Cytogenetické vyšetřovací metody v onkohematologii Zuzana Zemanová
Centrum nádorové cytogenetiky Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky VFN a 1. LF UK v Praze
Klinický význam cytogenetických nálezů v onkohematologii Analýza karyotypu nádorových laboratorním vyšetřením
buněk
patří
k
základním
U pacientů s různými subtypy hematologických malignit přispívá ke: stanovení diagnózy upřesnění prognózy
sledování úspěšnosti terapie Doporučené vyšetřovací postupy – závisí na typu onemocnění a léčebném protokolu
Konvenční cytogenetická analýza: KD 24h/48h kultivace alespoň 20 metafází
normální karyotyp bez t(9;22) nebo nedostatek metafází
FISH: BCR/ABL1
aberantní karyotyp
cílená FISH nebo jiná molekulárně cytogenetická metoda (mFISH/mBAND, array CGH)
Popis karyotypu podle ISCN
CML
Chronická myeloidní leukémie (CML)
Cytogenetika
Při diagnóze
FISH
RT-PCR
Kostní dřeň
X
Periferní krev
X
Konvenční cytogenetická analýza - záchyt Ph chromosomu (fúzní gen BCR/ABL) a všech dalších aberací.
FISH - záchyt Ph chromosomu (fúzní gen BCR/ABL1), delece 9q34,
RT-PCR - umožňuje pouze detekci fúzního genu BCR/ABL1 (ale je nejcitlivější).
dalšího Ph chromosomu a případně dalších změn (trisomie 8); poskytuje informace o procentuálním zastoupení patologického klonu
CML
Cytogenetika, FISH a RT-PCR při diagnose
Kostní dřeň Během terapie
Periferní krev MRD
Cytogenetika
FISH
RT-PCR
(jestliže je negativní pak FISH / PCR)
X
X
monitorování
kompletní
(minimální residuální onemocnění)
Konvenční cytogenetická analýza cytogenetické odpovědi (CCyR)
-
FISH nebo PCR - monitorování velké molekulární odpovědi (Major Molecular Response)
PCR - každé 3 měsíce (výsledky mohou kolísat!!)
Cytogenetika + FISH - každých 6 měsíců až do dosažení CCyR, poté 1x ročně
CML
Cytogenetika, FISH a RT-PCR při monitorování účinku léčby
Chromosomová aberace
Frekvence
Klinický význam
del(13)(q14)
30-50%
relativně dobrá prognóza
trisomie 12
10-25%
horší prognóza kratší celkové přežití
5-8%
špatná prognóza progrese onemocnění
9-15%
velmi špatná prognóza rezistence na léčbu
del(11)(q22-q23)
ATM
del(17)(p13)
TP53
CLL
Chromosomové aberace u chronické lymfatické leukémie (CLL)
Konvenční cytogenetická analýza - většinou neinformativní (nalézány pouze buňky s normálním karyotypem).
Cílená I-FISH s panelem specifických DNA sond → záchyt klonálních aberací u ~ 90% nemocných s CLL. Stimulace pomocí B-buněčných mitogenů
Periferní krev (PK)
Kostní dřeň (KD)
Přímé zpracování
24h kultivace (případně mitotická stimulace)
FISH:
FISH:
Centromera 12 ATM (11q22) 13q14/13q34 TP53 (17p13) IGH@ (14q32)
Centromera 12 ATM (11q22) 13q14/13q34 TP53 (17p13) IGH@ (14q32)
Popis karyotypu podle ISCN
cytogenetika Aberrantní karyotyp
Normální karyotyp
Cílená FISH Nebo jiné molekulárně cytogenetické techniky (mFISH/mBAND, array CGH)
CLL
Chronická lymfatická leukémie (CLL)
Klonální vývoj – zisk nových genomových aberací v průběhu onemocnění. Klonální vývoj je pozorován u ~26-30% nemocných s CLL del(13)(q14.3) (monoalelická a/nebo bialelická) del(11)(q22.3) – ATM delece del(17)(p13.1) – TP53 delece trisomie 12 Zisk delecí genů TP53 nebo ATM (tzv. high-risk delece) v průběhu onemocnění nepříznivě ovlivňuje celkové přežití nemocných s CLL. Doporučení: pravidelné sledování nemocných s CLL metodou I-FISH – časná detekce „high-risk“ delecí následná volba vhodné terapie.
FISH analýza každých 6 měsíců (PK)
CLL
Klonální vývoj u CLL
chromosomové aberace
prognóza
delece /monosomie 13
střední/špatná
přestavby IgH genu
špatná
t(11;14)(q13;q32)
dobrá?
t(4;14)(p16;q32)
velmi špatná
delece genu p53
velmi špatná
zisk 1q21
velmi špatná
hyperdiploidie
dobrá
hypodiploidie
velmi špatná
MM
Chromosomové aberace u mnohočetného myelomu (MM)
Konvenční cytogenetika (KC) 30-40% pacientů
U přibližně 60% nemocných je KC neinformativní nízká mitotická aktivita plasmocytů nízká infiltrace plasmocytů v KD
Nalézány pouze buňky s normálním karyotypem Abnormální karyotyp je spojen se špatnou prognózou I-FISH chromosomové aberace až u 80-90% pacientů Kombinace imunocytochemického značení nádorových buněk a I-FISH Imunomagnetická separace plasmatických buněk
MM
Detekce chromosomových aberací u MM
MM
Mnohočetný myelom (MM) Vzorek KD 24h kultivace infiltrace KD
10 % cytogenetika
10 % cytogenetika
cIg-FISH analýza LSI IGH
Normální karyotyp
Aberantní karyotyp
Aberantní karyotyp
cílená FISH nebo jiná molekulárně cytogenetická metoda (mFISH/mBAND, array CGH)
Popis karyotypu podle ISCN
Normální karyotyp
zlom IGH
LSI RB1/13q34
LSI
CCND1/IGH
LSI
FGFR3/IGH
LSI
IGH/MAF
LSI 1q21/1p36 LSI TP53
Chromosomová aberace
geny
prognóza
t(8;21)(q22;q22)
RUNX1-RUNX1T1
dobrá
inv(16)(p13.1q22) nebo t(16;16)(p13.1;q22)
CBFB-MYH11
dobrá
t(15;17)(q22;q12)
PML-RARA
dobrá
t(9;11)(p22;q23)
MLLT3-MLL
střední
t(6;9)(p23;q34)
DEK-NUP214
špatná
inv(3)(q21q26.2) nebo t(3;3)(q21;q26.2)
RPN1-EVI1
velmi špatná
t(1;22)(p13;q13)
RBM15-MKL1
dobrá
přestavby MLL genu
MLL
špatná
monosomie 7 nebo delece 7q31
?
špatná
delece 5q31
?
špatná
komplexní chromosomové přestavby
?
velmi špatná
AML
Cytogenetické nálezy u akutní myeloidní leukémie (AML)
Konvenční cytogenetická analýza: KD (PK pouze pokud jsou blasty) 24h/48h kultivace Alespoň 20 metafází
aberantní karyotyp
normální karyotyp nebo málo metafází
subtyp-specifická FISH: MLL, 5q31/5p15, 7q31/7, 8/9 PML/RARA, AML1/ETO, CBFB, atd.
cílená FISH nebo další molekulárně cytogenetické metody (mFISH/mBAND, array CGH)
Popis karyotypu podle ISCN
AML
Akutní myeloidní leukémie (AML)
Riziková skupina Nízké riziko
ALL
Cytogenetické nálezy u akutní lymfoblastické leukémie (ALL) Cytogenetický nález vysoká hyperdiploidie (51-65 chromosomů)
ETV6-RUNX1 t(1;19)(q23;p13)
IGH-CEBP IGH-ID4 del(6)(q) aberace 9p
Střední riziko
aberace 11q dup(1q) -7 dic(9;20)(p13;q11) dic(9;12)(p11-21;p11-13) jakákoliv jiná změna
normální karyotyp t(9;22)(q34;q11) iAMP21
MLL translokace
Vysoké riziko
„near“ haploidie (˂30 chromosomů) nízká hypodiploidie (30-39 chromosomů) t(17;19)(q23;p13) aberace 17p ztráta 13q
Moorman et al., Lancet Oncol 2010
I-FISH: B-ALL: „triple test“
Konvenční cytogenetická analýza: přímá/24h kultivace buněk KD G-pruhování
ETV6/RUNX1 MLL
Hyperdiploidie
nebo
aberantní karyotyp
T-ALL:
TCR geny cílená FISH nebo další molekulárně cytogenetické metody (mFISH/mBAND, array CGH)
TCRαδ (14q11), TCRβ (7q34), TCRγ (7p14)
Popis karyotypu podle ISCN
TP16 (9p21) ABL1 (9q34)
ALL
Akutní lymfoblastická leukémie (ALL)
Závěry: Cytogenetická a molekulárně cytogenetická analýza nádorových buněk
Přispívá ke stanovení diagnózy onemocnění
Přispívá k upřesnění prognózy onemocnění
Přispívá k časnému záchytu relapsu onemocnění
Umožňuje monitorování léčebné odpovědi
Kombinace cytogenetických a molekulárně cytogenetických technik poskytuje komplexní informace o genomu nádorových buněk a umožňuje záchyt klonálních chromosomových aberací, které mohou
významně ovlivnit průběh a prognózu onemocnění.
