Chapter
Summary & Samenvatting
Marjon Roos
137
Chapter 8
Summary The kidneys regulate extracellular fluid volume and osmolarity, they maintain ion balance, regulate pH, excrete wastes and foreign substances, and participate in endocrine pathways. The excretion of fluid, salt and waste products starts in a glomerulus. Arterial blood arrives at this first structure of a nephron, the functional unit of the kidney, and passes from the afferent arteriole into the capillary loops inside the glomerulus where plasma without proteins filters out into the tubule. Blood leaves the glomerulus via the efferent arteriole. The resistances of these two periglomerular vessels mainly determine the glomerular filtration rate. Various illnessess, among which diabetes mellitus, can cause patholigical changes in the kidneys. The focus of the first part of this thesis is type 1 diabetes mellitus. It is due primarily to auto-immune-mediated destruction of pancreatic β-cells, resulting in absolute insulin deficiency. In the Netherlands 66,000 people are affected by this disease. 20-40% of these patients will develop diabetic nephropathy. Why some patients are nephropathy prone and others are not is at present unknown. It is already well known that the development of nephropathy is preceded by glomerular hyperfiltration. The question remains which processes are responsible for the hyperfiltration. A decrease in preglomerular resistance is seen as the main cause. This results in a heightened glomerular pressure. It may be caused by a decreased sensitivity for vasoactive substances which induce constriction and/or an increased sensitivity to vasodilatory substances. It is important to mention that although 20-40% of the diabetic patients will develop nephropathy, 60-80% will not. To be able to study mechanisms that are involved in the processes possibly responsible for diabetic glomerular hyperfiltration, we needed a combined rat model of type 1 diabetes mellitus and a model to study the small renal microvessels. Type 1 diabetes mellitus was induced by injection of streptozotocin. This compound is directed to the β-cell of the pancreas and causes destruction of DNA and apoptosis. Subsequently, the β-cell can not produce insulin anymore and this will result in hyperglycemia. To directly visualize that part of the renal microvasculature important for regulation of glomerular and capillary pressure, i.e. distal interlobular arteries, afferent and efferent arterioles, the isolated perfused hydronephrotic kidney model was used. Hydronephrosis was induced by ligating the left ureter 6-8 weeks before the experiments. This resulted in a complete atrophy of the tubular elements, while leaving the glomerular microvessels intact. Two weeks later the diabetes was induced by injecting streptozotocin.
138
Summary & Samenvatting
Three stimuli to induce renal microvascular constriction were used throughout this thesis i.e the reaction to a change in arterial pressure (myogenic response), angiotensin II and direct membrane depolarization. All three stimuli have an important physiological function in the kidney. An unique property of the hydronephrotic kidney is the possibility to study myogenic reactivity. It is an important mechanism to protect the glomerulus against a relay of too high systemic blood pressure. The receptor mediated stimulus angiotensin II is an important regulator of pre- as well as postglomerular hemodynamics. Pressure as well as angiotensin II are mediating vasoconstriction via membrane depolarization. Important for the constriction of vascular smooth muscle is a rise in intracellular calcium concentration. This can be caused by opening of voltagegated calcium channels in the outer cell membrane as is done by all three stimuli. Angiotensin II is also capable of calcium mobilization from intracellular stores. Moreover, angiotensin II can stimulate synthesis and release of various prostanoids. These products of the cyclo-oxygenase (COX) pathway also play an important role in renal and glomerular hemodynamics. The COX-1 isoform is expressed constitutively in most tissues while in the kidney this is also the case for COX-2. In chapter 2, the myogenic response was used to induce vasoconstriction of the preglomerular arterioles; of note, postglomerular arterioles are not myogenically active. In our study we found an impairment of the renal microvascular myogenic response in diabetic rats. However, this depended on the rat substrain used. In this rat substrain, in which breeders had been selected for large litters, we also found an increased sensitivity to the vasodilator prostanoid PGE2, indicating that a difference in PGE2-signaling might be one of the possible factors determining whether a diabetic patient will develop nephropathy or not. Involvement of angiotensin II in the origination of diabetic nephropathy is indicated by an increased risk for its development in carriers of the C1166 allele of the angiotensin II type 1 receptor, and by the clinical use of angiotensin converting enzyme inhibitors which leads to a delay in the loss of kidney function in patients with diabetic nephropathy. Involvement of COX-2 in diabetic nephropathy is indicated by studies in rats. Therefore, in chapter 3 we investigated a possible effect of selective COX-2 inhibition on angiotensin II induced vasoconstriction in renal pre- and postglomerular arterioles of diabetic rats, partially supplemented with insulin, and of controls. Interestingly, we noted that COX-2 inhibition unmasked a decreased microvascular responsiveness to angiotensin II in the diabetic animals only, which was not directly apparent because it was compensated for by an increased COX-2 derived production of the
139
Chapter 8
vasoconstrictive prostanoid thromboxane A2. This warrants caution regarding the prescription of such drugs in diabetic patients, even when kidney function is still normal, to avoid disturbing this new balance. In chapter 4 we studied the effects of aselective inhibition of COX on angiotensin II induced vasoconstriction. In diabetic rats, partially supplemented with insulin, we found a decreased arteriolar responsiveness to angiotensin II which could be fully restored by the aselective inhibition of COX. This indicated an involvement of a vasodilatory COX-product. Therefore, we subsequently established the effect of the prostanoid PGE2 on the preglomerular microvessels. The sensitivity to PGE2 was not changed in diabetic renal microvessels as compared to control. Finally, we established whether the ability to constrict was impaired in diabetic rats by inducing membrane depolarization by increasing the potassium chloride concentration in the perfusion medium. The vasoconstriction to potassium chloride was not impaired, indicating that the basal ability to constrict was not impeded in the diabetic renal microvessels. Part II of this thesis deals with obesity. The prevalence of obese people in The Netherlands is increasing and has been reported to be 1,6 million, which is 10% of the population. It occurs when the number of calories consumed exceeds the number that is metabolized, the remainder being stored as adipose tissue. Obesity is associated with renal changes, among others, by an increase in glomerular filtration rate, increased renal plasma flow and an increased urinary albumin excretion. As prediabetic obesity model the genetically obese Zucker rat was used in chapter 5. This animal displays many of the health problems seen in human obesity such as hyperlipidemia, hypercholesterolemia and hyperinsulinemia. This rat has a mutation in the hypothalamic leptin receptor causing leptin resistance. Lean control rats are genetically identical except for this mutation. We investigated in obese and lean Zucker rats whether the increased glomerular filtration rate and proteinuria as found in humans might be related to alterations in the diameter of pre- and postglomerular microvessels and in their reactivity to the resistance regulator angiotensin II, using the hydronephrotic kidney model. Our data indicate for the first time that in obese rats, a vasodilated state in small preglomerular microvessels and a vasoconstricted state in the postglomerular arteriole exists. Although angiotensin II cancelled the former, the latter remained. Therefore, these data reveal periglomerular vascular changes that in obesity may play a role in the possibly increased glomerular capillary pressure, which likely contributes to the increased glomerular filtration rate and proteinuria. Finally in part III a potentially important determinant for renal microvascular constriction is investigated. It is clear from the above that the
140
Summary & Samenvatting
vascular tone of the smallest renal microvessels is important in regulating renal hemodynamics. Vasoconstriction is an important determinant of vascular tone. Contraction of vascular smooth muscle is determined not only by levels of intracellular free calcium, but also by the sensitivity of its contractile apparatus. A potential modulator of the latter is rho kinase. In chapter 6 we addressed the question of a possible central role for rho kinase in the regulation of periglomerular microvascular tone. Preglomerular vasoconstriction induced by direct membrane depolarization, increases in pressure or angiotensin II all depended for their effect on rho kinase. A differing role for rho kinase in efferent arteriolar constriction to angiotensin II as compared to preglomerular microvessels was not found. This indicates that in the kidney rho kinase is involved in a variety of signaling pathways leading to microvascular constriction. It plays a pivotal role not only in preglomerular but also in postglomerular tone. Chapter 7 presents a general discussion of the aforementioned findings as well as some new supplemental data and will give some suggestions for future experiments. Our studies in diabetic rats suggest that the COX-pathway is important in the diabetic dysregulation of renal hemodynamics and may suggest that the balance within this pathway is important whether a diabetic individual will develop nephropathy or not. Furthermore, the hyperfiltration as found in obese patients might depend among others on a vasoconstricted state of the postglomerular arteriole, which is paralleled by a vasodilated basal state of preglomerular microvessels. Moreover, our studies have shown that rho-kinase plays a pivotal role in renal microvascular constriction not only of preglomerular microvessels, but also of the postglomerular efferent arteriole.
141
Chapter 8
Samenvatting De meeste mensen hebben 2 nieren die als belangrijke taken hebben ten eerste ervoor te zorgen dat afvalstoffen worden afgevoerd, ten tweede het reguleren van de vochtbalans en ten derde maken ze een aantal hormonen aan. Het proces van uitstoten van vloeistof, zout en afvalstoffen start in de glomerulus. Bloed met afvalstoffen komt via de nierslagader in de nier en komt uiteindelijk bij een afferente (aanvoerende) arteriool (heel klein bloedvat) in de glomerulus waar de filtering plaats vindt. Bloed verlaat de glomerulus via de efferente (afvoerende) arteriool. De afvalstoffen worden via het tubulussysteem afgevoerd naar de urineleider. De weerstand van de afferente en efferente arteriool bepalen mede hoe snel er gefiltreerd (glomerulaire filtratie snelheid) wordt. Het eerste deel van dit proefschrift gaat over type 1 diabetes mellitus oftewel suikerziekte. Deze ziekte wordt - indien onbehandeld - gekenmerkt door een veel te hoge bloed glucose concentratie wat wordt veroorzaakt door een auto-immuun gemedieerde destructie van de β-cellen van de pancreas waardoor er geen insuline meer geproduceerd wordt. Insuline verzorgt onder andere de glucose opname uit het bloed in veel cellen. In Nederland hebben 66.000 patiënten deze ziekte. Twintig tot 40% van deze patiënten ontwikkelen nierfalen (nefropathie) ten gevolge van de diabetes. Waarom sommige mensen nefropathie ontwikkelen en anderen niet is op dit moment onduidelijk. Wat al wel bekend is, is dat de ontwikkeling van nefropathie vooraf gegaan wordt door een verhoogde filtratie in de nier, hyperfiltratie. Een afgenomen weerstand van de preglomerulaire (voor de glomerulus) vaten wordt hiervan als een van de mogelijke oorzaken gezien, omdat het leidt tot een verhoogde glomerulaire druk. Een afgenomen gevoeligheid op stimuli die vasoconstrictie (kleiner worden van bloedvaten) induceren of een toegenomen gevoeligheid op stimuli die dilatatie (groter worden van bloedvaten) veroorzaken kunnen een afgenomen preglomerulaire weerstand veroorzaken. Het is nog belangrijk om te vermelden dat alhoewel 20 tot 40% van de diabetes patienten nefropathie ontwikkelt, 60 tot 80% dit dus niet krijgt. Om de vasculaire mechanismen die ten grond slag liggen aan de hyperfiltratie te kunnen bestuderen, hebben we in ratten een type 1 diabetes mellitus model en een model om de kleine vaten in de nier te kunnen bestuderen gecombineerd. Type 1 diabetes mellitus werd geïnduceerd door de injectie van streptozotocine. Deze stof wordt naar de β-cel van de pancreas getransporteerd en zorgt er daar voor dat de insuline producerende cellen dood gaan (apoptose). Doordat er geen insuline meer is, stijgen de bloed glucose waarden en
142
Summary & Samenvatting
ontwikkelen de ratten diabetes. De nier is een solide orgaan waardoor de kleine vaten niet zomaar met behulp van een microscoop bestudeerd kunnen worden. Om dit wel mogelijk te maken wordt het hydronefrose model gebruikt. Door 6-8 weken voor de dag van het experiment de ureter (afvoerbuis die loopt van nier naar blaas) af te binden, atrofiëren de tubulaire elementen en worden de kleine bloedvaten in de schors van de nier bloot gelegd zodat ze bestudeerd kunnen worden. De microscopisch kleine bloedvaten die verantwoordelijk zijn voor het reguleren van de druk in de haarvaten (capillairen) van een glomerulus zijn de meest distaal gelegen interlobulair arterie, de afferente en efferente arteriool. Twee weken nadat de ureter was afgebonden werd de diabetes geïnduceerd. In dit proefschrift worden 3 stimuli die in kleine vaten in de nier vasoconstrictie kunnen induceren gebruikt, te weten de reactie op druk, angiotensine II en membraan depolarisatie. Deze 3 stimuli vervullen belangrijke fysiologische functies in de nier. Een unieke eigenschap van de hydronefrotische nier is dat de reactie op druk bestudeerd kan worden, ook wel myogene reactiviteit genoemd. Dit is de acute reactie van een bloedvat op een verhoging in transmurale druk (drukverschil tussen binnen en buiten het vat). Het is een belangrijk mechanisme om de glomerulus te beschermen tegen veranderingen in systemische bloeddruk. Als de druk in de lichaamsslagaders omhoog gaat, worden de arteriolen voor de glomerulus kleiner zodat de druk in de glomerulus hetzelfde blijft en er geen schade aan het fijne filter kan optreden. Alleen de bloedvaten stroomopwaarts van de glomerulus reageren op druk. Angiotensine II bindt aan een receptor (bindingsplaats) aanwezig op onder andere de kleine bloedvaten in de nier. Dit hormoon is belangrijk in de regulatie van de kleine bloedvaten in de nier zowel voor als na de glomerulus. Zowel druk als angiotensine II mediëren vasoconstrictie via membraandepolarisatie van de gladde spiercellen in de vaatwand. Hiervoor is het ion calcium belangrijk. Een verhoging van de calcium concentratie door het open gaan van kleine kanaaltjes in de membraan van een gladde spiercel zal leiden tot constrictie. Veel vasoactieve stimuli werken op deze manier. Daarnaast zorgt angiotensine II ervoor dat het calcium uit de intracellulaire voorraden gemobiliseerd wordt. Bovendien kan angiotensine II ook de synthese (aanmaak) en het vrijlaten van verschillende prostanoïden stimuleren. Dit zijn produkten van de cyclooxygenase signaaltransductie route die ook een belangrijke rol in renale en glomerulaire hemodynamica spelen. De cyclo-oxygenase (COX)-1 en -2 isovormen worden beide in de nier tot expressie gebracht. In hoofdstuk 2 wordt de reactie op druk gebruikt om constrictie van de kleine preglomerulaire arteriolen te induceren. In deze studie vonden we in diabetische ratten een verstoring van de renale microvasculaire responsen op
143
Chapter 8
druk. Dit was echter afhankelijk van welke rattensubsoort er werd gebruikt. Het bleek dat de ratten met de verstoorde respons op druk ook gevoeliger waren voor de dilatoire effecten van PGE2. Dit geeft aan dat er waarschijnlijk een verschil in de cyclo-oxygenase balans bestaat tussen deze twee subsoorten welke de gevoeligheid voor het ontstaan van diabetische nefropathie kan bepalen. De betrokkenheid van angiotensine II in het ontstaan van diabetische nefropathie wordt weergegeven door een verhoogd risico op de ontwikkeling van diabetische nefropathie voor dragers van het C1166 allel van de angiotensine II type 1 receptor. Tevens blijkt dit uit het gebruik van angiotensine converting enzyme (ACE) inhibitors in patiënten met diabetische nefropathie waar het verlies van nierfunctie vertraagd wordt. Betrokkenheid van COX-2 in de ontwikkeling van diabetische nefropathie blijkt uit studies in ratten. In hoofdstuk 3 hebben we de mogelijke effecten van de inhibitie van COX-2 op angiotensine II geïnduceerde vasoconstrictie in renale pre- en postglomerulaire bloedvaten onderzocht. Onze resultaten lieten zien dat in nieren van diabetische ratten die gedeeltelijk gesupplementeerd werden met insuline, selectieve COX-2 inhibitie een afgenomen respons op angiotensine II veroorzaakt, maar niet in die van controle dieren. In diabetische nieren werd er een toegenomen productie van het prostanoïde thromboxane A2 waargenomen, wat een afgenomen reactie op angiotensine II normaliseerde. Deze resultaten wijzen erop dat men voorzichtig moet zijn met het voorschrijven van COX-2 inhibitors aan diabetische patiënten, zelfs als de nierfunctie nog normaal is, om deze nieuwe balans niet te verstoren. In hoofdstuk 4, hebben we de effecten van een aselectieve inhibitie van cyclo-oxygenase (gelijktijdige remming van COX-1 en –2) bestudeerd op de angiotensine II geinduceerde constrictie. In diabetische ratten, die gedeeltelijk gesupplementeerd werden met insuline, hebben we een afgenomen reactiviteit op angiotensine II waargenomen, welke geheel hersteld werd door de inhibitie van COX. Dit wijst op de betrokkenheid van een vasodilatoir COX produkt in de verstoorde reactiviteit. Vervolgens hebben we de gevoeligheid op het prostanoide PGE2 bepaald. De gevoeligheid op PGE2 was niet verstoord in controle en diabetische nieren. Uiteindelijk hebben we nog onderzocht of de mogelijkheid als zodanig om in constrictie te gaan in diabetische nieren verminderd was; dit deden we met behulp van membraan depolarisatie middels het verhogen van de kaliumchloride concentratie in het perfusiemedium. Hieruit bleek dat de mogelijkheid om in constrictie te gaan niet verschilde in diabetische ten opzichte van controle nieren. Het tweede deel van dit proefschrift gaat over overgewicht (obesitas). De hoeveelheid mensen die overgewicht hebben neemt in Nederland nog steeds
144
Summary & Samenvatting
toe. Op dit moment zijn 1.6 millioen mensen te dik, dit is 10% van de totale bevolking. Obesitas komt voor wanneer de hoeveelheid calorieën die men tot zich neemt het aantal calorien dat gemetaboliseerd wordt overschrijd. De overtallige calorieën worden dan als vetweefsel opgeslagen. Obesitas wordt geassocieerd met veranderingen in de nier zoals een toegenomen filtreer snelheid, stroom en een verhoogde hoeveelheid eiwitten in de urine (proteinurie). De Zucker rat is een dier dat een mutatie in de leptine receptor in de hypothalamus heeft, en daardoor obesitas ontwikkelt. Deze rat heeft een groot aantal kenmerken die ook bij obesitas in de mens worden gezien zoals hyperlipidemie, hypercholesterolemie en hyperinsulinemie. Slanke ratten zijn genetisch identiek, behalve dan voor deze mutatie. Wij hebben deze ratten-stam gebruikt in hoofdstuk 5 om te bestuderen of de toegenomen filtreer snelheid en proteinurie bij obesitas gerelateerd waren aan veranderingen in de diameter van de kleine bloedvaten voor en na de glomerulus in de nier. Tevens hebben we onderzocht of deze veranderingen gerelateerd waren aan de reactie op angiotensine II. Onze studie heeft voor de eerste keer laten zien, dat in obese ratten de vaten voor de glomerulus in een gevasodilateerde status waren terwijl de efferente arteriool na de glomerulus juist vernauwd is. Allhoewel angiotensine II de gevasodilateerde status van de preglomerulaire vaten ophief, gold dit niet voor de postglomerulaire efferente arteriool. Deze studie heeft inzicht gegeven in de periglomerulaire vaatveranderingen die een rol kunnen spelen in obesitas en die de oorzaak kunnen zijn van de verhoogde glomerulaire druk zoals in obese patiënten ook gevonden is. Een verhoogde glomerulaire druk kan bijdragen aan de verhoogde filtreer snelheid en proteinurie. In het laatste deel van dit proefschrift wordt een mogelijk belangrijke determinant van renale microvasculaire constrictie onderzocht. Uit het bovenstaande is wel duidelijk geworden dat vasoconstrictie van de periglomerulaire vaten belangrijk is in het bepalen van de vasculaire tonus (basis diameter van deze bloedvaten). Vasoconstrictie van gladde spiercellen wordt niet alleen bepaald door intracellulaire calciumniveaus, maar ook door de gevoeligheid van het contractiele apparaat. Een mogelijke modulator van dat laatste is het enzym rho kinase. In hoofdstuk 6 hebben we dan ook de mogelijke centrale rol voor rho kinase in de regulatie van pre- dan wel postglomerulaire vaten onderzocht. Uit onze studie bleek dat preglomerulaire vasoconstrictie zoals geïnduceerd door membraan depolarisatie, druk-verandering of angiotensine II allemaal mede afhankelijk waren van rho kinase. Ook in postglomerulaire vaten was de constrictie op angiotensine II mede afhankelijk van rho kinase. In de nier is rho kinase dus betrokken bij verschillende signaal routes die allemaal leiden tot vasoconstrictie.
145
Chapter 8
Tot slot wordt in hoofdstuk 7 een algemene discussie gepresenteerd waarin de bevindingen van de hierboven genoemde studies in onderling verband besproken worden, waarin enkele nieuwe data zijn weergegeven en waarin voorstellen worden gedaan voor toekomstige experimenten.
146
