KREV Krev, krevní elementy Zhotovení, barvení a hodnocení krevního nátěru Leukogram, jeho diagnostický význam
Ústav histologie a embryologie MUDr. Filip Wagner Předmět: Obecná histologie a obecná embryologie B02241 1
KREV • plasma • formované elementy – červené krvinky (bezjaderné) (méně než 1 % jsou retikulocyty) – bílé krvinky • agranulocyty (lymfocyty a monocyty) • granulocyty (eosinofilní, basofilní a neutrofilní)
– krevní destičky (nebuněčné elementy)
Funkce krve • přenos kyslíku a oxidu uhličitého • stálá výměna vody a iontů mezi krví a intersticiální tekutinou • udržování acidobazické rovnováhy • účast na imunitních reakcích, zánětových reakcích a na hojení ran • transportní funkce • výměna informací a komunikace mezi tkáněmi a orgány organismu (hormony, růstové faktory, cytokiny) • schopnost setrvat v tekutém stavu a udržovat reologické vlastnosti, schopnost koagulace a zpětného „zkapalnění“
Periferní krevní obraz Parametry krevního obrazu - analyzátor
jednotka
ženy
muži
Leukocyty - počet (WBC)
109/l
4,0 - 10,0
4,0 - 10,0
Erytrocyty - počet (RBC)
1012/l
3,80 - 5,20
4,00 - 5,80
Hemoglobin - koncentrace (HGB)
g/l
120 - 160
135-175
Hematokrit (HCT)
l/l
0,350 - 0,470
0,400 - 0,500
Střední objem erytrocytů (MCV)
fl
82,0 - 98,0
82,0 - 98,0
Střední množství hemoglobinu v erytrocytu (MCH)
pg
28 - 34
28 – 34
Střední koncentrace hemoglobinu v erytrocytech (MCHC)
g/l
320 - 360
320 – 360
Šíře distribuce erytrocytů - směrodatná odchylka (RDW-SD)
fl
37,0 - 54,0
37,0 - 54,0
Šíře distribuce erytrocytů - variační koeficient (RDW-CV)
%
10,0 - 15,2
10,0 - 15,2
109/l
150 - 400
150 – 400
Střední objem trombocytů (MPV)
fl
7,8 - 11,0
7,8 - 11,0
Šíře distribuce trombocytů - směrodatná odchylka (PDW-SD)
fl
9,0 - 17,0
9,0 - 17,0
Šíře distribuce trombocytů - variační koeficient (PDW-CV)
%
12,0-18,0
12,0-18,0
Šíře distribuce trombocytů - variační koeficient - ADVIA (PDW-CV)
%
25,0 - 65,0
25,0 - 65,0
ml/l
1,2 - 3,5
1,2 - 3,5
%
0,5 - 2,5
0,5 - 2,5
109/l
25 - 100
25 - 100
Trombocyty - počet (PLT)
Destičkový hematokrit (PCT) Retikulocyty - relativní počet (RET) Retikulocyty - absolutní počet (RET#)
Krevní nátěr Odběr a manipulace s biologickým materiálem: • periferní krev odebraná do K3EDTA • stabilita vzorku do zhotovení nátěru: max. 5 hodin (při laboratorní teplotě) • uchování nátěru na skle do doby vyšetření: – fixovaný nenabarvený nátěr lze skladovat až několik týdnů před vlastním barvením (při laboratorní teplotě) – fixovaný a nabarvený nátěr vydrží až několik let (při laboratorní teplotě) – nefixovaný nátěr nelze dlouhodobě skladovat
Fixace nátěrů – je nezbytná v případě uchovávání nenabarvených skel, pro rutinní barvení nátěrů se nevyžaduje – rovnoměrné nátěry krve na skle je nutné nechat minimálně 10 minut zaschnout při laboratorní teplotě – v kyvetě fixovat nátěry 5 minut metanolem, nátěry nechat zaschnout
Zhotovení krevního nátěru
Barvení dle Pappenheima • panoptické barvení • roztoky: May – Grünwald Giemsa – Romanovski
• klasický postup: – neředěné May-Grünwaldovo barvivo (3 minuty) – následně se barvivo na preparátu zředí stejným dílem destilované vody a nechá se působit 1 minutu – barvivo se slije a bez oplachu se převrství Giemsovým roztokem /1 díl barviva na 10 dílů redestilované vody/ (15 minut)
periferní krev
Laboratorní postup barvení nátěru 1. Pracovní roztoky • fixační roztok 1: pracovní čistý roztok May-Grünwald • promývací roztok 2: fosfátový pufr pH 6,7 – 6,8 • barvicí roztok 3: ředit 1 díl roztoku Giemsa-Romanowski (před použitím přefiltrovat) s 9 díly fosfátového pufru pH 6,7 – 6,8 • promývací roztok 4: čistý fosfátový pufr pH 6,7 – 6,8 • promývací roztok 5: čistý fosfátový pufr pH 6,7 – 6,8 2. Fixace a barvení nátěrů • rovnoměrné nátěry krve na skle je nutné nechat minimálně 10 minut zaschnout při laboratorní teplotě. • v první kyvetě nátěry fixovat 10 minut fixačním roztokem 1 (fixační roztok nesmí přijít do kontaktu s vodou) • ve druhé kyvetě nátěry oplachovat roztokem 2 • ve třetí kyvetě nátěry barvit 10 minut barvicím roztokem 3 • ve čtvrté kyvetě nátěry opláchnout roztokem 4 • v páté kyvetě nátěry opláchnout roztokem 5 • nátěry řádně opláchnout pod tekoucí vodou a nechat zaschnout
Erytrocyty • bezjaderné, tvar bikonkávního disku • v izotonickém prostředí průměr 7,5 µm • v zaschlém krevním nátěru průměr 7,2 µm • makrocyty (nad 9 µm) a mikrocyty (pod 6 µm) • retikulocyty – mladá forma, obsahují rRNA
Trombocyty • krevní destičky • bezjaderné diskoidní buněčné fragmenty • vznikají fragmentací magakaryocytů • denzní tělíska (δ granula), α granula, λ granula • úloha krevních destiček ve srážení
Diferenciální rozpočet - analyzátor Parametry diferenciálu - analyzátor
jednotka
ženy
muži
Neutrofily
%
45,0 - 70,0
45,0 - 70,0
Lymfocyty
%
20,0 - 45,0
20,0 - 45,0
Monocyty
%
2,0 - 12,0
2,0 - 12,0
Eozinofily
%
0,0 - 5,0
0,0 - 5,0
Bazofily
%
0,0 - 2,0
0,0 - 2,0
Neutrofily
109/l
2,00 - 7,00
2,00 - 7,00
Lymfocyty
109/l
0,80 - 4,00
0,80 - 4,00
Monocyty
109/l
0,08 - 1,20
0,08 - 1,20
Eozinofily
109/l
0,00 - 0,50
0,00 - 0,50
Bazofily
109/l
0,00 - 0,20
0,00 - 0,20
Diferenciální rozpočet bílých krvinek manuální Parametry diferenciálu - mikroskop
jednotky
ženy
muži
Neutrofilní segmenty
%
47 - 70
47 - 70
Neutrofilní tyče
%
0-4
0-4
Lymfocyty
%
20 - 45
20 - 45
Monocyty
%
2 - 10
2 - 10
Eozinofily
%
0-5
0-5
Bazofily
%
0-1
0-1
Neutrofilní granulocyty • neutrofilní tyčka a neutrofilní segment • • • •
granula specifická a azurofilní v cytoplasmě obsahují glykogen „mikrofágy“ – aktivně pohlcují malé částice terminální stadium diferenciace
• poločas v krvi 6-7 hodin • přežití ve vazivové tkáni 1-4 dny
Elektronogram lidského neutrofilního granulocytu. Cytoplasma obsahuje dva typy granul: malá (peroxidáza-negativní) specifická granula a větší (peroxidáza-pozitivní) azurofilní granula. Jádro je laločnaté, Golgiho komplex je malý. Drsné endoplasmatické retikulum je nepočetné, obdobně mitochondrie. x27,000.
Eosinofilní granulocyty
• charakteristická dvojlaločná jádra • hojné částice glykogenu • velké množství světlolomných specifických granul barvících se eosinem
Elektronogram eosinofilního granulocytu. EG, eozinofilní granula N, jádro M, mitochondrie x20,000.
Basofilní granulocyty • jádro rozděleno na nepravidelné laloky – zpravidla ale zastřeno specifickými granuly • méně specifických granul než v jiných granulocytech, variabilnější co do tvaru a velikosti • specifická granula obsahují heparin a histamin • specifická granula se barví metachromaticky bazofilními složkami Romanovského směsí
Elektronogram králičího bazofilního granulocytu. Laločnaté jádro (N), bazofilní granula (B), mitochondrie (M), Golgiho komplex (G). x16,000.
Lymfocyty • malé, střední a velké lymfocyty • buňky efektorové a paměťové • T-lymfocyty • supresorové, pomocné, cytotoxické
• B-lymfocyty • terminálně plasmatické buňky
• NK buňky
Elektronogram lidskéh lymfocytu jádro (N) jadérko (Nu) mitochondrie (M) x22,000.
Plasmatická buňka (EM ×10000)
Monocyty • oválné, podkovovité nebo ledvinovité jádro • jádro uloženo obvykle excentricky • cytoplasma obsahuje jemná azurofilní granula • azurofilní granula monocytů jsou lyzosomy • poločas monocytů v krvi je 12 – 100 hodin
Elektronogram lidského monocytu. Golgiho komplex (G) mitochondrie (M) azurofilní granula (A) volné ribosomy (R) x22,000
Sedimentace • rychlost poklesu erytrocytů je dána rychlostí tvorby agregátů erytrocytů, které sedimentují mnohem rychleji, než samostatné erytrocyty • rychlost tvorby agregátů závisí na koncentraci fibrinogenu, imunoglobulinů, proteinů akutní fáze • sedimentaci zrychluje anémie, naopak vysoký hematokrit (polycytémie) sedimentaci zvyšuje stejně jako vysoký albumin • defibrinovaná krev téměř nesedimentuje
• sedimentace stoupá mírně s věkem • rychlost sedimentace závisí na pohlaví
muži
ženy
17 – 50 let
do 10 mm/hod
do 12 mm/hod
51 – 60 let
do 12 mm/hod
do 19 mm/hod
nad 60 let
do 24 mm/hod
do 20 mm/hod
Punkce kostní dřeně (aspirací) • odběr materiálu pro morfologické (cytologické), cytochemické, imuno(cyto)logické a cytogenetické vyšetření • aspirace ze spina iliaca superior posterior nebo ze sterna • v žádném případě není možné provést histologické vyšetření kostní dřeně z aspiraca sternální punkcí
Trepanobiopsie kostní dřeně • vzorek se odebírá trepanobioptickou jehlou (např. Jamshidiho) • lze získat materiál pro histologické vyšetření a současně i materiál pro cytologii a cytogenetiku
Úvod do terminologie • pancytopenie – anémie – leukopenie, neutropenie, lymfopenie – trombocytopenie
• polycytémie – polycytémie (erytrocytóza, polyglobulie) – luekocytóza, neutrofilie, eosinofilie, basofilie, lymfocytóza, monocytóza – trombocytémie (trombocytóza)
• leukemoidní reakce, leukémie
