CAS9: CARATERBARUUNTUK MEMUKUL JATUH GEN"

BioTrends Vol.7 No.2 Tahun 2016

BIOTEKNOLOGI CRISPR/CAS9: CARATERBARUUNTUK “MEMUKUL JATUH GEN" SUPATMI Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI Jl Raya Bogor Km 46 Cibinong 16911 Telp.0218754587; Fax. 0218754588 Email:[email protected]

P

ada satu abad terakhir, kemajuan teknologi di bidang bioteknologi dan biologi molekuler mengalami peningkatan yang luar biasa. Kemajuan tersebut dimulai sejak ditemukannya teknologi PCR (polymerase chain reaction) untuk amplifikasi gen hingga teknologi transgenesisyang mengantarkan berbagai keberhasilan penelitian di bidang biomedik dan pertanian. Namun demikian, transgenesis memiliki keterbatasan. Teknologi transgenesisadalah teknologi rekayasa genetika dengan menyisipkan/mengintroduksi gen asing untuk menciptakan sifatsifat baru yang memiliki nilai

agronomis/biomedis tinggi (Hefferon, 2012) atau memodifikasi sifat-sifat yang tidak diinginkan. Penyisipan gen asing tersebut menimbulkan kekhawatiran publik atas produkproduk hasil rekayasa genetika khususnya apabila gen yang diintroduksi memiliki hubungan kekerabatan yangjauh seperti misalnya kita menyisipkan gen tertentu hewan pada tanaman atau manusia. Hal ini tentu saja menghambat transgenesis untuk digunakan secara luas. Selain itu untuk melepaskan produk transgenesis diperlukan beberapa regulasi terkait tentang produkproduk rekayasa genetika

(transgenik) seperti uji keamanan pangan dan hayati serta lingkungan dalam rangka untuk mengatasi keselamatan publik dan ini menambah beban biaya produksi yang besar (Todaka et al., 2015). Untuk itu para ahli berusaha mencari inovasi baru untuk mengatasi keterbatasanketerbatasan teknologi transgenesis tersebut. Berbagai penelitian dilakukan untuk mendapatkan metode manipulasi fungsi gen yang lebih effisien, aplikatif dan tepat sasaran. Beberapa usaha tersebut diantaranya adalah homologous recombination dan RNA interference (RNAi). RNAi menjadi

Gambar 1. Ilustrasi kartun genome editing , http://www.ecologise.in/2016/03/13/crispr-is-coming-withbig-implications-for-food-farmers-consumers-and-nature/ 31


metode yang memungkinkan untuk mengetahuifungsi dari gen yang akurat dan murah, namun demikian, beberapa penelitian menunjukkan bahwa penghambatan fungsi gen ini bersifat sementara dan dimungkinkan menyebabkan penghambatan fungsi gen lain yang bukan merupakan gen target (off-target effects) (Baulcombe, 2004).

Genome editing adalah metode perakitan genetik dimana sebuah sekuens DNA bisa disisipkan, diganti dihapus, dan atau dipindahkan dari genom suatu organisme ke organisme laindengan bantuan suatu enzim nuklease yang berfungsi seperti gunting molekuler (Schinkel & Schillberg, 2016). Tujuan dari metode ini tak lain adalah mengedit susunan basa DNA pada genom sehingga ketika Saat ini, telah muncul teknologi diterjemahkan dalam bahasa genome editing yang asam amino bisa merubah sifat pendekatannya disinyalir lebih dari organisme tersebut. baik dari teknologi manipulasi gen Teknologi genome editing secara transgenesis klasikseperti tergolong baru karena baru resmi mengintroduksi sifat baru pada dipublikasikan pada tahun 2005. tanaman atau hewan dengan Beberapa modul teknik genome rekombinasi genetik alami dengan editing yang telah digunakan cara mengawinkan dengan induk diantaranya Zinc Finger Nucleases yang lebih baik atau unggul. (ZFNs) dan Transcription

Activator-Like Like Effector Nucleases (TALENs) (Ledford, 2016). Teknik ini berbeda dengan teknik transgenesis klasik sebab tidak melibatkan pengambilan gen dari spesies lain melainkan mempercepat terjadinya pros proses mutasi genetik yang secara alami terjadi saat proses perkawinan /pemuliaan (Sprink et al., 2015). Teknologi ini memungkinkan para peneliti untuk menciptakan mutasi secara permanen, namun demikian, teknik ini sangat mahal dan membutuhkan waktu yang lamaa serta terbatas untuk digunakan dalam skala luas (Lusser et al., 2012). Untuk itu, para peneliti berusaha untuk menciptakan modul terbaru genome editing yang lebih murah dan memiliki presisi tinggi. Belum lama ini, teknologi tersebut sudah

Gambar 2. Prinsip kerja dari CRISPR-Cas9 CRISPR Cas9 untuk pengeditan gen. 1) sgRNA yang terdiri dari sekuen crRNA yang spesifik menyasar DNA target dan tracrRNA yang berinteraksi dengan Cas9 protein. 2) Terbentuk ikatan komplek antara sgRNA dengan pro protein Cas9 yang mengandung aktivitas DNA endonuclease. 3) Ikatan komplek tersebut akan menyebabkan dsDNA target terputus. 4) Situs yang terputus tersebut akan diperbaiki oleh lewat jalur perbaikan DNA non--homologous homologous end joining (NHEJ), proses ini bisa menye menyebabkan insersi atau penghapusan dari nukleotida yang menyebabkan rusaknya fungsi gen. Diambil dari http://www.clontech.com/xxclt_ibcGetAttachment.jsp?cItemId=100247 http://www.clontech.com/xxclt_ibcGetAttachment.jsp?cItemId=100247. 32


ditemukan dan diberi namaCluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-associated protein-9 nuclease (CRISPR-Cas 9). Modul teknologi genome editing ini disebut-disebut sebagai era penemuan baru dan terbesar dalam dunia biologi molekuler (Gambar 1). Lalu, sebenarnya apa

pemberi jarak DNA(DNAspacer) dan pengulangan frasa sekuen yang sama (palindromic sequence).Karena proses pengulangan singkat sekuen basa DNA tersebut maka disebut dengan istilah CRISPR. Ternyata,pola yang sama hampir dimiliki di 40% bakteria dan 90%

serangan beberapa virus Bakteriofage yang berdampak pada kerusakan dari produk makanan yang dihasilkan sehingga menurunkan baik kuantitas dan kualitas produk makanan yang dihasilkan. Karena itulah para ahli berusaha mengatasi hal tersebut. Mereka akhirnya menemukan

Gambar 3. Organisme hasil genome editing dengan menggunakan teknik CRISPR.Kanan: Embrio zebrafish yang memiliki kelebihan jaringan ventral berlebih; kiri: lalat buah yang memiliki mata berwarna hitam dengan mengedit gen yang bertanggung jawab terhadap pigmen warna mata pada lalat buah. Diambil dari Pennisi (2013). itu CRISPR-Cas9, bagaimana cara kerjanya dan mengapa teknik ini menjadi buah bibir? Jawabannya dimulai dari penelitian pada tahun 2007 mengenai kekebalan imunitas yang terjadi pada bakteri.

di mikroba dengan lokasi yang berbeda.Pada mulanya para ahli menduga bahwa sekuen yang aneh itu hanyalah sampah, tetapi pada tahun 2005,tiga grupahli bioinformatika melaporkan adanya kesesuaian DNAbakteri dengan DNA pada sekuens virus Fage yang mengindikasikan adanya kemungkinan cara kerja CRISPR dalam mekanisme imunitas mikroba (Pennisi, 2013). Dan ini menjadi petunjuk yang menarik dalam perkembangan CRISPR selanjutnya.

cara bagaimana mendorong agar bakteri ini melawan serangan dari virus Fage tersebut. Mirip dengan prinsip vaksinasi, jadi bakteri tersebut diekspose dengan virus tersebut agar melawan serangan virus. Menariknya bakteri tersebut mampu menciptakan kekebalan Asal Penemuan CRISPR imun sistem yang memungkinkannya untuk resisten Sebenarnya ide pertama dari pada serangan virus yang kedua teknik CRISPR ini bermula pada dan seterusnya. Sistem tahun 1987, ketika sebuah tim pertahanan yang ditunjukkan oleh peneliti mengamati fenomena bakteri S. thermophilus tersebut proses pengulangan sekuens yang menjadi sangat penting tidak aneh pada salah satu ujung dari hanya bagi para ahli makanan dan gen bakteri. Satu dekade Pada tahun 2007, para peneliti mikrobiologi tapi para ahli biologi kemudian para ahli mikroba dari Danisco, yang bergerak dalam molekuler lainnya untuk meneliti menemukan pola yang sama di industri komposisi makanan yang lebih lanjut. Akhirnya, Danisco dan genom mikroba dimana sekuen dimiliki oleh DuPont, melakukan timberhasil merubah S. dari DNA ternyata diikuti oleh penelitian mengenai bakteri thermophilus yang resisten sekuen yang polanya hampir mirip Streptococcus thermophilusyang terhadap serangan Fage dengan seperti pelengkapdari sekuen sangat penting dalam industri menambah atau menghapus sebelumnya. Pola sekuen tersebut pembuatan yoghurt dan keju. spacer DNA yang bersesuaian adalah 30 basa nukleotida yang Bakteri ini ternyata menjadi dengan Fage. Pada saat itu para acak yang disebut sebagai bersifat lemah karena adanya ahli tersebut masih belum 33


memikirkan bahwa teknologi tersebut adalah cara kerja CRISPR dan potensi CRISPR sebagai teknologi genom editingdalam skala yang lebih besar. Kemudian ahli dari Jerman, Doudna dan Emmanuelle Charpentier (2007)meneliti lebih jauh dari sistem CRISPR ini dengan mengaitkannya dengan proteinprotein lain untuk mengetahui bagaimanaS. thermophilus ini menggunakan DNA spacers dalam sistem pertahanan imun mereka. Kedua ahli ini fokus menggunakan sistem CRISPR ini dengan protein yang disebut Cas9 untuk menyederhanakan sistem CRISPR dibandingkan dengan yang lain (Pennisi, 2013). Lalu bagaimana, cara kerja dari CRISPR-Cas9 ini hingga mampu mengedit DNA dari genom organisme?. Cara kerja CRISPR/Cas9 Ada dua komponen utama dalam sistem CRISPR-Cas9 yaitu protein Cas dan single guide RNA (sgRNA). Dalam sistem CRISPR-Cas tipe II, Cas 9 ini merupakan protein penting yang menjadi karakteristik utama dan sistem ini yang paling banyak digunakan dalam penelitian. Hal ini karena CRISPRCas tipe II ini memiliki komponen yang lebih sederhana yaitu 3 komponen (Cas9, crRNA dan trRNA) yang lebih mudah diadaptasi dibandingkan CRISPRCas tipe I, III dan IV. Cas 9 berfungsi sebagai enzim yang memotong DNA target di sekuen yang posisinya dekat dengan situs protospacer adjacent motif (PAM). Sekuen di situs PAM ini biasanya ditandai dengan 3 basa nukleotida (NGG, dengan N adalah basa nukleotida yang bisa berupa A: Adenin; T: Timin; C: Cytocine; G: Guanin). Protein cas9 ini memiliki

Streptococcus thermophilusyang sangat penting dalam industri pembuatan yoghurt dan keju. Bakteri ini ternyata menjadi bersifat lemah karena adanya serangan beberapa virus Bakteriofage yang berdampak pada kerusakan dari produk makanan yang dihasilkan sehingga menurunkan baik kuantitas dan kualitas produk makanan yang dihasilkan. bakteri ini melawan serangan dari virus Fage tersebut 2 situs homolog yaitu RuvC dan HNH, yang masing-masing memotong satu dari untai ganda DNA, yang menghasilkan potongan tumpul (blunt cut) pada sekuen DNA target. Selanjutnya, sgRNA yang merupakan RNA buatan gabungan dari dua noncoding RNA yaitu crRNA yang berfungsi sebagai guide yang bisa menyesuaikan dengan sekuen dari DNA target dan tracrRNAyang berfungsi sebagai scaffold. Sekuen sgRNA ini digunakan untuk mentarget lokus genom tanaman/hewan yang secara 34ector34us panjangnya 19-22bp, dengan penambahan 3 bp sekuen PAM (NGG). Cas9 dan sgRNA dapat dikonstruk dalam satu vektor atau bisa menggunakan dua vektor yang terpisah dengan 34

mengkombinasikan dengan jenis promotor dan sekuen dari enzim restriksi lainnya tergantung dari karakter genom yang ditargetkan. Metode pengeditan dari CRISPR ini, sama dengan dua teknologi sebelumnya yaitu adanya mekanisme reparasi akibat terpotongnya sekuen DNA target. Mekanisme reparasi tersebut bisa terjadi secara alami yang bergabung dengan Nonhomologous end joining (NHEJ) maupun dengan menggunakan cetakan eksternal yang diinginkan seperti homology directed repair (HDR). Dari mekanisme perbaikan ini maka akan terjadi insersi basa atau penghapusan nukleotida baru yang menyebabkan terjadinya disfungsi gen (Gambar 2).(Sprink et al., 2015).


Aplikasi CRISPR-Cas 9

jaringan daun. Sebagai contoh pada tahun 2014, Shan dan Sejak awal kemunculannya, koleganya menemukan metode teknologi CRISPR ini telah untuk menciptakan mutasi pada membawa angina segar dalam padi dan gandum dengan dunia genome editing. Aplikasinya menggunakan teknik CRISPR ini yang sederhana dan relatif murah dengan menggunakan telah banyak diterapkan di sel transformasi dari protoplas eukariotik, tikus, nematode dan dengan masa regenerasi mutan tanaman. Sebagai contoh nyata yang relatif cepat selama 13-17 Pennisi (2013) melaporkan bahwa minggu. Menariknya, pada bulan 8 bulan sejak kemunculannya di April 2015, para peneliti tahun 2007, teknologi CRISPR ini melaporkan bahwa mereka mampu menciptakan varietas berhasil mengedit embrio baru dari lalat buah yang memiliki manusia dengan menggunakan mata berwarna hitam dengan teknik CRISPR ini. Meskipun hal ini mengedit gen yang bertanggung memunculkan perdebatan di jawab terhadap pigmen warna kalangan masyarakat dunia mata pada lalat buah (Gambar 3). mengenai etis atau tidak etisnya Dalam dunia industri dan teknologi CRISPR ini digunakan therapeutik, penggunaan CRISPR untuk penelitian pada manusia sangat gencar dilakukan, terbukti (Jiang et al., 2013; Ledford et al., dengan dana penelitian yang 2015). Dari beberapa contoh dikeluarkan mencapai hamper 89 aplikasi dan trend dari juta dollar pada tahun penggunaan teknologi CRISPR 2013.Menariknya, publikasiyang cenderung meningkat dalam publikasi ilmiah yang membahas dunia penelitian baik biomedis tentang aplikasi teknik CRISPR ini dan pertanian merupakan bukti dalam dunia medis meningkat nyata bahwa teknik ini merupakan tajamsepertipenggunaan CRISPR- gebrakan baru dalam dunia Cas 9 untuk terapi gen secara in genome editing dan biologi vivo(Ledford, 2015). Menariknya, molekuler yang tentu saja publikasi-publikasi tersebut menimbulkan status pro dan tercatat sebagai terbesar kedua kontra mengenai status produk setelah teknologi induced yang dihasilkannya di masa depan. pluripotent stem sel (iPS) dan diikuti oleh Zinc fingers dan Talens Status dan Masa Depan CRISPR(Ledford, 2015). Cas 9 Penerapan teknologi CRISPR ini juga menjadi buah bibir dalam dunia pertanian. Setidaknya pada tahun 2013, ada delapan publikasi ilmiah yang menerapkan teknik ini pada genom tanaman yaitu di Arabidopsis, tembakau, padi, gandum dan sorgum (Belhaj et al., 2013). Teknik CRISPR ini diuji dengan assay ekspresi sementara dengan menggunakan transformasi dari protoplas tanaman serta agroinfiltrasi di

Mudah dan efisiennya penggunaan teknologi CRISPR ini bukan berarti tanpa hambatan. Sejak kemunculannya, banyak para peneliti yang memperdebatkan tentang siapa yang berhak mendapatkan paten dari teknologi ini karena banyaknya pengajuan klaim atas teknologi ini.Selain itu para peneliti internasional juga mulai memperdebatkan mengenai apakah produk yang dihasilkan 35

dengan teknologi CRISPR ini masih tergolong sebagai GMO. Mereka menilai bahwa teknologi genome editing bukan termasuk dalam kategori produk GMO, karena tidak adanya DNA asing yang dimasukkan dan tidak melibatkan penggunaan bakteri Agrobacterium yang bersifat pathogen dalam perakitannya (Puchta & Fauser , 2013; Araki & Ishii, 2015). Dengan kata lain teknik ini meniru proses alami dari sel dan tidak menyebabkan transformasi gen secara keseluruhan yang merupakan isu sensitif dari produk GMO. Karena itulah, para peneliti-peneliti internasional berdebat mengenai terminologi GMO yang dirasa regulasinya tidak lagi valid untuk produk-produk hasil dari teknik genome editing karena organisme yang dihasilkan lebih disebut sebagai Genetically edited organism (GEO) (Qaim& Zilberman, 2003). Menariknya, baru baru ini US Department of Agriculture (USDA) meloloskan jamur hasil dari teknologi CRISPR ini dari regulasi sebagai produk GMO yang merupakan lampu hijau dari produk hasil genome editing(Waltz, 2016). Meskipun begitu, kekhawatirankekhawatiran mengenai modifikasi genom hasil dari teknik genome editing ini, yang dimungkinkan tidak bisa dibedakan dengan mutasi alami yang terjadi di alam dan hasil pemuliaan konvensional seperti pada tanaman atau mutagenesis kimia atau fisik yang terjadi. Hal ini menimbulkan kekhawatiran adanya pencemaran plasma nutfah dari alam dan kekhawatiran akan kestabilan dari gen yang diturunkan ke generasi selanjutnya. Karena itulah regulasi mengenai GEO ini menjadi topik yang panas di kalangan pakar


peneliti internasional sampai saat ini. Evaluasi mengenai produkproduk baru dan akhir yang dihasilkan dari teknik genome editing ini mungkin perlu menjadi perhatian yang serius kedepannya oleh para ahli, agar masyarakat ter-edukasi dan mampu menentukan pilihan dan sikap yang benar terhadap produkproduk dari GMO/GEO ini. Namun demikian, terlepas dari adanya kontroversi terkait regulasi GMO maupun GEO, teknologi CRISPRCas9 ini memberikan angin segar bagi para peneliti, industri dan masyarakat pada umumnya. Karena pada akhirnya, inovasi dan perkembangan bioteknologi hewan dan tanaman yang dulu sukar diprediksi akan tercerahkan kedepannya, terutama dengan maraknya isu-isu mengenai pemanasan global dan climate change yang sekarang banyak diperbincangkan.

safety and regulation in the Jiang, W, Bikard, D, Cox, D, Zhang, EU. The Plant Journal 78, 742F, & Marraffini, LA. (2013): 752. RNA-guided editing of bacterial genomes using Hefferon KL. (2012): Plant virus CRISPR-Cas systems. Nature expression vectors set the biotechnology, 31(3), 233stage as production 239. platforms for biopharmaceutical proteins. Shan Q, Wang Y, Li J, Gao C. Virology, 433(1), 1-6. (2014): Genome editing in rice and wheat using the http://www.clontech.com/xxclt_i CRISPR/Cas system. Nat bcGetAttachment.jsp?cItemI Protocols 9, 2395-2410. d=100247.Mei 2013. Sprink T, Metje J, Hartung F. http://www.ecologise.in/2016/03 (2015): Plant genome editing /13/crispr-is-coming-withby novel tools: TALEN and big-implications-for-foodother sequence specific farmers-consumers-andnucleases. Current Opinion in nature/. 13 Maret 2016 Biotechnology 32, 47-53.

Ledford, H. (2015): CRISPR, the Todaka D, Shinozaki K, & disruptor. Nature, 522(7554), Yamaguchi-Shinozaki K. 20-24. (2015): Recent advances in the dissection of droughtLedford, H. (2016): Riding the stress regulatory networks CRISPR Wave. Nature, and strategies for Daftar Pustaka 531(7593), 156-159. development of droughttolerant transgenic rice Araki M & Ishii T. (2015): Towards Lusser M, Parisi C, Plan D, plants. Frontiers in plant social acceptance of plant Rodriguez-Cerezo E. (2012): science, 6, 84. breeding by genome editing. Deployment of new Trends in plant science, 20(3), biotechnologies in plant Schinkel H & Schillberg S. (2016): 145-149. breeding. Nat Biotech 30, Genome editing: intellectual 231-239. property and product Baulcombe D. (2004) : RNA development in plant silencing in plants. Pennisi, E. (2013): The CRISPR biotechnology. Plant cell Nature431, 356-363. craze. Science, 341(6148), reports, 1-5. 833-836. Belhaj K, Chaparro-Garcia A, Waltz E. (2016): Gene-edited Kamoun S, Nekrasov V. Puchta H, Fauser F. (2013): Gene CRISPR mushroom escapes (2013): Plant genome editing targeting in plants: 25 years US regulation. Nature News, made easy: targeted later. The International 532, 293. mutagenesis in model and Journal of Developmental crop plants using the Biology 57, 629-637. CRISPR/Cas system. Plant Qaim, M, & Zilberman, D. (2003): Methods 9, 39. Yield effects of genetically modified crops in developing Hartung F, Schiemann J. (2014): countries. Science, 299(5608), Precise plant breeding using 900-902. new genome editing techniques: opportunities, 36

CAS9: CARATERBARUUNTUK MEMUKUL JATUH GEN"

Recommend Documents