Praktikum č. 16: Mikrobiologická diagnostika veterinárně významných zástupců rodů Actinomyces, Arcanobacterium, Actinobaculum, Mycobacterium, Rhodococcus, Nocardia, Dermatophilus. Barvení na acidorezistenci.
Cíle: Seznámit se s morfologií a kultivačními vlastnostmi veterinárně významných zástupců uvedených rodů. 2. Naučit se barvicí techniku k průkazu acidorezistentních bakterií. 3. Naučit se obecné postupy bakteriologické diagnosticky tuberkulózy zvířat a paratuberkulózy přežvýkavců. 1.
NEPRAVIDELNÉ NESPORULUJÍCÍ GRAMPOZITIVNÍ TYČINKY • bakterie aerobní nebo fakultativně anaerobní (rody Corynebacterium, Actinomyces, Propionibacterium) • bakterie anaerobní nebo aerotolerantní (rody Bifidobacterium, Actinobaculum)
Rod: Corynebacterium Corynebacterium pseudotuberculosis • saprofyt sliznic gastrointestinálního ústrojí ovcí, koz, skotu a koní • jako potenciální patogen vyvolává kaseózní lymfadenitídy a pneumónie ovcí a koz, dále pak ulcerativní lymfangoitídy koní a skotu
Corynebacterium renale • latentní kolonizace genitálií skotu • původce pyelonefritíd a cystitíd skotu Corynebacterium cystitidis • saprofyt prepuciálního vaku zdravých býků a genitálií krav • příležitostný původce hemoragických cystitíd a pyelonefritíd skotu Corynebacterium pilosum • součást běžné mikroflóry vaginy krav • příležitostný původce cystitíd a pyelonefritíd skotu
100
Corynebacterium kutscheri • saprofyt horních dýchadel myší a krys • jako potenciální patogen vyvolává pseudotuberkulózní změny v plicích a dalších parenchymatózních orgánech DIAGNOSTIKA KORYNEBAKTERIÍ (obecně) Vyšetřovaný materiál: hnis, moč, stěry sliznic, změněné tkáně Přímá mikroskopie preparátů barvených podle Grama. Korynebakteria tvoří drobné, pleomorfní grampozitivní tyčinky, někdy zakřivené. Kultivační průkaz. Vzorky kultivujeme přímo na MPKA a paralelně pomnožujeme v tekutém médiu, po 24 h subkultivujeme na MPKA. Naočkované půdy inkubujeme aerobě o při 37 C po dobu 24-72 h. Získané kultury identifikujeme podle jejich biochemické aktivity k jejímu stanovení využíváme komerčně vyráběných mikrotestů např. API Coryne. Tabulka č. 25: Biochemické vlastnosti vybraných korynebakterií a příbuzných druhů Vlastnost
Arcanobacterium pyogenes
Corynebacterium renale
+ + -
+ +
β hemolýza želatináza ureáza redukce nitrátů kataláza
Corynebacterium Rhodococcus pseudotuberculosis equi
(+) + +
+ + +
(upraveno pro výuku )
Rod: Actinomyces A. israelii, A. odontolyticus, A. naeslundii • tyto druhy se izolují z člověka A. bovis • původce aktinomykózy skotu A. viscosus • infekce psů, koček i prasat
Rod: Arcanobacterium A. pyogenes • komenzál sliznic zvířat, který vyvolává hnisavé infekce (abscesy, polyartritídy, pyémie, mastitídy skotu, endometritídy krav ...)
101
DIAGNOSTIKA Vyšetřovaný materiál: změněné tkáně, hnis, výtěry, výtoky, mléko ... Přímá mikroskopie: grampozitivní tyčinky, rovné nebo mírně zakřivené, různé délky a šířky, řadí se v párech nebo v podobě písmene Y a T, palisády, řetězce. Kultivační průkaz. Vzorky kultivujeme na MPKA připravený z mozkosrdcové infuze (BHI). o Naočkované půdy inkubujeme anaerobně při 37 C po dobu 2-5 dnů (A. pyogenes aerobní inkubace). Čisté kultury identifukujeme podle jejich biochemické aktivity.
DIAGNOSTIKA Vyšetřovaný materiál: výtoky, močový sediment. Přímá mikroskopie : !!! imunofluorescence, G+ pleomorfní tyčinky. Kultivační průkaz. Vzorky kultivujeme na podmínek po dobu 3-5 dnů.
MPKA, který inkubujeme
za anaerobních
Rod: Actinobaculum
•
koryneformní anaerobní bakterie, které na krevním agaru vytvářejí kolonie o průměru do 3 mm s lesklým centrem a matnými okraji. Z biochemické aktivity je významná pozitivní hydrolýza močoviny
Actinobaculum suis • epifyt prepuciální sliznice kanců • původce cystitíd a nekrotických pyelonefritíd prasnic Rod: Propionibacterium • G+ pleomorfní, nepohyblivé tyčinky • vyskytují se v mléčných produktech, hlavně v tvrdých sýrech Rod: Bifidobacterium • G+ anaerobní, krátké, tenké a pravidelné tyčinky • součást mikroflóry střeva člověka a zvířat
MYKOBAKTÉRIA Čeleď: Mycobacteriaceae Rod: Mycobacterium Mykobakteria jsou grampozitivní pleomorfní tyčinky, jejichž charakteristickým znakem je acidorezistence (barví se podle Ziehl - Neelsena). Rod zahrnuje řadu druhů od obligátně patogenních až po saprofytické. 1. Obligátně patogenní původci tuberkulózy a lepry člověka
102
M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. leprae 2. At ypická mykobakteria (mohou být fakultativně patogenní) Dnes má klasifikace těchto mykobakterií podle RUNYONa (rychlost růstu a pigmentace kolonií) spíše historický význam: a) fotochromogenní - pomalý růst, ve tmě tvoří nepigmentované kolonie, které na světle při další inkubaci zřetelně zežloutnou . M. marinum - tuberkulóza ryb a chladnokrevných živočichů M. kansasii - saprofyt b) skotochromogenní - pomalý růst, i ve tmě tvoří výrazně pigmentované kolonie M. scrofulaceum - saprofyt c) nonchromogenní - pomalu rostoucí a nepigmentované kolonie M. avium subsp. avium - původce tuberkulózy ptáků M. intracellulare - saprofyt půdy a vody, izoluje se z tuberkulózních změn v mezenteriálních mízníchuzlinách prasat M. terrae, M. triviale - saprofyté půdy a vody d) rychle rostoucí - vyrůstají do 5 dnů při teplotě 20 - 25oC M. fortuitum, M.phlei, M. smegmatis - saprofyté, kteří mohou příležitostně vyvolat i některé infekce (mastitídy, dermatitídy) 3. Původce tuberkulózy ptáků M. avium komplex - původce tuberkulózy ptáků (kromě papoušků), ojediněle prasat, skotu 4. Ostatní oblikátně patogenní mykobakteria M. avium subsp. paratuberculosis - obligátní patogen, který vyvolává paratuberkulózu přežvýkavců, zejména skotu M. lepraemurium - původce lepry hlodavců a koček DIAGNOSTIKA MYKOBAKTERIÍ (obecně) Vyšetřovaný materiál: změněné tkáně, spůtum, mléko ... Přímé mikroskopické vyšetření otiskových preparátů obarvených podle Ziehl-Neelsena (viz. barvicí metody), preparát prohlížíme minimálně 5 až 10 minut. Barvení acidorezistentních mikroorganismů Mykobakteria a některé druhy aktinomycet (podobně i spóry) přijímají lépe zahřátá barviva, která si podržují i při odbarvování kyselinami, alkoholem či jinými prostředky. Podle této schopnosti se tato skupina bakterií označuje někdy jako acidorezistentní nebo acidoalkoholostabilní. Podstata této vlastnosti nebyla zatím zcela objasněna, ale důležitou
103
úlohu zde bude hrát přítomnost mykolových kyselin v buněčné stěně těchto bakterií. Nejpoužívanější metodou na stanovení acidorezistence je barvící postup podle ZIEHLNEELSONA.
Postup: Preparát fixujeme plamenem, přelijeme konc. karbolfuchsinem a 3x během 5 minut zahříváme nad plamenem do výstupu par (barvivo se nesmí vařit a nesmí vyschnout!) Slijeme barvivo a preparát odbarvíme kyselým alkoholem (musí odtékat čistý alkohol!). Preparát opláchneme vodou a dobarvíme 1% vodným roztokem metylénové modři nebo malachitové zeleně (15 - 20 s.). Pak opláchneme vodou a osušíme. Karbolfuchsin zbarví acidorezistentní bakterie červeně na modrém nebo zeleném pozadí. Kultivační postup: Preparace vyšetřovaného materiálu. Asi 25g tkáně/výkalů po přidání 50 ml fyz. roztoku homogenizujeme ve třecí misce. Tekuté vzorky odstředíme při 3 000 ot., 15-20 minut. Dekontaminace. Homogenizovaný materiál nebo sediment smísíme s 4-6násobným množstvím kyseliny (3-6% H2SO4 nebo HCl) a necháme stát 10-15 min.. Neutralizace vzorku 4 % NaOH, pak odstředění 10-15 min.. Sediment se kultivuje. Kultivace na vaječné půdy podle Petragnaniho nebo Löwenstein-Jensena Inkubace: aerobně při 37oC 8 až 12 týdnů Identifikace kultur: 1. naočkované půdy se odečítají jedenkrát za týden a suspektní kultury se barví podle Z-N 2. pokud kutury vyrůstají do 5 dnů jedná se o rychle rostoucí mykobakteria 3. pomale rostoucí mykobakteria (>5 dnů) se diferencují podle morfologie kolonií a bichemické aktivity (akumulace niacinu, redukce nitrátů, produkce pirazinamidázy...)
Tabulka č. 26: Biologický pokus - pozorovací doba 6-8 týdnů pokusné zvíře (způsob aplikace) M.tuberculosis M.bovis morče (s.c. 0,01mg) ++ ++ králík (i.v.0,01 mg) + ++ kur (i.v. 0,1 mg) -
M.avium +/++ ++
Vysvětlivky: ++ generalizovaná infekce, + lokalizovaná infekce, - beze
Alergenodiagnostika – tuberkulinace.
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis • původce paratuberkulózy (chronická enteritída) skotu, ovcí, koz a ostatních přežvýkavců • inkubační doba onemocnění je několik let (2-6 let) DIAGNOSTIKA Vyšetřovaný materiál: výkaly, stěry změněných sliznic, mezenteriální MU.
104
Přímé mikroskopické vyšetření otiskových preparátů barvených podle Ziehl-Neelsena. Při této metodě je uváděna pouze 30 % úspěšnost průkazu infikovaných zvířat. Kultivační průkaz: vyšetřovaný materiál se preparuje 5% kyselinou šťavelovou po dobu 30 minut při 37oC a následně neutralizuje sodou. Preparovaný vzorek se kultivuje na média, která se obohacují extraktem z Mycobacterium phlei (mykobaktin). Naočkované půdy se aerobně při 37oC až 8-12 týdnů. Nepřímý průkaz: ♦ RVK (90% spolehlivost u klinických infekcí, 30% spolehlivost u latentních) ♦ ELISA ♦ alergický intradermální test (johnin)
NOKARDIOFORMNÍ
BAKTÉRIE
Bakterie této skupiny tvoří mycelium, které se rozpadá na tyčinkovité nebo kokovité formy. Rod: Nocardia • saprofyté půdy, vody a symbionti některých členovců Patogenní druhy: Nocardia asteroides (celosvětové rozšíření) • vyvolává nokardiózu, která probíhá u skotu ve formě akutních až chronických mastitíd, často vznikajících jako důsledek nesprávné léčby primárních mastitíd (iatrogenní vlivy) • méně časté jsou aborty a celkové infekce skotu • u psů a koček může tento mikroorganismus vyvolat séropurulentní pleuritídy • v tropech se u skotu, psů a člověka může rozvinout kožní forma nokardiózy (granulomatózně-purulentní zánět podkoží a regionálních mízních uzlin) DIAGNOSTIKA Vyšetřovaný materiál: hnis, změněné tkáně, mléko. Přímá mikroskopie: hledáme grampozitivní vlákna, tyčinky a koky, které se částečně barví jako mykobakteria – acidorezistentně. Kultivační průkaz: Vzorky kultivujeme na krevní agar připravený z BHI nebo Sabouraudův o agar. Půdy inkubujeme aerobně při 25 - 37 C po dobu 3 - 4 dnů. Nokardie vytvářejí bílé až oranžové kolonie voskovitého vzhledu, 1-2 mm v průměru, pevně ulpívající k médiu. Rod: Rhodococcus • pleomorfní mikroorganismy tvaru koků, tyčinek i větveného mycelia • mají společné antigeny s rody Corynebacterium, Mycobacterium a Nocardia
105
Rhodococcus equi • saprofyt v půdě, komenzál střeva koní, skotu,ovcí a prasat • je původcem bronchopneumonií hříbat, izoluje se rovněž z infekcí cervikálních a submandibulárních MU prasat DIAGNOSTIKA Vyšetřované vzorky: výtěry, změněné MU, krevní sérum. Kultivační průkaz: R. equi vyrůstá na MPKA po 24-48 h inkubace v koloniích pro které je charakteristická M-fáze růstu a narůžovělé zabarvení. Tvoří EQUI faktor, jehož účinek na ovčí erytrocyty je potencován do úplné hemolýzy exolátkami L. monocytogenes. Toho se využívá při identifikaci listerií. Z biochemických vlastností je typická tvorba ureázy a redukce nitrátů. K nepřímé diagnostice lze využít průkazu titru neutralizačních protilátek proti EQUI- faktoru v krevních sérech hříbat a v mlezivu klisen.
Rod: Dermatophilus Dermatophilus congolensis Jsou to grampozitivní kokoidní bakterie, které vyvolávají u člověka a zvířat dermatitídy. Původce se množí v epidermis hostitele, pod vlivem oslabujících vlivů. Onemocnění se projevuje tvorbou vrstevnatých strupů a masivní exudací. DIAGNOSTIKA Vyšetřovaný materiál: kožní seškraby. Přímá mikroskopie: hledáme vláknité formy, spóry. Kultivace: vzorky kultivujeme na MPKA . Půdy inkubujeme za mikroaerofilních až anaerobních podmínek po dobu 1 - 2 dny. Kolonie D.congolensis jsou šedožluté barvy, suché konzistence se zónou úplné hemolýzy. Mikroskopicky ověříme přítomnost vláknitých forem se spórami.
Poznámky:
106
