THE WALL
• Buněčná stěna lépe vystihuje svébytnost suchozemských rostlin než plastidy a fotosyntéza. • Je aspektem celé rostlinné buňky, ani syntéza celulózy se nedá pojmout jako jednoduchá enzymatická reakce. • 7 funkcí buněčné stěny.
• Plasticita vs. elasticita
Od Hooka k "atomic force microscopy"(F) (E) - izolovaný HGA(homogalakturonan) 400nm.
Simpson AG and Roger AJ (2004) The real 'kingdoms' of eukaryotes. Curr Biol 14:R693-6.
Aerobní amoeboflagelát s mitochondriemi = cenancestor
tj. Po „neomurální“ revoluci nezávislý vznik a zánik stěn.
murein (Science: protein) cross linked peptidoglycan complex from the inner cell wall of all eubacteria. Constitutes 50% of the cell wall in gram-negative and 10% in gram-positive organisms and comprises _(1-4) linked N acetyl glucosamine and N acetyl muramic acid extensively cross linked by peptides.
NAM = kys. N-acetyl muramová
EVO-DEVO a buněčná stěna
Stěna 2004
Listový houbový parenchym
korunní plátek hledíku
tracheida = xylem
listový trichom
Složky buněčné stěny • Kalóza • Celulóza • Hemicelulózy (zvl. XyG a GAX, MGL) • Pektiny (HG, RG-I a -II) • Extensiny, AGPs, GRPs
kalóza celulóza
zbytek stěn. polymerů
Stěny I. a II. typu
I. – bohaté pektiny a proteiny; hemicelulózy=xyloglukany II. – chudé dtto; hemicelulózy=glukuronoarabinoxylany, bohaté křížové vazby přes fenolické molekuly – diferulát.
• Buněčná diferenciace u rostlin = velmi často diferenciace ve složení b. stěny.
Buňky mají na svém povrchu specializované mikrodomény Buněčné Stěny =CW • Př. Epidermální buňka
Povrch listu
Vnitřek listu
AGP spec. pro kortex
AGP spec. pro vaskul.a epid.
zel.: Met-pektin žlut.:deesterif.pekt.
OVES kořen – A a B Arabidopsis stonek – C, různě modifikované pektiny v téže buňce.
Perikarp rajčete JIM5 protilátka = deesterifikovaný pektin
Metody chemické analýzy b. stěny - mimořádně náročné
= Poměrné zast. cukrů.
Při analýze struktuty polysach. jsou nejprve modif. volné –OH skupiny – methyljodidem.
Dnes je velmi populární neinvazivní Fourierova transformační infračervená (FTIR) mikrospektroskopie, která je schopna kvantitativně detekovat řadu substituentů (př. karboxyl.kys., estery, fenoly, amidy…)
Co všechno tam je? a z čeho??
uridin di-fosfo glukóza = UDPG
Stavební kameny stěny
SuSy – dodává UDPG pro syntézu celulózy i kalózy
C1 – anomerní uhlík (karbonyl)
Mlatóza je redukující c.
Sacharóza je neredukjící c.
bio-Chemie cukrů
• Glycosidic Bonds
Kalóza - Zrození stěny
FRAGMOPLAST
Kalosa na počátku (i na konci) β-1,3-glukan
Kalosa syntázy
CalS je blízce příbuzná β-1,3,glukan syntáze kvasinky
• CalS1 shares high sequence homology with the wellcharacterized yeast beta-1,3-glucan synthase and transgenic plant cells over-expressing CalS1 display higher callose synthase activity and accumulate more callose. • The callose synthase complex exists in at least two distinct forms in different tissues and interacts with phragmoplastin. UDP-glucose transferase, Rop1 and, possibly, annexin. • There are 12 x CalS isozymes in Arabidopsis, and each may be tissue-specific and/or regulated under different physiological conditions responding to biotic and abiotic stresses.
UGT - UDP-glukoso transferáza ANN - annexinu podobný protein Rop - Rho of plants SuSy - sacharoso syntáza; dodává substrát PRD - prolinem bohatá doména
Two major signaling mechanisms of eucaryotic cells
Molecular Biology of the Cell, 3rd edn, by B. Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, and J.D. Watson
Barveno "odbarvenou"(pH11) anilinovou modří - kalóza
Kalóza při rozmnožování Také meiocyty obaleny kalózou - tetrády
Celulóza • Celulóza je nejrozšířenějším bio-polymerem na zeměkouli. • Který je druhý?
Mikrofibrila celulózy asi 3 nm silná je tvořena 30 až 36 individuálními řetězci a může při počtu 14 000 glc jednotek dosáhnout délky 7um.
Cellulose higher order structure
6x6
8xTM
Terminální komplexy
Celulosa syntázy 10x u A.t. radial swelling (rsw1) - CesA1 procruste - CesA6 produkují méně celulosy a klesá anizotropie růstu mikrofibrily jsou disorganizovány, ale MT jako WT!
Konsensus katalytické cytopasmatické domény CesA
Hypot. mech. synt. celulosy Je možné, že lipidická molekula (sistosterol) může fungovat jako začátekočko?
Vedle CesA podjednotek je důležitá pro syntézu celulózy také endoglukanasa/celuláza KORRIGAN a další dosud neznámé bílkoviny např. RIC
SuSy
Pro fungování TK je třeba tří různých paralogů/podjednotek CESA. CESA 1,3 a 2/6 (I)– primární stěna CESA 4,7 a 8 (II)vysoce transkripčně koordinovány – sekundární stěna.
„Zinkový prst“ je interakční doména pro skládání TKs. Zdá se, že interakce podjednotek CESA jsou regulovány vedle fosforylací především redoxním stavem cytopl. a apoplastu.
rsw1 = cesA1 – teplotně sensitivní ts (radial swelling)
30°C V restriktivní teplotě má mutant jen 50% celulózy ve srov. s WT|
Kolokalizace MT s mikrofibrilou
Kortikální KortikálníMT MTorientují orientujíukládání ukládánímikrofibril mikrofibrilcelulosy celulosy
• Jednou z možností jak interaguje (a „drží“ se) TK mikrotubulu je konformace spojená s torzním tlakem při syntéze mikrofibrily. • Roli ovšem hrají také některé kinesiny – MTs motory
mor1 - 215kDa MAP u ts mutanta se v restriktivní teplotě rozpadají kortikální MT a dochází ke ztrátě polarity, ale mikrofibrily orientovány jako u WT.
• mor1 byl popsán nezávisle jako gem1 • mutace která vede k symetrickému dělení buněk při mikrosporové=1. pylové mitóze.
Reciprocita v uspořádávání mezi MTs a MFs!!!
Regulace TKs recyklací/endocytózou recyklací/endocytózou b. váčků
• Arabidopsis 10x CESA • Topol 18!!x CESA
Inhibitory syntézy celulózy • 2,6 – dichlorobenzonitril DCB • isoxaben
Hemicelulózy • Xyloglukany = I • Glukuronoarabinoxylany = II
Stěny I. a II. typu
I. – bohaté pektiny a proteiny; xyloglukany II. – chudé dtto; glukuronoarabinoxylany, bohaté křížové vazby přes fenolické molekuly – diferulát.
XG
(dříve hemicelulóza) – Xyloglukan endotransglykosylasy (XET – 33x u A.t.!) katalyzují „rekombinaci“ dvou molekul XG a tím rozvolnění stěny
Xyloglukan – typ I
(dříve hemicelulóza) oblasti se substitucí Ara - blok (lokálně) H můstky
Glukuronoarabinoxylany – typ II
k.ferulová
Stěny I. a II. typu MLG=mixed linkage glucans
I. – bohaté pektiny a proteiny; xyloglukany II. – chudé dtto; glukuronoarabinoxylany, bohaté křížové vazby přes fenolické molekuly – diferulát.
UV – excitace – diferulové můstky přispívají k autofluorescenci. bulliform cells
Youngest leave under the tassel.(1.) WT = 22x3.8cmADAXIAL rth1 = 12x2.5cm middle
PRICKLE HAIRS
edge
• CSL – problém topologie
CSL
glykosyltransferáza asoc.
• • • •
KATAMARI1/MUR3 lokus – duální funkce kóduje XyG galactozyltransferázu N´- interakce s aktinem (asi nepřímá) C´- XyG GT aktiv.
Aktin
8xTM
• Syntetizují hemiceluózy CSL podobně jako CESA celuózu, nebo funguje „bežící pás“ glykosyltransferáz? • CSLA je glukomannansyntáza, ale • XyG – buď CSLC nebo „bežící pás“ glykosyltransferáz?
• Klíčovými regulátory systému celulózahemicelulózy jsou xyloglukanendotransglykozylázy a expansiny.
XET xyloglukan endotransglykosylasy a
EXPANSINY
PEKTINY
Pektin RG-I
Pektin - RG-II borátový crosslink
Borátový diester – přes apiózu
Pektin - homogalacturonan Ca2+ cross-link
Zvýšená hustota vápenatých můstků – vetší tuhost stěny
Slaběji propojená doména
Pektiny
Pektiny ve stěně mohou být kovalentně propojeny.
Pektinová matrix ustavuje velikost „pórů“ ve stěně
• která může být dále modifikována např. interakcemi s AGPs (viz. dále)
Průduchy (u stěn I i II) mají zvýšený podíl fenoly esterifikovaných pektinů. po působení PME in vitro se zvětšuje apertura, zatím co feruolyl esteráza snižovala aperturu. Proto jsou také průduchy vysoce fluorescentní.
Rozdíly v metabolismu pektinů působí rozdíly tuhosti plodů Polygalakturonázy a pektolyázy Regulační fce etylénu.
Galaktomanany slouží jako zásobní polysacharidy ve stěnách endospermu – př. luštěniny, datle
Stěnové strukturní bílkoviny
Extensiny
příb. AGP (dále)
Odstranění arabinos z extensinu vede ke ztrátě tyčinkovitého tvaru.
Prolinem bohaté b. Glycinem bohaté bílkoviny !
• K hydroxylaci Pro dochází až ve stěně a koko-faktorem je při tom apoplastický askorbát. askorbát. • Askorbátový cyklus je důležitým regulačním systémem aktivit buněčné stěny.
Askorbát ve stěně MDHAR - monodehydroaskorbát reduktáza MDHA-monodehydroaskorbát
• Arabinogalaktanové bílkoviny = AGP
Většinou zakotveny GPI kotvou v membráně (modifikace probíhá v ER katalyzována transamidázou; po odštěpení peptidu na C-konci je připojena glykosylfosfatidylinositolová kotva
- inositolový ifosfolipid, s oligosacharidem substituovaným fosfoethanolaminem)
jako inhibitor vážící AGP Yariv reagent (β-D-gal)3 u BY-2 buněk indukuje PCD.
AGP kotví v membráně pomocí GPI
Převážnou část molekuly tvoří (poly)sacharidy
Asymetrické b. dělení – JIM8+ b. produkují pravděp. oligosach. signál uvolňovaný z AGPs. Kondiciované médium stačí k indukci u JIM8- buněk.
uge4 – postižená galaktozylace AGPs.
• GPI modifikované bílkoviny – tj. AGPs – specificky obsazují lipidové rafty (DRMs) • Částečně podobný fenotyp mají steroloví mutanti hydra. • Spec. fosfolipázy mohou odštípnout GPI – nejen odpojení AGP od PM, ale také uvolnění PI-signálu v membráně. • Interakce s WAK je pravděpodobná (viz. dále)
Glycin Rich Prot.
Odstranění arabinos z extensinu vede ke ztrátě tyčinkovitého tvaru.
Prolinem bohaté b. Glycinem bohaté bílkoviny !
GRP mohou tvořit β-list
• GRP - důležití nositelé mechanických zátěží ve stěně ve zralém (tj. postapoptotickém) xylému.
Technika tkáňových otisků na nitrocelulosu – věrné stopy bílkovin.
Jak to může fungovat všechno najedou?
Modes of (plant) cell growth isodiametric expansion
polar growth
even cytokinesis can be viewed as a special case of „growth“
tip growth
Stěny I. a II. typu
Musí fungovat metabolická koordinace mezi syntézou celulózy a syntézou a sekrecí! necelulózních složek buněčné stěny!
(A) Orientace mikrofibril se ve stěně během ukládání dalších vrstev a růstu mění – pův. představa o pasivním natahování (B) během dlouživého růstu vzniká ve stěně velké tangenciální napětí (σt), které roste příp. až k několika stovkám MPa, při turgoru 1MPa (C) názorný model pružiny
• EXPANSINY
• Expansiny jsou aktivovány snížením pH a hrají klíčovou roli v tzv. kyselém růstu indukovaném auxinem. (IAA aktivuje H+-P-ATPázy)
• Aplikace expansinu stačí k iniciaci listového primordia. • Mechanika buněčné stěny je výsledkem a cílem mnoha regulačních procesů.
XET xyloglukan endotransglykosylasy a
EXPANSINY
Stěnové XET – endotransglykozylázy • Nemění poměr mezi obsahem celulózy a XG. • Pevnost a roztažnost zůstávají zachovány. • Výrazný vzrůst moblity – posuvnosti složek stěny
Stěnové hydrolázy - xyloglukanázy (hemicelulázy)
• Hydrolyzují nejen spojovací část, ale částečně i frakci vázanou na celulózu a mění chemické složení stěny. • Působí zvýšenou tuhost, sníženou visko-elasticitu při zachování podélné extensibility. • In vivo hypokotyly mají asi jen 36% XG přístupných hydrolýze XGnázou – závislost na konformaci a mezi-molekulárních interakcích..
a – kontrolní stěna cellul.+XG intaktní; b – po působení bakter. endoglukanázy tenké XG spoje mizí a randomizuje se struktura celul.; c – po půs. xyloglukanázy strukt. kolabuje a splývá ; d – po půs. XET jen reorganizace.
Anti-intuitivní funkce stěnových enzymů. • Zdá se, že hlavní funkcí XG je udržovat mikrofibrily celulózy od sebe – aby nekolabovaly do velkých shluků. • XG působí tedy ve směru rozvolnění stěny. • Proto mohou glukanázy/hydrolázy zvyšovat!! pevnost/tuhost stěny, zatímco XET zvyšují viskoelasticitu při zachování mechanické pevnosti.
Komplementarita účinků expansinů a XET. • Expansiny oslabují uniaxiální pevnost, ale XET ne. • XET katalyzují roztahování/přeskupování stěnové sítě za konstantního bi-axiálního napětí, zatím co expansiny ne. • Proto často obě aktivity kolokalizují v místech růstu.
Nedávno byla biochemicky charakterizován stěnová Pro bohatá bílkovina s lipid transferovou proteinovou (LTP) doménou, která působí podobně jako expanziny. Definuje novou rodinu stěnových regulačních bílkovin.
Hydroxylové radikály (´OH) vznikající ve stěně činností PRX a O2 a NADH, Fentonovou reakcí (Fe2+ a H2O2 =ROS) případně v NOX, mohou neenzymaticky štěpit stěnové polysacharidy – XG a pektiny.
Vzniká v NOX
• Hydroxyl radical • The hydroxyl radical, ·OH, is the neutral form of the hydroxide ion. Hydroxyl radicals are highly reactive and consequently short lived; however, they form an important part of radical chemistry.
Askorbát ve stěně MDHAR - monodehydroaskorbát reduktáza MDHA-monodehydroaskorbát
• NADPH oxidáza
NADPH oxidase = NOX – a growth and polarity regulator •Arabidopsis NADPH oxidase (NOX) RHD2 regulated by RhoGDI is required for growth of Arabidopsis root hairs (Foreman et al. Nature 2003 422:442-6, Carol et al. Nature 2005 438:1013-6)
Foreman et al. Nature 2003 422:442-6
Carol et al. Nature 2005 438:1013-6
Plant NADPH oxidase Respiratory Burst Oxidase Hom. ●
10 NOX genes in Arabidopsis
●
at least 8 NOX genes in rice
●
5 NOX genes in mammals
●
regulation by Ca2+
ROP GTPase Sagi and Fluhr Plant Physiol 2006 141:336-40
Ca
2+
scn1 – mutant in Rho/RopGDI1
Carol et al. 2005
ROS production is delocalized in scn1
• Apikální růst
Pylové láčky mají rostoucí špičku tvořenou převážně metylovanými pektiny.
V oblasti pod špičkou dochází k deesterifikaci (demetylaci) a pektiny jsou křížově propojovány (cross-link) Ca2+.
kalóza
celulóza
Pylová láčka a metylace pektinů
oba začínají až za špičkou
PME
JIM5
JIM7
JIM5
u g-i jsou pektiny na špičce demetylovány přidáním PME JIM5 – deesterif. kys. p. ; JIM7 – metyl-esterifikované p.
Stěna jako senzor mechanických poměrů v buňce a okolí "celulozoví" mutanti nejen hromadí kompenzačně pektiny, ale mají "signálně" aktivovánu dráhu ukládání ligninu.
WAKs
Wall Associated Kinases
N´
C´
WAKs interagují s pektiny (HGA) za přítomnosti Ca2+
Funkce askorbátu ve stěně úzce souvisí s tvorbou ROS (oxidative burst) Je hlavním antioxidantem stěny. Jeho redoxní stav reguluje askorbát oxidáza (AO) a podílí se tak na regulaci redoxních poměrů v apoplastu a tím modifikuje aktivity receptorů a přenos signálů.
Askorbát ve stěně MDHAR - monodehydroaskorbát reduktáza MDHA-monodehydroaskorbát
Askorbát oxidáza hlavní regulátor
The PAO plants, which had 40-times higher AO activity and 3.5-fold more DHA in the apoplast than the wild type, showed enhanced growth and stem elongation when compared to untransformed plants. Význam také pro obranu proti patogenům a zvýenému ozónu. Zvýšená aktivita AO je spojena se silnější buněčnou expanzí = růstem.
Redoxní regulace je předpokládána také pro skládání a fci. CesA TK.
VTC1 = GDP mannoso pyrofosforyláza v synt. askorbátu
Mutanti se sníženým askorbátem mají více apoptotických/PCD buněk!
Stimulace AO působí oxidovaný stav apoplastu – blokuje růst stěny a aktivuje obranné reakce. Askorbát také reguluje buněčný c. (dále).
