CB1 cannabinoid receptorok megoszlásának vizsgálata a gerincvelő felületes hátsó szarvában
Készítette: Pálóczi János
Debrecen 2013
Tartalom 1. ÁTTEKINTÉS ....................................................................................................................... 3 1.1. A CB1 RECEPTOR TULAJDONSÁGAI .................................................................................. 4 1.2. A CB1 RECEPTOR LOKALIZÁCIÓJA A KÖZPONTI IDEGRENDSZERBEN ................................. 6 2. ANYAG ÉS MÓDSZER ........................................................................................................ 8 2.1. ÁLLATOK .......................................................................................................................... 8 2.2. RHIZOTOMIA ..................................................................................................................... 8 2.3. FIXÁLÁS, METSZÉS ............................................................................................................ 8 2.4. IMMUNHISZTOKÉMIA ........................................................................................................ 9 2.4.1. DAB kromogén reakció (fénymikroszkópos vizsgálatokra) .................................................. 9 2.4.2. Immunfluoreszcens jelölés (konfokális mikroszkópos vizsgálatokhoz) ................................10 2.4.3. Nanogold jelölés (elektronmikroszkópos vizsgálatokra) .....................................................11
2.5. ELEKTRONMIKROSZKÓPIA .............................................................................................. 11 2.6. KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA .......................................................................................... 12 2.7. KVANTITATÍV ANALÍZIS .................................................................................................. 13 3. EREDMÉNYEK .................................................................................................................. 14 3.1. A CB1 RECEPTOR MEGOSZLÁSA PATKÁNY GERINCVELŐ FELÜLETES HÁTSÓ SZARVÁBAN DAB KROMOGÉN REAKCIÓT KÖVETŐEN ................................................................................ 14 3.2 A CB1 RECEPTOR ÉS AZ AXONÁLIS MARKEREK KOLOKALIZÁCIÓJA ................................. 15 3.3. A CB1 RECEPTOR SUBCELLULÁRIS LOKALIZÁCIÓJA ....................................................... 21 4. DISZKUSSZIÓ .................................................................................................................... 23
5. FÜGGELÉK ..........................................................HIBA! A KÖNYVJELZŐ NEM LÉTEZIK. 5.1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ................................................................................................. 25 5.2. FELHASZNÁLT OLDATOK RECEPTÚRÁI ................... HIBA! A KÖNYVJELZŐ NEM LÉTEZIK.
6. IRODALOMJEGYZÉK ....................................................................................................... 26
2
CB1 cannabinoid receptorok megoszlásának vizsgálata a gerincvelőfelületes hátsó szarvában
1. Áttekintés A vadkendert (Cannabis sativa), mint ismert kultúrnövénytaz antik Európábanigen széleskörűen használták fel, úgymint kötelek, erős vásznak, ruhadarabok készítéséhez alapanyagként. ACommentary of theBritish Pharmacopedia egyik 1848-ban kiadott áttekintésében az indiai kenderről, mint a keleti orvoslásban széleskörűen használt analgetikushatású, pszichotróp „gyógyszerről” ír. Ezt követően a kenderkivonatok kiterjedt vizsgálata indult meg Európában. Időközben a kender pszichoaktív komponensét sikerült azonosítani, amely egy terpenoid-származék: Δ9-tetrahidro-kannabiol (THC). (1. ábra)
1. ábra:AΔ9-tetrahidro-kannabinol szerkezete. A THC pszichoaktív tulajdonságait igen hamar felismerték ugyan, de egyedi kémiai struktúrájából adódóan a hatásmechanizmusa nehezen követhető nyomon. Ezt a kérdést az 1950-es évek radioligand-jelöléses vizsgálatai tisztázták [21], amelyek acannabinoid-érzékeny kötőhelyek azonosításátlehetővé tették, eleinte csak a központi idegrendszerben (cannabinoid receptor1-CB1-R), későbbaz immunrendszer sejtes elemein [24], endothel sejteken, sőt a tüdőben, a herében és a placentában is [7,10] (CB2 receptor).
3
A CB1 recetor endogén agonistáinak keresése már az 1960-as évek elején megkezdődött,viszont az intenzív hatásmechanizmus-, és receptor-vizsgálatok ellenére csak a ’90-es évek elejére sikerült azonosítani az első endogén ligandot, az anandamidot [2,3]. A CB1 receptor endogén agonistáit az endorfinok analógiájára endocannabinoidoknak nevezték el. A CB1 receptor (CB1-R) elsőként izolált endogén ligandja az anandamid (arachidonoil-etanolamin)[2,3,7,10].Szerkezetét tekintve az eikozanoidok családjába tartozik (2. ábra bal oldala). Ez a vegyületcsalád mediátoraként ismert a gyulladásos folyamatokban, ill. szerepük van a nociceptív folyamatokban a neuronok közti kommunikációban [7].
2. ábra: Az ábra bal oldalán az anandamid, jobb oldalán a 2-arachidonilglicerol szerkezete látható. Egy másik, jelentős endogén cannabinoid agonista a 2-arachidonilglicerol (2-AG). Jelenlétét 1995-ban mutatták ki [4,7,8,10].Szerkezetét tekintve egy monoacil-glicerol (2. ábra jobb oldala), amely bonyolult metabolizmus révén igen nagy mennyiségben termelődik a központi idegrendszerben (200-szorosa az anandamid koncentrációnak). Ismeretes további három endocannabinoid: virodhamin, noladin-éter és Narachidonoil-dopamin(NADA).Jelentőségük még nem igazán nyert bizonyítást [7], mert az idegszövetben fiziológiás körülmények között igen kis mennyiségben vannak jelen és általában eléggé bomlékony vegyületek. Így nehezen vizsgálhatók, szerepük a retrográd jelátvitelben kérdéses.
1.1. A CB1 receptor tulajdonságai
A CB1 receptor egy 7 transzmembrán-doménnel rendelkező, a sejtmembránba integrálódott fehérje (4. ábra) [1,7,10]. Immunhisztokémiai vizsgálataink szempontjából
4
fontos megjegyezni, hogy a receptor N-terminálisa extracelluláris, C-terminálisa pedig intracelluláris helyzetű. A receptor szignáltranszdukcióját illetően Gi-fehérje kapcsolt, tehát intracellulárisan gátolja az adenilát-cikláz enzimet, így a sejtben csökken a cAMP szint, csökken a PKA aktivitása, ill. mindezeken keresztül mérséklődnek a foszforilációs folyamatok a sejtben. Ezáltal a CB1 mediált jelátvitel általános anyagcsere-depressziót indít el a sejtben. Ezen túlmenően az endocannabinoidok kötődése a CB1 receptorhoz az N-, illetőleg P/Q-típusú feszültségfüggő Ca2+-csatornák záródását idézi elő, ami jelentősen csökkenti a szóban forgó idegsejt EPSP-jét, így gátolja a neurotranszmitterek felszabadulását [16].
4. ábra: A CB1 receptor szerkezete. A közlemények többsége arról számol be, hogy a CB1 receptor preszinaptikus elhelyezkedésű [1,2,11,12,13]. Ez a helyzet egyedivé teszi az endocannabinoidok jelátvitelét és felveti a retrográd transzmisszió lehetőségét [11,12,13,16,18,19]. Hippocampus-beli piramissejteken tapasztalták először,hogy a depolarizált piramissejtek preszinaptikus, gátló GABAerg
interneuronjainak
neurotranszmitterfelszabadulása
tranziensen
csökkena
posztszinaptikus sejt depolarizációja után [16].A jelenség a depolarization-induced suppressionof inhibition(DSI)[7,10,11,12,13]. Hátterében a posztszinaptikus sejtben a membránpotenciál változás hatására bekövetkező endocannabinoidtermelése játszik szerepet. A szintézisben számottevő szerep jut a Ca2+-ionoknak (5. ábra): a membrán-depolarizáció hatására ugrásszerűen megnő a posztszinaptikus sejtben a kalcium koncentráció, ami az endocannabinoidok szintézisében részt vevő enzimrendszer aktiválódását indítja el.
5
5. ábra.Endocannabinoidok által mediált neurotranszmitter felszabadulás-gátlás. Erős depolarizáció hatására endocannabinoidok gyors és azonnali szintézise történik a posztszinaptikus sejtben, amely anyagok kidiffundálva a szinaptikus résbe retrográd módon kötődve preszinaptikus helyzetű receptorukon olyan intracelluláris szignáltranszdukciót indítanak el, ami gátolja a további neurotranszmitterek felszabadulását. (Kano M. et al, 2005)
Hasonló hatás mutatható ki serkentő neuronokon. A megfigyelt jelenség a DSE (deporizationinduced supression of excitation). A posztszinaptikus sejtben megnövekvő intracelluláris Ca2+ koncentráció hatására felszabadult endocannabinoid mediátor hatékonyan gátolja a serkentő neurotranszmitter felszabadulását, így az EPSP mértékét a posztszinaptikus membránon [10,13].
1.2. A CB1 receptor lokalizációja a központi idegrendszerben A CB1 receptor széleskörűenexpresszálódik a központi idegrendszerben (6. ábra).
6. ábra. A CB1 előfordulása patkány agyában. Tríciummal jelzett CB1-R autoradiográfiás képe patkány agyának sagittalis metszetén. A szürkeskála reprezentatív a CB1-R különböző agyi területeken való relatív előfordulására nézve.(Herkenham M. et al,1990.)
6
A CB1 receptor nagymértékben expresszálódik a nagyagykéregben, a substantia nigra területén, a hippocampusban,a globus pallidus területén,illetőleg jelentős mértékben jelenik meg továbbá a kisagyban is. Ezeken kívül az agytörzs kivételével szinte mindenhol megjelenik a CB1 receptor az agyban, még ha eltérő mértékben is[16,18,20,21,22]. Igen jelentős a CB1 gerincvelői, ill. hátsó gyöki ganglionáris előfordulása.Összességében a hátsó gyöki ganglionsejtek közel fele CB1-receptort expresszál, ebből mindössze 1/4-ük nem nociceptív neuron [10,12,14]. A nociceptív primer afferens neuronokat két nagyobb szubpopulációra lehet bontani: ennek alapja, hogy milyen növekedési faktorra érzékenyek. Ilyenformán megkülönböztetünk neuronális növekedési faktorra (NGF), ill. gliális neutrofikus faktorra (GDNF) érzékeny nociceptív neuronokat. Előbbi neuron populációkülönböző neuropeptideket expresszál, mint például CGRP-t (calcitonin gene-related peptide), Substance-P-t,
szomatosztatint,
utóbbi
pedig
a
nem
peptiderg
axonterminálisaok
szubpopulációjaként a Bandeirea simplicifoliából izolált IB4-et (isolectin B4) köt. Korábbi tanulmányok alapján a II belső laminában GABAerg interneuronok szubpopulációjakifejezett CB1 immunreaktivitást mutat, amely nitrogén-monoxid szintáz (NOS) jelöléssel kolokalizál.Egyes szerzők megfigyelték a CB1 X-es lamina-beli feltűnését is [14] (a gerincvelő canalis centralis környéki régiója). A legélénkebb immunhisztokémiai jelölés viszont a gerincvelő dorsolaterális funiculus területéntapasztalható [14]. Több szerző beszámolt arról, hogy patkányokon végzett dorzális rhizotomia, ill. hemisectio után végzett a gerincvelő hátsó szarvi CB1 jelölése alig vesztett intenzitásából[12]. Így arra a következtetésre jutottak, hogy a hátsó gyöki ganglionok centrális nyúlványai csakkis mértékben expresszálják a receptor típust [12] (azt inkább a gerincvelő felületes hátsó szarvában található interneuronok termelik). Mások viszont ennek az ellenkezőjéről is beszámoltak,
tehát
a
primer
afferensek
CB1
expressziója
kifejezett,
a
dorzálisrhizotomiaszámukat szignifikánsan csökkenti[15, 21]. Vizsgálataim központjában az endocannabinoid CB1 receptor lokalizációja állt patkány gerincvelőjének hátsó szarvában. Munkám során célul tűztem ki a CB1 receptorok megoszlásának vizsgálatát fény- és elektronmikroszkópos szinten egyaránt a gerincvelő felületes hátsó szarvában Tekintettel arra, hogy a primer afferensek centrális nyúlványainak szerepe a gerincvelő I-II. lamináinak CB1 expressziójában ellentmondásos, vizsgálataink egyik fő elemeként vizsgálni kívántuk a primer afferensek axonterminálisainak CB1 receptor expresszióját.
7
2. Anyag és módszer 2.1. Állatok A kísérletet felnőtt, nőstény Wistar-Kyoto patkányokon végeztük, 200-320g közti mérettartományban. Az állatokat a számukra megfelelő körülmények között tartottuk, 12 órás fény/sötét ciklusban. Az általunk felhasznált CB1 receptor elleni antitest specificitásának tesztelésére a CB1 receptor elleni immunreakciót vad típusú és CB1 receptor knock out egereken [23] egyaránt elvégeztük.Míg a vad típusú egér felületes hátsó szarvában a patkányokéval mindenben megegyező immunfestődés volt megfigyelhető, addig a knock out egerek gerincvelőjéből készített metszetek semmiféle immunreakciót nem mutattak (9. ábra C és D részei)
2.2. Rhizotomia A CB1 receptor expressziójának vizsgálatára rhizotómiát is alkalmaztunk egyes állatokon. Az intraperitoneálisan adott Na-pentobarbitallal altatott állat lumbális gerincvelői szakaszán, a hátsó gyökereket metszettük el. A beavatkozás a lumbális gerincvelő L4-es szegmentumát, illetőleg ettől cranialisan és caudalisan 2-2 szegmentumnyi távolságban belépő gyökereket érintette. A rhizotómián átesett állatok gerincvelői a két hetes túlélés után lettek eltávolítva a perfúziót követően. A cél a rhizotómiával az volt, hogy ezen beavatkozást követő
immunhisztokémiai
vizsgálatokkal
kiderítsük,
vajon
számottevő
mértékben
expresszálódik-e a CB1 receptor a primer afferensek centrális nyúlványain.
2.3. Fixálás, metszés A perfundálni kívánt állatot60mg/testsúlykg intraperitonálisan adott nátriumpentobarbitallalaltattuk. A transzkardiális perfúziót először frissen oxigenizált, előzetesen jégen tartott Tyrodeoldattal, majd a fixáló oldattalvégeztük. A fiziológiás oldattal történő átmosással megakadályoztuk a kapillárisok sejtes elemekkel történő elzáródását, továbbá a lehűtött, magas oxigén tartalmú oldat késleltette a sejtek autolízisét. Konfokális mikroszkóppal végzendő kolokalizációs vizsgálatokhoz fixáló oldatként 0.1M-os foszfát pufferben(PB) oldott (pH: 7,4), 4%-os paraformaldehidet (PFA, SigmaAldrich) használtunk. Az elektronmikroszkópos vizsgálatainkhoz feldolgozott minták
8
fixálásához a fixáló oldat 0.1M-os PB-ben oldott 2.5% PFA-n kívül tartalmazott 0.5% glutáraldehidet(GA, Sigma-Aldrich), illetőlegmég 0.2%pikrinsavat(Fluka) is (a fixáló oldatok, illetőleg a pufferek receptúrája a mellékletben található). A perfúzió után közvetlenül eltávolítottuk a gerincvelő lumbális szakaszát. A 24 órás utófixálást követően az eltávolított lumbális gerincvelőt először0.1M-os PB-ben oldott 10%os majd 20%-os szacharóz-oldatba tettük, amíg le nem süllyedtek.Ennek célja a folyékony N2-ben történő feltárást megelőzőcryoprotekcio. A feltárás (freeze-thawing) után a lumbális gerincvelőt 8%-os agarba öntöttük, és vibrotómmal (Leica VT 1000 S) 50μm-es metszeteket készítettünk. A metszeteket 0.1 M-os PB-vel 3×15 percigmostuk. Ezek utána metszetek 0.01%-os H2O2 oldatba kerültek az endogén peroxidázok aktivitásának kioltása céljából. Az újbóli mosás után a glutáraldehiddel fixált
(elektronmikroszkópos
feldolgozásra
szánt)
metszetek
1%-os
NaBH(Sigma-
Aldrich)oldatba kerültek az aldehid behatás után kialakult fehérje-keresztkötések felszakítása miatt.Ezután ismét többszöri PB-s mosás következett, amit a konfokális mikroszkópos vizsgálatokra szánt, ill. a ’nanogold’ jelölést kapó metszetek esetében háromszori PBS-es, a diamino-benidinnel (DAB) jelölt metszetek esetében háromszori TPBS-es mosásváltott fel.
2.4. Immunhisztokémia
2.4.1. DAB kromogén reakció (fénymikroszkópos vizsgálatokra) Az alaposan átmosott metszeteket 50 percre TPBS-ben oldott 10%-os normál szérumban (normal goat serum-NGS) inkubáltuk. Az NGS(Vector Laboratories Inc. Burlingame, CA)csökkenti a metszetek nem specifikus kötőhelyeit. A blokkolás után mosás következett TPBS-ben oldott1%-os NGS-sel. Mindezek után került a metszetekre a CB1 receptor ellen termeltetett primer antitest megfelelően hígított oldata. Az általunk használt antitest (a Cayman cég által előállított, nyúlba termeltetett CB1 poliklonális antitest) a CB1 receptorintracellulárisC-terminálisának részletét felismerve kötődik a receptorhoz. Az anti-CB1-R 1%-os NGS-t tartalmazó TPBSben oldottuk fel 2000-szeres hígításban. A primer antitest minden esetben két éjszakán át, 4˚C-on volt a metszeteken. Ezt követően háromszori, 1%-os normál szérum oldattal történő mosás, majd a szekunder antitest következett. A DAB alapú immunhisztokémia esetében ez biotinnal konjugált goat anti-rabbit immunglobulin G-t (Sigma) jelent, amely 12 órán át volt a metszeteken, 4°C-on. A későbbiekbenhozzáadott avidinnel a primer antitest kötődésének
9
megjelenítésére alkalmasreakció játszódik le.Az avidin-biotin komplexben (ABC- Vector Laboratories Inc. Burlingame, CA) ugyanis térhálós szerkezetű keresztkötések alakulnak ki, amelyek között az avidinhez konjugált tormaperoxidáz enzim segítségével, H2O2 jelenlétében a diamino-benzidin könnyen precipitálódik, és barna csapadékként jelenik meg a metszeteken. A biotinilált szekunder után 1%-os NGS oldatban történő háromszorimosás, majd a fent említett ABC komplex applikálása következett egy éjszakán át. Ezt követően TPBS-es, majd 0.05M-os TRIS-esmosás követezett. A metszetekre ezek után került rá a diaminobenzidin (DAB) oldat, majd 20 perc eltelte után ennek előhívása következett 0.01%-os H2O2 oldat segítségével a barna csapadék megjelenéséig. A vizualizáció után háromszori TRIS-es, majd 0.1 M-os PB-s mosás következett. A tárgylemezre történő felszedés után a metszeteket felszálló etanol-soron 10-10 percig, majd xilolban 15-15 percigvíztelenítettük. A metszeteket DPX fedőanyaggal (Fluka) fedtük le.
2.4.2. Immunfluoreszcens jelölés (konfokális mikroszkópos vizsgálatokhoz) Az Immunfluoreszcens vizsgálatokra szánt metszeteket a primer antitest előtt 10%-os, illetőleg 1%-os NGS-t tartalmazó PBS oldattal kezeltük. Előbbi esetben a nem specifikus kötőhelyek számának csökkentése történt50 percen át,utóbbi esetben pedig a blokkoló oldat kimosása volt a cél. Az 1% NGS-t tartalmazó PBS oldatban történt az anti-CB1Rhígítása.Ugyanebben az oldatban történt kolokalizációs vizsgálatokban felhasználni kívánt markerekellen termeltetett primer ellenanyagok hígítása is.Az alkalmazott markerekközül a peptiderg primer afferensek centrális nyúlványainak jelölésérekalcitonin gén relációs peptid (CGRP) ellen termeltetett antitestet alkalmaztunk, míg a nem peptidergek kimutatásáraegy lektinkötési reakciót, a Bandeirea simplicifoliából izoláltisolectinB4 (IB4) kötődését használtuk fel. A gátló intrinsic neuronok axonterminálisainak jelölését a γ-amino-vajsavat (GABA) szintetizáló enzim (GAD 65/67) elleni antitesttel (anti-GAD65/67) végeztük, a serkentő
interneuronok
feltüntetésére
pedig
glutamaterg
terminálisokbankimutatható
vezikuláris glutamát transzporter (VGLUT2) ellen termeltetett antitestet alkalmaztunk.A kettős jelölés alapjául szolgáló primer antitestek 2 éjszakán át voltak a metszeteken. Ezután PBS-ben oldott 1%-os normál szérumos mosás következett háromszori ismétlésben. A szekunder antitesteket tartalmazó oldat ezek után került a metszetekre, 1000-szeres hígításban. A CB1 ellen termeltetett antitest megjelölésére goat anti-rabbit immunglobulin G (GAR-IgG) szekunder antitestet használtunk, amely Alexa-555 fluorokrómmal volt konjugálva(Sigma-Aldrich).Az IB4-jelölt metszetekre streptavidin-Alexa-647, a CGRP-ellen
10
termeltetett antitest megjelölésére goat anti-guinea pig-Alexa-488, a VGLUT2-jelölt metszetekre goat anti-guinea pig-Alexa-488, a GAD 65/67 jelölt metszetekre pedig goat antimouse-Alexa-488 jelzésű fluorokrómot tartalmazó szekunder antitest került (Sigma-Aldrich), amely 5 órán át volt a metszeteken.A fluoreszcens csoportot hordozó szekunder antitesttel kezelt metszetekre az immunreakciót követően előbb 1%-os NGS oldat, majd PBS, és végül 0.1 M-os PB oldat került háromszori cserével. Mindezek után a metszeteket speciális fedőanyaggal(Vectashield-Vector Laboratories Inc. Burlingame, CA)fedtük le.
2.4.3. Nanogold jelölés (elektronmikroszkópos vizsgálatokra) Nanogold jelölés esetében a primer antitest alkalmazása előtt 0.1 M-os PBS-t, illetőleg speciális blokkoló,majd inkubáló oldatot használtunk.Mindezek után a metszetekre anti-CB1R került inkubáló oldatban hígítva2 éjszakán át.A feleslegben levő, nem kötődött primer antitest eltávolítása inkubáló oldat segítségével történt háromszori 30 perc mosással. A szekunder antitestgoat anti-rabbit IgG kolloidális(~1nm-es)méretű aranyszemcsével volt konjugálva. A szekunder antitesteket tartalmazó oldat nanogoldos eljárás során egy éjszakán át voltak a metszeteken, 4°C-on. Ezután mosás következett: háromszori inkubáló oldat, majd háromszori PBS alkalmazása után még utófixálás következett 1%-os glutáraldehid oldat segítségével, amelyet újabb PBS-es, majd desztillált vizes mosás követett. Ezek után az ún. ezüst-intenzifikálás következett, amely során a szekunderhez kötött arany részecske felületére ezüst redukálódik(Aurion R-GENT, EMS Washington, PA). Végeredményben a szemcse mérete az aranyfelületre kivált ezüst miatt nagyobb lesz, így elektronmikroszkóppal vizsgálható a CB1 pontos szubcelluláris lokalizációja. Az intenzifikálást a metszeteken, az ezüstre jellemző sárgás-barna színmegjelenéséig végeztük, ami után a rajtuk lévő oldatot desztillált vízre, majd pedig 0.1 M-os PB-recseréltük.A metszeteket végülfelszálló etanol-sorban, majd propilénoxidbanvíztelenítettük.
2.5. Elektronmikroszkópia A kolloid méretű aranyszemcsével, illetőleg az intenzifikálás során erre a szemcsére rárakódó ezüstteljelölt metszetekettranszmissziós elektronmikroszkóppalvizsgáltuk a CB1 szubcelluláris lokalizációjának vizsgálatára. A metszeteket 0.1 M-os PB-ben oldott, 0.5%-os ozmium-tetroxid oldatba helyeztük 30-45 percre. Az ozmium nehézfémként a sejtek membránkomponenseihez, ezen belül is a foszfolipid összetevőkhöz igen nagy affinitással
11
kötődik. Így az ozmium fokozza a membránok denzitását, az intracelluláris képletek kontrasztját. A következő lépésbenhidrofób, epoxi alapú, négykomponensű gyantával (ARALDIT-gyanta; Durcupan ACM gyanta, Fluka) infiltráltuk a preparátumokat.Ezt követően a gerincvelői metszeteket ebben a vékony gyantarétegben szedtük fel tárgylemezre ésfedtük le.Ezt a polimerizáció követte, 56˚C-on.Az ultrastukturális vizsgálatokhoz már csak a kimetszett felületes hátsó szarvi részt használtuk fel.
Miután
a
megfelelő
blokkba
öntöttük
a
preparátumokat, ultramikrotómmal (Leica Ultracut UCT) 40-60 nm-es vastagságú metszeteket készítettünk belőlük. A megfelelőnek ítélt metszeteket ún. gridekre, elektronmikroszkóphoz használt tárgytartókra helyeztük. A preparátumok kontrasztosabb megjelenítéseérdekében a grideken levő metszeteket előbb uranil-acetátot, majd ólom-nitrátot, illetőleg nátrium-citrátot (Reynolds oldat) tartalmazó oldatba merítettük. A két kontrasztozás között pedig 50%-os etanolos, majd desztillált vizes mosást alkalmaztunk. Mivel az elektronnyaláb hullámhossza jóval kisebb, mint a láthatófényé, így lényegesen nagyobb felbontásban vizsgálhatóak a biológiai minták elektronmikroszkóppal. Így tehát a patkányból származó gerincvelői metszetek dorzális szarvának ultrastruktúrális és a CB1 receptor subcelluláris lokalizációjánakvizsgálata ezzel az eszközzel folytatódott tovább(JEOL 1010, 80kV, Japan).
2.6. Konfokális mikroszkópia A pásztázó lézersugaras konfokális mikroszkópia lényege, hogy egy koherens lézernyaláb végigpásztázza a minta meghatározott részletét egy dichroikus tükörrendszer segítségével. A mintát pásztázó, fókuszált lézernyaláb gerjeszti az immunhisztokémiai eljárások során jelölt target molekulához kapcsoltfluorokróm molekularészt. A gerjesztett molekulacsoportok által emittált fény optikai tulajdonságait egy számítógéppel összekötött nagy felbontású digitális kamera rögzíti. A számítógép az időben elkülönülő fluoreszcens felvillanásokat feldolgozva alkot képet. Az optikai rendszerbe két apertúra-rekesz (pin hole) van beépítve, amelynek átmérője, ily módon a beérkező fény mennyisége szabályozható.Nagy előnye a rendszernek, hogy a mintáról egy kb. 1µm-es optikai metszetről készít felvételt a koherens lézernyaláb pontos fókuszálása, illetőleg az apertúra-rekesz átmérőjének beállítása révén.
12
A konfokális mikroszkópra feldolgozott metszeteket két szekunder antitesttel jelöltük, melyekhez 1-1különböző színű fluorokróm volt kapcsolva. Ezen színes csoportok más-más hullámhosszúságú fénnyel gerjeszthetők, és eltérő hullámhosszúságú fényt emittálnak.A külön-külön készített felvételek egymásra vetíthetőek, az emittált fénypontok együttes megjelenése keveredésük révén,egy harmadik, kevert szín megjelenését teszi lehetővé. Ez a jelenség az alapja a kolokalizációs vizsgálatoknak.
2.7. Kvantitatív analízis A konfokális mikroszkóppal készített képeken a fluoreszcens jeleket Adobe Photoshop CS3 szoftver segítségével számoltuk. Minden 1µm vastag optikai szeleten egy 10×10-es, egyenként 4 µm-es élhosszúságú négyzetet vettünk fel a felületes hátsó szarv CB1 receptorra és a vizsgált marker előfordulására nézve releváns területén. Csak azokat az immunreaktív profilokat vettük figyelembe, amelyek a 4µm-es élhosszúságú négyzet vonalaira estek. A módszer jellegéből fakadóan statisztikailag reprezentatív és objektív adatok álltak rendelkezésünkre.
13
3. Eredmény E yek
3.1. A CB1 re ceptor meegoszlása patkány p gerincvelő g felületes hátsó szarrvában DAB B kromogéén reakcióót követően n
A CB1 receptor elleni e immuunreakció szembetűnő s en jellegzeetes eloszláást mutat a á A lumbális l g gerincvelő teljes rosstrocaudaliss gerinncvelő hátsó szarvábban (9. ábra). kiterjjedésében két k igen inteenzíven imm munfestett sáv s figyelheető meg. A külső, CB1 1 receptorraa erőteeljesen imm munpozitív sáv s a gerinccvelő I. lam minájának feelel meg, m míg a belső a II. laminaa belsőő részével (IIi) ( esik egybe. e Ezekket a terüleeteket egy gyengébb g iimmunreakcciót mutatóó vékoony sávszerűű zóna, a II. lamina küllső része (IIIo)választja el egymástóól.
9. ábra. á CB1 receptor elleni imm munreakció megoszlássa a gerinncvelő felülletes hátsóó szarvvában. a-b,, CB1 imm munfestődés vad típu usú és CB B1 knock oout egérben n. A CB1 immuunfestődés megfigyelhhető a vad típusú t egér gerincvelőj őjének hátsóó szarvában n (a), míg a CB1 knock out egérből száármazó mettszeten imm munreakció nem n láthatóó (b) mutatv va, hogy azz kísérrleteinkhez használt h anntitest speciffikus. c-d, CB1 C immunnfestődés paatkány gerin ncvelőjénekk hátsóó szarvábann az L2 (c) és é L4 (d) szzegmentum magasságábban. Erőteljes CB1 imm munreakcióó láthaató a gerincvelő I és IIIi lamináibaan, míg a IIIo lamina gyenge g imm munfestődéstt mutat. Azz L4 szegmentum s mban a IIi lamina l meddiális feléneek jelölődése sokkal ggyengébb, mint m az L22 szegm mentum meegfelelő terüületének imm munfestődéése. Lépték:: 100 µm A vizsggálataink középpontjábban álló negyedik n luumbális szzegmentumb ból készültt metszeteken meegfigyelhetőő, hogy a II. lamina beelső részéneek immunreaktivitása csak c a hátsóó szarvv laterális feelén jelenikk meg, míg mediálisan m az immunffestődés kevvésbé erőtelj ljes (9. ábraa
1 14
d része). Ez a jellegzetes eloszlás a lumbális gerincvelő további szegmentumaiban nem figyelhető meg, ott az immunreakció mind az I, mind a II. lamina belső részében a hátsó szarv teljes mediolaterális kiterjedésében közel azonos erősségű (9. ábra c része). Az általunk vizsgált metszetek egyikében sem sikerült immunfestett sejttestet vagy dendritet azonosítani, a jelölés mindig axonálisan, finom pettyek formájában jelentkezett. A CB1 receptor immunfestődését mindCB1 knockout egér gerincvelőjén,vad típusú egér [23] gerincvelőjénmegvizsgáltuk.A CB1 receptor knock out egér gerincvelőjében nem sikerült CB1 receptort kimutatni (9. ábra b része), míg a vad típusú egérben erőteljes immunfestődést tapasztaltunk (9. ábra a része), így az általunk alkalmazott antitest CB1 receptorra specifikusnak tekinthető. A vad típusú egerek lumbális gerincvelőjének felületes hátsó szarvában a CB1 immunfestődés megoszlása mintázata teljesen megegyezik a patkány gerincvelőjében tapasztalt eloszlással.
3.2. A CB1 receptor és az axonális markerek kolokalizációja CB1 receptor és nociceptív primer afferens markerek kolokalizációja. Általánosan elfogadott, hogy a nociceptív primer afferensek egy része a gerincvelő hátsó szarvában kizárólag glutamáttal valósítja meg az ingerületátvitelt, míg mások a glutamát mellett neuropeptideket is felszabadítanak. A peptiderg nociceptív primer afferensek döntő többsége calcitonin gén-relációs peptidet (CGRP) expresszál, a nem peptiderg primer afferensek sejtmembránja pedig egy speciális poliszacharidot tartalmaz, ami szelektíven képes kötni egy, a Bandeiraea simplicifoliából izolált lektint, az isolectin-B4-et. (IB4) Ezért a nociceptív primer afferensek axonterminálisainak CB1 receptor expresszióját a CB1 receptor immunfestődésének, illetve a CGRP ellenes immunreakciónak (10. ábra a-b-c része) vagy az IB4 kötésnek a kolokalizációja alapján vizsgáltuk (10. ábra d-e-f része). Korábbi vizsgálatokkal összhangban a CGRP ellenes immunreakció a hátsó szarv I. és és IIo laminájára korlátozódott. A CB1 receptor, illetve a CGRP immunfestődésének kolokalizációját vizsgálva, a CB1 immunpozitív profiloknak 22,8± SEM%-a mutatkozott CGRP-re is immunreaktívnak (12. ábra), miközben a CGRP pozitív axonterminálisoknak több mint a fele (54,42±SEM%) expresszált CB1 receptort (13. ábra). Az IB4 kötés alapján feltüntetett nem peptiderg primer afferensek axonterminálisai, korábbi leírásokkal megegyezően túlnyomórészt a IIi laminában helyezkedtek el. A CB1 receptorra pozitív profiloknak csaknem a harmada (30,59±SEM%) kolokalizált az IB4-t kötő
15
boutoonokkal (122. ábra), am míg az IB4 kötésre néézve pozitívv terminálissoknak 33,5 5±SEM%-aa mutaatott CB1 im mmunreakciiót (13. ábraa).
10. ábra. á A geerincvelő feelületes hátssó szarvábó ól készített 1 µm vasttag konfokális optikaii szeleet a CB1 receptor és a CGRP imm munfestődés (peptidergg primer aff fferens boutonok, zöld;; b), illetve az IB4 köttés (nem peptiderg primer afferens a terrminálisok, zöld; e)) kolokkalizációjánnak bemutaatására. Azz egymásrra vetített képen a keverék szzín (sárga)) megjjelenése jelzzi a kettőseen jelölt term minálisokat. A kettősenn jelölt term minálisokat nyílhegyekk jelöliik. CB1 reeceptor imm munreaktiviitás figyelh hető meg mind m a peptiderg, miind a nem m peptiiderg primer afferensekk axontermiinálisain. Léépték: 2 µm m
CB1 recceptor és a gerincvelőii interneuronok mark kereinek koolokalizáció ója. Több
k kísérletes
eredmény
alapján
a
serkenntő
gerinccvelői
intterneuronokk
VGLUT2) választottuk v k axonnterminálisaainak markeeréül a vezikkuláris glutaamát transzpporter 2-t (V (11. ábra a-b-cc része). Mások M ereddményeivel összhangbban a VGL LUT2 imm munfestődéss homoogén megosszlást mutaatott az I-II. laminákbaan. A CB1 és é a VGLU UT2 koexpressziójánakk vizsggálatával a CB1 imm munreaktív profiloknaak 27,56±S SEM%-át aazonosítottu uk serkentőő
1 16
internneuronok axontermin a nálisain (122. ábra), a VGLUT22-re pozitívv boutonok knak pedigg 22,388±SEM%-aa kolokalizáált a CB1 recceptorral (13. ábra).
11. ábra. á A geerincvelő feelületes hátssó szarvábó ól készített 1 µm vasttag konfokális optikaii szeleet a CB1 reeceptor és a VGLUT2 (serkentő gerincvelői g interneuronnok, zöld; b), b illetve a GAD D65/67 imm munfestődéss (gátló geerincvelői interneuronnok, zöld; e) kolokalizációjánakk bemuutatására. Az A egymásraa vetített kéépen a keveerék szín (sáárga) megjeelenése jelzii a kettősenn jelöltt termináliisokat. A kettősen jelölt term minálisokat nyilak jeelölik. CB1 receptorr immuunreaktivitáás figyelheető meg mind m a serrkentő, miind a gátlló intrinsicc neuronokk axonnterminálisaain. Lépték: 2 µm Általánoosan elfogaddott tény, hogy a gerrincvelői gátló, g GABA Aerg intern neuronok a GABA) gluttaminsav-deekarboxilázz szinaaptikus trannszmisszióhooz szükségees γ-amino vajsavat (G (GAD D) segítséggével szintettizálják, ezéért a gátló interneuron i nok CB1 recceptor expressziójánakk vizsggálatához a GABAergg termináliisok feltünttetését GA AD elleni iimmunreakcció alapjánn végeztük (11. ábra d-e-f része). A GAD imm munfestődéés homogénnnek, de erőteljesnek e k fe háttsó szarvbann. A CB1 receptorokn r nak 11,8±SE EM%-át azzonosítottukk mutaatkozott a felületes GAB BAerg bouttonon (12. ábra), illeetve a GAD D pozitív terminálisooknak 22,71 1±SEM%-aa festőődött CB1-ree is (13. ábrra).
1 17
12. ábra. Osszlopdiagram m a CB11 receptor és az alkalmazott a t axonális markerekk kolokkalizációjánnak bemutattására a gerincvelő I-III. lamináibann.
1 18
13. ábra.Oszlopdiagram az alkallmazott ax xonális markerek m kolokkalizációjánnak bemutattására a gerincvelő I-III. lamináibann. A
rhizotomia
uttánilumbáliss
gerincveelői
szakaasz,
éés
L4-ess
a
CB1 1
receptorr
szegmen nsének
épp
(konttralaterális)) felületes hátsó h szarváában a CB1 receptor disztribúcióója: az I-es laminábann mediiolaterális, a II belső lamina lateerális részén nek erőteljees CB1 receptor immu unfestődésee
volt megfigyelhhető (14. ábbra a része)).A rhizotom mia utáni állapotot á muutatja be a 14. ábra b f a keezelt (ipsilaaterális) oldaalt demonsttrálja. részee is. Viszontt ez utóbbi felvétel 14. ábra.CB1-R R immunfeestődés pattkány lumb bális gerinccvelő felüleetes hátsó szarvában,, rhizootomia után az ép oldallon (a) illetőőleg a kezett oldalon (b). Lépték: 1100µm Jól látható, l hoggy a különnböző, pepptiderg és nem n peptidderg primer afferenseek centráliss nyúlvványait jelöölő markerekk nem okozznak immun nfestődést cssak az ép olldalon (15. ábra). A koontralateráliis oldalon a zöld szín a peptiderg g boutonok markere, vagyis a kalcitonin génn reláláációs peptidd (CGRP), a kék peddig a nem peptiderg p axxonterminálisokat jelö öli, tehát azz isoleectin B4 (IB B4) immunreeaktivitásátt jelzi. A CB B1 receptor immunfesttődése viszo ont mind azz ép, mind m pedig a műtött olddalon hasonnló. 3.4. A CB1 re ceptor subbcelluláriss lokalizá ciója A CB1 receptor r és a különbözző axonális markerek kolokalizác k iójának leírrása mellettt mmunreakciió megoszláásának vizsgálata ultraastrukturáliss célunnk volt a CB1 receptorr ellenes im szintten is. A CB1 receptor r jelölését preem mbedding immunarany i y jelöléssel végeztük ultravékony u y metszeteken. A CB1 recceptort jelző ezüst paartikulumokkat kizárólaag axonoko on sikerültt kimuutatni, sem sejttesten, s sem dendriteen nem találltunk ezüstrrögöt. A CB B1 pozitív teerminálisokk mindd szimmetriikus, mind aszimmetriikus szinapsszisok kialaakításában rrészt vettek k, melyek a serkeentő, illetvve gátló szzinapszisokk morfológ giai megfellelői (17., 18., 19., ábra). Azz
1 19
aszim mmetrikus szinapszisok s k egy részéében a serk kentő terminnálisok dennse core vesiculákat iss tartallmaztak, meelyek jelenlléte a peptidderg primerr afferensekk terminálissaira jellemzző (17., 18.. ábra)).
15. ábra. Dorrzális rhizootomia utánn készült konfokális mikroszkóópos felvéttel patkányy gerinncvelőjénekk hátsó szarrváról. Zöldd szín jelzi a peptidergg primer affferensek teerminálisaitt (CGR RP, a,d), kék k színnel a nem pepptiderg prim mer afferensek láthatókk (IB4 kötés, b,d). A rhizootomia sikerrességét dem monstrálja, hogy a gerrincvelő inttakt (jobb) ooldalán min nd a CGRP P immuunreaktivitáás, mind azz IB4 kötéss megtartottt, míg a műűtött oldaloon a primerr afferensekk markkerei eltűnteek. Megfigyyelhető, hoogy CB1 im mmunfestőddés (piros, cc,d) az ép és é a műtöttt oldallon is megjeelenik, és a két oldal köözött nincs értékelhető é különbség. Lépték: 10 00µm
2 20
17. ábra. á CB1 receptor r fehhérje subcelluláris lokalizációja.M Mint minden elektronmikroszkóposs ábránn, így ezen is jól láthattó, hogy a CB1-R C imm munogold jellölés számoos szinaptiku us vesiculátt tartallmazó axonnterminális (at.) membbránjához kötötten k jeleenik meg ((nyilak). A nyílhegyekk egy szimmetrikkus (gátló) szinapszist jelölnek, amelynek a c csak részlettei kerültek k a metszéss síkjáába, így többb szinaptikkus résként látható. A csillag alakkú jelölésekk dense core vesiculákk melleett találhatóóak. Ezek veesiculák neuuropeptid trranszmitterrrel töltöttek.. Lépték: 50 00 nm. h a neurronok karaakterétől függgetlenül a CB1 receeptort jelzőő Megfigyelhető továbbá, hogy m esetbben a plazmamembránh hoz asszociááltak. A jelöölés specificcitását jelzi,, partikkulumok minden hogyy az ezüsttrögök a plazmamem mbrán prottoplazmatikkus felszínéhez kötötttek annakk megffelelően, hoogy a CB1 receptor r elleeni antitest a receptor intracellulár i ris epitópjátt ismeri fel.. Az általunk meggfigyelt ezüüst szemcsékk minden essetben extraaszinaptikussan helyezkeedtek el. Mindd periszinaaptikusan lookalizált, mind m a szin napszistól távol t elhellyezkedő ezzüströgökett sikerrült kimutatnni, azonbann a szinaptikkus appozíciióban nem találtunk t jellölődést.
2 21
á receptorfehhérje subceelluláris lok kalizációja (nyilak).Léényeges különbség azz 18. ábra.CB1 előzőő ábrához képest k a szinnapszis funkkciójában vaan: a kérdésses axonvégg (at.) gátló szinapszistt (nyílhhegy) létesíít a szomszzédos denddrittel (d.). A CB1 imm munreaktivitás az axo ontermináliss (at.) membránjáához asszociiáltan forduul elő, periszzinaptikusann. A csillag jelölés itt is egy densee core vesiculát mutat. m Jól láttható még az a aszimmettrikus szinaapszis (nyílhhegy), poszttszinaptikuss kus denzitáss mutatkozikk. A képen egy neuronn részee a dendritbben (d.) ameely mint possztszinaptik sejtm magja (n.) és é citoplazm mája (c.) is látszik. Azz a. jelzés egy myelinn hüvellyel rendelkezőő axonnt jelöl. Léppték: 500 nm m.
19. ábra.CB1 receptorffehérje subbcelluláris lokalizáciiója (nyilaak). Az ábrán á egyy denddrittüskével (dt.) szinapptizáló axonnterminális (at.) láthattó. A CB1 megjelenéssét a nyilakk jelöliik: jól láthható ezen a képen is, hogy a CB1 preeszinaptikuss, ill. periiszinaptikuss elhellyezkedésű. Az aszimm metrikus szinnapszist a nyílhegy n jelööli. Lépték: 250 nm
2 22
4. Diszkusszió A CB1 receptor expressziójának felfedezése centrális és perifériális neuronokon már a ’90-es években felvetette annak lehetőségét, miszerint a CB1 receptor mediált jelátvitel a fájdalomfeldolgozó folyamatok szabályzásában is részt vehet [25,26], majd az első endogén cannabinoid ligandok leírása egyre inkább valószínűsítette, hogy az endocannabinoid rendszer egyik fő feladata a fájdalom modulálása [3]. Számos kísérletes eredmény támasztja alá, hogy a cannabinoidok mérséklik a fájdalmas ingerekre adott magatartási választ mind mechanikai, mind pedig termális, vagy viscerális fájdalom esetén[27,28,29]. Ezen túlmenően több elektrofiziológiai és neurokémiai eredmény bizonyítja, hogy a cannabinoidok hatékonyan csökkentik a gerincvelői neuronok fájdalom-indukált aktivitását [30,31,32]. Ezt a hatást legalább részben a primer afferensek centrális nyúlványain expresszálódó preszinaptikus CB1 receptorok válthatják ki [12], amelyek aktivációja csökkenti a primer afferensek glutamát felszabadulását [33]. Bár mind a primer afferensek centrális axonterminálisainak, mind pedig a hátsó gyöki ganglionsejtek CB1 receptor expressziója egyértelműen bizonyított [34,35], fontos megjegyezni, hogy korábbi elektrofiziológiai vizsgálatok alapján a C és Aδ rostokkal monoszinaptikusan kiváltható posztszinaptikus potenciálokat az anandamid csak a gerincvelői interneuronok egyharmadában, illetőleg kétharmadában csökkentette, ezzel azt jelezve, hogy a primer afferensek egy csoportja nem reagál cannabinoid felszabadulásra [33]. Konfokális mikroszkópos felvételeken végzett kvantitatív elemzéseink alapján a peptiderg primer afferens terminálisoknak több mint a fele, a nem peptidergeknek pedig harmada CB1 receptort expresszál. Ez jó egyezést mutat a korábbi elektrofiziológiai vizsgálatok eredményeivel. Eredményeink alapján azonban figyelembe kell venni, hogy a peptiderg primer afferensek centrális boutonjainak csaknem a felén, a nem peptidergeknek közel kétharmadán nem sikerült CB1 receptort kimutatni jelezve, hogy a nociceptív érző információknak csak egy részét modulálja az endocannabinoid rendszer. Korábbi (neonatális capsaicin injekciót követően) autoradiográfiás [36] és (gerincvelő hemisectióját követő) immunhisztokémiai vizsgálatok [15] szerint a CB1 receptorok egy részét
gerincvelői
elektrofiziológiai
interneuronok vizsgálat,
expresszálják.
amelyek
az
Ezt
a
endocannabinoid
megállapítást
erősíti
transzmisszióra
több
jellemző
preszinaptikus gátlást mind GABAerg [37], mind pedig glutamaterg [12] gerincvelői interneuronok terminálisain bemutatták. Saját leleteink jó egyezést mutatnak az említett morfológiai és funkcionális megfigyelésekkel egyaránt Eredményeink alapján a gerincvelő I-
23
II lamináiban kimutatható CB1 receptoroknak 11%-t GABAerg, 27%-át glutamaterg interneuronok expresszálják. Azonban a primer afferensekhez hasonlóan az intrinsic gerincvelői neuronoknak csak egy részében sikerült CB1 receptort kimutatni. Úgy találtuk, hogy a GABAerg boutonoknak 10%-a, a glutamaterg terminálisoknak 28%-a expresszál CB1 receptort. A gerincvelői interneuronoknak tehát nagyobbik hányadának működésére a CB1 receptor mediált jelátvitel nincsen hatással. A CB 1 receptor ultrastruktúrális megoszlására vonatkozó vizsgálatok többsége a receptort nem csak axonálisan, hanem a neuronok sejttestjén és dendritjén is leírja. Ezzel szemben a cannabinoidokalkalmazása a gerincvelőben speciális fiziológiai válaszokat vált ki, melyek a receptor preszinaptikus megjelenését támasztják alá [12,37]. Eredményeink és az elektrofiziológiai leírások jól korrelálnak egymással. Immunarany jelöléses vizsgálatainkban a CB 1 receptort jelző ezüstszemcséket kizárólag axonterminálisokon detektáltuk, jelölt sejttestet, vagy dendritet nem sikerült kimutatni. Eredményeink alapján a gerincvelő felületes hátsó szarvában kimutatható CB1 receptorok mind primer afferensek, mind gátló és serkentő gerincvelői interneuronok axonterminálisain
jelentős
mértékben
expresszálódnak.
Korábbi
elektrofiziológiai
vizsgálatokkal összhangban [12,15,] ezek az eredmények azt sugallják, hogy az endocannabinoidok a gerincvelői szintű fájdalom-feldolgozást primer afferenseken és intrinsic neuronokon egyaránt hatva képesek modulálni. Fontos hangsúlyozni azonban, hogy vizsgálataink alapján a gerincvelő I-II lamináiban expresszálódó CB1 receptoroknak körülbelül a 90%-át tudtuk az általunk vizsgált neuronális elemekhez rendelni jelezve, hogy a CB1
receptoroknak
fennmaradó
közel
10%-a
általunk
nem
vizsgált
neuronok
axonterminálisain, vagy a gerincvelő gliális elemein expresszálódnak.
24
5.1. Rövidítések jegyzéke BrSt:agytörzs Cer: cerebellum; Col: colliculi; Cx:agykéreg CP: caudato-putamen;
GP: globus pallidus; EP: entopedunclaris mag; Hi: hippocampus; SNr: substantia nigra pars reticulata; Th: thalamus
25
6. Irodalomjegyzék 1. Matsuda L. A. Lolait S. J., Brownstein M.J. Young A. C.és Bonner: Structure of a cannabinoid receptor and functional expression of the cloned cDNA. Nature 346, 561564 (1990). 2. Devane W. A. et al.: Isolation and structure of a brain constituentthat binds to the cannabinoid receptor. Science 358, 1946-1949 (1992). 3. Di Marzo V. et al.: Formation and inactivation of endogenous cannabinoidanandamide in centralneurons. Nature 372, 686-691 (1994). 4. Sugira T. et al.: 2-Arachidonoylglycerol: a possible endogenous canabinoid receptor ligand in brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 215, 87-97 (1995). 5. Mechoulam R. et al.: Identificationof an endogenous 2-monoglyceride, present in carine gut, that binds to cannabinoid receptor. Biochem. Pharmacol. 50, 83-90 (1995). 6. Hanus L.et al.: 2-Arachidonyl-glycerol ether, an endogenous agonist of the cannabinoid CB1 receptor. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98, 3662-3665 (2001). 7. Piomelli D.: The molecular logic of endocannabinoid signaling. Nature Reviews/ Neuroscience, vol.4. 873-884, (2003). 8.
Stella N., Schweitzer P. és Piomelli D.: A second endogenous cannabinoid that modulates long-termpotentiation.Nature 388, 773-778 (1997).
9. Porter A. et al.: Characterization of a novel endocannabinoid, virodhamin with antagonist activity at the CB1 receptor. J. Pharmacol. Exp. Ther. 301, 1020-1024 (2002). 10. Freund T. F., Katona I. és Piomelli D.: Role of endogenous cannabinoids in synaptic signaing. Physol. Rev. 83, 1017-1066 (2003). 11. Ohno-Shosaku T., Hashimotodani Y., Maejima T., Kano M.:Calcium signaling and synpatic modulation: Regulation of endocannabinoid-mediated synaptic modulation by calcium. Cell Calcium 38, 369-374 (2005). 12. Morisset V., Ahluwalia J., Nagy I., Urban L.: Possible mechanisms of cannabinoidinduced antinociception in spinal cord. European Journal of Pharmacology 429, 93100 (2001) 13. Ohno-Shosaku T., Maejima T., Kano M.: Endogenous cannabinoids mediate retrogradesignals from depolarized postsynaptic neurons to presynaptic terminals. Neuron, vol. 29, 729-738 (2001). 14. Salio C. et al.: Pre- and postsynaptic loalization of the CB1 cannabinoid receptor in the dorsal horn of the rat spinal cord. Neuroscience 110, 755-764 (2002).
26
15. Farquhar-Smith W. P., et al.: Cannabinoid CB1 receptor expression in rat spinal cord. Mol. Cell. Neurocsi. 15, 510-521 (2000). 16. WilsonR. I., Kunos G., Nicoll R. A.: Presinaptic specificity of endocannabinoid signalling in the hippocampus. Neuron 31, 1-20 (2001). 17. Daniel H.et al.: Control of Ca2+ influx bycannabinoid and metabotropic glutamate receptors in rat cerebellar cortex requires K+ chanels. J. Physiol. 537, 793-800 (2000). 18. Robbe D., et al.: Localization and mechanisms of action of cannabinoid receptorsat the glutamatergic synapes of the mouse nucleus accumbens. J. Neurosci. 21, 109-116 (2001). 19. Wilson R. I., Nisoll R. A.: Endocannabinoid signalling in the brain. Science 296, 678682 (2002). 20. Carlson G., Wang Y., Alger B. E.: Endocannabinoids facilitate the induction of LTP in the hippocampus. Nature Neurosci. 5, 723-724 (2002). 21. Herkenham M, et al.: Cannabinoid receptorlocalization in brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,1932-1936 (1990). 22. Ong W.Y., Mackie K.: A light and electron microscopic study of the CB1 cannabinoid receptor in primate brain. Neuroscience 92, 1177-1191 (1999). 23. Ledent C., et al: Unresponsiveness to cannabinoids and reduced addictive effect of opiates in CB1 receptor knockout mice.Science 283, (5004) (1999). 24. Munro S. et al.: Molecular characterization of a pheripheral receptor for cannabinoids. Nature 365, 61-65 (1993). 25. Herkenham M., Lynn AB., Johnson MR., Melvin LS., de Costa BR., Rice KC.: Characterization and localization of cannabinoid receptors in rat brain: a quantitative in vitro study. J. Neurosci. 11, 563-583 (1991). 26. Tsou K., Brown S., Sanudo-Pena MC., Mackie K., Wlker JM.: Immunhistochemical distribution of cannabinoid CB1 receptors in the rat central mervous system. Neuroscience 83,393-411 (1998). 27. Buxbaum DM.: Analgesic activity of 9-tetrahidrocannabinol in the rat and mouse. Psychopharmacologia 25, 275-280 (1972). 28. Welburb PJ., Starmer GA., Cheter GB., Jackson DM.: Effect of cannabinoids on the abdominal
constroction
response
in
mice:
within
cannabinoid
interactions.
Pychopharmacologia 46, 83-85 (1976). 29. Richardson JD., Anonsen L., HargreavesKM.: Antihyperalgesic effect of spinal cannabinoids. Eur. J. Pharmacol. 345, 145-153 (1998).
27
30. Meng ID., Manning BH., Martin WJ., Fields HL.: An analgesic circuit activated by cannabinoids. Nature 395, 381-384 (1998). 31. Harris J., Drew LJ., Chapman V.: Spinal anandamide inhibits nociceptive transmission via cannabinoid receptor activation in vivo. Neuroreport. 11, 2817-2819 (2000). 32. PertweeRG.: Cannabinoid receptors and pain. Prog. Neurobiol.63, 569-611 (2001). 33. Luo C., Kumamoto E., Furue H., Chen J., Yoshimura M.: Anandamide inhibits excitatory transmission to rat substantia gelatinosa neuron sin manner different from that of capsaicin. Neurosci. Lett. 321, 17-20 (2002). 34. Hohmann AG., Herkenham H.: Localization of central cannabinoid CB1 receptor messenger RNA in neuronal subpopulations of rat dorsal root ganglia: double-label in situ hybridisation study. Neurosci. 90, 923-931 (1999). 35. Bridges D., Rice AS., Egertová M., Elphick MR., Winter J., Michael GJ.: Localization of cannabinoid receptor 1 in rat dorsal root ganglion using in situ hybridisation and immunhistochemistry. Neurosci. 119, 803-812 (2003). 36. Hohmann AG., Herkenham H.: Regulation of cannabinoid and mu opioid receptor binding sites following neonatal capsaicin treatment. Neurosci. Lett. 252, 13-16 (1998). 37. Jennings EA., Vaughan CW., Christine MJ.: Cannabinoid action on rat superficial medullary dorsal horn neuron sin vitro. J. Physiol. 534, 805-812 (2001).
28
