Ciprofloxacin-étel interakció in vitro vizsgálata Doktori tézisek
Pápai Katalin Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola
Témavezető:
Prof. Dr. Klebovich Imre egyetemi tanár, D.Sc.
Hivatalos bírálók:
Dr. Gazdag Mária tudományos tanácsadó, Ph.D. Prof. Dr. Szökő Éva egyetemi tanár, D.Sc.
Szigorlati bizottság elnöke: Prof. Dr. Mátyus Péter egyetemi tanár, D.Sc. Szigorlati bizottság tagjai: Prof. Dr. Kremmer Tibor, egyetemi magántanár, D.Sc. Prof. Dr. Szeberényi Szabolcs, c. egyetemi tanár, C.Sc.
Budapest 2010
Összefoglalás Doktori munkám során célom volt a CPFX-tej(termék) interakció hátterének in vitro módszerekkel történő molekuláris szintű vizsgálata, ill. eredményeim korábban publikált in vivo adatokkal történő összehasonlítása. A CPFX tejes közegben történő mennyiségi meghatározására egy olyan, reprodukálható, fehérjekicsapás nélküli, SPE-t követő HPLC-ESI-MS módszert fejlesztettem, optimáltam és validáltam, amely a tejes közeg zsírtartalmától függetlenül használható. A CPFX és a belső standard (aripiprazol) elválasztását gradiens elúcióval, szelektív ion detektálás mellett végeztem. Az in vitro kioldódás vizsgálat során a kioldó közeghez vizet, sovány vagy zsíros tejet, illetve a tejnek megfelelő mennyiségű kalciumot, kazeint vagy laktózt adtam. A GIT egyes szakaszainak megfelelő pH-jú közegek használatakor a hatóanyag kioldódása pH függést mutat; az alacsony pH kedvez a CPFX oldódásának. Sovány tej hatására a szabad hatóanyag mennyisége vizes közegben mérthez képest
a
jelentősen csökkent. A zsíros tejporból készült
tej a soványhoz képest mintegy 30%-kal alacsonyabb fehérjetartalma összefüggésbe hozható a zsíros tej esetén tapasztalt, ~ 30%-kal megemelkedett szabad CPFX mennyiséggel. Míg a kalcium 51-92%-kal, a tejcukor 87-98%-os mértékben csökkentette a kioldódott CPFX mennyiségét. A tej-CPFX kölcsönhatás molekuláris hátterében − in vitro eredményeim alapján − a kazein (a tejfehérje) áll. Nemcsak a tej és tejtermékek, hanem a fehérjében gazdag ételek is hatással lehetnek a CPFX felszívódására, biohasznosíthatóságára; a fehérjedús diéta a CPFX terápia sikertelenségét okozhatja, és felelős lehet a baktérium rezisztencia kialakulásáért. Vizsgálataim alapján CPFX esetén hangsúlyt kell kapnia a lehetséges CPFX-étel interakciók alkalmazási előiratban való feltüntetésének.
2
Bevezetés A kutatás-fejlesztés jelenleg érvényes protokollja szerint új originális gyógyszerkészítményeknél kötelező az esetleges étel-interakciók feltárására irányuló klinikai vizsgálat elvégzése, hiszen az elfogyasztott élelmiszer számos ponton befolyásolhatja egyes gyógyszerek biofarmáciai és farmakokinetikai tulajdonságait. A fluorokinolon (FQ) típusú kemoterápiás szer, a ciprofloxacin (CPFX) tej- és tejtermékek komponenseivel kölcsönhatásba léphet, ezzel megakadályozva a hatóanyag teljes mennyiségének abszorpcióját. A felszívódás során bekövetkező változások, az interakció típusának és mechanizmusának
pontosítása
in
vitro
körülmények
között
kioldódás
vizsgálattal nyomon követhetők. Ilyen esetben a kioldódási modellnek szimulálnia kell a biológiai rendszert – tekintetbe véve a kioldódás kezdetének helyét (pl. a gyomor, ill. a vékonybél), és a jellemző fiziko-kémiai paramétereket (pl. éhgyomri vagy étkezés utáni állapot). Az
in
vitro
kísérletek
pontos,
reprodukálható
hatóanyag-
koncentrációjának meghatározásához megbízható, hatósági előírásoknak is megfelelő minta-előkészítési- és bioanalitikai módszerre van szükség. A szilárd fázisú extrakciót (SPE) követő nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiával kapcsolt tömegspektrometriás (HPLC-MS) analitikai módszer a ciprofloxacintej interakció tanulmányozására alkalmas. Egy adott gyógyszerkészítmény in vitro kioldódási profilja és in vivo farmakokinetikája közötti összefüggés (IVIVR) esetén a fejlesztett kioldódás vizsgálati modell alkalmas a költségigényes in vivo klinikai vizsgálatok eredményeinek előrejelzésére.
3
Célkitűzés Kutatómunkám középpontjában az in vitro kioldódás vizsgálatok során használt, tejporból készült tej azon tejkomponensének (szénhidrát, zsír, fehérje vagy fémion) meghatározása volt, amely(ek) feltehetően a szabad, kioldódott CPFX
koncentráció
változását
(csökkenését)
okozzák.
Mindehhez
elengedhetetlen a kioldódás során alkalmazott tejporból készített sovány- és zsíros tej, valamint néhány eltérő zsírtartalmú kereskedelmi forgalomban lévő friss tej analízise, komponenseinek kvantitatív meghatározása. A kioldódás vizsgálat farmakokinetikai paramétereinek meghatározásához szükséges robosztus, pontos, reprodukálható SPE és HPLC-MS módszerek fejlesztésével, optimálásával és teljes validálásával célom a kísérlet során kapott eredmények megbízható értékelése volt. Munkám során célul tűztem ki olyan, biztonságosan alkalmazható in vitro kioldódás vizsgálati modell kidolgozását, amely
szimulálva a gasztro-
intesztinális traktus (GIT) egyes szakaszainak étkezés előtti, ill. utáni fiziológiás körülményeit
megbízható adatokat szolgáltathat a költségigényes in vivo tej-
interakciós vizsgálatok előrejelzésére. A kioldódás során kapott eredmények és a már korábban publikált in vivo tej/joghurt-CPFX interakciós klinikai vizsgálat adatainak összehasonlításával célom az irodalmi adatok alapján várt kapcsolat (IVIVR) bizonyítása volt.
4
Módszerek A
Ciprinol®
körülmények
500
közötti
mg
filmtabletta hatóanyag-leadásának
tanulmányozására
forgólapátos
statikus
kioldókészüléket
alkalmaztam. A készülék tartályaiba a gyomor-bél rendszer egyes szakaszait modellező (pH 1,2; 4,5 és 6,8) kioldó közeget öntöttem, ezzel szimulálva a fiziológiásan 120 perc alatt termelődő gyomor- és bélnedvet – enzimek nélkül. A kioldóközeghez a vizsgálat típusától függően 250 ml tejporból készült sovány, ill. zsíros tejet, valamint kalciummal, kazeinnel vagy laktózzal dúsított vizet adtam. A kioldódás során nyert – tejes, kalciumos, kazeines és laktózos – minták tisztítására SPE módszert fejlesztettem és optimáltam a mátrix összetételétől függetlenül. A minta-előkészítés alkalmas a CPFX és a biológiai mátrix – jelen esetben a tej – zavaró komponenseinek elválasztására. A CPFX mennyiségi meghatározására HPLC-MS módszert fejlesztettem, optimáltam és validáltam belső standard használatával. A CPFX és a belső standard elválasztása gradiens módszerrel
acetonitril és 0,02 M ammónium-
acetát hangyasavval pH 2,5-re beállított elegyének keverésével Nagyhatékonyságú
folyadékkromatográfiás
elúciót
valósult meg.
követően
a
CPFX
ionizációja electrospray ionforrással (ESI) történt. A tömegspektrométert pozitív ionmódban, két különböző monitorozási módszerrel (pásztázó-SCAN és szelektív ion mód-SIM) használtam. A friss és a tejporból készült tejminták analíziséhez Milko-Scan 130 készüléket használtam, mely alkalmas a tej- és tejtermékek fehérje, zsír és szénhidráttartalmának meghatározására. A mérés megkezdése előtt az előmelegítés a tejminta zsírtartalmának homogén cseppméretbeli eloszlása miatt fontos.
5
Eredmények - tézisek 1. A
CPFX
tejes
mátrixból
történő
kvantitatív
meghatározására új,
fehérjekicsapás nélküli, jól reprodukálható szilárd fázisú extrakciós mintaelőkészítési módszert fejlesztettem és optimáltam a mátrix zsírtartalmától függetlenül a legmagasabb kinyerési hatásfokkal (1. táblázat). 1. táblázat: SPE módszerek (A, B, C, D és E) mosási és elúciós lépései egymástól eltérő visszanyerési hatásfokot eredményeznek SPE módszer
Mosás
Eluálás
2,0 ml víz/metanol (80:20) elegy, majd 2,0 ml hexán 2,0 ml víz
3,0 ml 1 % TFA-t tartalmazó acetonitril 8,0 ml hexán
2,0 ml metanol 2,0 ml víz/metanol (80:20) elegy
8,0 ml hexán
E1
2,0 ml víz/metanol (80:20) elegy
E2
2,0 ml víz/metanol (80:20) elegy
6,0 ml 1 % TFA-t tartalmazó acetonitril 6,0 ml 1 % TFA-t tartalmazó acetonitril
A B C D
2. Az
SPE
tisztítást
8,0 ml acetonitril
követően
Mátrix minősége
Visszanyerési hatásfok (%) átlag ± S.D. Nem detektálható
sovány tejporból készült tej
0,08 ± 0,02 0,05 ± 0,01 4,2 ± 0,06
99,06 ± 0,15 zsíros tejporból készült tej
megbízható,
pontos,
98,57 ± 0,14
szelektív
és
nagyérzékenységű HPLC-ESI-MS bioanalitikai módszert fejlesztettem és validáltam aripiprazol belső standard használatával, ahol a meghatározási (LLOQ) és kimutatási határ (LOD) 4,0 és 0,4 ng/ml volt. 3. A fagyasztva szárított tejporból készült tej összetevőinek (szénhidrát, zsír és fehérje) mennyiségét nemzetközileg alkalmazott tejvizsgáló készülékkel határoztam meg. Az így kapott beltartalmi értékeket használtam fel a kioldódás vizsgálatok során.
6
4. Irodalmi adatok alapján ismert, hogy a CPFX biohasznosíthatósága tejjel együtt alkalmazva csökken. A csökkenés molekuláris hátterének feltárásához olyan in vitro kioldódás vizsgálati módszert dolgoztam ki, ahol a GIT egyes részeinek pH értékét (pH 1,2; 4,5 és 6,8) szimulálva a kioldóközeghez sovány- vagy zsíros tejet, ill. valamely korábban meghatározott mennyiségű tejkomponenssel dúsított vizet adtam. 5. A Ciprinol® 500 mg filmtabletta kioldódás vizsgálati eredményei igazolták, hogy
a vízhez képest
a kalcium, a kazein, a sovány- vagy zsíros tej,
valamint a laktóz jelenléte – pH-tól függően
csökkenti a szabad, kioldódott
CPFX mennyiségét. A csökkenés a) a gyomor sósavban kicsapódott fehérje felületén történő adszorpcióval, illetve b) a többértékű fémionokkal (főként kalciummal) létrejött komplexek kialakulásával magyarázható. 6. Korábban
publikált
in
vizsgálatban
vivo
a
kalcium
CPFX
biohasznosíthatóságát csökkentő hatása feltételezett. In vitro kioldódás vizsgálataim során három különböző pH értéken igazoltam, hogy a tej- és tejtermékeknek a CPFX biohasznosítható mennyiségére kifejtett csökkentő hatásának molekuláris hátterében a tejkomponensek közül elsősorban nem a kalcium, hanem a kazein (a tejfehérje) áll (1. ábra). 7. Az előbb leírt molekuláris folyamatok ráirányítják a figyelmet nemcsak a tejnek és a különböző tejtermékeknek, hanem a fehérjében gazdag ételeknek a CPFX felszívódására, biohasznosíthatóságára kifejtett potenciális, de klinikailag és farmakokinetikailag szükségszerűen vizsgálandó hatására.
7
AUC értékek vízhez képest (DE)
sovány tej 2,15% kazein
3,13% kazein zsíros tej 0,2% kalcium 4,9% laktóz
100% 80% 60% 40% 20% 0% pH=1,2
pH=4,5
pH=6,8
1. ábra: Tejkomponensek hatása a CPFX kioldódására
8. Az új in vitro kioldódási módszer modellvizsgálatnak tekinthető, amellyel más hatóanyag(ok) és tej kölcsönhatása is tanulmányozható. Az in vitro módszer
ellentétben a drága in vivo klinikai vizsgálatokkal
egyszerűbb,
kis laborköltségű, gyorsabb, jó összefüggése miatt alkalmas az in vivo eredmények előre jelzésére jelentősen csökkentve a mintaszámot és a vizsgálat időtartamát.
8
Következtetések Az alacsony LOD és LLOQ értékkel leírható HPLC-ESI-MS bioanalitikai technika alkalmazást nyerhet a gyógyszerészeti kutatásokban, kiemelten a farmakokinetikai, illetve az in vitro étel/tej és CPFX/FQ interakciók vizsgálatában. A kioldódás vizsgálati eredmények alapján az tej/kazein-CPFX interakció hatására bekövetkező farmakokinetikai paraméterek változása olyan nagymértékű lehet, hogy a fehérjedús diéta a CPFX terápia sikertelenségét okozhatja, és felelős lehet a baktérium rezisztencia kialakulásáért. A bakteriális fertőzésben szenvedő betegeknél nagy hangsúlyt kell fektetni a lehetséges interakció ismertetésére, és fel kell hívni figyelmüket, hogy a CPFX tartalmú gyógyszerkészítményt tejjel vagy magas fehérjetartalmú étellel együtt ne alkalmazzák. Eredményeim alapján a CPFX tartalmú orálisan
használandó
készítmények
alkalmazási
előiratában
és
betegtájékoztatójában nem csak azt kellene feltűntetni, hogy a gyógyszert kalcium tartalmú étellel, savlekötővel vagy étrendkiegészítővel ne vegye be a beteg, hanem hangsúlyt kellene kapnia a fehérje biohasznosíthatóságot jelentősen csökkentő szerepének is. Kísérleteim azt igazolták, hogy CPFX-et nem szabad egyidejűleg olyan étellel bevenni, ami fehérjét tartalmaz. Az élelmiszer bevitelt úgy kell időzíteni, hogy a CPFX gyógyszerkészítmény bevételét megelőzően legalább 1 óra vagy utána 2 óra teljen el. Vizsgálataim
alapján
CPFX
esetén
hangsúlyt
kell
kapnia
a
gyógyszermellékhatás-jelentésnek, melynek során a hatóság az IVIVR miatt egy esetleges in vivo vizsgálat helyett a javasolt in vitro módszerrel rövid idő alatt, költséghatékonyan modellezheti a kérdéses kölcsönhatást és további vizsgálatokkal pontosíthatja annak mechanizmusát, molekuláris hátterét.
9
Az értekezés témájában megjelent közlemények Publikációk 1. Pápai Katalin, Ludányi Krisztina, Budai Marianna, Antal István, Klebovich Imre Ciprofloxacin-tej interakció in vitro vizsgálata LC-MS módszerrel, Acta Pharmaceutica Hungarica, 77: 33-38 (2007) 2. Füredi Petra, Pápai Katalin, Budai Marianna, Ludányi Krisztina, Antal István, Klebovich Imre Fluorokinolonok in vivo étel-interakciós vizsgálatai, Acta Pharmaceutica Hungarica, 79: 81-87 (2009) 3. Katalin Pápai, Marianna Budai, Krisztina Ludányi, István Antal, Imre Klebovich Analysis of ciprofloxacin in low- and high-fat milk by high performance liquid chromatography-mass spectrometry. Acta Chromatographica, 22: 115-129 (2010) IF: 0,676 4. Katalin Pápai, Marianna Budai, Krisztina Ludányi, István Antal, Imre Klebovich In vitro food-drug interaction study: which milk component has a decreasing effect on the bioavailability of ciprofloxacin? Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 52: 37-42 (2010) IF: 2,453 Előadások 5. Pápai Katalin, Ciprofloxacin-étel interakciójának vizsgálata, XLI. Rozsnyay Mátyás Emlékverseny, Berekfürdő, 2006. június 15-17., Abstr. p. 38. 6. Pápai Katalin, Gyógyszer-étel interakciók, A gyógyszertári gyakorlat aktuális kérdései, Budapest, 2007. március 21., 5. sz. előadás
10
7. Pápai Katalin, Budai Marianna, Ciprofloxacin-tej interakciójának in vitro biofarmáciai vizsgálata, VIII. Clauder Ottó Emlékverseny, Budapest, 2007. április 12-13., Abstr. p. 35. 8. Klebovich Imre, Pápai Katalin, Budai Marianna, Ludányi Krisztina, Antal István, A gyógyszer-étel interakciók in vitro vizsgálatának jelentősége a gyógyszerfejlesztésben, Gyógyszerkutatási Szimpózium, Szeged, 2007. november 9-10., Abstr. p. 27. 9. Klebovich Imre, Pápai Katalin, Ludányi Krisztina, Antal István, Gyógyszer-étel interakció vizsgálata egy új in vitro technikával, Farmakokinetika és Gyógyszermetabolizmus Szimpózium, Galyatető, 2008. április 2-4., Abstr. p. 43. 10. Imre Klebovich, Katalin Pápai, Marianna Budai, Krisztina Ludányi, István Antal, Bioanalytical aspects of in vitro and in vivo food-drug interactions, 14th International Symposium on Separation Science, Primošten, 30 September – 3 October 2008., 3. sz. előadás Poszterek 11. Pápai Katalin, Budai Marianna, Antal István, Klebovich Imre, Ludányi Krisztina, Ciprofloxacin étel-interakciójának vizsgálata, Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XIII., Budapest, 2006. május 25-26., Gyógyszerészet, 50 (Suppl.), 83 (2006) 12. Pápai Katalin, Budai Marianna, Ludányi Krisztina, Antal István, Klebovich Imre, Ciprofloxacin étel-interakciójának in vitro vizsgálata sovány tejes közegben, A Magyar Experimentális Farmakológia III. Szimpóziuma, Budapest, 2007. június 1-2., Abstr. p. 50.
11
13. Pápai Katalin, Budai Marianna, Ludányi Krisztina, Antal István, Klebovich Imre, Ciprofloxacin in vitro étel-interakciós vizsgálata sovány és zsíros tej, valamint kalcium jelenlétében, Gyógyszerkutatási Szimpózium, Szeged, 2007. november 9-10., P-23 14. Katalin Pápai, Marianna Budai, Krisztina Ludányi, István Antal, Imre Klebovich, Food-drug interaction study on ciprofloxacin in the presence of calcium and low- or high-fat milk, 7th Balaton Symposium on High-performance Separation Methods, Siófok, 2007. szeptember 5-7., Abstr. p. 152. 15. Pápai Katalin, Budai Marianna, Ludányi Krisztina, Antal István, Klebovich Imre Ciprofloxacin-kazein interakció in vitro vizsgálata Farmakokinetika és Gyógyszermetabolizmus Továbbképző Szimpózium, Galyatető, 2008. április 2-4., Abstr. p. 43. 16. Pápai Katalin, Budai Marianna, Ludányi Krisztina, Antal István, Klebovich Imre, Ciprofloxacin in vitro étel-interakciós vizsgálata HPLC-MS módszerrel, Elválasztástudományi Vándorgyűlés, Sárvár, 2008. november 5-7., Abstr. p. 166. 17. Pápai Katalin, Füredi Petra, Budai Marianna, Mike Zsolt, Ludányi Krisztina, Antal István, Klebovich Imre, Diétás étkezés hatása a ciprofloxacin biohasznosulására – in vitro vizsgálat, Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XIV., Budapest, 2009. november 13-14, Gyógyszerészet, 53 (Suppl.), 85 (2009)
12
Egyéb közlemények jegyzéke 18. Imre Klebovich, Károly Migléczi, Emil Mincsovics, William Amoyal, Katalin Pápai, István Hazai, Does it Make Sense to Perform Planar Chromatography in Metabolism Research?, in: Proceedings of the International Symposium on Planar Separations - Planar Chromatography 2005. New Milestones in TLC. (Ed.: Sz. Nyiredy), Published by Research Institute for Medical Plants, Budakalász, Hungary, 107-114 (2005) 19. Ádám Zoltán Dávid, Emil Mincsovics, Katalin Pápai, Krisztina Ludányi, István Antal, Imre Klebovich OPLC Comparison of Methods for Aqueos Extraction of Sennae folium and Tiliae flos Plant Samples, Journal of Planar Chromatography, 21: 119-123 (2008) IF: 0,982 20. Marianna Budai, Pál Gróf, Andreas Zimmer, Katalin Pápai, Imre Klebovich, Krisztina Ludányi, UV light induced photodegradation of liposome encapsulated fluoroquinolones: An MS study Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, 198: 268-273 (2008) IF: 2,362 21. Emil Mincsovics, Katalin Pápai, Krisztina Ludányi, Ádám Zoltán Dávid, Marianna Budai, István Antal, Imre Klebovich, Fully on-line hyphenation of an experimental OPLC separation unit with diode-array detection and mass-spectrometry (OPLC-DAD-MS) for analysis of xanthine compounds Journal of Planar Chromatography 21, 361-366 (2008) IF: 0,982 22. Ádám Zoltán Dávid, Emil Mincsovics, Katalin Pápai, Krisztina Ludányi, István Antal, Imre Klebovich, HPLC-MS analysis of sennoside A and B in aqueous extracts of Sennae folium prepared by a new microwave extraction method Acta Chromatographica 21, 473-482 (2009) IF: 0,676
13
