Praktikum č. 10: Mikrobiologická diagnostika veterinárně významných zástupců rodů Campylobacter, Helicobacter, Lawsonia, Pseudomonas, Burkholderia, Ornithobacterium, Flavobacterium, Moraxella, Francisella, Bordetella, Brucella, Pelistega, Alcaligenes, Acinetobacter.
Cíle: 1. 2.
Seznámit se s morfologií a kultivačními vlastnostmi veterinárně významných zástupců uvedených rodů. Naučit se postupy bakteriologické diagnosticky enzootické sterility skotu, infekcí vyvolaných C.jejuni, pseudomonádových infekcí, brucelózy zvířat, tularémie, infekční keratokonjunktivitídy skotu.
AEROBNÍ NEBO MIKRO AEROFILNÍ, POHYBLIVÉ, ZAKŘIVENÉ AŽ SPIRÁLKOVITÉ GRAMNEG ATIVNÍ BAKTERIE Čeleď: Campylobacteraceae Rod: Campylobacter ♦ zakřivené tyčinky až spirálky s několika závity, velké O,2 - O,5 µm x O,5 - 5 µm, mohou se vyskutnout i formy dlouhé 8 µm. Kratší formy mají tvar písmene S nebo „profil letícího racka“. Starší kultury tvoří kokoidní formy. Buňky jsou na jednom nebo obou koncích vybaveny bičíkem, což jim umožňuje vývrtkovitý pohyb. Jsou mikroaerofilní s respiratorním typem metabolismu. Druhy vyvolávající infekce reprodukčních orgánů: C. fetus subsp. veneralis ♦ původce enzootické sterility skotu, (poruchy plodnosti, časná odúmrť plodu, aborty krav) ♦ asymptomatické infekce prepucia býků C. fetus subsp. fetus ♦ komenzál střeva skotu, ovcí, koz, prasat a ptáků ♦ u skotu vyvolává sporadické aborty ♦ u ovcí a koz je původcem enzootických abortů, porody mrtvých a méně životných jehňat a kůzlat ♦ u člověka může způsobovat občasné enteritídy ! ♦ k infekcím dochází perorální cestou
Diferenciální diagnostika. Při diagnostice kampylobakterových infekcí reprodukčních orgánů zvířat je třeba odlišit nepatogenní saprofytické druhy kolonizující sliznice genitálií a střeva : C. sputorum subsp. sputorum a subsp. bubulus.
59
Druhy vyvolávající infekce střeva: C. jejuni ♦ u řady druhů ptáků a savců je součástí mikroflóry střeva, některé kmeny mohou vyvolat enteritídy u mláďat skotu, ovcí a psů. U ovcí byly popsány aborty po předchozí infekci střeva. ♦ je běžným nálezem ve střevě ptáků různých druhů (latentní infekce), může však vyvolat infekční kampylobakterovou hepatitídu drůbeže. ♦ kontaminované potraviny nebo přímý kontakt se zvířaty (bacilonosiči), mouhou být zdrojem infekce člověka, u kterého vyvolává enteritídy. C. coli ♦ součást mikroflóry střeva zvířat, může vyvolávat enteritídy selat, člověka. ♦ C. uppsaliensis ♦ součást mikroflóry střeva psa, možný původce průjmů štěňat Další druhy izolované z výkalů prasat : C. hyoilei, C. hyointestinalis, C. mucosalis Další druhy izolované z výkalů psů a koček: C. helveticus, C. lari Rod: Arcobacter - vyčleněn z rodu Campylobacter A. butzleri – může u prasat a skotu vyvolat aborty, u člověka pak průjmy A. cryaerophilus – u skotu sporadické mastitídy, izolován z výkalů řady druhů zvířat A. skirrowii – kolonizuje prepucium býků, může být izolován z abortovaných plodů skotu, ovcí a prasat
DIAGNOSTIKA Kampylobaktery vyvolávají různé klinické formy onemocnění zvířat, proto druhy vzorků odebírané k vyšetření jsou různorodé. Pro přepravu vzorků je vhodné použít transportní půdy. Mikroskopie. Oba poddruhy C. fetus je možné prokázat v roztěrech z obsahu slezu zmetka obarvených ředěným karbolfuchsinem (4 min.). V materiálech s nízkou koncentrací původců (cervikální hlen, prepuciální výplašky, obsah slezu) je vhodné použít imunofluorescenční techniky. Spirálovitě zakřivené buňky C. jejuni s vývrtkovitým pohybem hledáme buď v nativních preparátech nebo ve fixovaných preparátech obarvených ředěným karbolfuchsinem nebo krystalovou violetí. Takto vyšetřujeme výkaly, obsahy slezů ovčích zmetků a žluč kuřat s podezřením na kampylobakterovou hepatitídu.
60
Kultivační vyšetření: C. fetus (oba poddruhy) Vyšetřovaný materiál – placenta, obsah slezu abortovaného plodu, vaginální a prepuciální výplašky Zpracování výplašků : 1. filtrační metoda: odstředění při nízkých otáčkách, filtrace supernatantu přes membránový filtr s póry 0,65 µm a kultivace několika kapek na thioglykolátovém krevním agaru 2. selektivní metoda: odstředění 20 min., sediment se kultivuje na KA s antbiotickým suplementem (novobiocin, polymyxin B, cykloheximid) + Paralelně se očkují neselektivní půdy pro možný záchyt jiných patogenů. Mikroaerofilní inkubace v anaerostatu, který naplníme směsí plynů z tlakové láhve (84% N2, 10% O2 , 10% CO2) nebo použijeme komerčně vyráběných generátorů. Doba inkubace 4-6 dnů, podezřelé kolonie se mikroskopicky vyšetří a izolují na KA s thioglykolátem sodným.
C.jejuni ♦ rektální výtěry nebo výkaly se kultivují na jedno z několika použitelných médií. Jako základní půdy pro kampylobaktery slouží např. Columbia agar, Brucella medium a jiné komerčně vyráběné základy, které se obohacují o směs antibiotik. Naočkované půdy se inkubují ve výšezmíněné atmosféře 2 – 3 dny při 42o C. Biochemická diferenciace:
hydrolýza hippurátu sodného C.jejuni +
C. coli –
Tab. Č. 6: Základní biochemické rozlišení kampylobakterů: růst při kataláza redukce produkce H2S druh 25oC 42oC
C.fetus subsp. veneralis C.fetus subsp. fetus C. jejuni C.coli C. lari C.sputorum biovar sputorum C.sputorum biovar bubulus C.sputorum biovar fecalis
NO3
octan Pb TSI
citlivost ke kys.nalidix.
citlivost k cefalotinu
+
-
+
-
-
-
R
C
+
-
+
-
+
-
R
C
-
+ + + +
+ + + -
+
+ + + +
+
C C R R
R R R C
V
-
-
+
+
+
V
C
-
+
+
+
+
+
R
C
61
Rod: Helicobacter H.pylori ♦ původce gastritíd a vředů žaludku člověka (z žaludku a střeva člověka mohou být izolovány i další druhy H.nemestrinae, H.acinonyx, H.fennelliae) Přehled druhů helikobakterů izolovaných z gastrointestinálního traktu zvířat: H.hepaticus, H.muridarum (myš), H.canis (pes, člověk), H.cinaedi (křeček, člověk), H.heilmannii ( kočka, člověk), H.felis (kočka, pes), H.pametensis (prase, volně žijící ptáci), H.mustelae (fretka), H.pullorum (drůbež), H.pamentensis, H.nemestrinae.
Úkol: Zakreslete mikroskopický tvar kampylobakterů.
Lawsonia intracellularis Původce proliferativní enteropatie prasat, která postihuje odstávčata ve stáří 6 – 12 týdnů. Zánětlivé změny postihují terminální část tenkého střeva, především ileum, z tlustého střeva cékum a kolon. Diagnostika: ♦ klinické příznaky a charakteristické patoanatomické změny mohou být dostatečné pro předběžnou diagnózu ♦ původce se prokazuje ve výkalech nebo sliznici střeva imunofluorescencí nebo PCR ♦ v histologických řezech změněné sliznice lze lawsonie prokázat impregnací stříbrem nebo imunohistochemickým barvením ♦ se může izolovat na buněčných liniích odvozených z enterocytů
GRAMNEG ATIVNÍ AEROBNÍ / MIKRO AEROFILNÍ TYČINKY A KOKY Čeleď: Pseudomonadaceae Rod: Pseudomonas Pseudomonas aeruginosa Fakultativní patogen vyvolávající hnisavé záněty různých tkání. Vyskytuje se ve vodě, půdě, odpadech; může kontaminovat potraviny. DIAGNOSTIKA Vyšetřovaný materiál - tamponové výtěry, výtoky, změněné tkáně.
62
Kultivační průkaz. P.aeruginosa roste na běžných médiích v plochých koloniích velikosti 34mm, často s olejovitý leskem a charakteristickým nasládlým zápachem (po aminoacetofenonu). Kultury mohou tvořit pigmenty (modrozelený, zelený, červený nebo hnědý), které difundují do kultivačních média. Rod: Burkholderia Rod zahrnuje některé původní druhy pseudomonád. Burkholderia mallei Vyvolává maleus (vozhřivka) lichokopytníků. Diagnostika založena na metodách nepřímého průkazu (sérologické a alergické testy). Burkholderia pseudomallei Původce melioidózy u kopytníků, ptáků a člověka (Blízký Východ). Průběh onemocnění podobný vozhřivce. Další druhy : P. fluorescens, Burkholderia cepacia, P.stutzeri, P.putida a jiné.
Tab. č. 7: Charakteristické vlastnosti patogeních pseudomonád Vlastnost tvorba pigmentu zápach růst na MCA růst při 5 o C růst při 42 o C oxidace glukózy oxidace laktózy arginin dihydroláza redukce nitrátů na NO2 redukce nitrátů na N2 pohyblivost
P.aeruginosa ++ nasládlý + + + + + v +
Burkholderia pseudomalei hnilobný + + + + + + + +
Burkholderia malei + většinou + + -
č. Neisseriaceae Rod: Moraxella ♦ subgenus Moraxella (tyčinky) ♦ subgenus Branhamella (koky) Moraxella bovis Je to komenzál sliznice horních dýchacích cest a spojivky skotu, může však u těchto zvířat vyvolat infekční keratokonjuktivitídu (IKKS). Na rozvoji IKKS se podílí i další mikroorganismy jako mykoplazmata, chlamydie, ricketsie, viry a faktory prostředí (intenzita UV záření, mechanické dráždění).
63
DIAGNOSTIKA Vyšetřovaný materiál. Pro kultivační vyšetření se získávají tamponové výtěry spojivkového vaku. Kultivační průkaz. Přímá kultivace se provádí na MPKA , nejlépe ihned po odběru vzorku. Případně se použije pro rychlou přepravu do laboratoře transportní médium. Identifikace. Moraxella bovis vyrůstá na MPKA v šedých, hlenovitých koloniích s výraznou hemolýzou. Při hodnocení biochemické aktivity jsou typické tyto vlastnosti: ♦ je kataláza pozitivní ♦ nefermentuje uhlohydráty ♦ zkapalňuje želatinu ♦ netvoří indol a ureázu Č. Flavobacteriaceae Rod: Flavobacterium Flavobacterium columnare Původce kolumnariózy, infekce ryb chovaných v teplých vodách (25-32 oC). Infekce se projevuje žlutohnědými lézemi na žábrech a kůži. Flavobacterium psychrophilum Původce fry syndromu duhových pstruhů a septických infekcí lososovitých ryb. Rod: Ornithobacterium Ornithobacterium rhinotracheale Původce infekcí respiratorního traktu kuřat a krůt. Infekce jsou provázeny výtokem z nosu, ztíženým dýcháním, ztrátami na váze a zvýšeným úhynem.
Ostatní rody Rod: Brucella Brucely jsou intracelulární parazité, kteří u zvířat a člověka vyvolávají brucelózu. Predilekčním místem výskytu těchto bakterií je u samic placenta a plodové vody, u samců tkáň varlat. DIAGNOSTIKA Vyšetřovaný materiál - placenta, obsah žaludku plodu, mléko, obsah abscesů, nadvarlata, ejakulát.
64
Mikroskopie – otiskové preparáty z placenty, roztěry vyšetřovaného materiálu barvíme modifikovaným postupem podle Ziehl-Neelsena. Teplem fixovaný roztěr barvíme 15 minut ředěným karbolfuchsinem, odbarvíme 0,5% roztokem kyseliny octové (15 vteřin), dobarvíme 2 minuty metylénovou modří, opláchneme vodou a osušíme. Brucely se barví červeně na modrém pozadí buněčného detritu. Kultivační průkaz. K izolaci brucel se používají média jejichž základem bývá tryptonový agar, Brucella agar nebo Columbia agar. Tato média se obohacují o selektivní suplementy, např. barviva (krystalová violeť) a antibiotika (cykloheximid, bacitracin, polymyxin B). Identifikace. Brucely jsou velmi drobné kokobakterie s pozitivní tvorbou katalázy, oxidázy a ureázy (B.ovis negativní). Další růstové a biochemické vlastnosti vhodné k diferenciaci druhů jsou uvedeny v učebnici Speciální veterinární mikrobiologie. Druhy B.abortus, B.melitensis, B.suis se dále člení na biotypy. Nepřímý průkaz (viz. cvičení z imunologie) Využívá se pomalá a rychlá aglutinace, Coombsův test, RVK a další testy. Tabulka č. 8: Podmínky inkubace brucel Druh Atmosféra Teplota Inkubační doba B.abortus 10% CO2 4 - 10 dnů 37o C B.ovis 10% CO2 2 - 3 dny 37o C B.suis aerobně 4 - 10 dnů 37o C B.canis aerobně 3 dny 37o C B.melitensis aerobně 3 dny 37o C B.neotomae aerobně 3 dny 37o C Poznámka: V některých chovech prasat komplikuje diagnostiku brucelózy zkřížená antigenní struktura brucel s druhem Yersinia enterocolitica sérovar 09. Rod: Bordetella B. bronchiseptica Široce rozšířený mikróbní druh u domácích a volně žijících zvířat, má afinitu ke sliznici dýchacího traktu, latentní infekce jsou časté zvláště u prasat. Uvedené infekce vyvolává samostatně nebo společně s bakteriemi jiných druhů, viry a mykoplazmaty. Vyvolává následující infekce: ♦ atrofickou rhinitis prasat (sípavka) - často společně s druhem Pasteurella multocida ♦ bronchopneumonie selat ♦ rhinitis a pneumonie u králíků a jiných hlodavců ♦ bronchopneumonie u psů (tzv. psincový kašel), méně časté jsou infekce koček ♦ respiratorní infekce krůt i jiné drůbeže
65
DIAGNOSTIKA Vyšetřovaný materiál. Získávají se výtěry horních dýchacích cest, výtoky, plicní tkáň. Kultivační vyšetření. Vzorky kultivujeme na MPKA, Endův agar nebo McConkey agar. Naočkované půdy pak inkubujeme při 37o C po dobu 24-72 hodin. Identifikace. U získaných kultur hodnotíme zejména následující vlastnosti: oxidáza + pohyb + H2S -
nitráty + OF test indol -
kataláza + ureáza + utilizace citrátu +
želatináza -
B. avium Vyvolává vysoce kontagiózní infekce respiračního traktu drůbeže. Další druhy: B.pertussis, B.parapertussis, B.holmesii Rod: Riemerella Riemerella anatipestifer Je to původce infekční serozitídy kachen (new duck disease). Rod: Alcaligenes A. faecalis Gramnegativní pohyblivé tyčinky až koky, které mají význam z hlediska diferenciální diagnostiky bordetel. Tabulka č. 9: Diferenciace veterinárně významných bordetel a Alcaligenes faecalis Vlastnost růst na MCA růst na SSA redukce nitrátů ureáza utilizace citrátu utilizace malonátu
B.bronchiseptica + + + + -
B.avium + + + -
Alcaligenes faecalis + + + +
Rod: Francisella Francisella tularensis Původce tularémie, která primárně postihuje zajíce a volně žijící hlodavce (latentní infekce až generalizované septikémie). Fatální septikémie jsou zřídka zjišťovány u domácích zvířat. Infikovat se může i člověk, zvláště při kontaktu s nemocnými zvířaty, infekci mohou přenést rovněž infikovaní členovci. DIAGNOSTIKA Vyšetřovaný materiál. Vyšetřují se změněné tkáně jako mízní uzliny, parenchymatózní orgány, z kadáverů v rozkladu je nejvhodnějším materiálem kostní dřeň.
64
Kultivační médií:
vyšetření. Provádí se přímá kultivace na některé z následujících izolačních
♦ Francisův agar - agar s glukózou, cystinem, 10% králičí nebo morčecí krve a antibiotickým suplementem (penicilin, polymyxin B a nystatin) ♦ Mc Coy a Chaplinovo vaječné médium Biochemické vlastnosti. F. tularensis štěpí bez tvorby plynu glukózu, sacharózu, manit, maltózu. Negativní je test na průkaz štěpení laktózy, želatiny, močoviny a tvorby indolu. Rod: Pelistega P. europaea Druh je izolován v souvislosti s infekcemi dýchacího ústrojí holubů.
Poznámky:
65
66
