí nukleární pórový komplex
Selektivní obousměrný transport látek mezi jádrem a cytoplasmou Transport iontů a malých hydrofilních molekul - prostou difusí Transport velkých molekul (velké proteiny a makromolekulární komplexy) - založen na rozpoznání specifických signálních sekvencí uvnitř jádra (nukleární lokalizační signál a nukleární exportní sekvence) receptorovými molekulami (importiny, exportiny), které realizují transport pórovým kanálem za přítomnosti GTP, který zajišťuje pro transport energii Import do jádra - histony, laminy, ribosomové proteiny, transkripční faktory, hormony (steroidy) Export z jádra - ribosomové podjednotky, mRNA, tRNA, transkripční faktory
SCHEMA JADERNÉHO PÓROVÉHO KOMPLEXU Obvod póru – 8 proteinových podjednotek - osmiboká CYTOPLASMA centrální kostra - vložena mezi cytoplasmatický a nukleoplasmový zevní jaderná prstenec membrána Do cytoplasmy vstupuje z cytoplasmatického prstence 8 krátkých proteinových fibril
proteinové fibrily subjednotka cytoplasmatického prstence centrální kostra
vnitřní jaderná membrána
subjednotka nukleoplasmového prstence
lamina fibrosa (nukleární lamina) luminální podjednotka
jaderný koš
terminální prstenec Schéma: Histology, Ross, Pawlina, 2011
centrální pór JÁDRO
Nukleoplasmový prstenec - zakotven - do koše z osmi tenkých filament připojených k terminálnímu prstenci.
Vnitřní a zevní jaderná membrána perinukleární prostor (cisterna)
granulární ER (GER)
LAMINA FIBROSA (jaderná lamina)
jaderný pór jádro nukleární lamina fibrosa - síť intermediárních filament
DNA – vlákna chromatinu
Histology, Ross, Pawlina, 2006
Obraz sítě (metoda mrazového lomu)
JADERNÁ MATRIX (nukleoplasma) Vysoce dynamická struktura - vytváří otevřený kompartment pro volnou difusi látek v jádře
• DNA (genetická informace) - replikace v S fázi buněčného cyklu Počet chromosomů - somatické buňky - 46 chromosomů - 23 párů = diploidní počet - 2n (jedna sada otcovských a jedna sada mateřských chromosomů); 22 párů homologických chromosomů + 1 pár heterochromosomů (pohlavní chromosomy XY nebo XX). V buňkách ženského pohlaví zůstává trvale jeden X kondensován – sex chromatin (Barrovo tělísko) - zralé pohlavní buňky (gamety) - 23 chromosomů = haploidní počet -1n Polyploidní počet chromosomů
• RNA - realizace genetické informace, vzniká transkripcí z DNA - tvořena jedním polynukleotidovým řetězcem - tři druhy- mRNA, tRNA a rRNA - tvorba specifických bílkovin (enzymů) dlouhé raménko krátké raménko
chromatidy (sesterské)
Schema stavby chromosomu v metafázi
obr. Google
centromera
Chromosomy pozorované v transmisním EM (spermatogonie 1denního laboratorního potkana)
Karyotyp (sada chromosomů) somatické buňky. Mužské chromosomy isolované z buňky v mitose. (použití speciálních fluorescenčních barviv - FISH technika)
Elektronogram – Z. Jirsová
1
6
2
7
3
8
13
14
19
20
Histology, Ross, Pawlina, 2011
4
9
15
21
5
10
11
16
17
22
XY
12
18 XX chromosom z normálního karyotypu ženy
Molekula DNA se skládá ze dvou polynukleotidových řetězců uspořádaných do dvoušroubovice Stavební jednotkou chromatinu je nukleosom složený z oktamerního histonového jádra (8 histonů - H2A, H2B, H3 a H4 – každý typ ze dvou molekul), okolo kterého je dvakrát ovinutá molekula DNA. Další segment DNA s připojeným histonem H1 tvoří spojnici s následujícím nukleosomem. Šňůra nukleosomů se dále stáčí a vytváří chromatinovou fibrilu o průměru 30 nm, která se skládá v kličky. Kličky chromatinové fibrily zakotvené do chromosomové kostry (složené z nehistonových proteinů) tvoří chromatinové vlákno interfázového jádra. Podle stupně kondensace se jeví jako heterochromatin nebo euchromatin.
H1
H1
Heterochromatin tvoří úseky silně kondensovaných chromatinových vláken. Barví se hematoxylinem a dalšími basickými barvivy, dá se prokázat Feulgenovou reakcí. Euchromatin je složen z volně uspořádaných chromatinových vláken, kde je uložena převážná část transkribovaných genů
EUCHROMATIN HETEROCHROMATIN
V profázi buněčného dělení dochází k vystupňované kondenzaci chromatinových vláken do formy chromosomů Schéma: Histology, Ross, Pawlina, 2006
metafázový chromosom
SCHEMA NUKLEOSOMU Střední část - 8 histonových molekul (H2A, H2B, H3 a H4)
centrální DNA dvakrát obtočená (obsahuje kolem 150 bazí) vázající (připojovací) DNA
Schéma: Junqueira´s Basic Histology, Mescher, 2010
Nukleosomy - dynamické struktury, uvolnění H1 a despiralisace DNA umožní přístup dalších proteinů (transkripční faktory, enzymy) k DNA H1 histon
JADÉRKO (NUKLEOLUS) - není ohraničeno membránou, je místem syntézy rRNA a tvorby ribosomových podjednotek - na koncových úsecích pouze pěti chromosomů - geny pro rRNA - v interfázi probíhá transkripce (syntéza rRNA) - počet jadérek a jejich velikost závisí na metabolické aktivitě buňky Nukleolární organizátor (NO) - DNA kódující rRNA Pars fibrosa (PF) - ribonukleoproteinová vlákénka (5 -10 nm) - obsahují primární transkripty rRNA Pars granulosa (PG) -granulární materiál ze zrajících ribosomových podjednotek. Ribosomové proteiny - syntetizovány v cytoplasmě a transportovány do jádra, ribosomové podjednotky jsou exportovány nukleárními póry do cytoplasmy. Perinukleolární heterochromatin (NAC) - chromatin asociovaný s nukleolem NE – jaderný obal, C - cytoplasma Schéma: Junqueira´s Basic Histology, Mescher, 2010
Jadérko (nucleolus)
Elektronogram: Histology, Ross, Pawlina, 2006
Pars granulosa
Pars fibrosa
Fibrilární centrum Molecular Biology of the Cell, Alberts et al., 2002
(nukleolární organizátor –DNA kódující rRNA)
Jadérko v jádru nervové buňky
Transmisní EM fibrilární centra (FC, organizátor nukleolu) a nukleolonemata
SM - barvení hematoxylin-eosin jadérko (šipka)
FC
Nukleolonemata (síť z fibrilárního a granulárního materiálu)
Elektronogram: Histology, Ross, Pawlina, 2006
Wheater´s Functional Histology, 2011
SCHEMA BUNĚČNÉHO CYKLU
G2 - post DNA duplikace duplikace
syntéza tubulinu syntéza tubulinu příprava příprava na na vznik vznik mitotického vřeténka mitotického vřeténka
oddělování oddělování chromosomů chromosomů (vznik chromatid) (vznik chromatid)
NBP (neproliferující buněčná populace)
bod kontroly úplnosti replikace DNA G1 - presyntéza DNA DNA S - replikace DNA restrikční bodbod
PBP (proliferující buněčná populace) Schéma: Histology, Ross, Pawlina, 2006
BUNĚČNÝ CYKLUS
•
U většiny buněk vyzrálých tkání neprobíhá buněčný cyklus, protože se nacházejí v klidové fázi (G0). Tyto buňky jsou plně diferencovány a každá plní specifické funkce. Mitotické figury jsou proto ve vyzrálých tkáních poměrně vzácné.
•
I diferencované buňky mohou pod vlivem mitogenních faktorů (růstových faktorů) opět vstoupit do buněčného cyklu a znovu se množit. V jiných tkáních jsou přítomny kmenové buňky a populace nezralých mitoticky aktivních buněk, které zajišťují náhradu za odumřelé diferencované buňky.
BUNĚČNÝ CYKLUS Klíčovou událostí mezi děleními buněk je S-fáze. Slouží ke zdvojení (replikaci) DNA, stejně jako histonů a regulačních proteinů v každém chromosomu. Proteinový komplex (kohesin) slouží tomu, aby sesterské chromatidy držely až do příští mitosy pohromadě. M- a S-fáze jsou odděleny dvěma časovými mezerami (gaps), G1-fází a G2-fází. V obou G-fázích je na genetickém materiálu provedena kontrola chyb a ty jsou v případě potřeby opraveny, aby byl v následujícím dělení jako bezchybný předán do dceřinných buněk. Před přechodem z jedné fáze do další je zařazen kontrolní bod, v němž je cyklus v případě poškození DNA zastaven. Tak je získán čas pro případnou opravu poškození, nebo je buňka apoptosou stažena z oběhu. V G1-fázi se rozhoduje také o tom, zda buňka vůbec překoná hranici (restrikční bod) dalšího běhu cyklu; to se stane pouze vlivem mitogenních faktorů. Jinak je buňka vyřazena z cyklu a vstupuje do G0-fáze, v níž buď pod vlivem diferenciačních faktorů vyzrává, nebo apoptosou zaniká.
REGULACE BUNĚČNÉHO CYKLU Průběh buněčného cyklu je přísně regulován a jištěn. Pro postup jsou důležité enzymy specifické pro řízení cyklu – proteinkinasy, cyklindependentní kinasy, CDK), které se aktivují díky tvorbě komplexů s určitými proteiny, cykliny.
CDK jsou trvale přítomné, cykliny jsou (vzhledem k jejich přesně programované tvorbě a odbourávání vždy k disposici jen krátký čas). Pokračování dané fáze cyklu a postup do další je možný pouze, když pro fázi specifický cyklin/CDKkomplex dosáhne efektivní úrovně a aktivita komplexu není inhibitory snížena.
REGULACE BUNĚČNÉHO CYKLU
BUNĚČNÝ CYKLUS V G1-fázi proběhne: (a) zvětšení na velikost mateřské buňky (synthesa ribosomů, proteinů, biomembrán, atd.); doplnění stavu buněčných organel, (b) prověření DNA na možné chyby po předchozí mitose a jejich oprava (c) přírodní „proliferativní brzda“ je např. retinoblastomový protein, který znemožňuje překročení prahu (restrikčního bodu) do S-fáze. Tento práh může být překonán pouze tehdy, když se tato brzda uvolní stimulačním působením mitogenních faktorů (inaktivace Rbproteinu). Za restrikčním bodem nejsou již takové stimuly pro pokračování cyklu zapotřebí. V G2-fázi jsou DNA zkontrolovány a opraveny případné chyby vzniklé při jejich zdvojování. Kontrolní body. V každé fázi cyklu jsou připraveny nouzové mechanismy, jimiž může být cyklus zpomalen nebo zastaven, pokud dílčí kroky nejsou řádně dokončeny; G1/S-kontrolní bod před vstupem do S-fáze; v průběhu S-fáze; G2/Mkontrolní bod před vstupem do M-fáze; kontrolní bod dělícího vřeténka před vstupem do anafáze.
MITOSA •
•
PROFÁZE – již během S-fáze jsou centrioly zdvojeny a leží jako dva centriolové páry v jednom centrosomovém komplexu. Buňka se zakulacuje. Centrosomový komplex se rozděluje ve dva sesterské centrosomy, které se od sebe vzdalují a organizují vznik mitotického vřeténka. To se skládá z bipolárně seskupených mikrotubulů a proteinů molekulárního motoru. Mikrotubuly jsou svými (-) konci zakotveny k centrosomům a tvoří tak póly dělícího vřeténka. Chromosomy začínají být viditelné díky postupné kondenzaci. Jaderný obal se rozpadá v drobné vesikuly. Tak získávají (+) konce mikrotubulů vřeténka přístup k chromosomům a mohou se připojit ke kinetochorám (kinetochorové mikrotubuly). Toto období je někdy označováno jako PROMETAFÁZE. METAFÁZE – všechny chromosomy se svými kinetochorami sestaví do jedné (ekvatoriální), roviny jež je ve středu vřeténka a kolmá k jeho ose (metafázová ploténka). Zůstane-li i jen jediná nepřipojena, mitosa se zastaví (kontrolní bod vřeténka).
jaderná membrána
centrioly MTOC
centroméra PROFÁZE
mikrotubuly vřeténka pól mitotického vřeténka
mikrotubuly kinetochory
PROMETAFÁZE
zbytky jaderného obalu - vesikuly
polární mikrotubuly
ekvatoriální rovina
METAFÁZE
Schéma: Stevens and Lowe, Histology, 1993
Kerr, Functional Histol, 2010
MITOSA •
ANAFÁZE – oddělování sesterských chromatid. Rozštěpí se poslední kohesinová propojení enzymem separasou. Kinetochorové mikrotubuly se začínají díky depolymeraci na (+) koncích zkracovat. Tak jsou chromatidy od sebe odtahovány a svými kinetochorami se přibližují k pólům dělícího vřeténka. Buňka se protahuje.
•
TELOFÁZE - rozpad dělícího vřeténka, začínající dekondensace rozdělených chromatid a nově se tvoří jaderný obal. Začíná se zaškrcovat buněčné tělo (dělící rýha) jako důsledek působení kontrakčního prstence z aktinových filament a myosinu II.
•
Cytokinese ukončuje dělení a znamená úplné rozdělení buněčného těla.
vesikuly jaderného obalu migrují k pólům
prodloužení polárních mikrotubulů
ANAFÁZE chromatidy směřují k pólům
zkrácení mikrotubulů kinetochor
dekondenzace chromosomů
TELOFÁZE
obnova jaderného obalu
centrioly CYTOKINEZE
akto-myosinové zaškrcení
Schéma: Stevens and Lowe, Histology, 1993
Kerr, Functional Histol, 2010
