CHAPTER VII
Summary Samenvatting
Chapter VII
SUMMARY Due to their importance in the production of many food and feed products lactic acid bacteria (LAB) have been subjected to extensive genetic and biochemical research. Most members of the LAB are regarded as safe organisms. They abound in nature, are used in a wide range of fermentations and are highly promising candidates for the further development of (new) applications in the food, feed and pharmaceutical industry. Their main function in fermentations is to lower the pH due to the production of lactic acid and, thus, to prevent the growth of spoilage or pathogenic bacteria in the fermentation product. During the last decades it has become evident that the antimicrobial activity of LAB is not only caused by lowering of the pH, but that LAB also produce compounds that can inhibit the growth of other bacteria. Examples of such substances are organic acids, hydrogen peroxide, diacetyl, defective phages, lytic agents, enzymes and bacteriocins. Moreover, LAB are not only important for the preservation of fermented products, they also greatly contribute to the development of flavour, texture and, frequently, the nutritional values of the end-products of the fermentation process. One of the most extensively investigated properties of LAB in the last several years is their ability to produce proteinaceous compounds (bacteriocins) that inhibit the growth of other closely or, in several cases, more distantly related bacteria. Knowledge concerning bacteriocins, has been gained at the genetic, biochemical and application level. This thesis describes the analysis of a number of aspects of the secretion and maturation machinery of the bacteriocin lactococcin A (LcnA) from Lactococcus lactis, which is initially synthesized as a precursor protein (preLcnA), containing an N-terminal extension of 20 amino acids (the leader). The emphasis was on the determination of the membrane topology of the proteins involved in the secretion of LcnA, as well as the elucidation of domains within the (pre)LcnA peptide that are important for the cellular localization and secretion of LcnA. Two membrane proteins, LcnC and LcnD, are essential for the secretion and maturation of LcnA. These two proteins form a Type I or sec-independent dedicated transport system. LcnC belongs to the family of ABC (ATP-binding cassette) transporters, while LcnD is an accessory protein. The membrane topology of LcnD has been analysed by constructing translational fusions of N-terminal parts of this protein to the reporter enzymes alkaline phosphatase (PhoA), lacking its own secretion signal, and ß-galactosidase (LacZ) (see Chapter II and III of this thesis). The enzymatic activities of these protein chimeras are indicative of the cellular location of those amino acid residues of LcnD to which the reporter enzyme has been fused. These studies conducted in Escherichia coli and L. lactis demonstrated that LcnD contains one transmembrane segment (TMS) in its N-terminus and that the first (approximately) 20 amino acids of the protein are present in the cytoplasm. The (major) C-terminal part of LcnD proved to be located at the extracellular side of the cytoplasmic membrane.
108
Summary/Samenvatting
This experimentally determined membrane topology model was in agreement with a computerpredicted model and with proposed or experimentally confirmed membrane topologies of accessory proteins of other Type I secretion systems. To facilitate the generation of fusions of a protein of interest to the reporter enzymes LacZ and PhoA, a wide-host-range fusion vector system consisting of the two plasmids pFUSLC and pFUSPC, respectively, has been developed (Chapter III). During the construction of the PhoA fusion vector, the phoA gene has been mutagenized. The mutated gene specified an enzyme (PhoA*) that still had the enzymatic properties of PhoA. In contrast to the wild-type gene, the mutated copy could be cloned under control of a strong lactococcal promoter in L. lactis. To test the system, fusions of LcnD with LacZ and PhoA* have been constructed and analysed. The data confirmed the earlier established membrane topology of LcnD. However, differences in alkaline phosphatase activities of the LcnD-PhoA* chimeras were observed between E. coli and L. lactis: chimeras with high activities in E. coli gave low activities in L. lactis and vice versa. Proteinase K accessibility studies showed that these differences were not caused by differences in the membrane topologies of the chimeras in E. coli and L. lactis, but, rather, that in L. lactis PhoA* has a high enzymatic activity in the cytoplasm, whereas activity is low when the moiety is translocated to the extracellular side of the cytoplasmic membrane. In this respect, PhoA* in L. lactis behaves like LacZ in E. coli and L. lactis. Several computer programs that predict the topology of membrane proteins, have been used to establish a model for the membrane topology of LcnC. Each of these programs arrived at a different model with respect to the number of transmembrane segments (TMSs) in LcnC, varying between four and six. To address these ambiguities, the fusion vector system described in Chapter III, has been used to analyse the membrane topology of LcnC experimentally (Chapter IV). The data suggest that LcnC deviates from most other ABC transporters, with known topologies, in that only four TMSs seem to span the cytoplasmic membrane instead of the commonly observed six TMS motif. Both LacZ and PhoA* protein fusions predict four TMSs, but they differ in the exact positioning of these membrane spanning domains in LcnC. However, in all cases the N- and C-terminal domains are predicted to reside in the cytoplasm. Co-expression of the accessory protein LcnD did not influence the membrane topology of the chimeras, as judged from their enzymatic activities. Also, no differences were observed in the LcnC membrane topology in the two hosts E. coli and L. lactis. In addition, preLcnA has been overexpressed in L. lactis in the presence or absence of the N-terminal 164 amino acids of LcnC. Samples of these cells were analysed by tricine-SDS-PAGE and by overlayering of the gels with L. lactis IL1403 as indicator strain and it was shown that the N-terminal cytoplasmic domain of LcnC is required for the in vivo processing in L. lactis of preLcnA into its mature form.
109
Chapter VII
Chapter V describes the mutational analysis, and the cellular localization of epitopetagged derivatives of LcnA. All mutations at various positions in the leader or the mature part of the bacteriocin affected drastically its extracellular antimicrobial activity. As the LcnA derivatives contained a defined epitope, they could be detected by Western hybridization. Cell fractionation studies showed that preLcnA was mainly associated with the cytoplasmic membrane. This is the case in the presence as well as in the absence of the secretion machinery, indicating that the prebacteriocin has an intrinsic property to insert into the cytoplasmic membrane. Moreover, the results suggest that the information for the targeting of preLcnA to the cytoplasmic membrane is located in the putative "-helix in the C-terminal part of (pre)LcnA and, in the presence of the secretion apparatus, in the leader peptide. In addition, the results suggest that both these two domains in preLcnA may be important for (efficient) secretion. Using the topological model of LcnD, Chapter VI describes the use of this protein to present epitopes at the extracellular side of the cytoplasmic membrane of L. lactis. N-terminal parts of the pp65 protein of human cytomegalovirus (HCMV) were fused to the 80 N-terminal amino acids of LcnD. By using monoclonal antibodies raised against the N-terminal region of pp65 (amino acids 1-99), proteinase K accessibility studies demonstrated that the viral epitope can be expressed in L. lactis at the extracellular side of the cytoplasmic membrane. Based on this result, future work envisages the development of L. lactis as a tool for (oral) immunizations against the CMV virus.
110
Summary/Samenvatting
SAMENVATTING Vanwege het grote belang van melkzuurbacteriën (LAB) voor de productie van vele voedings- en voedermiddelen, zijn deze micro-organismen de afgelopen decennia onderwerp geweest van veel genetisch en biochemisch onderzoek. Verreweg de meeste LAB hebben de status van veilige organismen. Ze komen veelvuldig in de natuur voor, worden gebruikt in een grote variëteit aan fermentaties en zijn veelbelovende kandidaten voor een verdere ontwikkeling van (nieuwe) toepassingen in voedings- en voedermiddelen en de farmaceutische industrie. Hun belangrijkste functie in fermentaties is het verlagen van de pH door de productie van melkzuur, waardoor de groei van andere, pathogene of voedsel bedervende, bacteriën wordt onderdrukt. Gedurende de laatste decennia is het duidelijk geworden dat de antibacteriële activiteit van LAB niet allen wordt veroorzaakt door het verlagen van de pH, maar dat LAB ook bepaalde verbindingen produceren die de groei van andere bacteriën kunnen remmen of voorkomen. Voorbeelden daarvan zijn: organische zuren, waterstof peroxide, diacetyl, defecte bacteriofagen, lytische stoffen, enzymen en bacteriocinen. Bovendien zijn LAB niet alleen van belang voor de conservering van gefermenteerde producten, maar dragen zij ook in belangrijke mate bij aan de ontwikkeling van de smaak, de consistentie en, in vele gevallen, de voedingswaarde van de eindproducten van het fermentatieproces. Eén van de meest uitgebreid bestudeerde eigenschappen van LAB gedurende de afgelopen jaren is hun vermogen om eiwitten (bacteriocinen) te produceren, die de groei van andere, nauw, of in sommige gevallen, minder nauw aan LAB verwante micro-organismen kunnen voorkomen. Omtrent deze bacteriocinen is kennis vergaard op zowel genetisch als biochemisch niveau, alsmede op applicatie gericht onderzoek verricht. Dit proefschrift beschrijft de analyse van een aantal aspecten van het secretie apparaat van het bacteriocine lactococcine A (LcnA) van de melkzuurbacterie Lactococcus lactis, dat als een precursor wordt gesynthetiseerd met een N-terminale extensie van 20 aminozuren (de leader). De nadruk in het hier beschreven onderzoek lag op de bepaling van de membraan topologie van de eiwitten die betrokken zijn bij de secretie van LcnA, als mede de identificatie van domeinen van LcnA die van belang zijn voor de cellulaire lokalisatie en de secretie van dit bacteriocine. Twee eiwitten, LcnC en LcnD, zijn essentieel voor de secretie en maturatie van LcnA. Deze twee eiwitten vormen samen een Type I, oftewel een sec-onafhankelijk, specifiek secretie apparaat. LcnC behoort tot de familie van ABC (ATP-bindende cassette) transporters, terwijl LcnD een accessoir eiwit is. De membraan topologie van LcnD werd bepaald door translationele fusies te maken van N-terminale delen van LcnD met de reporter enzymen alkalische fosfatase (PhoA), ontdaan van het eigen secretie signaal en ß-galactosidase (LacZ) (zie Hoofdstuk II en III van dit proefschrift). De enzymatische activiteiten van deze fusie-eiwitten geven een indicatie van de
111
Chapter VII
cellulaire locatie van die aminozuren van LcnD, waarmee de reporter enzymen zijn gefuseerd. Dit onderzoek, zowel in Escherichia coli als L. lactis verricht, toonde aan dat LcnD één transmembraan segment (TMS) bevat in de N-terminus en dat de eerste (ongeveer) 20 aminozuren zich in het cytoplasma bevinden. Het (grootste) C-terminale deel van LcnD bleek zich aan de extracellulaire zijde van de cytoplasma membraan te bevinden. Deze experimenteel bepaalde membraan topologie bleek goed overeen te stemmen met een door computerprogramma’s voorspeld model en met voorspelde of experimenteel bepaalde topologieën van accessoire eiwitten van andere Type I secretie systemen. Om de constructie van fusies van een te onderzoeken eiwit met de reporter enzymen LacZ en PhoA te vergemakkelijken, is een fusie vector systeem ontwikkeld, respectievelijk bestaande uit de twee plasmiden pFUSLC en pFUSPC (Hoofdstuk III). Deze twee plasmiden zijn in staat te repliceren in een breed scala aan gastheren. Gedurende de constructie van de PhoA fusie vector, is het phoA gen gemuteerd. Dit gemuteerde gen codeert voor een enzym aangeduid met PhoA*, dat de enzymatisch eigenschappen van PhoA heeft behouden, maar in tegenstelling tot het wildtype gen, in L. lactis gekloneerd kon worden onder controle van een sterke promoter. Om het fusie vector systeem te testen werden fusie-eiwitten gemaakt en geanalyseerd van LcnD met LacZ en PhoA*. De uit dit onderzoek verkregen gegevens bevestigen het eerder bepaalde model voor de membraan topologie van LcnD. Echter tussen E. coli en L. lactis bleken aanzienlijke verschillen te bestaan ten aanzien van de alkalisch fosfatase activiteiten: fusie-eiwitten met hoge activiteiten in E. coli gaven lage activiteiten in L. lactis en vice versa. Onderzoek waarin de toegankelijkheid van de fusie-eiwitten voor proteinase K werd nagegaan wees uit, dat deze verschillen in enzymatische activiteit niet het gevolg waren van verschillen in de membraan topologie van de fusie-eiwitten in E. coli en L. lactis, maar veroorzaakt wordt door een hoge enzymatische activiteit van PhoA* in het cytoplasma van L. lactis, terwijl de activiteit juist laag is indien dit enzym zich via een membraan anker aan de extracellulaire zijde van de cytoplasma membraan bevindt. In dit opzicht gedraagt PhoA* in L. lactis zich dus als LacZ in E. coli en L. lactis. Verscheidene computerprogramma’s waarmee de topologie van membraan eiwitten voorspeld kan worden, zijn gebruikt om een model voor de membraan topologie van LcnC op te stellen. Elk van de gebruikte computerprogramma’s voorspelde een ander model met betrekking tot het aantal TMS’en in LcnC, variërend van vier tot zes. Op grond van deze discrepantie werd het fusievector systeem beschreven in Hoofdstuk III gebruikt om de membraan topologie van LcnC experimenteel te bepalen (Hoofdstuk IV). De gegevens doen veronderstellen dat LcnC in die zin afwijkt van andere ABC transporters met bekende membraan topologie dat, in plaats van de gebruikelijke zes, slechts vier TMS’en in LcnC voorkomen. Hoewel de analyse van de topologie van zowel de LacZ als de PhoA* fusieeiwitten op de aanwezigheid van vier TMS’en wijst, geven de twee soorten fusie-eiwitten verschillen te zien met betrekking tot de exacte positionering van deze segmenten in het LcnC
112
Summary/Samenvatting
eiwit. Echter, in beide gevallen blijkt, dat zowel de N-terminus als de C-terminus van LcnC zich in het cytoplasma bevindt. Co-expressie van het accessoire eiwit LcnD bleek de membraan topologie van de fusie-eiwitten niet te beïnvloeden. Evenmin werden verschillen gevonden in de membraan topologie van LcnC in de twee gastheren E. coli en L. lactis. Tevens werd de precursor van LcnA tot overexpressie gebracht in L. lactis in de aan- of afwezigheid van de N-terminale 164 aminozuren van LcnC. Monsters van deze cellen werden onderworpen aan tricine-SDS-PAGE en door vervolgens de gewassen gelen te bedekken met een topagarlaag met (LcnA) sensitieve L. lactis IL1403 cellen kon worden aangetoond dat het N-terminale (cytoplasmatische) gedeelte van LcnC, in vivo, de precursor van LcnA kan processen tot de mature vorm. Hoofdstuk V beschrijft de analyse van LcnA mutanten en de cellulaire lokalisatie van epitoop bevattende vormen van (pre)LcnA. Alle mutaties op verschillende posities in de leader of het mature gedeelte van het bacteriocine bleken een drastisch effect te hebben op de (extracellulaire) antibacteriële activiteit. De epitoop bevattende afgeleiden van LcnA konden worden gedetecteerd in Western hybridisaties. Cel fractionering toonde aan dat preLcnA zich voornamelijk in de cytoplasma membraan bevond, zowel in de aanwezigheid, als de afwezigheid van het secretie apparaat. Het prebacteriocine heeft dus de intrinsieke eigenschap om in de cytoplasma membraan te insereren. Bovendien doen de resultaten veronderstellen dat de informatie voor de targeting van preLcnA naar de cytoplasma membraan gelegen is in de mogelijke "-helix in het C-terminale deel van (pre)LcnA en, althans in aanwezigheid van het secretie apparaat, in de leader. Verder impliceren de resultaten dat deze beide domeinen in preLcnA van belang zijn voor (efficiënte) secretie. In Hoofdstuk VI wordt beschreven hoe, op basis van het topologie model van LcnD, een eiwit of epitoop als fusie-eiwit met LcnD aan de extracellulaire zijde van de cytoplasma membraan in L. lactis gepresenteerd kan worden. N-terminale delen van het pp65 eiwit van het humane cytomegalovirus (HCMV) werden gefuseerd met de 80 N-terminale aminozuren van LcnD. Door gebruik te maken van monoklonale antilichamen tegen het N-terminale deel van pp65 kon in proteinase K toegankelijkheids studies worden aangetoond dat het virale epitoop in L. lactis tot expressie gebracht kan worden aan de extracellulaire zijde van de cytoplasma membraan. Dit resultaat opent mogelijke perspectieven voor de ontwikkeling van L. lactis tot een (oraal) vaccin tegen CMV virus.
113
