Campylobacter jejuni/coli
Campylobacter jejuni
Campylobacter spp. úvod Termotolerantní kampylobaktery známe jako významné původce alimentárních onemocnění teprve posledních 20 let. Roční incidence kampylobakterióz se v humánní populaci pohybuje kolem 210 případů na 100 000 obyvatel. C.jejuni patří k nejvýznamnějším druhům tohoto rodu postinfekční syndrom Guillain-Barré
Campylobacter • Gram negativní, zkřivená, tvar S nebo sférická tyčinka • Mikroaerofilní / 5-10% O2 3-5%CO2 • • • •
Pohyblivá Neroste pod 30 oC Hlavní lidské patogeny: C.jejuni a C. coli Některé druhy působí systémové onemocnění C. concisus
Úvod Rod Campylobacter - „zakřivená bakterie“ 0,2-0,5 μm široká, 0,5-8,0 μm dlouhá původně rod Vibrio Gram-negativní, nesporulující, oxidasa pozitivní, indol negativní, nefermentuje ani neoxiduje sacharidy, energii získává se metabolismem aminokyselin. GC obsah kolísá pro jednotlivé druhy mezi 29-39 mol%. Vibrio fetus - původce potratů u ovcí, dysenterie hospodářských zvířat od 50.let organismus izolován z krve pacientů a označen jako „podobný Vibriu“ Sebald a Veron 1963 - Campylobacter
Kultivace ze stolice pacientů -1972 v 80. letech pokračovala taxonomická upřesnění mnoha druhů, která pokračuje dodnes Campylobacter pylori a Campylobacter mustelae (Goodwin et al.1989) přejmenován na Helicobacter pylori a H. mustelae Sekvence 5S a 16S rRNA pomohly k rozlišení současných druhů
Zařazení rodu Campylobacter Kmen Proteobacteria Třída Epsilonproteobacteria Řád Campylobacteriales Čeleď Campylobacteraceae Rod Campylobacter
Taxonomie Bakterie rodu Campylobacter (čeleď Campylobacteriaceae) jsou charakterizovány následovně: • Gram negativní, mikroaerofilní, malé spirálkovitě zahnuté tyčinky s charakteristickým vývrtkovitým pohybem • Jsou oxidáza pozitivní s negativní reakcí na indol, redukují nitráty, ale nefermentují uhlohydráty • K termotolerantním kampylobakterům (schopnost růstu při 42°C) patří C. jejuni, C. coli, C. upsaliensis a C. lari
campylobacter
Kritické teploty • • • • • •
Všechny druhy rodu Campylobacter rostou při 37 oC C. jejuni a C.coli mají optimum mezi 42 – 45 oC C. jejuni a C.coli nerostou při 28 oC Mohou přežít v mléce a vodě při 4 oC Rovněž mohou přežít v mrazení drůbeže Za nepříznivých teplotních a dalších podmínkách v prostředí mění fyziologii a tvoří „viable non-culturable“ formy – VBNC • Resuscitace VBNC probíhá v živočišném hostiteli.
Campylobacter – přežívání v potravinách • • • • • • •
Teplota v rozmězí 30 – 42/45 oC Velmi citlivý na teplotu Usmrcen pasterizací pH nejnižší hodnota při které je shopen růstu je 4,5 aw Je citlivý vůči NaCl v koncentraci 1-2% v závislosti na na teplotě a druhu potraviny • Atmosféra • Mikroaerofilní redukované hladina kyslíku, zvýšená hladina CO2, růst je podporován H2
Campylobacter • Zdroje infekce: domací a volně žijící zvířata a ptáci • Syrové mléko je hlavní zdroj infekce in USA, drůběž in UK • Infekční dávka je velmi nízká, v potravině se nerozmnožuje • Obecně je v současné době více rozšířen než salmonela, hlavně na jaře a v ůlétěu dětí a starších lidí • Pathogenese není ještě dostatečně popsána, a není jasné, který toxin je produkován
Campylobacter – přežívání v potravinách • • • • • • •
Teplota v rozmězí 30 – 42/45 oC Velmi citlivý na teplotu Usmrcen pasterizací pH nejnižší hodnota při které je shopen růstu je 4,5 aw Je citlivý vůči NaCl v koncentraci 1-2% v závislosti na na teplotě a druhu potraviny • Atmosféra • Mikroaerofilní redukované hladina kyslíku, zvýšená hladina CO2, růst je podporován H2
Campylobacter • Zdroje infekce: domácí a volně žijící zvířata a ptáci • Syrové mléko je hlavní zdroj infekce v USA, drůbež v UK • Infekční dávka je velmi nízká, v potravině se nerozmnožuje • Obecně je v současné době více rozšířen než salmonela, hlavně na jaře a v létě u dětí a starších lidí • Pathogenese není ještě dostatečně popsána, a není jasné, který toxin je produkován
Patogeneze Po požití kontaminované potravy pronikají bakterie do tenkého střeva, kde se množí. Bakterie adherují ke střevní sliznici v proximální části tenkého střeva a produkují toxin, toxin který proniká do lymfatického a krevního oběhu. U některých postižených osob se onemocnění vyvíjí v až v hemoragickou enteritídu a ulcerativní změny v kolonu. U tekutin (voda, mléko) je průchod žaludkem rychlý a tím se zvyšuje množství živých buněk, které pronikají do tenkého střeva, kde se pomnožují.
Patogeneze Po požití kontaminované potravy pronikají bakterie do tenkého střeva, kde se množí. Bakterie adherují ke střevní sliznici v proximální části tenkého střeva a produkují toxin, toxin který proniká do lymfatického a krevního oběhu. U některých postižených osob se onemocnění vyvíjí v až v hemoragickou enteritídu a ulcerativní změny v kolonu. U tekutin (voda, mléko) je průchod žaludkem rychlý a tím se zvyšuje množství živých buněk, které pronikají do tenkého střeva, kde se pomnožují.
Patogeneze Infekční dávka je u zdravého člověka přibližně 102 - 103 bakterií Inkubační doba je nejčastěji udávána 2 - 5 dní Příznaky onemocnění jsou horečka, intenzivní bolesti břicha, průjem
Výskyt v prostředí a v potravinách K nejpravděpodobnějším způsobům infekce člověka patří: • nízká hygienická úroveň při manipulaci se syrovou drůbeží v domácnostech i v provozech veřejného stravování a skladování drůbeže v lednici společně s ostatními potravinami určenými k přímé spotřebě, •
kontaminace pracovních ploch a kuchyňského náčiní při porcování a zpracováním drůbeže před tepelnou úpravou
Vzhledem k nízké infekční dávce je možný i přímý přenos kontaminovanýma rukama např. při přípravě syrového masa z matky na dítě nebo při hře s domácími zvířaty.
Výskyt v potravinách K nejčastěji kontaminovaným potravinám patří: • syrové maso (drůbeží, vepřové) • syrové mléko • některé mražené potraviny (zelenina)
Taxonomie Campylobacter a Helicobacter Druh C.fetus C.jejuni C.coli C.laridis „C.upsaliensis“ C.hyointestinalis C.mucosalis C.cinaedi C.fennelliae C.sputorum C.concisus C.cryaerophila C.nitrofigilis H.pylori H.mustelae
Poddruh Biovar fetus,venerealis jejuni,doylei
sputorum,bubulus,faecalis
Vliv technologií Sušení je účinným prostředkem k eliminaci kampylobakterů. Použití organických kyselin redukuje počty kampylobakterů a proto je v některých státech na jatkách před chlazením drůbeže zařazeno ošetření povrchů těl kyselinou mléčnou nebo octovou.
Výskyt v prostředí a v potravinách Termotolerantní baktérie rodu Campylobater se vyskytují ve střevním traktu domácích i volně žijících teplokrevných zvířat často bez klinických příznaků onemocnění. Těmito baktériemi může být člověk infikován buď: • přímo (např. přímým kontaktem se zvířetem) • nepřímo kontaminovanou vodou, potravinou C. jejuni bývá velmi často izolován z drůbeže i volně žijících ptáků. C. coli převažuje u prasat nad C. jejuni C. lari bývá izolován z volně žijících ptáků, převážně racků C. upsaliensis bývá izolován vzácně a to např. z faeces domácích mazlíčků (např. psů a koček).
Odolnost kampylobakterů vůči vnitřním a vnějším faktorům •
optimální teplota je 42 °C, minimální teplota růstu je 32 °C, maximální 45 °C,
•
hraniční hodnota aktivity vody pro množení je od 0.98
•
rozmezí hodnot pH při kterých se mohou pomnožovat jsou od 4.9 – 9.0, optimum je při neutrálním pH,
•
koncentrace soli nad 1,5 % působí baktericidně
•
optimální složení atmosféry pro růst kampylobakterů je 5 % O2 + 10 % CO2 + 85 % N
•
bakterie rodu Campylobacter jsou citlivé k většině desinfekčních látek včetně chlorových preparátů (chlorování pitné vody je vhodnou obranou proti onemocnění)
Vliv technologií Bakterie rodu Campylobacter jsou málo odolné k vnějšímu prostředí, nepřežívají za přítomnosti kyslíku a v suchém prostředí (živé, ale nekultivovatelné formy). my) Sterilační ani pasterační teploty nepřežívají, Chlazení působí zastavení růstu, ale zlepší přežívání buněk v porovnání s pokojovou teplotou Mrazením je v potravinách počet kampylobakterů redukován, ale ne eliminován a baktérie mohou za příznivých podmínek přežívat i několik měsíců.
Izolace a identifikace • Mnoho typů nabohacovacích medií bylo testováno – Prestonovo medium • Směs antibiotik: polymyxin B, trimethoprim,a další • Kultivační media obsahují „vychytávače“ kyslíku, krev, FPB (směs FeSO4, Na2S2O5, Na pyruvát) + směs antibiotik
Typical Formula*gm/litre • Meat peptone 10.0 • Lactalbumin hydrolysate 5.0 Yeast Extract 5.0 Sodium chloride 5.0 Alpha-ketoglutaric acid 1.0 Sodium pyruvate 0.5 Sodium metabisulphite 0.5 Sodium carbonate 0.6 Haemin 0.01 pH 7.4 ± 0.2 @ 25°C •
Obsah 1 vialky – každá stačí na 500ml media • • • • • •
na 1 vialku na 1 litr Cefoperazone 10,0 mg 20,0 mg Vancomycin 10,0 mg 20,0 mg Trimethoprim. 10,0 mg 20,0 mg Cycloheximide 25,0 mg 50,0 mg Návod 13,8 g Boltonova media do 500 ml destilované vody. Sterilizace v autoklavu při 121°C po 15 min. Ochladit na 50°C. Asepticky se přidá 25ml Laked Horse Blood SR0048 a 1 vialka Bolton Broth Selective Supplement SR0183, rozpustí se podle návodu. Dobře se promíchá a rozdělí se do sterilních lahviček se šroubovacím uzávěrem.
Vzhled kolonií a buňky • Karmali agar
Podstata zkoušky ČNS ISO 10272 Zkušební vzorek (x g nebo x ml) buď
+
9x bujon podle Prestona
nebo 9x bujon podle Parka a Sanderse
přímé vyočkování výchozí suspenze pomnožení - inkubace
inkubace
za mikroaerofilních podmínek (42oC, 18 h)
Vyočkování
za mikroaerofilních podmínek (32oC, 4 h) přidání roztoku antibiotik B
agar podle Karmaliho a 2.selektivní půda
inkubace za mikroaerofilních podmínek (37o C, 2h)
inkubace za mikroaerofilních inkubace za mikroaerofilních podmínek (42o C, až 72 h) podmínek (42o C, až 42h) 5 charakteristických kolonií další testy a vyjádření výsledků
Jaké mikroorganismy nyní sledujeme ? • • • • • • •
Listeria monocytogenes Salmonella Enterobacter sakazakii Escherichia coli Koagulasa-pozitivní stafylokoky Bacillus cereus Enterobacteriacae
Enterobacter sakazakii Cronobacter sakazakii
Kontaminace kojenecké mléčné výživy • Enterobacter sakazakii je jednou z vysoce virulentních baktérií, také Salmonella sp. + Clostridium byly nalezeny ve výrobcích kojenecké mléčné výživy • Sušená kojenecká mléka NEJSOU sterilní výrobky • Mohou být kontaminovány při výrobě patogenními baktériemi rezistentními vůči teplu
• Americký úřad pro kontrolu potravin a léčiv (FDA) varoval, že 14% z testovaných sušených kojeneckých mlék bylo kontaminováno E. sakazakii a že: “ Klinici by si měli být vědomi
toho, že sušená kojenecká mléka nejsou sterilní výrobky a mohou obsahovat bakteriální patogeny…” Duben
Komise Codex Alimentarius • Je společnou komisí FAO/WHO, která stanovuje standardy pro složení a bezpečnost potravin • Jedním z výborů komise je Codex Committee on Food Hygiene (CCFH) • CCFH se setkává každý rok ve Washingtonu. V roce 2005 se sešel v Buenos Aires v Argentině
CODEX - “Profily rizika” • 2002 - Codex požádal zástupce USA a Kanady, aby připravili Profil rizika pro Enterobacter sakazakii; který byl pak revidován v roce 2003 • Profil rizika stanovil závažnost problému a zpochybnil platnost současných mikrobiologických standardů Codexu, zvláště pro novorozence a zranitelné kojence
• “ E. sakazakii je přítomen v některých sušených kojeneckých mlékách, bylo prokázáno, že tato mléka způsobila onemocnění u novorozenců, a tato onemocnění mohou ohrožovat život dítěte. Tato skutečnost je dostatečnou pobídkou k vážnému zamyšlení nad vhodnými strategiemi ke snížení tohoto zdokumentovaného rizika”. Souhrn Profilu rizika
Hlášené případy • Červenec 2005 : Enfamil AR (Mead Johnson) kontaminovaný E. sakazakii hlášen v Argentině • Leden 2005: Aptamil (Numico/Milupa) kontaminovaný E. sak., výrobek zakázán v Brazílii na dobu 6 měsíců • Říjen 2004: : Pregestimil (Mead Johnson) kontaminovaný E. sak. Způsobil úmrtí kojenců ve Francii: celosvětové hlášení
Výrobci – vlastní výzkum • 2004 – Nestlé Research Centre - E. sak. zjištěn ve vzorcích z prostředí u 8 z 9 potravinářských výroben, 4 z nich byly továrny na výrobu sušených mlék…..
Zlepšení testů a detekce • 2004 - Nestlé Research Centre – vyvinuli nový, senzitivnější test • Analýza 192 vzorků z prostředí ze 4 různých továren na výrobu sušeného mléka • Při použití starého USFDA testu zjištěno 26 % vzorků kontaminovaných E. sak. • Při použití nového testu byl E. sak. zjištěn u téměř 40 % odebraných vzorků
Brány kontaminace • • • •
Čerstvé mléko - transport a skladování Pasterizace a sušení + příprava směsi Plnění do obalů a skladování Příprava nápoje ze sušeného prášku
Pracovní skupina pověřená výborem (CCFH) • Výbor pověřil pracovní skupinu provedením revize kodexu praxe a vypracováním mikrobiologických kritérií • Tato Pracovní skupina Codexu je vedena kanadskými zástupci a je zastoupena účastníky z Belgie, EU, Francie, Německa, Itálie, Japonska, Nizozemí, Španělska, Švýcarska, UK, USA a Uruguay •
Plus NGOs jako jsou skupiny IBFAN a zastupující průmysl
Rezoluce WHA 58.32 • Vyzývá členské státy, aby “ zajistily, že kliničtí a ostatní zdravotničtí pracovníci, rodiny a rodiče a další opatrovníci…budou informováni o tom, že sušená kojenecká mléka mohou obsahovat patogenní
mikroorganismy a musí být připravována a používána správným způsobem; tato infomace by měla být součástí výslovného varování na obalu výrobků, kterých se to týká ;”
INFOSAN – International Food Safety Authorities Network (leden 2005)
• Nekojené děti – informace poskytovaná matkám by měla zahrnovat instrukce pro správnou přípravu a upozornění na rizika z nevhodné přípravy a použití výrobku • Doporučená příprava – kojeneckou vodu přivést k bodu varu a nechat ochladit během několika minut na teplotu 70-90 st. C, rozmíchat prášek a směs ochladit na tělesnou teplotu, zkrátit dobu mezi přípravou a konzumací, nepoužité zbytky mléka vyhodit
Enterobacter sakazakii • Systematické zařazení • Říše:Bakterie Kmen:Proteobakterie Třída:Gamma Proteobakterie Řád:Enterobacteriales Čeleď:Enterobacteriaceae Rod: Enterobacter • Rod:Cronobacter od r.2007
Enterobacter sakazakii - vlastnosti • Gramnegativní, fakultativně -anaerobní, oxidasa negativní, Katalasa pozitivní, tyčinkovitá bakterie, čeledi Enterobacteriaceae. • Pohyblivé, redukuje nitrát, utilizuje citrát, hydrolyzuje eskulin a arginin, také dekarboxylují L-ornithin. • Kyseliny tvoří z D-glukosy, D-sukrosy, D-raffinosy, Dmelibiosy, D-cellobiosy, D-mannitolu, D-mannosy, Lrhamnosy, L-arabinosy, D-trehalosy, a D-maltosy. Cronobacter má pozitivní reakci na produkci acetoinu ( Voges–Proskauer ) a negativní test na methyl červeň
Variabilita D hodnot pro 2 kmeny Enterobacter sakazakii zahřáté na 58°C
Survivors [Log(CFU/mL)]
9 8
D = 591.9 sec
7 6 5
D = 30.5 sec
4 3 2 0
500
1000
1500
Heating Time (sec)
2000
2500
Porovnání D58°C-Values pro různé Enterobacteriaceae E. sak azakii 607
600
D-value (sec)
500 400 300 200 100 0
E. coli O157:H7 E. sak azaki N&Fpooled K . pneuomoniae Salm onella Hartford E. coli E. aerogenes E. sak azakii 51329
Distribution of D58°C-values for 12 Enterobacter sakazakii strains 6
# of Strains
5 4 3 2 1 0
0-100 100200
200300
300400
D-value (sec)
400500
500600
Effect of Heating Temperature on D-Value for E. sakazakii 607
D-Value (sec)
10000 1000 100 10 1 55
60
65
Heating Tem perature (C)
70
Reported Z-values • Nazarowec-White and Farber (1997) – Pooled food isolates: 5.6°C – Pooled clinical isolates: 6.0 °C – All: 5.8 °C
• Edelson-Mammel and Buchanan (2003) – Strain 607: 5.6 °C
Predicted Inactivation 100 Tim e to 5D inactivation (sec)
• Results of these heating trials indicate that heating rehydrated infant formula at 70°C for even a few seconds will result in a substantial inactivation of E. sakazakii
10 1 65 70 75 80 85 90 95 0,1 0,01 0,001 Tem perature (C)
Effectiveness of Pasteurization 3 sec
10 sec
16 sec
30 sec
60 sec
59°C
100
100
60 °C
63
50
61 °C
100
79
50
20
62 °C
100
40
3.2
3.2
63 °C
38.8
50.1
20
0.63
0.40
64 °C
39.8
16
5.0
0.013
0.040
65 °C
31.6
2.0
0.20
0.0004
66 °C
6.31
0.20
0.079
67 °C
0.398
68 °C
0.063
Resistances If Like Other Enterobacteriaceae • • • • • •
Not heat resistant Moderate acid resistance if adapted Moderate alkali resistance if adapted Low to moderate chlorine resistance Low to moderate irradiation resistance Will remain viable in refrigerated and frozen products for extended periods, particularly if neutral pH • Moderate to good resistance to drying
Surviving P opulation [Log(CFU/ m L)]
Resistance to Dehydration 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 0
2
4
6
Storage Tim e (m on)
8
10
Cronobacter sakazakii Modročerné kolonie na chromogenní půdě bioMerieux
Existuje ISO norma k průkazu C. sakazakii.
Escherichia coli • Systematické zařazení • Říše:Bakterie Kmen:Proteobakterie Třída:Gamma Proteobakterie Řád:Enterobacteriales Čeleď:Enterobacteriaceae Rod: Escherichia • Druh: Escherichia coli
Escherichia coli • E. coli náleží do čeledi Enterobacteriaceae. • Katalasa-pozitivní, oxidasa-negativní, fermentativní, krátká Gram-negativní, nesporulující tyčinka, obvykle s bičíky,které jsou peritrichní. • Často tvoří pouzdra (capsule) nebo mikrokapsule.
Escherichia coli
Záchyt Escherichia coli
TBX – CHROMOGENNÍ AGAR Selektivní medium pro detekci a zjištění počtu Escherichia coli v potravinách
Chromogenní půda pro koliformní bakterie
Escherichia coli
Citrobacter freundii
Princip chromogenních půd
Escherichia coli Enterotoxigenní (ETEC), Enteroinvasivní (EIEC), Enteropatogení (EPEC), Enterohemoragický (EHEC), Enteroaggregativní (EaggEC), Adherentní E. coli (DAEC)
Úloha bakterií v gastrointestinálním traktu
Atypické enteropathogenní E.coli ATEC
Přehled dalších patogenů přenášených potravinami • • • • • • • • •
Aeromonas hydrophila Brucella Clostridium botulinum Clostidium perfringens Mycobacterium Plesiomonas shigelloides Shigella Vibrio Yersinia enterocolitica
