Cílem mé bakalá ské práce bylo poskytnout p ehled o problematice geneticky modifikovaných organism . Práce je rozd lena do n kolika kapitol, ve kterých samostatn popíši jednotlivé oblasti, kde se geneticky modifikované organismy uplat ují. Je to p edevším rostlinná výroba a živo išná výroba. Další velkou kapitolou je pak produkce potravin moderními biotechnologiemi. Novou technologií je nap íklad biofortifikace, která bude v této práci také popsána. Nové biotechnologie rovn ž produkují mikroorganismy pro mléka ský pr mysl nebo pro pivovarnictví. Transgenní organismy se s úsp chem využívají i v jiných oborech, a už je to farmaceutický pr mysl, medicína nebo technické využití. Modifikované organismy jsou také vhodné pro výzkumné ú ely. Poslední kapitola bude v nována legislativ a jsou zde zmín ny laborato e, které se v eské republice zabývají diagnostikou geneticky modifikovaných organism .
1
Geneticky modifikovaný organismus (GMO) je organismus, krom
lov ka, jehož genetický materiál byl zám rn
zm n n technikou
genetické modifikace a zachoval si schopnost reprodukce [69] [70]. Organismem se rozumí biologická jednotka, bun ná nebo nebun ná, schopná rozmnožování nebo p enosu d di ného materiálu v etn vir , viroid a živo išných a rostlinných bun k v kultu e [69] [70]. Genetickým materiálem je deoxyribonukleová (DNA) nebo ribonukleová kyselina (RNA) [69] [70] Genetickou modifikací (neboli transgenozí) je cílená zm na d di ného materiálu organismu zp sobem, kterého se nedosáhne p irozenou rekombinací, a to vnesení cizorodého d di ného materiálu do d di ného materiálu organismu nebo vyn tí ásti d di ného materiálu organismu [40] [69] [70]. Cisgenní organismy nenesou žádné cizorodé geny, mají pouze zm n ny funkce gen , jež jsou nedílnou sou ástí jejich vlastní d di né informace [33]. Genové inženýrství umož uje kontrolovan m nit DNA s ím zpravidla souvisí i fenotypová zm na, nej ast ji syntéza nového genového produktu. Jeho technikami lze p enést izolovaný gen i mezi jednotlivými druhy organism (nap . eukaryotický gen do bakterií). Zabývá se vytvá ením pozm n ných
i nových gen
nebo p ípravou nových (nep irozených)
kombinací gen a jejich zavád ním do genomu organizm s cílem rekonstruovat jejich genetickou výbavu. Metodickým základem genového inženýrství jsou manipulace s DNA in vitro založené na p íprav rekombinantních molekul DNA a jejich klonování. Tyto metody jsou možné díky objevení dvou typ enzym – restrik ní endonukleasy (pro získání požadovaného fragmentu) a ligasy (pro vložení fragmentu do takové molekuly DNA, která je schopna replikace ve zvoleném typu bun k). Potomci jsou pak ozna ováni jako klon [8, 16, 17].
2
„V lah dká ství nedaleko pláže Waikiki na Havaji si v listopadu 1972 povídali pánové Herbert Boyer z Kalifornské university v San Francisku a Stanley N. Cohen ze Stanford University. První objevil zvláštní enzymy, které „p est ihují“ DNA v ur itém míst tak, že se vzniklé konce zase snadno spojují. Druhý studoval malé kroužky DNA zvané plasmidy v bakteriích. Dohodli spole ný pokus: pomocí Boyerových enzym vloží kousek cizorodé DNA do Cohenova plasmidu, který ji vnese do bakteriální bu ky; co to ud lá? Když takto vnesli do bakterie DNA p edstavující jeden z gen žáby, bakterie produkovala p íslušnou žabí bílkovinu. Tento výsledek p ednesli v dalším roce na Gordonské konferenci v New Hampshire. Zrodila se technika rekombinantní DNA (rDNA), neboli st íhání gen “ [12]. Herbert Boyer spole n
s banké em Robertem Swansonem založili biotechnologickou firmu
Genentech vkladem 500 dolar . Dva mladí v dci Dennis Kleid a Dave Goeddel pracovali na p enesení genu pro inzulín do bakterie, získání obou et zc inzulínu a jejich spojení. V noci ze dne 23. srpna na 24. srpna se jim to poda ilo. Díky t mto 20 nanogram m p išel 14. íjna 1980 historický den pro firmu Genentech. Burza na Wall Street po otev ení za ala prodávat akcie této firmy za 35 dolaru, za 20 minut cena vzrostla na 89 a ve er kon ila na 711/4. Zakladatelé tedy za svou ástku 500 dolar získali každý po 66 milionech. A tímto se odstartoval velký boom biotechnologického pr myslu [11, 12]. Následn
za aly vznikat nové biotechnologické firmy, z nichž n které fungují dodnes.
Nejvýznamn jším produktem byl peptidy pro farmaceutický pr mysl p ipravované fermentací z transgenních kvasinek nebo bakterií. To m lo zna ný medicínský význam, tímto došlo ke snížení ceny lék a zvýšení jejich bezpe nosti. P edtím byly získávány z lidských zdroj a v n kterých p ípadech se tak mohly p enést i n které závažné choroby [11]. Náhodné genetické zm ny se d jí spontánn i u divokých druh rostlin. Lidé se po staletí zapojovali do k ížení rostlin, užitím selektivní hybridizace ke zvýšení užite ných vlastnosti, následované zp tným k ížením pro eliminaci necht ných gen . Genové inženýrství m že spustit žádoucí vlastnost daleko precizn ji pomocí p enesení specifických genetických materiál do rostlinných bun k. Vlastnost by m la být ízena nejlépe jedním nebo n kolika málo geny a n kde v p írod tyto geny najít. M že to být jakýkoli organismus, protože zp sob genetického kódování je univerzální [11, 55]. 3
Možnost modifikovat rostliny se poprvé objevila v roce 1978 (p enos pomocí Agrobacterium tumefaciens) [31]. V roce 1994 byla na trh poprvé uvedena GM plodina. Bylo to raj e FlavrSavr (Lycopersicon esculentum) s prodlouženou životaschopností [8]. Obr. 1: Antisence modifikace [60]
Genetickou modifikací je snížení polygalakturonázové (PG) aktivity. Nová odr da byla vyvinuta pomocí inzerce další kopie genu kódující PG v „antisense“ orientaci, výsledná redukce translace endogenních PG messenger RNA (mRNA). PG enzym je hlavním mechanismem degradace pektin v raj eti vedoucí k m knutí plod . Transgenní odr dy dozrávají normáln ,ale byla zaznamenána pozd jší degradace pektin . Mají zv tšenou tlouš ku a konzistenci, která setrvává ve všech fázích sklizn
i zpracování. FlavrSavr raj e bylo vyvinuto transformací pomocí Agrobacterium
tumefaciens, který obsahoval transferovou DNA (T-DNA) a kopii raj ecího genu kódujícího PG v antisense orientaci. Navíc T-DNA obsahovala sekvenci kódující enzym neomycin fosfotransferázu II (NPTII). Exprese aktivity NPTII se využívá k vyselektování transformovaných rostlin. Výsledkem transkripce antisense genu pro PG není žádný nový protein [4, 14] V roce 1996 to byly další plodiny jako sója, kuku ice, epka nebo bavlník s odolností v i herbicid m i šk dc m.
4
Prvním naklonovaným savcem na sv t byla ovce Dolly v laborato ích Roslin Institutu ve Skotsku. Narodila se 5. ervence 1996 a m la t i matky. Jedna matka dodala DNA, druhá vají ko, do kterého byla DNA injektována a t etí donosila výsledné embryo. Ke klonování byla použita metoda jaderného p enosu [44]. Obr. 2: Fáze jaderného p enosu [44]
Jde o p enos jádra z diploidní bu ky (obsahující 30 – 40 000 gen
a plnou sadu párových
chromozom ) do neoplodn né vaje né bu ky, ze které byl jaderný materiál odstran n (žluté obrázky). Technika zahrnuje n kolik krok . Jádro m že být p eneseno (modré obrázky) nebo intaktní bu ky mohou být vloženy do oocytu. V jiném p ípad dojde k fúzi oocytu a donorové bu ky a rekonstruované embryo je aktivované krátkými elektrickými pulzy. V ovci jsou pak embrya kultivovány asi 5 až 6 dní a pokud se vyvíjí normáln jsou implantovány do náhradních matek [44]. Genetické modifikace živo ich
prod lávají v poslední dob ohromný rozvoj, který však stále
z stává nevyužit. To zp sobuje p edevším nejistota odbytu produkt geneticky modifikovaných hospodá ských zví at a v n kterých p ípadech i nejasnostmi provázejícími dopad chovu GM živo ich na životní prost edí.
5
! " #$
%
$
&
o výb r genu( ) pro dosažení požadovaných nových vlastností o izolace vhodného genu( ) a klonování genu v bakterii o úpravy genu( ) o vnesení a integrace genu do d di ného základu rostliny (transformace) o selekce transformovaných rostlin o sledování projevu transgenu o testy v uzav ených prostorách laborato í a skleníku o vyhodnocení biologické bezpe nosti o polní zkoušky transgenních rostlin o hodnocení biologické bezpe nosti o registra ní zkoušky GM odr dy [64]
! ' Ne všechny transgenní rostliny jsou využívány v zem d lství, ást je použita i pro výzkumné ú ely a poté zni ena. Podle p enosu DNA do bun k rozlišujeme n kolik metod: P ímé: a. elektroporace protoplast Narušení bun né membrány elektrickým pulzem, takže do ní m že vstoupit makromolekula DNA [3, 21, 58] Používá se pro p echodnou i stabilní transfekci. b. mikroinjekce DNA Roztok DNA aplikován p ímo p es plazmatickou membránu do cílové bu ky tenkou jehlou mikromanipulátoru [21, 58]
6
c. bombardování mikroprojektily [3, 34, 58] Za ízení ozna ované jako „gene gun“ umožní vytvo it v bun né st n rostlinných bun k otvory. Tyto otvory vznikají nast elováním ástic zlata nebo wolframu pokrytých ur itým genem. Takto byla modifikována v tšina dnešních transgenních obilovin. Ú innost transfekce závisí na bun ném typu, bun né hustot a stupni proliferace, na kultiva ním mediu, na nastavení parametr pušky a na typu a velikosti mikroprojektil . 2. Nep ímé: a. Agrobacterium tumefaciens semena, listové disky, ko eny, vakuová infiltrace Jednou z nejvíce používaných metod transformace rostlin je práv transformace pomocí rostlinného patogena Agrobacterium tumefaciens. Bakterie p evede ást své vlastní DNA (Ti-plasmid – „tumor-inducting“) do genomu rostlin a tento plasmid je pak schopen vyvolat tvorbu tumoru. Za to odpovídá ást Ti-plasmidu ozna ovaná jako T-DNA (integrace do chromozomu). Bu ky nádoru pomocí n kterých gen bakteriální bu ky produkují opiny, které slouží jako zdroj energie, uhlíku i dusíku [3, 6, 17, 32 58, 66]. Obr. 3: Agrobacterium tumefaciens na rostlinných bu kách [64]
V laborato ích lze bakterii p izp sobit tak, aby byla schopna p enosu zcela ur itých gen . Transfekce však neprob hne ve všech p ípadech úsp šn , je tedy nutné tyto bu ky od sebe odd lit. Proto se p enáší zárove i geny, které toto vyselektování umož ují. Jsou to v tšinou geny rezistence v i antibiotiku kanamycinu nebo jinému faktoru. Z t chto bun k se pak v laborato i vyp stují rostliny [3, 6, 58, 66]
7
! (
$
%
$
)
Transgenní plodiny mohou nést velmi odlišné vlastnosti, které je iní výhodnými pro p stitele, spot ebitele i r zná odv tví pr myslu. asto se setkáváme s jejich rozd lením do n kolika skupin (generací), viz nap . systém, který uvádí Bedná (2000): I. generace: plodiny mají p ínos p edevším pro p stitele – ochrana proti chorobám, šk dc m a plevel m, v tší šetrnost k životnímu prost edí (zjednodušení technologií) II. generace: rostliny odolné v i abiotickým stres m, rezistence nebo tolerance k chladu, suchu nebo zasolení p dy, výhody pro zem d lce III. generace: transgenní plodiny s vyšší nutri ní hodnotou (vhodné složení mastných kyselin, zastoupení deficitních aminokyselin) a antikarcinogenními ú inky, výhody pro spot ebitele IV. generace: plodiny p stované jako ekologicky výhodné suroviny pro n která pr myslová odv tví V. generace: plodiny používané jako náhrada fosilních paliv (výroba etanolu a bionafty) Dnes jsou p stovány hlavn plodiny první generace [18] První genetické transformace rostlin byly provedeny v 80. letech a n které z nich byly dovedeny do formy registrovaných odr d. Mezi nejvýznamn jší GM plodiny pat í sója, kuku ice nebo bavlník [8, 22]. Obr. 4: Vývoj osevních ploch transgenních rostlin [18]
8
Podle p ehledu ISAAA (The International Service for the Acquisition of Agri-biotech Aplications – ISAAA) (Briefs No. 34-2005) byly v uplynulém období GMO p stovány celkem na zhruba 400 milionech hektar p dy, 8,5 miliony farmá , v 21 zemích sv ta, v etn
R. V roce 2005 bylo asi
90 milion hektar oseto schválenými GMO. Podle údaj ISAAA (2005) je oficiáln p stována nejvíce sója (54,4 m ha = 60%), kuku ice (21,2 m ha = 24%), bavlna (9,8 m ha = 11%) a epka (4,6 m ha = 5%) [8, 48]. Mezi nejv tší p stitele geneticky modifikovaných plodin pat í USA, Argentina, Kanada,
ína a
Brazílie. Dále se p stování rozši uje i do íny a Indie nebo jihovýchodní Asie [8, 22].
! Herbicidy Plevele omezují kulturní plodiny v r stu (slune ní zá ení, voda, živiny). V konven ním zem d lství dominuje chemická ochrana proti plevel m v podob selektivních herbicid , které jsou toxické jen pro herbicidy. Neselektivní (totální) herbicidy se požívají jen mimo ornou p du. Modifikované plodiny s geny pro toleranci k herbicidu tolerují ošet ení neselektivními herbicidy. N které plodiny mají schopnost metabolizovat pomocí enzym n které herbicidy na neú inné látky, jiné mají enzym necitlivý k ú inku herbicidu další herbicid prost nep ijmou [18] [31]. Místem toxického ú inku herbicidu bývá obvykle jediný enzym, který je podstatný pro život rostliny. Pro navození rezistence rostlin k herbicid m existují t i hlavní mechanismy transgenoze: 1. transgen kóduje nadbytek enzymu, který je aktivován herbicidem transgen pro odolnost k glyfosátu Dne 14. kv tna 2001 byla v eské republice poprvé povolena ke zpracování (ale ne k p stování) transgenní rostlina. Byla to geneticky modifikovaná sója odolná v i herbicidu Roundup, linie GTS 40-3-2 [34]. Aktivní složkou herbicidu Roundup je glyfosát (jednoduchá slou enina odvozená od aminokyseliny N-fosfinomethylglycin).
9
Obr. 5: vzorec glyfosátu
Ú inek t chto herbicid je založen na schopnosti blokovat rostlinný enzym 5-enolpyruvylšikimát-3fosfosyntázu (EPSPS). Specifického enzymu biosyntézy aromatických aminokyselin (tryptofan, tyrozin, fenylalanin) vyskytujícího se pouze u rostlin, n kterých hub nebo mikroorganism . Všechny rostliny pot ebují aminokyseliny pro sv j r st a funkce. Zablokováním této kritické dráhy, se znemožní rostlinám schopnost získání protein
a enzym
a rostlina hyne. Bakterie
(Agrobacterium tumefaciens, Salmonella typhimurium, Escherichia coli) mají alternativní formu EPSPS enzymu, ozna ovanou jako CP4-EPSPS, která není inhibována glyfosátem. Rozdíl mezi geny, kódující tyto enzymy je nepatrný. Jednoduchá bodová mutace v genu vym ní guanin za cytosin, to má za následek vým nu aminokyseliny alaninu za glycin [43, 47]. Proto je glyfosát neselektivním herbicidem a p sobí na všechny zelené rostliny. Geneticky modifikovaná sója Roundup Ready má d di nou informaci obohacenu o gen EPSPS izolovaný z bakterií [31, 32, 34, 43].
10
Obr. 6: Místo p sobení glyfosátu [60]:
Inhibice glyfosátem
Stejnou odolnost v i glyfosátu lze navodit i p enosem genu produkujícího enzym glyfosát oxidoreduktázu (GOX), kterým je glyfosát v rostlinné bu ce rozložen. Tento gen byl klonován z bakterie Achtomobacter. Této metody bylo použito nap íklad u epky. Vysoce odolných odr d bylo dosaženo kombinací obou modifikací [34, 47]. 2. transgen kóduje odlišnou formu enzymu, která není herbicidem inaktivována. Rezistence na herbicid fosfinotricin (4-hydroxy-methylphosphinol-D,L-homoalanin), známého jako glufosinát (Liberty, Basta). Herbicid blokuje enzym glutaminsyntázu, která odbourává amoniak, jinak by amoniakové ionty rostlinu otrávily. Z p dní aktinomycety Streptomyces hygroscopicus byl získán gen bar (bialaphos resistance) a ze Streptomyces viridochromogenes podobný gen pat
11
(phosphinothricin acetyltransferase). Tyto geny kódují enzym, který je schopen p em ny herbicidu na netoxickou slou eninu, která se i rychle rozkládá [31, 47]. 3. transgen kóduje enzym, který rozkládá herbicid. Transgenní rostliny rezistentní proti herbicidu typu sulfonylmo oviny (sulfuron) jsou schopny inaktivovat enzym acetolaktátsyntázu, která se ú astní syntézy aminokyselin. Transgen byl získán z mutantní linie rostliny Arabidopsis thaliana [47]. V sou asné dob existuje ada herbicid rezistentních odr d, které jsou používány v evropském a zejména sv tovém zem d lství: Tab. 1 [31] Aktivní složka herbicidu
plodina
chlorsulfuron
cukrová epa, slune nice
isoxazol
kuku ice, epka, sója
oxynil
bavlník, epka
sulfonamid
epka
Pro uvol ování t chto odr d do prost edí nebo do ob hu platí p ísné regulace [31].
Šk dci K hubení šk dc se využívají ú inné chemikálie. V 50. letech se využívalo DDT, které se dnes nahrazuje toxinem z bakterie Bacillus thuringiensis ve form post iku. V i šk dc m jsou odolné Bt-plodiny. Rezistence je zp sobena p ítomností genu bakterie Bacillus thuringiensis [31, 34]. Spory tohoto mikroba obsahují krystalický protein - Cry-protein (kódovaný plasmidem, d íve deltaendotoxin), který vykrystalizuje a dokáže velmi specificky hubit ur itý hmyz. Má ú inek na v tšinu lepidopter (motýli, m ry, moli), dipter, (mouchy), hymenopter (vosy, v ely) a coleopter (brouci). Vzácn s ú inkem na nematoda (há átka) [1, 18, 21, 34, 47].
12
Obr. 7: Mechanismus toxicity Bt [67]
Cry-protein sám o sob toxický není, na toxický protein se m ní až v zažívacím traktu hmyzu. Trávicí proteázy odšt pí jeden nebo oba konce molekuly, teprve takto upravená molekula je toxická a rozpouští se jen p i ur itém pH. Larvy lepidopter a dipter mají siln alkalické prost edí v zažívací trubici, kdežto brouci a jejich larvy neutrální nebo mírn kyselé. Proto toxiny p sobící na první skupinu mají ve struktu e p evahu argininu, který je v p ípad molekul ú inných na brouky nahrazen mén
zásaditým lysinem. Další rozhodovací stupe
jsou trávicí enzymy, které musí odšt pit
správnou ást molekuly. Místem ú inku upravených peptid jsou specifické povrchové receptory na epitelu hmyzí trávicí trubice. Jakmile se na n peptid naváže, zm ní formu své molekuly a v membrán bu ky vytvo í otvor, který bu ka není schopna zacelit a hyne. V d sledku toho hyne i ten, kdo krystal poz el – hmyzí larva nebo dosp lec. U Bt plodin je do rostlinného genomu za azen gen ídící tvorbu toxické ásti bílkoviny Cry [1, 18, 21, 34, 47].
Viry Ze 600 typ rostlinných vir jich 250 p sobí vážn jší onemocn ní, která mohou zp sobit ztráty sklizn asi 15%. Rostlinné viry mohou být ssRNA, dsRNA, ssDNA i dsDNA. Studia byla zam ena p edevším na studium geminivir , které mají kružnicovou ssDNA s autonomní replikací v jádrech jako mimochromozomová kružnicová kopie. Dalšími patogeny jsou viroidy tvo ené krátkou kružnicovou ssRNA [47]. Virová rezistence je tedy velmi d ležitá ke zlepšení zem d lské produktivity. Testují se sladké brambory (feathery mottle virus), kuku ice (maize streak virus) a africký maniok (mosaic virus). Významným
patogenem
brambor
je
luteovirus
(Poleovirus
sp.)
p enášený
mšicemi. 13
Vývoj virus-rezistentní pšenice je zatím ve fázi laboratorního výzkumu, kv li složitému genomu této plodiny [15, 41, 47]
Bakteriální a houbové choroby Rezistenci k t mto patogen m zvyšují transgeny kódující chitinázy. Polními pokusy byla otestována epka olejná modifikovaná tímto genem a vykazovala zvýšenou rezistenci k houbovým patogen m Cylindrosporium concentricum, Phoma ingram, Sclerotinia sclerotinium. Zesilující ú inek na geny pro chitinázu mají geny kódující glukanázy [47]. Jiným mechanismem, který zvyšuje tuto rezistenci je lysozym bakteriofága T4, narušující bakteriální bun nou st nu. Tímto genem byl modifikován genom bramboru a navodil tak vysokou odolnost k Erwinia carotovora [47].
!* +
,
Je to systém pravidel, které by m ly zabránit konflikt m mezi p stováním geneticky modifikovaných plodin a konven ním nebo ekologickým zem d lstvím. P enos pylu z transgenních rostlin by mohl ohrozit ekofarmy, které mají zakázáno používat GM plodiny. Zem d lec by nedostal osv d ení pro sv j bioprodukt. To znamená, že produkty by se mohly prodávat pouze jako konven ní a tedy na nižší cenu ( v R by mohl být ekologický zem d lec pokutován až do výše 50 tisíc korun). V Evropské Unii je v sou asné dob koexistence ešena formou doporu ení pro lenské zem , vydaného dne 23. ervence 2003 [4, 5, 15, 25, 31, 42, 45]. Základem úsp šné koexistence je dodržování tzv. izola ních vzdáleností mezi sousedními poli s transgenními a nemodifikovanými plodinami. Dopl kem ochrany jsou tzv. pufrové zóny (nap . pole s GM plodinou bude obseto konven ní plodinou stejného druhu nebo rodu) [5, 15, 45]. Nap íklad pro Bt kuku ici jsou stanoveny tyto vzdálenosti: → 100 m mezi polem s Bt kuku icí a polem s nemodifikovanou kuku icí, → 50 m mezi polem s Bt kuku icí a polem s nemodifikovanou kuku icí, pokud je Bt kuku ice obseta 6 ádky nemodifikované kuku ice, → 600 m mezi polem s Bt kuku icí a polem s kuku icí p stovanou ekologickým zp sobem, → 300 m mezi polem s Bt kuku icí a polem s kuku icí p stovanou ekologickým zp sobem, pokud je Bt kuku ice obseta 6 ádky nemodifikované kuku ice. 14
Pokud zem d lec p stuje modifikované plodiny, m l by po dobu minimáln 5 let ukládat všechny dokumenty týkající se p stování i nakládání s plodinou i jejími produkty (nákup, skladování, transport nebo prodej) [5]. Tento systém má tedy vylou it nebo alespo co nejvíce omezit vzájemné poškození producent r zného typu zem d lství [5, 25, 45].
!-
%
Za cisgenní jsou považovány rostliny, do jejichž d di né informace byly p eneseny úplné geny – tedy geny obsahující všechny introny a s p ipojenými regula ními a termina ními sekvencemi – z druh , z kterých by rostliny mohly získat tentýž gen tradi ním k ížením. Cisgenní rostlina m že nést n kolik takových gen [20, 33, 50]. Do transgenní rostliny byl p enesen jeden i n kolik gen z organism , z nichž by se tyto geny nemohly p enést tradi ním k ížením. asto jde o geny i jejich ásti p evzaté ze d di né informace zástupc jiných íší (nap íklad geny bakterií nebo regula ní sekvence z vir ) nebo nejr zn jší kombinace t chto sekvencí [20]. Sou asná legislativa mezi cisgenními a transgenními rostlinami nerozlišuje. Odborníci z university v nizozemském Wageningenu Henk J. Schouten, Frans A. Krens a Evert Jacobsen však míní, že cisgenní rostliny by nem ly být posuzovány stejnými normami jako rostliny transgenní. Cisgenní rostliny neobsahují cizorodé geny, byly pouze „obohaceny“ o kompletní geny, které pocházejí ze stejného druhu nebo druhu, se kterým lze rostlinu k ížit. Rostliny se tedy v zásad neliší od rostlin, které vznikly klasickým šlecht ním a jsou tedy s ohledem na životní prost edí nebo zdraví lov ka stejn bezpe né [20, 33, 50]. Dá se využít nap íklad p i k ížení kulturních plodin s plan rostoucími pro zvýšení rezistence v i šk dc m nebo chorobám. P i tradi ním šlecht ní se genotyp vysokoproduk ní odr dy smísí s genotypem, který krom požadovaných gen obsahuje i adu gen nežádoucích, které se pak zdlouhav a složit odstra ují dalším šlecht ním. Cisgeneze tento proces významn urychlí, protože se p enese pouze ur itý gen [20, 33, 50]. Této metody se využívá nap íklad p i p íprav rostlin, které za své vlastnosti vd í vysoké mí e heterozygotnosti, jež je udržována vegetativním množením, nap . brambor, jablo nebo banánovník. U plan rostoucí pšenice byly objeveny geny, které zvyšují množství živin a minerálních látek ukládaných do zrna. B hem šlecht ní kulturních plodin na zvýšení výnosnosti se tyto geny vytratily. 15
I moderní okrasné kv tiny b hem šlecht ní n které své geny. U r ží nebo karafiát bylo šlecht ní zam eno hlavn na trvanlivost a vzhled kv tu, p i emž pozbyly geny pro svou intenzivní v ni [20, 33, 50].
16
* .
/0
*! Efektivita p enosu gen závisí na druhu živo icha, který má být modifikován. Rozdílné metody se volí u savc , pták nebo ryb, protože každý má své specifické problémy. P i modifikaci pták je nejv tším problémem to, že snesené vejce obsahuje zárodek již v pokro ilém vývojovém stádiu. U ryb tyto problémy odpadávají, díky použití mikroinjek í techniky. Jikry ryb jsou dostate n velké a bez tvrdých obal . Geny mohou být do živo išných bun k vpraveny transfekcí: 1. Lipofekce Negativn nabitá lipidová transfek ní inidla se váží k záporn nabité DNA, tyto agregáty se p ipojí na bun nou membránu a umožní vstup do bu ky [21, 58]. 2. Pomocí retroviru Živo išné bu ky jsou modifikovány retrovirem, který obsahuje žádanou DNA. V infikovaných bu kách se retroviry stabiln integrují do chromozomu ve form proviru. P i této metod je omezena velikost p enášeného genu (obvykle do 10 kilobazí) [17, 37, 58, 62]. 3. Mikroinjekce Vpravení genu p ímo do raného zárodku pomocí sklen né kapiláry, zárodek je následn vpraven do t la náhradní matky, kde se vyvíjí. Tato metoda se používá hlavn u myší, u hospodá ských zví at není snadné získat pot ebný po et embryí [17, 37, 62]. 4. Embryonální kmenové bu ky Používá se hlavn k vy azení („knock-out“) ur itého genu. Embryonální kmenové bu ky se získávají z raných stádií sav ích embryí, nebo se dokáží neustále množit a jsou schopny diferencovat v jakoukoli tká . Embryonální kmenové bu ky jsou vpraveny do cizích zárodk a vzniká chiméra, která nese v n kterých ástech t la cizí gen [37, 62]. 5. Klonování Jádro je vpraveno do vají ka, které bylo p edtím zbaveno vlastní genetické informace. Vzniklý jedinec je totožný s dárcem bu ky. Úsp šnost této metody je mnohem v tší už u metod p edchozích (okolo 10%). Klonování bylo s úsp chem použito u skotu, koní, prasete, myší nebo králík [36, 37, 62]. 17
*! (
$
%
12
/0 $
)
Hlavní využití geneticky modifikovaných živo ich je p edevším ve výzkumu v oblasti medicíny nebo biologie (nap . octomilka Drosophilla melanogaster, myši nebo potkani). V zem d lství se dá využít geneticky modifikovaných zví at k n kolika ú el m [36].
*! ! 3
0
&
#
#
Nejv tšího úsp chu se dosáhlo u myší (nap . p enosem gen pro r stový hormon, protein c-ski, r stový faktor IGF1), stejný systém však u hospodá ských zví at nefungoval, zde se objevily spíše zdravotní problémy. S lepším výsledkem byla provedena modifikace lososa, do kterého byl vpraven gen pro r stový hormon pstruha. Takto upravení lososi dosahovali až 4krát vyšší hmotnosti (n které druhy transgenních ryb se využívají na Kub nebo v ín ). U hospodá ských zví at se jeví být úsp šn jší metoda knockoutování genu pro protein myostatin, který reguluje r st kosterní svaloviny. Pokud je tento gen vy azen ze své funkce, dochází k nadm rnému r stu svaloviny (p íkladem skotu je plemeno belgické modré) [36, 37, 62].
*! ! 3
0
&/
#
Vyšlecht ní odolných hospodá ských odr d by p edstavovalo velký p ínos. V tomto ohledu nabízí genové inženýrství daleko v tší možnosti než šlecht ní klasické. Významné ekonomické ztráty zp sobuje zán t mlé né žlázy dojnic (mastitis). Mléko nemocné dojnice se nesmi používat, lé ba není dokonalá a onemocn ní se asto vrací. P vodcem je bakterie Staphylococcus aureus, jejíž bun nou membránu narušuje protein lysostaphin z bakterie Staphylococcus simulans. Transgenní zví ata by tedy obsahovala gen pro tuto bílkovinu, která by vznikala p ímo v mlé né žláze. Genového knockoutu lze také využít ke zvýšení odolnosti v i prionovým chorobám. Naruší se gen kódující prionový protein, který je ve správné konfiguraci neškodný, pokud ale dojde ke p em n vyvolá chorobné zm ny nervové soustavy (hov zí BSE – spongioformní encefalopatie, ov í scrapie nebo lidská Creutzfeld-Jakobova choroba). V ín nebo Velké Británii byly zahájeny projekty s cílem zajistit odolnost dr beže k ch ipkovým vir A, hlavn v i subtyp m, kde hrozí p enos na lov ka (nap . H5N1, H7N7) [36, 37, 62]. 18
*! ! 3
4
2
/0
#
) &
I zvýšení kvality živo išných produkt lze dosáhnout genetickými manipulacemi. Dala by se tak zvýšit i kvalita masa. Do prasat byl vpraven gen pro enzym ze špenátu (delta-12-desaturasa), který p em uje nasycené mastné kyseliny na nenasycené. Bohužel byly zm n ny i chu ové vlastnosti masa. Pokusy byly provád ny také se složením kravského mléka, nebo se tam nachází látky, které mohou zp sobovat zdravotní potíže, nap . neschopnost št pit laktosu. Jedním ze zp sobu, jak snížit obsah laktosy v mléce, je p enos genu pro enzym, který by laktosu št pil již v mlé né žláze. Druhým je potla ení syntézy proteinu alfa-laktalbuminu, bez n j není syntéza laktosy možná. Pokud by ale došlo k úplnému vy azení tohoto genu z funkce, narušila by se tím i samotná sekrece mléka. Probíhají také pokusy o tzv. humanizaci mléka. Cílem t chto genetických manipulací je co nejvíce kravské mléko p iblížit mate skému. V kravském mléce by se nahradil alfa-laktalbumin za lidský (zdroj esenciální aminokyseliny cysteinu) a zvýšila by se koncentrace laktoferinu, který váže ionty železa a transportuje je p es st evní sliznici, vykazuje také bakteriostatické ú inky. V kravském mléce je koncentrace laktoferinu nižší. Bylo by tedy vhodn jší pro kojeneckou výživu [36, 37, 62].
*! (
$
%
1
#
Tato problematika je obsahem zákona . 91/1996 Sb., o krmivech, ve zn ní zákona . 244/2000 Sb. Bezpe nost a vhodnost GM plodin jako krmiva je ízena stejnými kriterii pro posuzování jako bezpe nost potravin ur ených pro lidskou výživu. Krmiva mohou obsahovat transgenní plodiny ve velkém množství. Použitá technologie p i pr myslové výrob m že, ale také nemusí vést k degradaci p ítomné DNA a protein . Nejsou však zatím žádné d kazy o jakémkoli škodlivém vlivu, v etn zdraví, produktivity a pohody takto krmených zví at. Ale tyto záv ry nelze generalizovat, nebo každý p ípad by m l být posuzován samostatn [35, 61].
19
- + Potraviny produkované moderním biotechnologiemi jsou rozd leny do n kolika kategorií: 1. potraviny tvo ené nebo obsahující živé/životné organismy (kuku ice) 2. potraviny získané nebo obsahující ingredience získané z GMO (mouka, sojový olej) 3. potraviny obsahující jednotlivé složky nebo aditiva produkované GM mikroorganismy (barviva, vitaminy nebo esenciální aminokyseliny) 4. potraviny obsahující sou ásti zpracované enzymy, které produkují GM mikroorganismy (využití glukosoizomerázy) [15] V sou asnosti je na trhu jen n kolik transgenních rostlin. Jsou to herbicid- a insekticid-rezistentní kuku ice (Bt-kuku ice), k herbicidu rezistentní sója, epka olejka a insekticid-rezistentní bavlník (pro výrobu oleje jako potraviny). Mimoto n které státy schválily odr dy papáji, brambor, rýže, tykve, cukrové epy a raj at. Nov jší plodiny, jsou nicmén v sou asné dob p stovány a je s nimi obchodováno jen omezeném po tu zemí, p edevším pro tuzemskou spot ebu [15]. V n kterých státech se ozna ování GM potravin nevyžaduje. Mezi tyto státy pat í p edevším USA a Kanada [7]. V eské republice jsou producenti od 1. ledna 2000 povinni ozna ovat potraviny, které obsahují nebo byly vyrobeny z GMO (ale v potravin se již nevyskytují). Výrobc m to ukládá novelizovaný zákon . 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích a o zm n a dopln ní n kterých souvisejících zákon (§ 6 odst. 5) [10, 57]. Kontrolu zna ení potravin provádí Státní zem d lská a potraviná ská inspekce, kontrolou živo išných potravin se zabývá Státní veterinární správa. Zna ení GMO spadá pod kontrolu Inspekce životního prost edí [57]. Zna ení se nevztahuje na výrobky, které obsahují mén než 0,9 % GMO, dle vyhlášky . 113/2005 Sb., ve zn ní pozd jších p edpis [4, 57]. Ozna ují se na obalu nápisem „geneticky modifikováno“ nebo „obsahuje geneticky modifikovaný organismus“, pop ípad „vyrobeno z geneticky modifikované (-ho) ...“ s názvem použité suroviny [4, 7, 10, 59].
20
-! "
#
U GM potravin se posuzuje p edevším: 1. výskyt signálních a selek ních gen (rezistence na antibiotika) 2. toxické ú inky (toxiny jako ochrana proti hmyzu) 3. alergenní ú inky (stabilní ásti protein ) 4. nutri ní ú inky (antinutri ní látky, zm na složení charakteristických živin, p ítomnost nových živin) 5. patogenita (modifikované mikroorganismy) [15]
Rezistence Pro vyselektování modifikovaných rostlin se používá gen pro rezistenci na antibiotika (kanamycin nebo hygromycin). Tyto antibiotika se však používají i v léka ství, z tohoto d vodu se objevila obava, že by se mohly geny kódující rezistenci p enést do bakterií a dát tak vzniknou odolným kmen m. Bakterie rezistentní ke kanamycinu jsou však všeobecné p ítomné a geny se mohou voln vym ovat mezi r znými druhy bakterií p irozenou konjugací [47, 65].
Toxiny Mnoho rostlinných nebo živo išných toxických protein bylo vneseno do genomu rostlin, nap . toxiny záškrtu (zp sobuje letalitu rostlinných bun k, v nichž se projevuje, takže je jeho ší ení vylou eno) nebo cholery (zvýšení odolnosti k rostlinným infekcím). Klonovány byly i r zné rostlinné lektiny toxické pro obratlovce, nap . ricin. Tyto rostliny ovšem nebudou nikdy p stovány mimo chrán né prostory. Všechny laborato e pracující s transgenozí rostlin musí zajistit p ísnou izolaci pokusných rostlin od prost edí [47].
Alergie Prevalence potravinové alergie je p ibližn 1 – 2 % u dosp lých a 6 – 8 % u d tí. Nejvíce alergií je zprost edkováno antigen-specifickými protilátkami IgE a jsou charakterizovány jako reakce I. typu. Celkov asi 90 % všech potravinových alergií je spojeno s malým po tem specifických protein
21
p ítomných v osmi nejv tších alergenech: burské o íšky, o echy, kravské mléko, slepi í vejce, ryby, korýši (nap . kreveta), pšenice nebo sója [13, 23, 53, 54, 65]. V p ípad GM produkt je testování na alergenitu velmi d ležité, nebo v tomto produktu dochází k produkci nové bílkoviny. Mohly by nastat dv nebezpe né situace : o u nov produkovaného proteinu není alergenita známa (bakteriální protein) o alergenita proteinu je již známa z organismu dárce (protein sóji) [61] Existují mezinárodn uznávaná doporu ení na testování, která sestavila Mezinárodní zdravotnická organizace za pomoci FAO v roce 2001. D ležitá kritéria používaná p i testování zahrnují (decision tree – rozhodovací strom): o p vod p eneseného genetického materiálu o sekven ní homologie: aminokyselinová sekvence mnoha alergen je snadno dostupná o imunoreaktivita nového proteinu: pokud je tento protein odvozený ze známého alergenního zdroje nebo pokud má homologní sekvenci se známým alergenem, potom je reaktivita tohoto proteinu s IgE ze séra p ecitliv lého jedince stanovena o vliv pH a/nebo trávení: mnoho alergen je odolných ke kyselým žalude ním š ávám a trávicím proteazám o teplota a stabilita: labilní alergeny v jídle, které jedí va ené nebo prošly jiným procesem p ed konzumací jsou mén závažné [13, 23] Když GMO obsahuje geny získané ze zdroje se známým alergenním efektem, potom se musí p edpokládat, že i nový genový produkt je alergenní, jestliže nebyl zjišt n opak. Jestliže jsou v GMO obsaženy geny ze zdroj , kde nebyla prokázaná alergenita, b žné testování závisí primárn na srovnání sekven ní homologie se známým alergenem a na stabilit nového proteinu p i trávení nebo zpracování. Ale pouze tato dv
kriteria nesta í p i posuzování
potenciálního rizika alergenity GM potravin. Zkoumání stability b hem trávení se jeví být pom rn užite ným znakem p i stanovování alergenity GM potravin. Nové proteiny modifikovaných potravin by mohly také hrát d ležitou roli p i vyvolání glutensenzitivní enteropatie. Pokud je požadovaný gen získán z pšenice, žita, je mene, ovsa nebo
22
p íbuzných obilovin, musí být pozorn posuzována možná úloha nového proteinu v podnícení gluten-senzitivní enteropatie [13, 54]. Genetické modifikace nabízejí možnost snížení nebo eliminace proteinových alergen , které p irozen vznikají v ur itých potravinách. P íkladem je transgenní rýže, kde bylo touto technologií výrazn redukováno množství hlavních rýžových alergen [13].
-! 5 Biofortifikace je vývoj plodin, které budou mít vyšší obsah mikronutrient .za použití tradi ních šlechtitelských meto nebo nových biotechnologií. Genetická modifikace rostlin pro zvýšení obsahu mikronutrient je dopl ková cesta. Genetické modifikace m že být provedena dv ma podstatn odlišnými p ístupy. První je použití konven ního šlecht ní a selek ních technik, vznikají kultivary s vyšším obsahem stopových prvk , lepší využitelností mikronutrient a/nebo sníženým obsahem inhibitor vst ebávání stopových prvk . Druhým p ístupem je genové inženýrství. Tyto techniky jsou použity k vytvo ení nových kultivar s požadovanými vlastnostmi. P íkladem takové metody jsou inzerce nových gen , zvýšení exprese gen již p ítomných, ale exprimovaných v malé mí e a deprese exprese gen nebo p erušení dráhy zapojené do syntézy inhibitor absorpce stopových prvk [26, 28].
-! !
2
#
6
Tato rýže, také známá pod názvem „zlatá rýže“, má vyšší obsah -karotenu (prekurzor vitaminu A). Vitamin A (retinol) je nezbytný pro zvýšení rezistence k chorobám, chrání p ed poruchami zraku a slepotou. Deficience vitaminu A je problém, který p ispívá k vážným chorobám a d tské mortalit . Deficience vitaminu A je velkým problémem zdravotnictví rozvojových zemí. Obohacená rýže byla vyvíjena pro p stování v rozvojových zemích. Nyn jší úsilí je zam ené na zajišt ní toho, že vitamin A bude efektivn absorbován v lidském st ev [15, 19, 38, 56, 68].
23
Obr. 8: Zrno rýže [56]:
Dr. Ingo Potrykus (the Swiss Federal Institute of Technology in Zurich) a Dr. Peter Beyer (the University of Freiburg in Germany) vložili do rýže dva geny narcisu a jeden bakteriální gen (bakterie Erwinia uredovora), které realizují
ty i kroky pot ebné pro produkci
-karotenu
v endospermu rýže. Tyto t i geny produkují enzymy nezbytné pro p em nu geranylgeranyl difosfátu (GGDP) na provitamin A. inzertované geny jsou pod kontrolou specifických promotor . Endosperm je vyživovací tká obklopující embryo semene a tvo í v tšinu rýžového zrna, které jsou konzumovány. Zrna mají žlutou barvu díky p ítomnosti provitaminu A [38, 56, 68].
-! !
2
#
2
Prevalence deficitu železa je zna n
vysoká v t ch
ástech sv ta, kde je rýže hlavní denní
potravinou, protože v rýži je železa velice málo. Doposud byly dva železo-vázající proteiny inkorporovány do rýže, protože rýže má ve srovnání s jinými rostlinami n kolik výhod. Rýžové proteiny mají velmi nízkou alergenitu, neobsahuje toxické složky a lze dosáhnout velmi vysokých úrovní exprese. Do rýže byl inkorporován železo-vázající protein mate ského mléka laktoferrin s vysokou úrovní exprese (5 g laktoferrinu/kg zrna), která byla stabilní po více než p t generací [15, 26]. Každá molekula laktoferrinu váže dva atomy železa a rekombinantní laktoferrin byl pln saturován. Tato metoda je vhodná spíše pro kojence a malé d ti, ale u dosp lých nemá v tší význam. Proto se u dosp lých využívá spíše ferritinu, jehož každá molekula m že vázat až 4500 atom železa [15, 26, 42]. 24
Do rýže byt inzerován sojový ferritin, obsah se tak zvýšil dvakrát až t ikrát. Jiným genem vloženým do rýže byl gen pro ferritin z Phaseolus vulgaris. Transformace byla zprost edkována bakterií Agrobacterium tumefaciens a s pomocí rýžového glutellinového promotoru se zdvojnásobil obsah železa [15, 26].
-! ! 7
&
1 2
#
&
Kyselina fytová je inhibitorem vst ebávání železa i zinku a je považována za jednoho z initel p ispívajícího k celosv tovému problému deficience železa a zinku. V lidských i zví ecích studiích bylo dokázáno, že exogenní i endogenní fytáza m že redukovat obsah fytátu ve strav a zlepšovat využitelnost stopových prvk . Jinou možností je inzertovat gen pro fytázu do b žných plodin a exprimovat ji ve vysokých hladinách. P íkladem je vložení genu pro fytázu z plísn Aspergillus fumigatus do rýže. Tato fytáza byla vybrána, protože je tepeln stabilní a proto se p edpokládá, že z stane aktivní i po takových procesech jako je va ení. V rýži dosahuje velmi vysoké exprese, ale var porušuje fytázovou aktivitu a je tedy zjišt na pouze prom nlivá redukce fytát . Nové objevy extremn mikroorganism
mohou pomoci v hledání odoln jších fytáz. Nicmén
termofilních
musí být detailn
prozkoumána jejich alergenita [26, 47].
-! ! 3
0
$
0)
#
&
Cystein nebo peptidy bohaté na cystein vykazují pozitivní vliv na vst ebávání železa a histidin má vliv na usnadn ní absorpce zinku. Jiné organické kyseliny jako fumarát, sukcinát a citrát také zlepšují absorpci stopových prvk . Pro zvýšení obsahu cysteinu ve strav byl inzertován gen pro rýžový matallothionein-like protein. Tento protein je normáln indukován stresem. Byly vyp stovány brambory obsahující nealergenní protein AmA1 izolovány z rostliny Amaranthus hypochondriacus. Hlízy takto modifikovaných plodin se, ve srovnání s kontrolními plodinami, vyzna ují vyšším obsahem všech aminokyselin. Produkce cysteinu, methioninu, lyzinu a tyrozinu je obzvlášt d ležitá. Jejich množství je zna n limitováno v b žn p stovaných plodinách [26, 41, 52].
25
-! !* 3
0
$
Aminokyseliny jsou základními stavebními kameny protein . N které jsou použity jako prekurzory hormon , neurotransmiter , pigment a jiných biomolekul. Lidé a monogastrická zví ata nedokáží syntetizovat 10 z 20 aminokyselin a pot ebují tedy tyto esenciální aminokyseliny ve strav . Ale tyto aminokyseliny jsou p ítomny ve strav
jen v nízkých koncentracích. Mnoho plodin obsahuje
p edevším nízké hladiny lysinu, proto se v minulosti r zné pokusy zabývaly zvýšením koncentrace lysinu v rostlinách klasickým šlecht ním nebo muta ní selekcí. Lysin je syntetizován spole n s jinými esenciálními aminokyselinami threoninem, methioninem a izoleucinem z aspartátu metabolickou dráhou, která je regulována primárn n kolika cykly se zp tnou inhibicí kone ným produktem, které ovliv ují aktivitu klí ových enzym [26, 41, 52]. Kone ný produkt lysin m že blokovat aktivitu prvního klí ového enzymu, který je spole ný všem aminokyselinám této dráhy, aspartátkinázy (AK). Krom toho m že lysin také inhibovat aktivitu dihydrodipikolinátsyntázy (DHDPS), prvního enzymu dráhy vedoucí k syntéze lysinu. DHDPS je dokonce citliv jší než AK. Bakteriální geny kódující bakteriální enzymy AK a DHDPS jsou stokrát mén
citlivé ke zp tné inhibici. Exprese nesenzitivního enzymu DHDPS má za následek
šestinásobný vzr st lysinu, exprese AK zvyšuje osmkrát množství threoninu a dvakrát methioninu [52].
-! !- 5
$
& 1 /
#
Metody biotechnologie byly využity i p i zvyšování zdraví prosp šných složek raj at. Flavonoidy tvo í velké a rozdílné skupiny polyfenolických složek, které jsou ubikvitární v rostlinách. Flavonoidy se ú astní v mnoha ohledech r stu a vývoje rostlin, jako rezistence v i patogen m, produkce pigmentu a ochranu proti UV zá ení. Mimoto, díky antioxida ním vlastnostem jsou prosp šné lidskému zdraví. V epidemiologických studiích bylo zjišt no, že zvýšená konzumace flavonoid by mohla pomáhat chránit proti chronickým chorobám nebo má význam v prevenci nádorových onemocn ní. Mnoho hlavních plodin ur ených pro lidskou stravu bohužel obsahuje jen malé množství flavonoid
a jejich jedlý podíl nebo produkce flavonoid
nemá optimální
antioxida ní vlastnosti. V tšina enzym ú astnící se na biosyntéze r zných flavonoid byla dob e popsána a byly izolovány jejich kódující a regula ní geny [52].
26
Flavonoly jsou skupinou flavonoid , která má velmi dobré antioxida ní vlastnosti a protektivní ú inky v i kardiovaskulárním chorobám. Jak biochemické, tak data o genové expresi poukazují na to, že kritickým krokem v biosyntéze flavonol je chalconizomeráza (CHI), klí ový enzym této biosyntézy. Biosyntéza flavonol byla „up-regulated“ v raj eti pomocí „over-expressing“ CHI genu z Petunie v transgenních raj atech [52].
-! 8
$/
#
) &
Mlé né výrobky nejsou sami o sob modifikované produkty, ale n které z nich mohou být vyráb ny pomocí transgenních mikroorganism .
Chymozin V potraviná ství se vyrábí sýry srážením mléka pomocí enzymu chymozinu. V sou asnosti je n kolik zdroj tohoto enzymu: sající telata, dosp lé krávy a prasata, dále jsou to houby Rhizomucor miehei (neboli Mucor miehei), Endothia parasitica a Rhizomucor pusillus (neboli Mucor pusillus). Dnes se díky moderním biotechnologiím proces získávání chymozinu zna n
zjednodušil.
Chymozin je produkován bakterií Escherichia coli, která byla modifikována telecím genem kontrolující expresi genu pro chymozin. Genem kódujícím chymozin byly také modifikovány kvasinky (Kluyveromyces lactis) a plísn (Aspergillus niger var. awamori). Chymozin produkovaný mikroorganismy je identický se zví ecím enzymem a je také kvalitn jší [2, 24, 27].
Startovací bakteriální kultury Primární funkcí t chto bakterií, ozna ovaných jako bakterie mlé ného kvašení, je p em na laktózy na kyselinu mlé nou. Genetické manipulace t chto bakterií by tedy mohly zahrnovat tyto cíle: o rezistenci k infekci bakteriofágem o produkci antibakteriálních látek jako dalších ochranných faktor o specializovaných startovacích kultur, které budou schopny v tší produkce ur ité chu ové látky Jsou to však stále jen potenciální cíle, které dosud nebyly realizovány [2, 24].
27
-! 8 První fází výroby piva je získání mladiny, která je následn
fermentována kvasinkami
(Saccharomyces cerevisie). Mladina se vytvo í smícháním sladovnického je mene s horkou vodou a p ítomné enzymy degradují sacharidy do formy, kterou kvasinky fermentují. Kv li limitující enzymatické aktivit sladovnického je mene fermentativní prom nlivosti pivovarských kvasnic, okolo 20 % sacharid extrahovaných do mladiny z stane v pivu. V tšina sacharid se skládá z dextrin a škrob . K p evedení tohoto materiálu na fermentovatelné sacharidy se používá enzym glukoamyláza, kterou v dnešní dob produkují GM kvasinky. Na konci procesu dojde k odstran ní kvasinek filtrací a pasterací [24].
-!* +
)
/
Posuzování bezpe nosti GM potravin není v praxi jednoduchý proces, nebo se jedná o komplexní posuzování vzorku, ve kterém je množství chemických látek. Proto byl vyvinut nový zp sob testování bezpe nosti produkt biotechnologií, ozna ovaný jako „substantial equivalence“ (testování podstatné shody). Testování by m lo vystihnout nep ímé ú inky genetické modifikace. Je založeno na pozorování míry shody modifikované plodiny s výchozím organismem. Organizace pro hospodá skou spolupráci a rozvoj (zkrácen OECD z angl. Organisation for Economic Co-operation and Development) vydává tzv. konsensuální dokumenty, ve kterých jsou výchozí organismy popsány. Zatím existují dokumenty pouze pro rostliny [2, 34, 54]. Sleduje se zastoupení nutrient , antinutrient a toxických látek. Pokud nejsou zjišt ny v tší rozdíly mezi potravinami, znamená to, že v d sledku modifikace nedošlo k žádným nežádoucím zm nám a GM potravinu lze považovat za bezpe nou. V p ípad , že ale rozdíly zjišt ny byly, nelze potvrdit substantial equivalence, je na vin n kolik vliv . Prvním je tzv. pleiotropní efekt vnášeného genu vyvolaný bu
ne ekanou interakcí produktu vnášeného genu s n kterou komponentou rostliny,
ne ekanou interakcí metabolické cesty podmín né vnášeným genem s jinou metabolickou cestou, jež je rostlin vlastní, nebo ne ekanou aktivací metabolické cesty, jež není v rostlin obvykle aktivní. Vylou it nelze ani tzv. inzer ní mutaci, která vznikne „nabouráním“ vnášeného genu do genu, jenž je rostlin vlastní a je tímto zásahem narušen, takže nem že zajiš ovat obvyklé funkce. Nejsložit jší je hledání d sledk chromozomální nestability
tzv. somatoklonální variace, která nastala v d sledku
i epigenetických zm n p i laboratorní regeneraci geneticky 28
modifikované rostliny z geneticky modifikovaných. Poté probíhá další testování a zjiš ování, zda je tato zm na závažná z hlediska bezpe nosti rostliny jako potraviny [13, 34, 53, 54].
Konzultace FAO/WHO ur ila obecné požadavky na stanovení nezávadnosti potravin a potravinových složek odvozených z mikroorganism : o mikroorganismy musí být taxonomicky i genotypicky identifikovány o vnesený materiál nesmí kódovat škodlivou látku a musí být geneticky stabilní o vektory musí být modifikovány tak, aby nemohlo dojít k p enosu na jiné mikroby o markerové geny kódující rezistenci na antibiotika se nesm jí použít v mikrobech, které budou v potravin p ítomny živé o do potravin se nesm jí zavád t živé mikroorganismy o nezávadnost modifikovaného produk ního organismu je testována s ohledem na nezávadnost produktu s vneseným genem, schopnosti p em nit nežádoucím zp sobem výživovou strukturu potraviny a jakékoli p íslušné biologické omezení [2]
29
9
0
)2
%
9! (
# $
%
%
&
) )
Možnost genetických manipulací byla dokázána asi p ed 25 lety a s tím také za al ohromný rozvoj molekulární biologie, nebo se naskytly nové možnosti pro studium d di ných struktur. Díky geneticky modifikovaným organism m se výrazn urychlilo studium i mapování genomu r zných organism . Usnadnilo se studium funkcí promotor , zejména u vyšších organism , kde je jich mnoho. Lze je z organismu izolovat a vložit do jiného vhodného, kde se snadno zjistí jeho funkce. Ve vhodných systémech se dá stanovit síla i tká ová specifika promotor (p írodních i zám rn upravených). Transgenní organismy jsou také vhodné ke zkoumání složitých kaskád vývojových a jiných proces , ale také metabolických drah v rámci biochemie i fyziologie [7].
9! (
$
%
4
Lé iva, která byla d íve získávána ze zví ecích tkání, se dnes vyrábí pomocí geneticky modifikovaných organism . P íkladem m že být inzulín pro diabetiky, d íve získávaný z prase ích slinivek. Tento inzulín pomáhá lidem s diabetem, ale lidský inzulín nenahradí nebo se od n j pon kud liší (dv mi aminokyselinami). Imunitní systém n kterých lidí m že tedy na tento inzulín reagovat citliv . V dci zjistili, že se gen pro lidský inzulín dá vpravit do lidské st evní bakterie Escherichia coli a tu je pak možné p stovat na um lých p dách. Inzulín vyráb ný bakterií je zcela istý a v dostate ném množství. Takto byl inzulín poprvé p ipraven v roce 1982 (rDNA technologie) a od devadesátých let 20. století se produkuje ve velkém a levn
lidský inzulín pomocí transgenních kvasinek
(Saccharomyces cerevisie) - Humulin® [8, 30]. Geneticky modifikované organismy pomáhají i p i lé b d tí s poruchami r stu (tzv. nanismus). Takto postižené d ti si v t le nevyrábí dostatek vlastního r stového hormonu. Zví ecí r stový hormon v t le lov ka nep sobí, a proto se využíval hormon izolovaný z ásti mozku (hypofýzy) mrtvých lidí. Hrozilo ovšem nebezpe í Creutzfeldt-Jakobovy nemoci [8]. Jsou však bílkoviny, které bakterie nemohou vyprodukovat v použitelné kvalit . Proto se za aly pro tuto produkci využívat transgenní zví ata. Takto se nap íklad získává srážlivý faktor (VIII a IX) nutný pro lé bu lidí postižených hemofilií, alfa-1-antitrypsin pro lé bu rozedmy plic, antitrombin 30
pro prevenci tvorby nebezpe ných krevních sraženin apod. Chov t chto tzv. živých bioreaktor je p edm tem innosti specializovaných biofarmaceutických firem a zem d lství se na n m nebude podílet významn jší m rou [8, 36]. Také se zkoumá možnost syntézy antigen sav ích patogen , které by po konzumaci p íslušné rostliny mohly vyvolat imunitní reakci a fungovat jako vakcíny. V transgenních bramborách se poda ilo ov it (u myší) vakcínu pro hepatitidu B a posléze se podobného výsledku dosáhlo i u tabáku [40, 41]. Transgenních organism
se dá také využít pro xenotransplantaci, zde se využívá hlavn
transgenních živo ich . P i transplantacích ale dochází k velmi rychlému odvržení práv transplantované tkán (hyperacute rejection). Této reakci by mohla zabránit p ítomnost lidských povrchových antigen . Za slibné jsou považovány p edevším geny pro DAF (decay accelerating factor), gen pro MCP (tzv. membrane cofactor protein) a gen pro CD59. Prase í srdce nesoucí na povrchu bun k antigen DAF vydrží 4hodinový pr tok lidské krve bez zjevného poškození. Byla získána prasata s r znými kombinacemi gen pro DAF, MCP a CD59 [37].
9! (
$
%
1 &
)
I v tomto odv tví se dá využít transgenních živo ich . P íkladem m že být výroba nového materiálu BioSteel transgenními kozami. Kanadská soukromá spole nost Nexia Bioscience zabudovala strukturní gen pro bílkovinu pavou ího vlákna do sekvence pro kozí mlé nou bílkovinou. Bílkovina je v mléce v rozpušt ném stavu a vysráží se p i snížení pH. Z bílkoviny je pak sp ádáno vlákno o nízké hmotnosti a velké mechanické odolnosti. Je asi t ikrát odoln jší než kevlarové vlákno, využívá se tedy k výrob
nepr st elných vest nebo v leteckém pr myslu. V medicín
se používá
k chirurgickému šití p i operacích oka nebo mozku. Je velmi dob e snášeno lidským organismem a po ase je beze zbytku vst ebáno [29, 37, 62].
31
: ; % :! 3 :! ! <
)
Zákony a provád cí p edpisy • nakládání s geneticky modifikovanými organismy je upraveno zákonem
. 78/2004 Sb. o
nakládání s geneticky modifikovanými organismy a produkty a zm n n kterých souvisejících zákon . Datum ú innosti tohoto zákona je od 25.2.2004 a nahrazuje zákon 153/2000 Sb. • Dne 13. zá í 2005 nabyla ú innosti novela zákona . 78/2004 Sb., o nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty – zákon . 346/2005 Sb. • Vyhláška Ministerstva životního prost edí . 372/2000 Sb., kterou se stanoví technická ešení, pomocí kterých m že vzniknout geneticky modifikovaný organismus, a technická ešení, která ke vzniku geneticky modifikovaného organismu nevedou • Vyhláška Ministerstva životního prost edí . 373/2000 Sb., kterou se stanoví požadavky na uzav ený prostor a ochranná opat ení pro jednotlivé kategorie rizika p i uzav eném nakládání s geneticky modifikovanými organismy • Vyhláška Ministerstva životního prost edí . 209/2004 Sb., o bližších podmínkách nakládání s geneticky modifikovanými organismy a produkty v etn všech p íloh [8, 9, 10, 59, 61] Zákon rozlišuje t i zp soby používání GMO: • uzav ené nakládání s GMO, což je použití GMO v laborato ích, uzav ených sklenících, chovech zví at a pr myslových provozech. Pod pojmem nakládání se rozumí nejen vlastní genetická modifikace, ale i uchovávání, p stování a další manipulace s GMO. • uvád ní GMO do životního prost edí je jejich zám rné vnesení do životního prost edí mimo uzav ený prostor, a to za jiným ú elem, než je uvedení do ob hu. Jde o polní pokusy s geneticky modifikovanými rostlinami na p esn definovaném pozemku, které podléhají p ísným pravidl m, sklizené rostliny a semena se po skon ení pokusu musí stanoveným zp sobem zlikvidovat. Pozemek je i po následujících n kolik let kontrolován. • uvád ní GMO a produkt do ob hu je jejich p edání jiné osob za ú elem distribuce nebo používání, pokud se nejedná o p edání výlu n
k uzav enému nakládání nebo uvád ní do
32
životního prost edí. Jde o dovoz, prodej v obchodní síti, skladování, p stování za ú elem prodeje a zpracování, výrobu kone ných produkt a podobn [9, 69, 70].
Výkon státní správy Správní ú ady na úseku nakládání s geneticky modifikovanými organismy a produkty jsou: a) ministerstvo je úst edním správním ú adem v oblasti posuzování vlivu geneticky modifikovaných organism a produkt na životní prost edí a biologickou rozmanitost, b) Ministerstvo zdravotnictví navrhuje ministerstvu postupy hodnocení zdravotních rizik spojených s nakládáním s geneticky modifikovanými organismy a produkty, c) Ministerstvo zem d lství navrhuje ministerstvu postupy hodnocení rizik spojených s nakládáním s geneticky modifikovanými organismy a produkty z hlediska zem d lství d)
eská inspekce životního prost edí (dále jen "inspekce") kontroluje z hlediska ochrany životního prost edí, jak jsou dodržována ustanovení právních p edpis a podmínky stanovené rozhodnutími ministerstva, které se týkají nakládání s geneticky modifikovanými organismy a produkty, a spolupracuje s celními orgány
e) celní orgány kontrolují zásilky, které jsou p i p echodu hranic deklarovány jako geneticky modifikované organismy nebo produkty, zda jsou vybaveny p íslušnými doklady pro p epravu, vývoz, dovoz a tranzitní p epravu f) orgány veterinární správy g) Úst ední kontrolní a zkušební ústav zem d lský h) Státní ústav pro kontrolu lé iv i) Ústav pro státní kontrolu veterinárních biopreparát a lé iv j) Státní rostlinoléka ská správa k)
eská zem d lská a potraviná ská inspekce [70]
33
:! ! = •
>
Sm rnice 90/219/EHS, zm n ná sm rnicí 98181/ES o uzav eném nakládání s geneticky modifikovanými mikroorganismy (GMM)
•
Sm rnice 2001/18/ES, o zám rném uvol ování GMO do životního prost edí
•
Na ízení (ES) 258/97, o nových potravinách a potravinových p ísadách
•
Na ízení (ES) 1829/2003, o geneticky modifikovaných potravinách a krmivu
• Na ízení (ES) 1830/2003, o vysledovatelnosti (dohledatelnosti p vodu) a ozna ování GMO a o sledovatelnosti potravin a krmiv vyrobených z GMO a o zm n sm rnice 2001/18/ES •
Na ízení (ES) 1946/2003, o p eshrani ních pohybech GMO [4, 9, 10, 59, 61]
:! !
%
Cartagenský protokol o biologické bezpe nosti (CPB) se snaží chránit biologickou rozmanitost p ed potenciálními riziky, která mohou p edstavovat živé modifikované organismy, které jsou výsledkem moderní biotechnologie. Je zam en p edevším na p enos živých modifikovaných organism p es hranice stát a má ochra ovat zem , kde dosud chybí vlastní vnitrostátní právní p edpisy v oblasti živých modifikovaných organism . P itom respektuje suverénní práva jednotlivých stát . Byl sepsán v rámci programu OSN pro životní prost edí jako první protokol Úmluvy o biologické rozmanitosti (CBD). Byl p ijat na zasedání Konference smluvních stran CBD dne 29. ledna 2000 v Montrealu a vstoupil v platnost 11. zá í 2003, potom co byl ratifikován 50 r znými státy. eská republika podepsala Cartagenský protokol dne 24. kv tna 2000 v Nairobi (na základ usnesení vlády
eské republiky ze dne 10. kv tna 2000) a pat í k prvním smluvním stranám
Úmluvy o biologické rozmanitosti [8, 39, 46, 49, 51].
:! " #
1<
$
)
Podle zákona 153/2000 Sb. schvaluje Ministerstvo životního prost edí použití živých GMO. Povolení je vždy asov omezeno, vydává se pouze na dobu ur itou (3 – 10 let) a po vypršení této doby se musí podat nová žádost, která je op t posuzována. Pokud Ministerstvo používání GMO schválí, musí následovat ješt posuzování podle dalších zákon . Zda bude GMO sloužit jako potravina, krmivo nebo je ur en k p stování i se bude dovážet ze zahrani í a zpracovávat. 34
Ministerstvem životního prost edí byl založen poradní orgán eská komise pro nakládání s GMO a genetickými produkty ( K GMO). V této komisi jsou p ední v dci a odborníci z obor ochrany zdraví, životního prost edí, zem d lství, mikrobiologie, botaniky, živo išné fyziologie, medicíny a dalších. Žádost posuzuje i Evropský ú ad pro bezpe nost potravin. O uvád ní GMO mají tedy možnost rozhodovat všechny lenské zem . Je to velmi složitý proces, který m že trvat až n kolik let [4, 8, 9, 63]. Obr. 9: Posuzování žádosti o polní pokusy [9]:
Geneticky modifikovaný organismus i jeho produkty je pot eba sledovat po schválení a uvedení do ob hu, pro p ípadné stažení produktu z trhu, pokud by se zjistilo jeho negativního ovlivn ní lidského organismu. Proto bylo je legislativou na ízeno ozna ování takovýchto produkt [8, 9, 63].
:! +
%$$
%
V tšina t chto organism je povolena pouze pro používání v laborato i k v deckým výzkum m. Pro pokusné p stování jsou povoleny dv modifikace kuku ice (odolná v i herbicidu a zavíje i kuku i nému), epka olejka (odolnost v i herbicidu Liberty), brambory, len a slivo . Pro komer ní ú ely zatím nebyl v eské republice povolen žádný transgenní organismus. 35
Pro využití v potraviná ství a krmivech je povolena pouze sója (tzv. Roundup Ready sója firmy Monsanto). Ale tato sója se v naší republice nesmí p stovat, pouze se dováží jako surovina, polotovar nebo hotový výrobek [8, 61].
:! 3
/
Vysledovatelnost (traceability) zabezpe uje zp sob jak sledovat produktu od výrovy po distribuci. Obecné cíle k usnadn ní: o Kontrola a verifikace požadavk na zna ení o Cílený monitoring potenciálních vliv na zdraví a prost edí o Odebrání produkt , které obsahují nebo se sestávají z GMO, kde bylo zjišt no nep edvídatelné riziko na lidské zdraví nebo životní prost edí 1. V p ípad , že produkt obsahuje nebo se sestává z GMO: Pracovníci musí zajistit, že následující dv
okolnosti budou zaznamenány v dokumentu pro
pracovníka, který bude produkt p ebírat: o Sd lení, že produkt – nebo n které z jeho složek – obsahuje nebo se sestává z geneticky modifikovaných organism o Unikátní identifikátor p id lený tomuto geneticky modifikovanému organismu, v p ípad , že obsahuje nebo se sestává z GMO V p ípad , že produkt obsahuje nebo se sestává ze sm si GMO používané pouze a p ímo jako potrava nebo krmivo nebo pro další zpracování, informace vztahující se k unikátnímu identifikátoru mohou být nahrazeny popisem použití od pracovníka, doprovázený seznamem unikátních identifikátor pro všechny tyto GMO, které byly použity k vytvo ení sm si. 2. V p ípad , že produkty jsou vyráb ny z geneticky modifikovaných organism Pracovníci musí zajistit, že následující okolnosti budou p edány v dokumentu, který obdrží pracovník p ebírající produkt: o Ozna ení každé složky potraviny, která byla získaná z geneticky modifikovaného organismu o Ozna ení každé složky krmných materiál nebo aditiv, které jsou získány z geneticky modifikovaného organismu 36
o V p ípad , že produkty pro které neexistuje žádný seznam složek, ozna ení, které produkty jsou získány z geneticky modifikovaného organismu V t chto dvou hypotézách musí pracovníci dodržovat informace pro periodu p ti let od každé transakce, aby bylo možné identifikovat pracovníka, kterým a komu byly výrobky dodány [42]
:!* Diagnostikou GMO, GM produkt a potravin nového typu na bázi GMO se v R se zabývá 6 laborato í: • Laborato Státní veterinární ústav (SVÚ) Jihlava o stanovení GMO v krmivech a potravinách molekulárn biologickou metodou PCR o Roundup-Ready sója, Bt-kuku ice • Státní zdravotní ústav – Centrum hygieny potravních et zc (SZÚ-CHP ) v Brn o Detekce potravin nového typu na základ GMO, GMO a GM produkt na základ pov ení Ministerstva zdravotnictví o Realizace projektu GENOMON ( laboratorní pr kaz, zda potraviny odebrané v obchodní síti byly nebo nebyly vyrobeny z GMO) o Metody PCR a EIA o Sója, kuku ice, raj ata • Státní zem d lská a potraviná ská inspekce (SZPI) Brno o Od roku 2004 sou ástí „Evropské sít laborato í analyzujících geneticky modifikované organismy“ (European Network of GMO Laboratories – ENGL) o Kontrola potravin na základ EC na ízení No. 1829/2003 o Sója, kuku ice, rýže • Ústav molekulární biologie rostlin Akademie v d (ÚMBR AV) R v eských Bud jovicích • Vysoká škola chemicko – technologická (VŠCHT) Praha o Diagnostika GMO a GM produkt jako smluvní laborato e Ministerstva životního prost edí o PCR o Sója, kuku ice, brambory, pšenice
37
• Výzkumný ústav rostlinné výroby (VÚRV) v Praze o Smluvní laborato Ministerstva životního prost edí o Referen ní laborato MŽP R v oblasti kvantitativního stanovení GMO o Chmel kuku ice, epka, sója o PCR [61]
38
? 3
4
Genetické modifikace organism jsou v dnešní dob hodn diskutovaným tématem, které má mnoho odp rc i p íznivc . Je to rychle se vyvíjející obor, jehož rozvoj by se m l podporovat pro jejich možný p ínos. V rostlinné výrob by se díky odoln jším odr dám rostlin mohly snížit ztráty zp sobené šk dci nebo infekcemi napadající hospodá ské plodiny. Díky transgenním organism m se uspíšil výzkum mapování genom . Transgenní organismy také pomáhají ešit problémy v medicín , kde nap . transgenní mikroorganismy mohou produkovat inzulín daleko levn ji a ve v tším množství než byl získáván d íve. Díky nové technologii biofortifikace by se mohly ešit nutri ní problémy v r zných oblastech sv ta. V sou asnosti se tedy s geneticky modifikovanými organismy m žeme setkat v mnoha oborech. P i jejich vývoji je však d ležité dbát na bezpe nost t chto modifikovaných produkt , proto velmi podstatnou roli hraje jejich laboratorní testování p ed možným d sledky v oblasti životního prost edí a zdraví lov ka. Zvlášt u transgenních organism , které mohou mít využití v lidské výživ , je významné testování jejich zdravotních rizik, p edevším jejich potenciální alergenity. Podle mého názoru je d ležité ve vývoji a zkoumání transgenních organism pokra ovat, práv pro jejich potenciální využití v mnoha oblastech lidské innosti.
39
