Buněčný cyklus, onkogeny a nádorové supresory

Buněčný cyklus, onkogeny a nádorové supresory

Barbora Fialová, Jan Bouchal a Jiří Ehrmann Laboratoř molekulární patologie LF UP http://lmp.upol.cz

Přehled 1) Rozdělení buněčného cyklu, jeho iniciace a vlastní mechanismus 2) Proliferace, diferenciace 3) Průtokový cytometr 4) Onkogeny, aktivace onkogenů a jejich funkce 5) Nádorové supresory

Buněčný cyklus (BC) • základní mechanismus rozmnožování všech buněk organismu • evolučně konzervovaný proces všech eukaryotických buněk • studium mechanismů kontroly BC je středem velkého zájmu

• Nobelovy ceny za medicínu (2001) • Hartwell – objasnil systém regulace BC • Nurse - objevil cyklin-dependentní kinázy (Cdk) = enzymy, které

fosforylují podřízené proteiny cyklu • Hunt - popsal první cyklin jako regulační protein nutný pro enzymovou aktivaci Cdk

Buněčný cyklus ovlivňuje kontakt buňky s okolím přítomnost mitogenních signálů změny stavu jaderné membrány a chromatinu

Rozdělení aktivit buňky do buněčných fází

Buněčný cyklus  Časové trvání všech fází dohromady = délka buněčného cyklu nebo

generační doba buňky

 G1 fáze časově nejvariabilnější  S + G2 + M fáze časově konstantní

Interfáze (G1 + S + G2)

transkripce genů a syntéza proteinů

buňka roste (zvětšuje většinu buněčných struktur) replikace DNA (dvojnásobné množství)

Profáze  kondenzace chromozomů  vznik mitotického aparátu tvořeného mikrotubuly

Prometafáze rozpad jaderného obalu přechod mikrotubulů do jádra připojení mikrotubulů ke

kinetochorům (tělísko v místě centromery chromatid)

Metafáze a anafáze

posun chromozomů do ekvatoriální roviny

oddělení chromatid a

posun k opačným pólům buňky

Telofáze

dekondenzace chromozomů rekonstrukce jaderného obalu

Regulace a kontrolní body BC

restrikční bod G1 kontrolní body G2/M • molekula p53 • centrum pro organizaci mikrotubulů (MTOC)

 poruchy vzniklé při replikaci, distribuci genetického materiálu → vážné následky pro buňku a organismus → zpětnovazebná kontrola vnitřními mechanismy buňky

Aktivace fází BC  zahájení a průběh fází BC - řízenou aktivací katalytických komplexů cyklin/Cdk  cykliny A- I, K, T – proteiny podílející se na průběhu fází BC  Cdk – cyklicky aktivované proteinkinázy – regulace akumulací a degradací cyklinu  Cdk 1-12, strukturální a hmotnostní podobnost

 Cdk aktivní pouze v komplexu s cyklinovou podjednotkou  syntéza či destrukce příslušných cyklinů v určitých fázích BC → aktivita komplexů cyklin/Cdk → regulace přechodu G1-S-G2 fáze

Regulace aktivity cyklin/Cdk správný průběh jednotlivých fází BC závisí na několika klíčových faktorech • typ cyklinů

• regulace transkripce a translace • posttranslační modifikace • cyklin/Cdk – katalyticky aktivní pouze v dané fázi BC

Regulace aktivity cyklin/Cdk • řízení exprese jejich složek a ubikvitin-dependentní degradaci cyklinové podjednotky • tvorba a rozpad komplexů katalytických podjednotek Cdk s cykliny

• posttranslační modifikace komplexů cyklin/Cdk (fosforylace, defosforylace) • inhibice Cdk specifickými polypeptidovými inhibitory

Regulace aktivity cyklin/Cdk Vliv přirozeně se vyskytujících proteinových inhibitorů: 1. inhibitory třídy INK4 (p15, p16, p18, p19)  přísně specifická pro cyklin D-dependentní kinázy Cdk4 a Cdk6  spojována s řízením G1 fáze 2. inhibitory třídy CIP/KIP (p21, p27, p57)  přednostně inhibují Cdk v G1 a S fázi  schopnost inhibovat i ostatní Cdk

p21: - blokování interakce komplexu se substrátem - tvorba také stimulována p53 po detekci poškození DNA - spojovací článek mezi p53 a pRb

Proliferační kinetika vs. tumorigeneze • buňky proliferují, jsou-li stimulovány signály okolních buněk, nedostanou-li tyto signály, vstupují do G0 fáze • kontrola proliferace, diferenciace a apoptózy buněk je úzce spjata s procesem onkogeneze • většina nádorových buněk obsahují mnohočetné genetické změny podporující proces tumorigeneze • proliferační schopnost buněk - proteiny PCNA, Ki-67 • morfologické zhodnocení diferencovanosti

• analýza průtokovým cytometrem • upřesnění diagnózy a výběr terapie

Stanovení množství DNA pomocí průtokového cytometru

Stanovení množství DNA pomocí průtokového cytometru stanovení S fáze buněčného cyklu je důležitým ukazatelem proliferační aktivity nádoru

Onkogeny

Onkogeny  objeveny díky retrovirům nesoucím virové analogy lidských onkogenů  základy teorie o existenci onkogenů datovány do r. 1911 → Rous: přenosný sarkom u kuřat (Rous Sarcoma Virus - RSV)  RSV - RNA virus (retrovirus) - reverzní transkriptáza - virus inkorporovaný do DNA hostitele = provirus

Onkogeny

 Nádory → výsledkem mutací → buňky nereagují na regulační faktory buněčného dělení a přežívání→ schopnost proliferovat bez normálních zábran

• Poruchy diferenciace • Inaktivace apoptózy • Aneuploidie

Protoonkogeny a normální růst buňky Protoonkogeny (PO) =tvoří normální vybavení genomu = kódují proteiny řídící proliferaci diferenciaci přežívání buněk

= mutací přeměněny na onkogeny (somatická buňka - přes 100 různých PO)

Onkogeny = všechny aktivní geny schopné způsobit či podpořit nádorovou transformaci = mutací se zvýší aktivita nebo množství proteinových produktů = onkoproteinů

Onkogeny  Celulární (c-onc) = geny vznikající aktivací protoonkogenů

 Virální (v-onc) = geny virů zodpovědné za maligní transformaci • RNA viry – retroviry (HIV-1, HIV-2, lidské lymfotropní viry typu I) • DNA onkoviry – kódují proteiny, které interagují s nádorovými supresory (adenoviry, papilomaviry, herpes viry, HBV)

Aktivace onkogenů  Mutace = zvýší aktivitu anebo množství onkoproteinu (kvantitativní změny exprese onkogenu) = syntéza onkoproteinu se změněnou funkcí (kvalitativní změny)  Téměř vždy dominantní – stačí aktivace 1 alely protoonkogenu • Fúzní proteiny s nepřirozenou regulací

• Spontánní dimerizace a aktivace nezávislá na ligandu • Trvalá aktivace (delece oblasti s negativní regulační funkcí)

Mechanismus aktivace onkogenů  Bodová mutace – záměna nukleotidu vedoucí ke změně pořadí AMK (př. geny rodiny ras: vliv na vazbu produktů k proteinu GAP)

 Amplifikace – zmnožení genu, prokázána v četných nádorech (př. N-myc v neuroblastomu)

 Translokace – přesuny ovlivňující expresi nebo funkci protoonkogenů (př. během připojení c-myc ke genům pro syntézu Ig - Burkittův lymfom)

 Transdukce – implantace protoonkogenu do virového genomu → vysoká exprese transdukovaného genu → vliv na homeostázu buněk (př. akutně transformující retroviry, RSV)

 Inzerční mutageneze – vložení retrovirových promotorů a enhancerů do genomu hostitelské buňky, do blízkosti protoonkogenu (př. c-myc, c-erbB)

Funkce c-onc 1.

Transkripční regulační faktory (Myc, Fos, Jun)

2.

Proteinkinázy (intracelulární - IC a transmembránové - TM) a receptory růstových faktorů (Src, Abl, Erb)

3.

Růstové faktory (Int, Sis)

4.

Signální transduktory (Ras)

5.

Inaktivující nádorové supresory (MDM2, E6, E7)

6.

Blokující apoptózu (= antiapoptotické, Bcl-2)

1. Onkogeny kódující transkripční regulační faktory Jaderné onkoproteiny - vazba na DNA - imortalizační aktivita  myc 

klíčový gen pro kontrolu proliferace a diferenciace



6 členů; jen u proliferujících buněk s ↑ proliferačním potenciálem

 funguje

jako - promotor replikace DNA - regulátor přechodu z fáze G0 do G1 - regulátor buněčné proliferace

 fos, jun 

časné geny indukované růstovými faktory a hormony



vazba na promotory různých genů = regulace proliferace, apoptózy, angiogeneze



c-jun – za normál. podmínek neindukuje transformaci, teprve porucha regulace jeho exprese → nádorová transformace

2. Onkogeny kódující proteinkinázy a receptory růstových faktorů  src  rodina

 abl

onkogenů, kódují jen IC proteinkinázy s tyrosin-specifickou aktivitou  aberace vedoucí k vyšší kinázové aktivitě = stimulují nádorový růst u mnoha typů buněk homolog – transformuje sekvence v-abl Abelsonova viru myší leukemie (retrovirus s defektní replikací transformující fibroblasty na lymfoidní buňky)

 buněčný

 erb

erbA, erbB onkogeny viru ptačí erytroblastózy  erbB je homologní s částí EGFR (receptor pro epidermální růstový 

faktor)



c-erbB-2 identický s HER2/neu – kóduje receptor pro růstový faktor

podobný EGFR  amplifikace HER2/neu – u 30 % případů nádorů prsu

3. Onkogeny kódující růstové faktory  Int 

aktivuje se integrací myším onkovirem



u karcinomů mléčné žlázy

 kóduje

proteiny rodiny fibroblastického růstového faktoru (FGF)

 Sis 

opičí sarkomový virus izolovaný z fibrosarkomu



odvozen od genu pro PDGF (destičkový růstový faktor)



silný mitogen mezenchymálních buněk

4. Onkogeny kódující signální transduktory  Ras 

rodina onkogenů, každý kóduje polypeptid - onkoprotein p21 (21 kD)



vazba p21ras k GTP = aktivní forma, je regulována GAP proteiny (GAP pomocí enz. GTPázy konvertují p21ras na neaktivní GDP vázající proteiny)



po aktivaci proteiny p21ras stimulují buněčné dělení



aktivní p21ras → komplexy s produkty raf genu → aktivace raf stimuluje MAPK dráhu → fosforylace a aktivace transkripčních faktorů fos a jun (signální dráha ras-raf-MAP-fos+jun)



mutantní ras onkogeny nehydrolyzují GTP→ trvale aktivní → onkogenní proces



cca 15 % nádorů (karcinomů, sarkomů, melanomů, leukemií) obsahuje mutovaný c-ras

5. Onkogeny inaktivující nádorové supresory  E6, E7 

součást genomu onkogenních HPV (lidský papilomavirus)



jejich produkty vytváří komplexy s p53 a pRB = inaktivace

 imortalizace

buněk → nádorový růst

 MDM-2 

nadměrná exprese onkoproteinu → nádorová transformace buněk (téměř totéž jako mutace p53)



udržuje hladinu p53 na nízké úrovni a inhibuje jeho transkripční aktivitu



po vazbě na p53 → zablokování jeho transkripční domény → stimulace degradace p53



zpětnovazebný vztah s p53

6. Onkogeny blokující apoptózu (= anti-apoptotické)  Rodina Bcl-2 

mají vztah k buněčné smrti, ne k proliferaci



jeho produkt je homologní s produkty genů viru EB

 chrání

buňky před zánikem - apoptózou → podpora vývoje nádoru či selhání terapie př. Folikulární lymfomy

Hormonálně dependentní nádory (Ca mléčné žlázy, prostaty, vaječníku) 

nadměrná exprese Bcl-2 – rezistence buněk vůči apoptóze → nádorový růst

Rodina proteinů Bcl-2 • klasifikace podle počtu společných domén (BH1-4)

• tvorba hetero a homodimerů

Geny kódující nádorové supresory

Nádorové supresory = tumor suprimující geny – kódují proteiny kontrolující BC, ztráta jejich funkce – zodpovědná za změněný fenotyp nádorové buňky  antionkogeny

 „pojistky“ buněčného cyklu  brání abnormální proliferaci a přenosu poškozené genetické informace  inaktivace, dysfunkce → ztráta kontrolních mechanismů → transformace buněk  v somatických i zárodečných buňkách  mutace recesivního charakter - nutný defekt obou alel = ztráta heterozygotnosti fenotypu (Loss of heterozygosity – LOH)

Identifikace antionkogenů identifikovány později než onkogeny obtížnější než u onkogenů (vnesení antionkogenu do normální buňky = prakticky nepozorovatelné) cytogenetické studium vrozených chromosomálních změn u pacientů s nádorem analýza vedoucí k lokalizaci genů zodpovědných za predispozici k tvorbě určitého typu nádorů studie sledující LOH nebo ztráty alel při srovnávání normální a nádorové tkáně

Přehled nádorových supresorů  p53  pRb  NF-1

 NF-2  APC  WT-1

 PTEN  BRCA 1, 2  p16

INK4

p53 (STRÁŽCE GENOMU)  tumor supresorový gen lokalizovaný na chromozomu 17p13.1  tetramerová struktura (53 kD),

4 strukturně-funkční domény  transkripční jaderný faktor regulující stovky genů (uplatňují se při blokaci BC a apoptóze)  konstitutivně exprimován, přesto je jeho hladina v normální buňce nízká  nádorové buňky - exprese p53 nezměněna  regulován pomocí degradace (MDM2-E3-ubiquitinligázou, přičemž transkripce MDM2 je řízena p53 = zpětnovazebná autoregulační smyčka)

Aktivace a funkce p53  závisí na povaze stresového signálu  nutriční stres, poškození DNA, aktivace onkogenů… → blok replikace poškozené DNA (blok BC) → blok angiogeneze → aktivace DNA reparačních genů → nenávratné poškození DNA vede k apoptóze mutace p53 → replikace poškozené DNA → rezistence vůči apoptóze → nádorový růst

Inaktivace p53  ~ 21.000 mutací (somatické i germinální buňky) = ztráta schopnosti interakce s cílovou sekvencí  50 % všech nádorů zahrnuje mutace p53 (inaktivace obou alel genu → karcinomy plic, tlustého střeva, mléčné žlázy)  90 % mutací u karcinomu kůže  80 % bodových mutací a 20% zlomů

 inaktivace zvýšenou expresí MDM2 i virovými onkoproteiny - adenovirální protein E1B - protein E6 lidského papilomaviru

- velký T-antigen viru SV

„Wild type“ p53

Mutovaný p53

Detekce p53  imunohistochemie  Western blot analýza  „wild type“ p53 – nestabilní  mutovaný p53 – stabilní – možnost detekce

Příklad western blot analýzy exprese proteinu p53

pRb    

     

první objevený nádorový supresor (1986) protein retinoblastomu (pRb) - maligní nádor retiny 40 % případů familiárních a 60 % sporadických familiární forma = vrozený defekt 1 alely pRb ve všech buňkách organizmu → k rozvoji nádoru defekt druhé alely v jakékoliv buňce (LOH) sporadická forma = obě mutace v jedné buňce abnormální exprese produktu pRb – i u jiných typů nádoru (př. osteosarkom) jaderný fosfoprotein, kontrola transkripce genů regulujících BC více než 10 fosforylačních míst regulace vstupu do S fáze buněčného cyklu inaktivace → význam pro celou řadu lidských nádorů

Regulace pRb  nefosforylovaná forma pRb = aktivní → blokuje přestup z G1 do S-fáze (antiproliferační aktivita)  hyperfosforylovaná forma pRb = inaktivní → zvýšená proliferace buněk i v nepříznivých podmínkách  komplexy i s produkty onkogenů myc → pRb snižuje jejich hladinu v buňce  nepřítomnost

funkčního pRb → uvolnění kontrolních bodů

buněčného cyklu → snadný přechod do S-fáze

NF1, NF2  NF1 – neurofibromatóza typu 1  kóduje protein neurofibromin → negativní regulátor p21ras •

defekty → mnohočetné benigní neurofibromy kůže, kožní hyperpigmentace, abnormality skeletu, feochromocytom (nádor dřeně nadledvin) aj.

 NF2

produkt merlin tvoří komplexy s aktinem a CD44  zárodečná mutace – autozomálně dominantní dědičnost 

•



defekty → oboustranný neurinom akustiku

somatické mutace •

defekty → gliomy, meningiomy aj.

APC  zděděná mutace APC – familiární adenomatózní polypóza (FAP) tračníku → vznik mnohočetných polypózních adenomů s vysokým potenciálem malignizace •

defekty → kolorektální karcinom, karcinom pankreatu, desmoidy, hepatoblastom

 funkční protein degradací ß-kateninu reguluje diferenciaci a množení buněk  mutace vedou ke vzniku stop kodonů či posunům čtecího rámce  dominantní chování – k projevům dochází i při mutaci jedné alely ! ( = haploinsuficience – heterozygotní stav, kdy normální alela nestačí plnit přirozenou inhibiční funkci)

WT1, PTEN  WT1 – Wilmsův nádor ledvin 

produkt působí jako tkáňově specifický regulátor transkripce genů řídících dělení buněk



defekty → uplatňuje se během embryonálního vývoje močového ústrojí

 PTEN (Phosphatase and TENsin homologue)

kooperace se signálními drahami p53 a pRb defekty → četné nádory v pokročilých stádiích vývoje (glioblastomy, melanoblastomy, ca prsu, prostaty, ovarií aj.)

BRCA1 a BRCA 2 funkční produkty se podílejí na opravách zlomů v DNA a regulaci

transkripce mutace: poruchy oprav DNA → zvýšená genetická nestabilita → nádorová transformace defekty BRCA 1 (Breast carcinoma 1)  zděděná mutace jedné alely → predispozice a familiární výskyt karcinomu mléčné žlázy, ovaria a pravděpodobně prostaty a tlustého střeva defekty BRCA 2 (Breast carcinoma 2)  navíc predispozice ke ca pankreatu a hrtanu

p16INK4  inhibitor Cdk 4 a 6 → blok BC  v nádorech často gen deletován

nebo hypermetylován promotor  defekty: 

maligní melanom - rodinný výskyt



ca jícnu, pankreatu, žaludku



nemalobuněčné ca plic



glioblastom, sarkom aj.

Význam onkogenů a nádorových supresorů v histopatologii  Detekce produktů onkogenů, supresorových genů, antimetastatických genů • poznatky o dráhách vedoucí ke vzniku nádorů • prognóza onemocnění • nejvhodnější způsob terapie • případná cílená genová terapie (př. antisence)

Laboratoř molekulární patologie LF UP

www.ustavpatologie.upol.cz