7
Enzymový imunologický test pro stanovení koncentrace pyridinových můstků (PYD) v lidské moči Pro in vitro diagnostické použití
RYCHLÝ NÁVOD K PROVEDENÍ STANOVENÍ 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Přidejte 50 µl zředěných (1:10) standardů, kontrol a vzorků. Přidejte 100 µl studeného enzymového konjugátu Nechte inkubovat v temnu 3 hodiny ± 10 minut při teplotě 2-8°C Propláchněte 3-krát promývacím pufrem 1X Přidejte 150 µl roztoku pracovního substrátu o teplotě 20-28°C. Nechte inkubovat 60 ± 5 minut při teplotě 20-28°C. Přidejte 100 µl ukončovacího roztoku a odečtěte hodnotu optické hustoty při 405 nm.
heparinová nebo kortikosteroidní terapie. Dalšími onemocněními, které se projevují abnormální kostní přestavbou jsou Pagetova choroba a karcinomy 3 s metastázemi na kostech. U stanovení Metra™ PYD byla k získání monoklonální protilátky, která 11 vykazuje specificitu vůč i PYD, použita technologie protilátek. Specificita monoklonální protilátky použité v stanovení Metra PYD umožňuje jednoduché, praktické, reprodukovatelné a přímé stanovení koncentrace PYD a DPD v moči.
PRINCIP Metra PYD je konkurenční enzymová imunochemická reakce probíhající formou mikrotitru na proužku, při které se k měření koncentrace PYD a DPD v moči používá monoklonální protilátka proti pyridinovým m ůstkům. PYD a DPD ve vzorku soutěží o protilátku s PYD naneseným na proužku. Reakce je detekována pomocí pNPP substrátu. Hodnoty stanovené pomocí testu Metra PYD jsou korigovány pomocí kreatininu, aby byla zohledněna koncentrace vzorku v moči.
DODANÝ MATERIÁL A REAGENCIE 96 testů pro stanovení koncentrace pyridinových můstků Souprava Metra PYD EIA obsahuje:
POUŽITÍ Metra™ PYD je test lidské moči ke stanovení koncentrace vylouč ených pyridinových můstků, jakožto ukazatele resorpce kolagenu typu I, zvláště pak kostního kolagenu.
SHRNUTÍ A VYSVĚTLENÍ Přibližně 90% organické kostní matrix př edstavuje kolagen typu I, protein s 1 trojitou šroubovicí. Kostní kolagen typu I je sesíťovaný specifickými molekulami, které poskytují pevnost a houževnatost. Sesítění zralého kolagenu typu I v kostech tvoří pyridinové můstky pyridinolin (PYD) a 1,2 deoxypyridinolin (DPD). PYD a DPD se tvoří enzymatickým působením 3 lysyl oxidázy na aminokyselinu lysin. Do cirkulace jsou uvolňovány během 2-5 procesu resorpce kostní tkáně . Pyridinové mů stky jsou vylučovány močí 6 v nemetabolizované podobě a nejsou závislé na typu stravování , tudíž jsou vhodné ke diagnostice resorpce. V kostech se neustále odehrává metabolický proces zvaný remodeling – 2,7 přestavba kosti. Tento proces zahrnuje degradaci – resorpci (vstřebávání) kostní tkán ě –zprostředkovanou činností osteoklastů a 2,7 stavební proces – tvorbu kostí – zprostředkovaný činností osteoblastů. Remodeling je potřebný pro udržování a celkové zdraví kostí a jeho dvě fáze jsou tě sně svázané. To znamená, že vstřebávání a tvorba kostí jsou v rovnováze. U abnormálního kostního metabolizmu se provázání těchto dvou fází kostní přestavby poruší. Když pak resorpce převýší tvorbu 7 dochází k čisté ztrátě kostní hmoty. Stanovení specifických produktů degradace kostní matrix pak poskytuje analytické údaje o míře kostního 2,4,5 metabolizmu. Osteoporóza je metabolické kostní onemocnění charakterizované abnormální přestavbou kostí. Jde o systémovou kostní chorobu charakterizovanou řídkou kostní hmotou a mikroarchitektonickým chátráním 8 kostní tkáně s následnou zvýšenou náchylností ke zlomeninám. Nejběžnější typ osteoporózy se vyskytuje u žen v postmenopauze a je zapříčiněn nedostatkem estrogenu v důsledku ukončení činnosti vaje 7 čníků. Obnova množství estrogenu typického pro období před menopauzou pomocí substituční terapie zabraňuje ztrátě kostní hmoty a 7-9 osteoporóze. Estrogeny a skupina sloučenin známá jako bisfosfonáty představují antiresorpční terapie, které lze využít k prevenci ztráty kostní 7-10 hmoty nebo k léčbě osteoprózy. Osteoporóza může rovněž být výsledkem vytvoř ení neadekvátní maximální kostní hmoty během období rů stu. Jedná se o nerovnováhu přestavby kostí související s věkem, kdy dochází k čisté převaze resorpce. Osteoporózu můžou rovněž zapř íčinit četné klinické stavy a terapie, které vyvolávají ztrátu kostní hmoty nebo 7 nerovnováhu přestavby kostí. Patří sem endokrinní onemocnění jako např. hypogonádizmus, hypertyroidizmus, hyperparatyroidizmus a hyperkortisolizmus, dále také choroby zažívacího traktu související s výživou a metabolizmem minerálů, onemocnění pojivových tkání, vícečetné myelomy, chronická nepohyblivost, alkoholizmus nebo kouření a chronická
A B C D E F
Pyridinolinové standardy položky 4251 - 4256 po 0,3 ml A = 0, B = 15, C = 40, D = 100, E = 250, F = 750 nmol/l PYD PYD purifikovaný z lidské moči v kyselině fosforečné 10 mmol/l s azidem sodným (0,05%) jako konzervačním prostředkem.
Vysoká/nízka kontrola
položky 4257, 4258
po 0,3 ml
L PYD purifikovaný z lidské moči v kyselině fosforečné 10 mmol/l s H azidem sodným (0,05%) jako konzervačním prostředkem.
Potažené proužky položka 4668 po 12 ks PYD purifikovaný z hovězí kosti adsorbovaný na proužkových zásobnících. Ukončovací roztok 1N NaOH
položka 4702
15 ml
10X Promývací pufr položka 4703 55 ml Neiontový detergent v pufrovém roztoku obsahující azid sodný (0,05%) jako konzervační prostředek. Pufr pro stanovení položka 4704 55 ml Neiontový detergent v pufrovém roztoku obsahujícím azid sodný (0,05%) jako konzervační prostředek. Substrátový pufr položka 4705 3 x 10 ml Roztok dietanolaminu a chloridu horečnatého obsahující azid sodný (0,05%) jako konzervační prostředek. Substrátové tablety p-nitrofenyl fosfát
položka 0012
3 x 20 mg
Enzymový konjugát položka 4250 po 3 ks Lyofilizovaná myší monoklonální protilátka proti pyridinovým m ůstkům konjugovaná s alkalickou fosfatázou s obsahem pufrových solí a stabilizátorů. Kryt na proužky položka 0047 po 3 ks
MATERIÁL DODÁVANÝ ZVLÁŠŤ Mikropipety na 50-300 µl Pomůcky vhodné k měření objemu v rosahu 7-300 ml Nádobka na ředění promývacího pufru Zkumavky na ředění vzorků, standardů a kontrol Deionizovaná nebo destilovaná voda Snímač proužků schopný snímat při vlnové délce 405 nm Software pro aproximaci kalibrační křivky se 4 parametry Hodnoty kreatininu (mmol/l) pro vzorky moči
UPOZORNĚNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ
SKLADOVÁNÍ
1. Pro in vitro diagnostické použití. 2. Se vzorky nakládejte, jako by byly potenciálně infekční. Při práci se
Soupravu skladujte při teplotě 2–8°C. Nepoužité reagencie skladujte při teplotě 2–8°C. Promývací pufr 1X skladujte (10X ředěný) při teplotě 0-28°C.
3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
10. 11. 12. 13. 14.
15. 16.
všemi komponenty a vzorky od pacientů se řiďte obecnými pravidly bezpečnosti práce. Nádoby a jejich nepoužitý obsah likvidujte v souladu s federálními, státníma a místními předpisy. Dodané reagencie použijte jako ucelenou soupravu před datem expirace vyznačeném na štítku na obalu. Reagencie skladujte v souladu s uvedenými pokyny. V případě že je sáček propíchnutý, potažené proužky nepoužívejte. Každý vzorek stanovte dvojmo. 1N NaOH má korosivní účinek a může způsobit vážné popáleniny. Nepožívejte. Zamezte kontaktu s kůží, očima a oblečením. Zasažené místo opláchněte vodou. Po požití vyhledejte lékaře. Jako konzervační prostředek byl použit azid sodný. Náhodné požití nebo kontakt s pufrem obsahujícím azid sodný může způsobit podráždění kůže, očí a úst. Pufry používejte pouze k určenému účelu a zamezte kontaktu s kyselinami. Azid sodný může reagovat s olovem nebo mědí za vzniku vysoce výbušných azidů kovů. Likvidovaný materiál proto spláchněte větším množstvím vody, aby se zabránilo nahromadění azidu. K zajištění včasného přísunu reagencií doporučujeme použít pipety s více kanálky nebo opakovací pipetovací přístroj. Aby stanovení vzorků proběhlo správně je třeba přidávat přesné množství vzorku a standardu. Pipetujte pečlivě a používejte pouze kalibrované příslušenství. Vzorky s koncentraci přesahující 750 nmol/l rozřeďte v pufru pro stanovení a stanovení opakujte. Zřeďovací poměr zahrňte do závěrečného výpočtu. Pro toto stanovení bylo schváleno ruční promývání. Pokud není možné udržet teplotu místnosti na 20-28°C a absorbance > 2,0 se neshoduje s Vaším snímačem proužků, sledujte vývoj substrátu v zásobnících standardu A. Reakci ukončete, když optická hustota dosáhne 1,2-1,5. Pak odečtěte proužky. Standardy a kontroly jsou v roztoku kyseliny fosforečné 10 mmol/l. Zabraňte styku s kůží, očima a oblečením. Nepožívejte. Zasažené místo opláchněte vodou. Po požití vyhledejte lékaře. Pyridinolinové standardy, kontroly, potažené proužky a vzorky moči jsou citlivé na světlo. Nevystavujte dlouho světlu, zejména přímému a nepřímému slunečnímu záření. Nepoužívané reagencie skladujte v temnu. Na vzorky a reagencie nemá významný vliv běžné umělé laboratorní světlo, pokud je s nimi nakládáno v souladu s Postupem stanovení.
PŘÍPRAVA REAGENCIÍ Promývací pufr – viz poznámka k postupu v části POSTUP STANOVENÍ Zředěním koncentrovaného promývacího pufru 10X (viz tabulka v části POSTUP STANOVENÍ) v poměru 1:10 deionizovanou vodou připravte požadované množství promývacího pufru 1X. Skladujte při teplotě 20– 28°C. Promývací pufr 1X spotřebujte do 21 dní od přípravy.
Pokyny pro speciální promývání: Podle výše uvedeného postupu připravte promývací pufr 1X a do doby použití skladujte při teplotě 28°C.
Enzymový konjugát Enzymový konjugát př ipravte nanejvýš 2 hodiny před použitím. Každou ampulku enzymového konjugátu rekonstituujte (viz tabulka) pomocí
7 ml chladného pufru pro stanovení. Rekonstituovaný enzymový konjugát skladujte do doby použití při teplotě 2-8°C.
Roztok pracovního substrátu Před zahájením stanovením je tř eba nechat substrátový pufr ustálit na teplotě 20-28°C. (Doporučuje se po dobu dvou hodin nebo až přes noc.) Roztok pracovního substrátu připravte nejvýše 1 hodinu před použitím. Do každé lahve se substrátovým pufrem o teplotě 20–28°C vložte po jedné substrátové tabletě (viz tabulka). Tablety nechte rozpouštět 30-60 minut. Lahve důkladně protřepejte, aby se obsahem dokonale promíchal.
ODEBÍRÁNÍ A SKLADOVÁNÍ VZORKŮ Stanovení Metra PYD je možné provést za použití první ranní (FMV) nebo druhé ranní (SMV) moči sesbírané bez konzervačních prostředků. Průběžně sbíranou moč (např. při hodnocení změn v resorpci) je třeba sbírat každý den v přibližně stejnou hodinu. Vzorky moči skladujte v chladu při teplot ě 2 -8°C př i skladování kratším 7 dnů, při delším skladování zmrazte na teplotu ≤ - 20°C. Vzorky opakovaně nerozmrazujte a nezmrazujte více než 3-krát. Zamezte delšímu působení světla, zejména pak slunečního záření. Během obvyklého zpracování nemá běžné laboratorní světlo na vzorky žádný vliv.
POSTUP STANOVENÍ Před zahájením stanovení si přečtěte celý návod. Před uskutečněním testu si přečtěte PŘÍPRAVU REAGENCIÍ. POZNÁMKA K POSTUPU: Stanovení Metra DPD je citlivé na způsob promývání. Celý promývací krok je třeba ukončit do 2 minut. Pokud promývání nelze ukončit do 2 minut, řiďte se Pokyny pro speciální promývání v částech PŘÍPRAVA REAGENCIÍ a Promývání.
Podle počtu proužků, které budete používat stanovte potřebné množství jednotlivých reagencií. Počet proužků Počet vzorků (stanovených dvojmo) Enzymový konjugát (ampulka) Substrát (láhev) Promývací pufr 1X (ml)
4 8 1 1 100
6 16 1 1 150
8 24 2* 2* 200
12 40 2* 2* 300
* Při použití více než jedné lahve nebo ampulky před použitím smíchejte jejich obsah a důkladně promíchejte.
Inkubace vzorků/enzymového konjugátu 1. Vzorky, standardy a kontroly zřeďte v poměru 1:10 pufrem pro stanovení (např. 50 µl vzorku + 450 µl pufru pro stanovení).
2. Vyjměte ze sáčku stojánek s proužkovými zásobníky a požadovaný 3. 4. 5.
6.
7.
počet potažených proužků (Viz tabulka). Sáček obsahující nepoužité proužky poté důkladně uzavřete. Požadovaný počet potažených proužků vložte do zásobníkového stojánku. Proužky označte, aby při jejich náhodném uvolnění ze stojánku nedošlo k jejich záměně. Do každého zásobníku potažených proužků přidejte 50 µl zředěného standardu, kontroly nebo vzorku. Tento krok je třeba ukončit do 30 minut. Enzymový konjugát připravte nejvýše 2 hodiny před použitím. Každou požadovanou ampulku (viz tabulka) enzymového konjugátu rekonstituujte pomocí 7 ml pufru pro stanovení. Do doby použití skladujte enzymový konjugát při teplotě 2-8°C. Do každého zásobníku přidejte 100 µl rekonstituovaného enzymového konjugátu. Proužky přikryjte dodaným krytem. Nechte inkubovat 2 hodiny (± 5 minut) při teplotě 2-8°C. Tento inkubační krok provádějte v temnu. Roztok pracovního substrátu připravte nejvýše 1 hodinu před použitím. Do každé lahve se substrátovým pufrem o teplotě 20–28°C vložte po jedné substrátové tabletě (viz tabulka). Tablety nechte 30-60 minut rozpouštět. Lahve řádně protřepejte, aby se obsah dokonale promíchal.
Promývání 8. Zředěním koncentrovaného promývacího pufru 10X v poměru 1:10
deionizovanou vodou připravte požadované množství promývacího pufru 1X (viz tabulka). Proužky ručně obraťte/vyberte (z kroku 6). Do každého zásobníku přidejte alespoň 250 µl promývacího pufru 1X a proužky ručně obraťte/vyberte. Postup ještě dvakrát zopakujte, aby promývání proběhlo celkem třikrát. Po posledním promytí nechte proužky důkladně oschnout na papírových utěrkách. Když jsou pružky otočené, opatrně otřete spodek proužků papírovým ručníkem co nepouští chloupky, aby byl spodek těchto proužků čistý.
Inkubace substrátu 9. Do každého zásobníku přidejte 150 µl roztoku pracovního substrátu. 10. Nechte inkubovat 60 minut (± 5 minut) při teplotě 20-28°C. Ukončení/Odečtení 11. Do každého zásobníku přidejte 100 µl ukončovacího roztoku.
Ukončovací roztok přidávejte stejným způsobem a ve stejných časových intervalech jako roztok substrátu. 12. Odečtěte optickou hustotu při 405 nm. V zásobnících nesmí být žádné větší bublinky a spodek proužků musí být čistý. Proužky je nutno odečíst do 15 minut od přidání ukončovacího roztoku. 13. Výsledky testu Metra PYD zpracujte pomocí softwaru určujícího koncentraci pomocí rovnice aproximace kalibrační křivky se 4 parametry. Rovnice: y = (A-D)/(1 + (x/C)^B) + D
14. Koncentraci vzorků a kontrol odečtěte z kalibrační křivky. 15. Kontrolní hodnoty by měly být v rámci rozmezí uvedeném na certifikátu analýzy dodaném se soupravou.
KONTROLA KVALITY Certifikát analýzy přiložený k této soupravě je specifický pro danou šarži a slouží k ověření, zda jsou výsledky naměřené ve vaší laboratoři obdobné jako výsledky získané ve společnosti Quidel. Uvedené jsou hodnoty optické hustoty a mají sloužit pouze jako vodítko. Výsledky stanovené vaší laboratoři se mohou lišit. Rozmezí hodnot pro kontrolu kvality jsou rovněž uvedena. Kontrolní hodnoty mají sloužit ke kontrole správnosti křivky a hodnot naměřených ve vzorku. Každá laboratoř si má určit vlastní parametry přijatelného rozmezí výsledků stanovení. Pokud se kontrolní hodnoty nachází MIMO přijatelného rozmezí určeného vaší laboratoří, výsledky stanovení je nutné pokládat za nevěrohodné a stanovení vzorku je třeba opakovat. Pokud je hodnota optické hustoty standardu A stanovení Metra PYD nižší než 0,8, výsledky stanovení je nutné pokládat za nevěrohodný a stanovení vzorku je třeba opakovat.
VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ Výsledky získané pomocí testu Metra DPD je tř eba upravit o rozdíly v koncentraci moči, a to podělením hodnoty DPD (nmol/l) hodnotou kreatininu (mmol/l) pro každý vzorek (kreatinin mg/dl x 0,088 = mmol/l). Konečný výsledek bude vyjádřený v nmol DPD/mmol kreatininu.
Typická kalibrační křivka Standardní koncentrace PYD: 0, 15, 40, 100, 250, 750 nmol/l
1.6 Optical Density (405 nm)
Pokyny pro speciální promývání: Postupujte podle výše uvedených bodů za použití studeného (2-8°C) promývacího pufru 1X. Po posledním promytí nechte proužky sušit 5-10 minut na papírovém ručníku než přidáte substrát.
1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0
1
10
100
1000
PYD (nmol/L)
OMEZENÍ METODY Test Metra PYD se používá k indikaci vstřebávání kolagenu typu I, zejména kostního kolagenu, není ale určen k předpovědi vývoje osteoporózy nebo náchylnosti ke zlomeninám. Tento test není rovněž určen k použití v menopauze, při Pagetově kostním onemocnění, primárním hyperparatyroidizmu a hypertyroidizmu. Vedle výše uvedených onemocnění a stavů můžou být výsledky testu zmatené i u pacientů s postižením, které působí na vstřebávání kostního kolagenu jako jsou metastázy na kostech. Výsledky stanovení Metra PYD je třeba interpretovat v souvislosti s klinickým nálezem a ostatními diagnostickými výsledky.
HODNOTY NAMĚŘENÉ VE VZORCÍCH Referenč ní rozmezí testu Metra PYD byla stanovena pomocí vzorků od zdravých mužů (n = 118) a zdravých žen před menopauzou (n = 301) ve věku od 25 let. Definice zdravého jedince pro účely stanovení referenčních rozmezí je: • V zásadě zdravý člověk bez onemocnění kostí a bez endokrinní nebo chronické choroby • U žen pravidelný menstruační cyklus • Netěhotná a nekojící žena (ženy) • Osoba, která v současnosti neužívá žádné léky o kterých se ví, že ovlivňují kostní metabolizmus (např. kortikosteroidy, analogy GnRH, antikonvulziva, heparin, léky na štítnou žlázu) Naměřené hodnoty můžou být ovlivněny skutečnostmi jako jsou nízká produkce estrogenu, nízký přísun vápníku, nedostatečná fyzická aktivita, nebo chorobami, které ovlivňují metabolizmus kostí jako jsou osteoporóza, Pagetova choroba, hyperparatyroidizmus, hypertyroidizmus a metastázy na kostech. Nedostatek estrogenu u žen v postmenopauze může způsobit zvýšené vstřebávání kostní tkáně. K interpretaci výsledků u žen v postmenopauze se doporu čuje použít referenční rozmezí odpovídající období před menopauzou. Každá laboratoř by si měla vytvořit vlastní normální referenční rozmezí. Rozmezí jsou vyjádřena jako neparametrické referenční intervaly (90% interval spolehlivosti). Střední Standardní Rozmezí Pohlaví hodnota odchylka (nmol/mmol) (nmol/mmol) (nmol/mmol) Ženy 16,0 - 37,0 25,5 7,5 Muži 12,8 - 25,6 18,5 4,4 Očekávaná variabilita výsledk ů jednoho jednotlivého jedince byla stanovena ze vzorků mo či od 49 zdravých osob (26 žen před menopauzou a 23 mužů) odebíraných pět dní (nejdoucích po sobě) v rámci dvou týdnů. Průměr podélné variace u jednotlivých jedinců byl 15%. Variabilitu výsledků různých jedinců se odráží ve výše uvedených neparametrických referenčních intervalech.
ZNAKY METODY
KLINICKÉ STUDIE
Specificita protilátek
K hodnocení koncentrace pyridinových můstků získané pomocí testu Metra PYD byly provedeny klinické studie. První studie se uskutečnila na klinických výzkumných pracovištích na 52 vzorcích od zdravých dobrovolníků a 138 vzorcích od pacientů se známým kostním onemocněním (osteoporózou, osteoporózou vyvolanou léky, Pagetovou chorobou, hyperparatyroidizmem a hypertyroidizmem). Tyto choroby se často pojí s nadměrným vstřebáváním kostního kolagenu v období odběru vzorků. V rámci studie bylo stanovení Metra PYD porovnáno s hodnotami naměřenými pomocí výzkumné metody vysokoúč inná kapalinová 12 chromatografie (HPLC). Prahové množství pro HPLC metodu bylo stanoveno ve studii, která zahrnovala 84 zdravých jedinců, a to 50 nmol/mmol pro muže a 60 nmol/mmol pro ženy (95% horní hranice intervalu spolehlivosti pro každé pohlaví). Sto jeden z 138 pacient ů s diagnostikovaným onemocněním kostí neměl při měření metodou HPLC hodnoty PYD zvýšené. Hodnoty koncentrace pyridinových můstků PYD se u zdravých jedinců pohybovaly od 13,7 do 49,4 nmol/mmol a u nemocných to bylo 9,8 až 135,9 nmol/mmol. K definování optimální relativní citlivosti a specificity v uvedeném souboru byla aplikována metoda ROC (receiver operating characteristic) za použití zvýšeného množství PYD určené pomocí HPLC jakožto klasifikační metody. Relativní citlivost a specificita jsou uvedeny v tabulce 1. Relativní citlivost a specificita jsou v tabulce 3. V kontingenční tabulce dvě na dvě je uveden počet jedinců v každé klasifikační skupině (tabulka 1). Tabulka 1 Metra PYD
100% 100% < 2,5%
Citlivost Minimální množství PYD zjistitelné pomocí testu Metra PYD je 7,5 nmol/l, určené horním limitem 3 standardních odchylek v studii přesnosti s nulovým standardem.
Zpětná výtěžnost – zpětná výtěžnost s přídavkem Zpětná výtěžnost s přídavkem byla stanovena přidáním známého množství purifikovaného PYD do vzorků moči s různým množstvím endogenního PYD. Charakteristické výsledky jsou uvedeny níže. Vzorek
Endogenní (nmol/l)
Přídavek (nmol/l)
1 2 3
16,7 71,0 141,0
68,2 68,2 68,2
Naměřená hodnota (nmol/l) 84,1 140,8 215,5
Zpětná výtěžnost (%) 99 102 109
Zpětná výtěžnost - linearita Linearita byla určena sériovým řed ěním vzorků a porovnáním naměřených hodnot s hodnotami očekávanými. Charakteristické výsledky jsou uvedeny níže. Vzorek
Poměr ředění
1
čistý 1:2 1:4 1:8 čistý 1:2 1:4 1:8 čistý 1:2 1:4 1:8
2
3
Naměřená hodnota (nmol/l) 261,6 127,8 59,9 31,1 382 183,2 90,4 57,9 412,3 199,0 98,2 47,8
Očekávaná hodnota (nmol/l) 130,8 65,4 32,7 191,0 95,5 57,1 206,2 103,1 54,5
Zpětná výtěžnost (%) 98 92 95 96 95 95 96 95 98
Přesnost Přesnost v rámci stanovení byla určena pro 52 replikátů ze 3 vzorků na 1 proužku z každé ze 3 šarží souprav (celkem 3 proužky). Přesnost mezi jednotlivými stanoveními byla určena pro 3 vzorky stanovené na 8 samostatných proužcích z každé ze 3 šarží souprav (celkem 24 proužků). Hodnoty naměřené v níže uvedených vzorcích představují rozmezí hodnot v nmol/l. Pro ženu s koncentrací kreatininu 5,0 mmol/l, vzorky 1-3 odpovídají spodní normální, horní normální a zvýšené resorpci (13,2 nmol/mmol, 32,0 nmol/mmol a 81,4 nmol/mmol, v uvedeném pořadí).
PYD (nmol/l) 66 160 407 1
n = 52
Variační koef v rámci 1 stanovení % 9,9 7,0 6,6 2
n = 8 testů
Variační koef. mezi 2 stanoveními % 11,2 5,8 3,9
Relativní citlivost Specificita
84% 82%
Obr. 1 HPLC PYD Zvýšené Nezvýšené
Metra PYD
Volný PYD Volný DPD PYD/DPD peptidy ≥ 1000 mol. hm.
+ –
+
–
38
26
7
119
V druhé studii byly hodnoty naměřené pomocí testu Metra PYD porovnány v rámci smíšeného souboru 39 vzorků od zdravých jedinců a 99 vzorků od pacientů s Pagetovou chorobou. I když Pagetova choroba představuje model pro identifikaci aktivní kostní resorpce, někteří z pacientů z tohoto výzkumu podstupovali léčbu, nebo se mohli nacházet v remisi, a nemuseli mít v č ase odběru vzorků zvýšené kostní resorpci. V rámci této studie se zdraví jedinci pohybovali v rozmezí 12,8 až 33,2 nmol/mmol a pacienti s Pagetovou chorobou v intervalu 14,4 to 667,6 nmol/mmol. K definování optimální relativní citlivosti a specificity v daném souboru byla použita metoda ROC za použití Pagetovy choroby jakožto klasifikační metody. Relativní citlivost a specificita je uvedena v tabulce 2. Na obr. 2 je kontingenční tabulka dvě na dvě. Tabulka 2 Metra PYD Relativní citlivost Specificita
89% 95%
Obr. 2 Pagetova choroba Ano Ne + – Metra PYD
Monoklonální protilátka proti pyridinovým můstkům vykazuje selektivní, vysokou afinitu vůči volným PYD a DPD a zanedbatelné vázání na peptidy PYD a DPD. % Reaktivita
+
88
2
–
11
37
ODKAZY 1. Seyedin SM, Rosen DM. Matrix Proteins of the Skeleton.
Covered by U.S. Patent Nos. 5,620,861, 5,700,694, 6,121,002, and 5,283,197.
Curr.Opin.Cell Biol. 1990;2:914-919.
2. Delmas PD. Biochemical markers for the assessment of bone
3. 4.
5.
6. 7. 8. 9.
10. 11. 12.
13.
turnover. In: Riggs BL, Melton LJ,III (eds): Osteoporosis: etiology, diagnosis, and management. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, 1995, pp. 319-333. Seibel MJ, Robins SP, Bilezikian JP. Urinary pyridinium crosslinks of collagen: specific markers of bone resorption in metabolic bone disease. Trends Endocrinol.Metab. 1992;3:263-270. Delmas PD, Schlemmer A, Gineyts E, Riis B, Christiansen C. Urinary excretion of pyridinoline crosslinks correlates with bone turnover measured on iliac crest biopsy in patients with vertebral osteoporosis. J.Bone Miner.Res. 1991;6:639-644. Eastell R, Colwell A, Hampton L, Reeve J. Biochemical markers of bone resorption compared with estimates of bone resorption from radiotracer kinetic studies in osteoporosis. J.Bone Miner.Res. 1997;12:59-65. Colwell A, Russell RG, Eastell R. Factors affecting the assay of urinary 3-hydroxypyridinium crosslinks of collagen as markers of bone resorption. Eur.J.Clin.Invest. 1993;23:341-349. Riggs BL. Overview of osteoporosis. West.J.Med. 1991;154:63-77. Consensus Development Statement. Who are candidates for prevention and treatment for osteoporosis? Osteoporos.Int. 1997;7:16. The Writing Group for the PEPI Trial. Effects of hormone therapy on bone mineral density: results from the postmenopausal estrogen/progestin interventions (PEPI) trial. JAMA 1996;276:13891396. Chesnut CH,III, McClung MR, Ensrud KE, et al. Alendronate treatment of the postmenopausal osteoporotic woman: Effect of multiple dosages on bone mass and bone remodeling. Am.J.Med. 1995;99:144-152. Gomez B Jr, Ardakani S, Evans BJ, et al. Monoclonal antibody assay for free urinary pyridinium cross-links. Clin.Chem. 1996;42:1168-1175. Pratt DA, Daniloff Y, Duncan A, Robins SP. Automated analysis of the pyridinium crosslinks of collagen in tissue and urine using solid-phase extraction and reversed-phase high-performance liquid chromatography. Anal.Biochem. 1992;207:168-175. Centers for Disease Control. Recommendations for prevention of HIV transmission in health-care settings. MMWR 1987;36 (suppl no. 2S):001.
TECHNICKÁ PODPORA S objednávkou, nebo žádostí o technickou podporu, se, prosím, obraťte na zástupce firmy Quidel na čísle 800-524-6318 nebo 408-616-4301, od pondělí do pátku mezi 8:00 a 17:00 (tichomořské časové pásmo). Objednávky lze také faxovat na číslo 408-616-4310. Mimo území Spojených států Vám služby poskytne Váš místní prodejce.
KATALOGOVÉ Č. REF 8010 – Metra™ PYD EIA Kit
AUTORIZOVANÝ ZÁSTUPCE Quidel Deutschland GmbH Betrieb Marburg Emil-v.-Behring-Straße 76 Gebäude M 213 35041 Marburg
QUIDEL CORPORATION Worldwide Headquarters 10165 McKellar Court San Diego, CA 92121 USA www.quidel.com
BIOVENDOR LABORATORNÍ MEDICÍNA A.S. Karásek 1767/1, 621 00 Brno, Česká republika Tel: 549 124 111
[email protected] www.biovendor.cz 0315J (2003/11)
