C YANG DIINDUKSI VAKSIN HEPATITIS B

MEKANISME IMUNOMODULATOR EKSTRAK BUAH MENGKUDU (Morinda citrifolia, L.) PADA MENCIT BALB/C YANG DIINDUKSI VAKSIN HEPATITIS B THE IMMUNOMODULATORY MECHANISM EXTRACT OF MENGKUDU (Morinda citrifolia, L.) FRUIT ON MICE BALB/C INDUCED BY HEPATITIS B VACCINE Ediati Sasmito 1, Nunung Yuniarti 2, dan CJ. Soegihardjo3 Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta

1,2,3)

ABSTRAK Mengkudu (Morinda citrifolia), yang telah diketahui mempunyai aktivitas imunomodulator, di dalam buahnya terdapat beberapa senyawa kimia, diantaranya adalah protein, polisakarida, skopoletin, damnakantal, prokseronin dan prokseroninase. Senyawa-senyawa tersebut mempunyai kelarutan dan aktivitas yang berbeda. Ada beberapa pendapat yang berbeda mengenai efek jus buah mengkudu terhadap sel-sel hati dan adanya beberapa kasus yang dilaporkan bahwa pemberian vaksin hepatitis B dapat menyebabkan efek samping yang menuju terjadinya penyakit auto-imun. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian terhadap mekanisme imunomodulator ekstrak n-heksana (EH), ekstrak kloroform (EK), dan ekstrak air (EA) buah mengkudu terhadap respon imun dan sel-sel hati pada mencit yang diinduksi dengan vaksin hepatitis B. Sejumlah mencit (umur ± 12 minggu, bobot ± 20g) yang telah dibagi dalam kelompok I, II, III, IV dan V (@ 6 ekor), berturut-turut diberi peroral dengan EH, EK, EA (masing-masing dengan konsentrasi 5%, 10%, 20% dan 30% dalam 0,5% larutan tween 80), kontrol pelarut (air+tween 80 = AT), dengan volume pemberian 0,5 mL/20g bobot mencit, selama dilakukan penelitian (53 hari). Semua mencit diinduksi dengan vaksin hepatitis B, 3 kali yaitu pada hari ke 7, 35 dan 49. Pengambilan darah dilakukan melalui plexus retroorbitalis, berturut-turut untuk penetapan jumlah IgM (hari ke 14), IgG (hari ke 21) dengan ELISA tak langsung dan penetapan kadar SGPT (hari ke 53) dengan metode GPT-ALAT. Pada hari ke 53 semua mencit dikorbankan untuk diisolasi sel limfosit (uji proliferasi dengan metode MTT reduction), dan hati untuk uji hepatotoksisitasnya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa mekanisme imunomodulator ekstrak buah mengkudu, terutama optimal pada EH 10%, dapat meningkatkan jumlah IgM, IgG, menurunkan kadar SGPT, memperbaiki kerusakan sel-sel hati, tetapi tidak dapat meningkatkan proliferasi sel limfosit. Kata kunci: mengkudu, vaksin hepatitis B, imunomodulator, hepatoseluler, SGPT ABSTRACT Morinda citrifolia L., especially the fruit contains of protein, polysaccharide, scopoletin, damnacanthal, proxeronine and proxeroninase. All those of active compounds, soluble in different solvents and have different activities. Since there were some reports concerning with M. citrifolia fruit juice effect on hepatocellular and several case reports that hepatitis B immunization may caused adverse effect to new cases, could shift the immune system encouraging the expression of auto-immune diseases. Due to these reports, the aim of our study was to evaluate the immunomodulatory mechanism of the n-hexane (HE), chloroform (CE) and aqueous (AE) extract of M. citrifolia, L. fruit and the effect on hepatocellular of mice. To the groups of mice (group I,II,III,IV and V), which were induced by hepatitis B vaccine three times at d 7, d 35 and d 49, treated p.o. with HE, CE and AE extract of M. citrifolia fruit (concentration of 5%; 10%; 20% and 30% in 0.5% tween 80); 0.5% tween 80 as solvent control through out of the study (53 days). We further determined the level of IgM (serum d 14) and IgG (serum d 21) by indirect ELISA, the level of GPT-serum (d 53) by GPT-ALAT method and then all the mice were sacrificed for isolation the lymphocyte (proliferation assay by MTT reduction method), and the liver (histopathological pattern by histological-microscopic photograph).The result of the study can be concluded that the immunomodulatory mechanism of M. citrifolia extracts, especially the 10% n-hexane extract, were, increased the level of IgM and IgG, decreased the level GPT-serum, repaired the histopathological of the liver, but did not influence the proliferation of lymphocyte cells. Key words: Morinda citrifolia, L., hepatitis B vaccine, immunomodulatory, hepatocellular, GPT-serum

PENDAHULUAN Mengkudu (M. citrifolia) merupakan tanaman yang sudah tidak asing lagi bagi masyarakat Indonesia. Buah mengkudu banyak mengandung protein, polisakarida, skopoletin, asam askorbat, prokseronin dan prokseroninase (Sjabana dan Bahalwan, 2002). Dilaporkan oleh Furuzawa, et al.(2003) senyawa polisakarida dalam jus buah mengkudu mempunyai potensial sebagai profilaktik maupun terapetik sebagai imunomodulator terhadap system tumor sarcoma 180. Ada beberapa laporan penelitian yang berbeda mengenai efek jus mengkudu terhadap sel-sel hati (hepatoseluler). Dilaporkan oleh Stadlbauer et al. (2005), bahwa terjadi 2 kasus hepatotoksisitas setelah mengkonsumsi Noni juice, akan tetapi dilaporkan oleh West et al. (2006), bahwa Noni juice tidak menyebabkan terjadinya hepatotoksisitas Imunomodulator adalah suatu senyawa yang dapat mempengaruhi sistem imun humoral maupun seluler. Ada 2 tipe imunomodulator, yaitu imnostimulator (meningkatkan sistem imun) dan imunosupresor (menekan sistem imun). Beberapa senyawa yang terkandung dalam suatu tanaman mempunyai efek imunostimulator (misal polisakarida dalam Aloe vera, dan proteoglikan dalam Ganoderma lucidum, dapat meningkatkan aktivitas limfosit (Tan and Vanitha, 2004) atau mempunyai efek imunosupresor (misal alkaloid tetrandrin dalam Stephania tetrandra S.Moore, mempunyai potensi untuk autoimmune diseases, khususnya rheumatoid arthritis (Lai, 2002). Telah diteliti oleh Hirazumi dan Furuzawa (1999), Adanya aktivitas anti tumor dengan model LLC (Lewis lung carcinoma) buah mengkudu, disebabkan oleh adanya aktivitas sistem imun hospes. Dilaporkan pula oleh Ediati dkk. (2004), bahwa jus mengkudu (kadar 0,625%) dapat meningkatkan proliferasi sel limfosit, tetapi tidak meningkatkan jumlah antibodi dalam kultur yang diberi vaksin hepatitis A. Dari penelitian tentang senyawa yang terdapat dalam buah mengkudu (Iglesias, 2005), skopoletin dapat digunakan untuk anti-artritis (anti-inflamasi), prokseronin yang dalam tubuh membebaskan

kseronin, dapat memperbaiki kerusakan sel. Adanya dosis yang kurang dan waktu konsumsi yang tidak tepat (dianjurkan setengah jam sebelum makan pagi atau supper), dapat menyebabkan efesiensi yang rendah. Hasil penelitian yang dikemukakan oleh Forbes (1999) dan Ascherio et al. (2001), bahwa pemberian vaksin hepatitis B dapat menyebabkan reaksi yang berbalikan, yaitu terjadi Sudden Infant Death Syndrome (SIDS), multiple sclerosis, lupus, Guillain-Barre Syndrome, myelitis dan optic neutritis, serta dapat terjadi disfungsi sistem imun, misal chronic arthritis Dari beberapa pernyataan yang telah dikemukakan, maka dilakukan penelitian untuk mengetahui mekanisme imunomodulator ekstrak buah mengkudu dan efeknya terhadap hepatoseluler mencit yang diinduksi dengan vaksin hepatitis B. METODOLOGI PENELITIAN Bahan Buah mengkudu tua, tetapi belum masak, diambil dari daerah Sleman, Yogyakarta (dicuci, diiris tipis, dikeringkan, dibuat serbuk) untuk bahan ekstrak, n-heksana dan kloroform p.a.(E.Merck), mencit Balb/c (LPPT-UGM), kit reagen ELISA untuk IgM dan IgG (Sigma), reagen MTT [3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide] (E.Merck), medium Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 (Sigma), penisilin, streptomisin, fungizon, fetal bovine serum (FBS), bahan uji hepatotoksisitas, vaksin hepatitis B (Glaxo), kit reagen GPT-ALAT (Diasys, Germany), dan akuades. Alat Inkubator CO2 (Heraeus), mikroplat 96 dan 24 sumuran (Nunc), hemositometer (Nebaeur) ELISA reader , sentrifus (Sorfall MC, 12V, Dupont), sentrifus berpendingin (IEC Centra 7R), Eppendorf tubes, laminar airflow hood (Labquib), inverted microscope (Olympus), vaccum rotary evaporator, hemositometer (Nebaeur), timbangan Sartorius, mikropipet (Eppendorf), timbangan Sartorius, dan alatalat gelas disterilkan yang lazim digunakan di laboratorium.

Jalannya Penelitian a. Pembuatan ekstrak n-heksana, kloroform, dan air buah mengkudu Serbuk kering buah mengkudu, 300g, berturut-turut dimaserasi dengan n-heksana, kloroform dan air panas. Masing-masing hasil maserasi diuapkan dengan vaccum rotary evaporator sampai kental dan tidak berbau pelarut, kemudian dilarutkan dalam 0,5% tween 80, sampai diperoleh konsentrasi 5%, 10%, 20%, dan 30%. b. Pemberian bahan uji pada mencit 0,5 mL/hari/20 g BB mencit, p.o. Pemberian vaksin hepatitis B: Suspensi 0,052 mcg/125uL/20gBB mencit, per intraperitoneal c.Penetapan jumlah IgM, IgG dan SGPT Sampel darah yang diambil pada hari ke 14 (IgM), ke 21 (IgG), dan ke 53 (SGPT), melalui plexus retroorbitalis dengan pipa kapiler berheparin. Sampel darah didiamkan 1 jam, disentrifugasi dengan pendinginan, kemudian dipisahkan serumnya untuk penetapan jumlah IgM dan IgG dengan ELISA tak langsung dengan kit reagen siap pakai untuk IgM/IgG dan SGPT secara spektrofotometri dengan kit reagen siap pakai dengan metode GPT-ALAT. d.Uji proliferasi sel limfosit dengan metode MTT reduction (Anonim,2003): Masing-masing 100 µL/sumuran suspensi sel limfosit dengan kepadatan 1,5x106/mL dalam medium RPMI komplit (RPMI+10% FBS+ penisilin+streptomisin+fungizon), dimasukkan ke mikroplat 96 sumuran, diinkubasi 48 jam, ditambahkan 10 µL/sumuran MTT 5 mg/mL, diinkubasi pada suhu 37°C, selama 4 jam. Reaksi dihentikan dengan reagen stopper,

larutan10% SDS dalam asam klorida 0,01 N sebanyak 100 µL/sumuran. Selanjutnya dibaca OD-nya dengan ELISA reader pada λ 550 nm. e.Pengamatan hepatoseluler: Dilakukan dengan metode histological microscopic photograph dan pengecatan hematoxylin-eosin, untuk melihat apakah terdapat perubahan pada sel hati, setelah induksi 3x vaksin hepatitis B dan pemberian perlakuan dengan ekstrak buah mengkudu selama 53 hari, dibanding dengan kontrol normal (tanpa perlakuan). f.Analisis Hasil : Data kuantitatif yang diperoleh, dievaluasi secara statistik yang melibatkan semua kelompok perlakuan. Analisis statistik yang digunakan adalah analisis non-parametrik yaitu uji Kruskall Wallis dan dilanjutkan dengan uji Mann Whitney taraf kepercayaan 95% (p≥0,05≤). HASIL DAN PEMBAHASAN Produk antibodi (IgM dan IgG) setelah diinduksi dengan vaksin hepatitis B sebanyak 3 kali, yaitu berturut-turut pada hari ke 7, ke 35 dan ke 49, dan pemberian ekstrak buah mengkudu, ditetapkan jumlahnya dengan metode ELISA tak langsung, menggunakan kit reagen siap pakai. Sampel darah diambil dari plexus retro orbitalis mencit dengan pipa kapiler berheparin pada hari ke 14 (7 hari setelah pemberian vaksin I, untuk IgM), hari ke 21 (14 hari setelah pemberian vaksin I, untuk IgG). Pengambilan sampel disesuaikan dengan kurva produksi antibodi dalam Seehan (1997), seperti pada Gambar 1.

O

L

AT

30 % NT R

20 %

KO

EA

EA

5%

10 % EA

EA

30 % EK

20 % EK

10 %

5%

EK

EK

30 % EH

EH

EH

EH

20 %

10 %

700 600 500 400 300 200 100 0 5%

Kelompok Perlakuan

Gambar 1 : Kurva produksi antibodi respon imun primer dan sekunder (Seehan, 1997)

Rata-rata ± SD

Kelompok Perlakuan

Gambar 2 : Grafik rata-rata nilai OD ± SD penetapan jumlah IgM (serum hari ke 14) dengan metode ELISA tak langsung terhadap pemberian perlakuan EH, EK , dan EA serta kontrol AT pada mencit Balb/c yang diinduksi vaksin hepatitis B

2500 2000 1500 1000 500

30 % EA 5% EA 10 % EA 20 % E KO A 3 0 N TR % O L A T

EK

20 %

EK

10 %

5%

EK

EK

30 %

EH

20 %

10 %

EH

EH

EH

5%

0

Rata-rata ± SD

Gambar 3 : Grafik rata-rata nilai OD ± SD penetapan jumlah IgG dengan metode ELISA tak langsung terhadap pemberian perlakuan EH, EK, dan EA serta kontrol AT pada mencit Balb/c yang diinduksi vaksin hepatitis B (serum hari ke 21, 14 hari setelah pemberian vaksin I)

30 % EA 5 EA % 10 % EA 20 E % KO A 3 0 N TR % O L A T

20 %

EK

10 %

EK

5%

EK

30 %

EK

20 %

EH

10 %

EH

EH

EH

5%

Kelompok Perlakuan

600 500 400 300 200 100 0

Rata-rata±SD

Gambar 4 : Grafik rata-rata nilai OD ± SD penetapan proliferasi limfosit dengan metode MTT reduction terhadap pemberian perlakuan EH, EK, dan EA serta kontrol AT pada mencit Balb/c yang diinduksi vaksin hepatitis B (diisolasi pada hari ke 49; 4 hari setelah pemberian vaksin III)

Hasil penetapan jumlah IgM dengan metode ELISA tak langsung, diberikan dalam bentuk grafik pada Gambar 2. Dari grafik (Gambar 2) dapat diketahui bahwa kelompok perlakuan EH 10%, dengan uji statistik Mann-Whitney, secara signifikan (p<0,05),dapat meningkatkan jumlah IgM paling besar dibanding dengan semua dosis antar kelompok EH dan semua kelompok perlakuan yang diberikan. Hal ini menunjukkan bahwa dalam ekstrak n-heksana terdapat senyawa aktif yang mampu meningkatkan produksi IgM. Dari senyawa kimiawi yang terkandung dalam buah mengkudu, beberapa senyawa tersebut bersifat non polar (misal golongan alkaloid yaitu skopoletin dan kseronin). Senyawa aktif yang berperan belum dapat dilaporkan, karena penelitian ini dilakukan dalam 2 tahap. Isolasi dan identifikasi senyawa aktif tersebut akan dilakukan pada penelitian tahap ke II. Hasil penetapan jumlah IgG dengan metode ELISA tak langsung diberikan dalam bentuk grafik pada Gambar 3 (untuk hari ke 21, 14 hari setelah pemberian vaksin I). Dari grafik (Gambar 3), dapat diketahui bahwa jumlah IgG hari ke 14, dengan pemberian

perlakuan EH 10% paling tinggi diantara kelompok perlakuan EH dan kelompok perlakuan lainnya, juga terhadap kelompok kontrol AT. Dari grafik pada Gambar 2 dan 3 dapat diketahui bahwa nilai OD jumlah IgG lebih tinggi dibanding dengan nilai OD jumlah IgM. Hal ini sesuai dengan kurva dalam Gambar 1 (Seehan, 1997), bahwa IgM akan diproduksi paling awal setelah ada paparan antigen, kemudian dalam waktu 3-4 hari berikutnya akan diikuti produksi IgG yang jumlahnya lebih tinggi dan mencapai puncak pada hari ke 14. Adanya peningkatan jumlah IgM maupun IgG dalam penelitian ini, sesuai dengan hasil penelitian Hirazumi dan Furuzawa (1999), bahwa aktivitas antitumor buah mengkudu disebabkan oleh aktivitas sistem imun hospes. Dari hasil uji proliferasi sel limfosit yang dikultur selama 48 jam, dan hasilnya ditetapkan dengan metode MTT reduction, diperoleh data yang diberikan dalam bentuk grafik (Gambar 4). Data yang diperoleh berupa rata-rata OD ± SD hasil pembacaan dengan ELISA reader.

15000 10000 5000 0

EH 5 EH % 10 EH % 20 EH % 30 % EK 5 EK % 10 EK % 20 EK % 30 % EA 5 EA % 10 EA % 20 E % KO A N 30% TR O L A T

Kelompok Perlakuan

20000

Rata-rata ± SD (U/L)

Gambar 5 : Grafik rata-rata nilai OD ± SD penetapan kadar SGPT dengan metode GPT-ALAT terhadap pemberian perlakuan EH, EK, dan EA serta kontrol AT pada mencit Balb/c yang diinduksi vaksin hepatitis B (serum diisolasi pada hari ke 49; 4 hari setelah pemberian vaksin III)

Gambar 6 a : Pola hepatoseluler mencit normal (tanpa pemberian perlakuan)

Gambar 6 b : Pola hepatoseluler mencit yang diinduksi dengan 3 kali vaksin hepatitis B (hati diisolasi pada hari ke 53). Terjadi nekrosis, ditunjukkan dengan tanda panah

Gambar 6 c : Pola hepatoseluler mencit yang diinduksi dengan 3 kali vaksin hepatitis B dan pemberian EH10% (hati diisolasi pada hari ke 53), tidak terjadi nekrosis.

Dari grafik pada Gambar 4, diketahui bahwa pemberian EH, EK, maupun EA dengan berbagai konsentrasi tidak dapat meningkatkan proliferasi limfosit, karena dari semua data yang diperoleh tidak ada perbedaan yang signifikan (p>0,05%) terhadap kontrol pelarut AT. Hal ini dapat disimpulkan, bahwa di dalam EH, EK, dan EA buah mengkudu tidak terdapat senyawa aktif yang dapat meningkatkan proliferasi sel limfosit, namun dapat meningkatkan produksi IgM dan IgG. Menurut Ediati dkk. (2004), jus buah mengkudu dapat meningkatkan proliferasi limfosit, tetapi tidak dapat meningkatkan jumlah antibodi dalam kultur yang diberi vaksin hepatitis A. Dalam hal ini, dapat dimengerti, bahwa dalam jus buah mengkudu, terdapat hampir semua senyawa yang terkandung dalam buah mengkudu, tetapi ada beberapa senyawa yang tidak terdapat dalam ekstrak n-heksana buah mengkudu. Hasil penetapan kadar SGPT diberikan dalam bentuk grafik pada Gambar 5. Kadar SGPT kontrol AT relatif tinggi dibanding dengan kadar SGPT dari EH, EK, dan EA. Hal ini menunjukkan, bahwa induksi dengan vaksin hepatitis B sebanyak 3 kali dalam waktu 42 hari, tanpa pemberian ekstrak buah mengkudu, dapat menimbulkan kerusakan sel-sel hati, yang dapat dikorelasikan dengan pola hepatoseluler pada Gambar 6a (tidak terjadi nekrosis) dan 6b (terjadi nekrosis), yang menyebabkan peningkatan kadar SGPT. Dengan pemberian EH 10% dapat terlihat adanya penurunan kadar SGPT yang signifikan (p<0,05) dibanding dengan kontrol

AT, yang dapat dikorelasikan dengan pola hepatoseluler pada Gambar 6c. Dari pola hepatoseluler Gambar 6c tidak terdapat nekrosis, yang sesuai dengan pola hepatoseluler (Gambar 6a) mencit normal. Hal ini dapat diasumsikan dalam EH 10%, terdapat senyawa aktif yang dapat memperbaiki kerusakan sel-sel hati, sesuai dengan yang dikemukakan Iglesias (2005) . KESIMPULAN Mekanisme imunomodulator ekstrak buah mengkudu (M. citrifolia), terutama optimal pada ekstrak n-heksana 10%, dapat meningkatkan jumlah IgM, IgG, menurunkan kadar SGPT, dan dapat memperbaiki sel-sel hati pada mencit yang diinduksi 3 kali dengan vaksin hepatitis B dalam waktu 42 hari. UCAPAN TERIMAKASIH Disampaikan pada Dir.Jen.DikTi, Dep.Dik.Nas.RI, atas dana penelitian yang diberikan lewat program Desentralisasi Penelitian Fundamental No.: LPPMUGM/563/2007. Juga diucapkan terima kasih pada Aden, Amri, Angkie, Candra, Emil, Jeffri, Kris, Heru, dan Lala, atas bantuan teknis yang diberikan.

DAFTAR PUSTAKA Anonim, 2003, Protocols MTT Assay, available at, file://A:\MTT Assay.htm, diakses Nopember 2004. Ascherio, A., Zhang, SM., Hernan, MA., Olek, M., Coplan, K., Brodovicz, and Walker, A., 2001, Hepatitis B vaccination and the risk of multiple sclerosis, N Engl J Med ., 344: 327-32 Ediati S., Sri Mulyaningsih, dan Fajar Novianharti, 2004, Uji Aktivitas Imunostimulator Jus buah Mengkudu (Morinda citrifolia L.) terhadap Vaksin hepatitis A secara in vitro, Prosiding, Seminar Nasional dan Pra Kongres PBBMI, ISBN 979-96008-1-2 Forbes, B.,1999,You Can Avoid KillerVaccine,The Tribune/Thompsons Newspaper, Sunday, Februari 7, 1999. Furuzawa, E., Hirazumi, A., Story, S., and Jensen, J., 2003, Antitumor potential of a polysaccharide-rich substance from the fruit juice of Morinda citrifolia (Noni) on sarcoma 180 ascites tumour in mice, Phytother Res., 17(10):1158-1164. Hirazumi, A. and Furuzawa, E., 1999, An immunomodulatory polysaccharide-rich substance from the fruit juice of Morinda citrifolia (noni) with antitumor activity, Phytother Res. Aug;13(5):380-7 Iglesias, C., 2005, World Data Research Center, yang diakses dari CubaNow.net, www.wdrc.cubaresearch.inf, 24 April 2005. Lai, JH., 2002, Immunomodulatory effects and mechanisms of plant alkaloid tetrandrine in autoimmune diseases, Acta Pharmacol Sin, Dec; 23(12): 1093-1101 Seehan C., 1997, Clinical Immunology, Principle and Laboratory Diagnosis 2nd Ed, Lippincott, Philadelphia, New York : 26 Sjabana, D. dan Bahalwan, R.R., 2002, Seri referensi herbal: Mengkudu, Penerbit Salemba Medika, Jakarta. Stadlbauer, V., Fickert, P., Lackner, C., Schmerlaib, J., Krisper, P., Trauner, M.,and Stauber, RE., 2005, Hepatotoxicity of Noni juice : Report of two cases, World J Gastroenterol, August 14;11(30):4758-60 Tan, B.K.H. and Vanitha, J., 2004, Current Medicinal Chemistry; 11: 1423-1430 West, BJ., Jensen, CJ., and Westendorf, J., 2006, Noni juice is not hepatotoxic, World J Gastroenterol, June 14; 12(22): 3616-19

Alamat korespondensi Bagian Kimia Farmasi,Fakultas Farmasi UGM Yogyakarta E-mail : [email protected]