Budapest, 2013. október 1. napja
WIREC Szakmai Nap Klubhelyiség
Budapest, 2013. október 1. napja
A glifozát regényes története – avagy egy korosodó gyomirtó feltámadása a GMO-k térhódításának évszázadában – analitikai vizsgálatok Suszter Gabriella, László József, Palotai Zoltán, Szigeti Tamás János WESSLING Hungary Kft. 1047 Budapest, Fóti út 56.
[email protected],
[email protected] [email protected],
[email protected]
Gyomirtas – a gyomnövények által okozott kár
Gyomnövények: • • • •
Térparaziták Vízparaziták Tápanyag-paraziták Esetenként allelopatikus hatásúak (pl. a mezei acat) • Emberre, állatra mérgezőek lehetnek
Kárt okoznak: • Gazdaságban • Egészségben
A mechanikai gyomirtás munka- és energiaigénye nagy
A gyommentesítés nagy, élő munkerő-igényes feladat
Tarackbúza (Agropyron repens)
Tarackbúza (Elymus repens) földalatti része
A glifozát, mint herbicid felfedezése, szabadalmaztatása
A glyphosate – továbbiakban glifozát – John E. Franz kémikus (Monsanto) által 1970-ben és Roundup kereskedelmi néven szabadalmaztatott herbicid. Kereskedelmi forgalmazása 1974ben kezdődött. Alkalmazását tekintve a ROUNDUP® az egyik legnagyobb mennyiségben és legszélesebb körben használható gyomirtó szer a világon.
John E. Franz – Monsanto 1970 a glifozát, mint herbicid felfedezője
Heszky László (2013): A glifozáttoleráns transzgénikus (GM) fajták előállítása és termesztése. Agrofórum, 2013. május p. 90-95.
A glifozát szerkezete
Glifozát: N-(foszfonometil)glicin – gyenge sav Készítmények: izopropilamin trimetilszulfónium sók (glifozát-IPA, glifozát-TMS)
A glifozát bomlásterméke az AMPA
AMPA: Aminometil-foszforsav
A hatást növelő polioxi-etilén-amin (POEA)
A glifozát növények felületen való megkötődését elősegítő felületaktív anyag. Toxicitása meghaladhatja a glifozátét…
A glifozát hatásmechanizmusa
Aromás aminosavak szintézisének gátlása a kloroplasztiszban
A glifozát herbicid tulajdonságának hatásmechanizmusa
Aromás aminosavak szintézisének gátlása
Triptofán
Hisztidin
Fenilalanin
A növényi kloroplasztisz keresztmetszete - fotoszintézis Granulóma
Külső membrán
Belső membrán
Sztóma Tilakoidok
A sikiminsav képződése a növényekben 1/2/a Enolpiroszőlősav-3-foszfát
3-deoxyi-D-arabinóz-heptulóz-7-foszfát (DAHP) Eritróz-4-foszfát
3-dehidro-kinolinsav
A sikiminsav képződése a növényekben 1/2/b Enolpiroszőlősav-3-foszfát
3-deoxyi-D-arabinóz-heptulóz-7-foszfát (DAHP) Eritróz-4-foszfát
3-dehidro-kinolinsav
A sikiminsav képződése a növényekben 2/2
3-dehidro-kinolinsav
Sikiminsav
A sikiminsavat először a japán csillagánizsból (Illicium anisatum) állították elő
Aromás aminosavak bioszintézise 1/5
Sikiminsav
Sikimát kináz enzim
Enolpiroszőlősav -3-foszfát
Sikiminsav-3foszfát
EPSP szintáz enzim
5-enolpiruvil-sikiminsav3-foszfát (EPSP)
Aromás aminosavak bioszintézise 2/5
Enolpiroszőlősav -3-foszfát
EPSPS enzim képe
Aromás aminosavak bioszintézise 3/5
Az 5-enolpiruvát-sikimát-3-foszfát a korizmát-szintáz enzim hatására korizmáttá alakul
A korizminsavat a korizmin mutáz enzim prefeninsavvá metabolizálja (Claisen reakció)
Aromás aminosavak bioszintézise 4/5
Dehidrogenáz
Prefeninsav
Transzamináz
4-hidroxi-fenilpiroszőlősav
Tirozin
Aromás aminosavak bioszintézise 5/5
Dehidrogenáz
Prefeninsav
Transzamináz
4-hidroxi-fenilpiroszőlősav
Tirozin
Aromás aminosavak szintézisének gátlása
Az aromás aminosavak szintézise gátlásának következményei: • Leáll a sejtekben a fehérjeszintézis • A sikiminsav koncentrációjának toxikus növekedése • Közvetett hatás a fotoszintézis leállása a kloroplasztiszokban
A kloroplasztiszban zajló fotoszintézis (NADPH, ATP)
Glükóz +6O2
6CO2 + 6H2O + fényenergia = C6H12O6 (szénhidrát) + 6O2
A glifozát LD50-értéke melegvérűekre (csekély akut toxicitás)
LD50 po.: 1000 – 5000 mg/ttkg fajtól függően
Az intenzív technológiákban elkerülhetetlen a vegyszerezés
Baj van azonban a szelektivitással, rezisztenciával
A herbicidekre számos kultúrnövény érzékeny
A Monsanto és világhírű termékei – a probléma megoldása…
Glifozát forgalmazása 40 évvel ezelőtt GMO szója kibocsátása kb. 20 évvel ezelőtt
Transzformáció : mutáns EPSP szintáz gén beépítése 1/2
Mutált EPSPS gén Transzgén
Terminátor
Promóter
Módosított génszakasz
Eredeti genom a beillesztett transzgén-konstrukcióval
A mutáns EPSP szintáz enzim nem ismeri fel a glifozátot 1/2
N-foszfonometil-glicin
Enolpiroszőlősav-3-foszfát
A mutáns EPSP szintáz enzim nem ismeri fel a glifozátot 2/2
N-foszfonometil-glicin
Enolpiroszőlősav-3-foszfát
A mezőgazdasági termelés globális szintű kézbentartása
A világ GM vetésterületének alakulása 1996-tól 2012-ig (M ha)
Az utolsó három év adataiból becsült értékek
Forrás: Clive James, 2004, ISAA – *GMO Compass, 2013
A világ GM vetésterülete és glifozát-felhasználása aránya (%)
GM vetésterület % Glifozát-felhasználás %
A világ GM vetésterülete és glifozát-felhasználása, tonna, ha
A központosított mezőgazdaság profitot termel, azonban…
GMO monokultúrák kockázatai
• A monokultúra kedvez a specifikus kártevők elszaporodásának; • Nem-kívánatos génáramlás indulhat meg (gének megszökése pl. pollenek terjedésével – kultúrnövények gyom-rokonai); • A fentiek alapján „szupergyomok” kialakulása (Heszky L. és mtsai., Darvas B. és mtsai.); • Felszaporodás a környezetben; • Megjelenés az emberi vizeletben (18 EU tagállamból önkéntesek vizeletében mutatták ki: Medical Laboratory Bremen, Haferwende 12, 28357 Bremen, Germany); • Kedvezőtlen élettani hatások gyanúja: teratogenitás, enzimrendszerek károsítása;
Glifozát-lefedettség saját számítás alapján (kb. 50g/ha)
A világ átlagos felhasználása: kb. 50 g/ha glifozát A honlap alapján számításba vehető biológiaialag hasznos termőterület: 1,8 GHa/fő Népesség: 6,7 milliárd = 6 700 000 000 ember
Termőterület: 6,7 milliárd x 1,8 Gha = 12 600 000 000 ha A honlap alapján számított glifozát-lefedettség: 2010-ben: 640 000 tonna = 640 000 000 kg glifozát globálisan felhasználva → 50 g/ha
Glifozát-maradékok mérési eredményei (irodalmi adatok)
Vizsgált minták Felszíni vizek Talaj szárazanyagban Üledékek Bogyótermésűek Zuzmók
Banán Szárazbab Szárazborsó Lencse Szója Gabonamagvak Cukornád Gyapot Tea Szálastakarmányok
Glifozát 1 – 1700 µg/L 0,07 – 40 mg/kg 0,05 – 19 mg/kg 1,6 – 19 mg/kg 45 µg/kg
<0,05 mg/kg 0,11 – 1,8 mg/kg 0,17 – 0,5 mg/kg 0,05 – 3 mg/kg 0,45 – 17 mg/kg 0,1 – 20 mg/kg 0,07 – 0,97 0,46 – 28 mg/kg 0,12 – 0,42 mg/kg 225 mg/kg
AMPA 1 – 35 µg/L 0,1 – 9 mg/kg 0,05 – 1,8 mg/kg 0,02 – 0,1 mg/kg 2,1 mg/kg
Krónikus glifozát-expozició – Toxikus hatások kétéltűeken
• Csökkent fejméret, • Központi idegrendszer genetikai elváltozásai, • A koponyát formáló sejtek pusztulása, • Ízületek porcainak deformálódása; • Hasonlóság a humán embrióval; • Humán születési rendellenességek, • Fémionokkal kelátot képez, • Az ember elsődleges glifozát-maradék forrása az élelmiszer;
Afrikai karmosbéka (Xenopus laevis)
Egy érdekesség: a glifozát megjelenése vizeletben A vizeletminták analitikai eredményeit általában a vizeletben mindig megtalálható kreatinin mennyiségére vonatkoztatva adják meg. Oka: A vizsgált komponensek mennyisége az egyén által elfogyasztott víz mennyiségétől is függ. Ezt a bizonytalanságot csökkenti a kreatininre vonatkoztatott mérési eredmények használata
Magyarországi vizeletminták kreatinin-tartalma
Determination of Glyphosate residues in human urine samples from 18 European countries. Medical Laboratory Bemen 2013.
Magyarországi vizeletminták glifozát- és AMPA-tartalma
Mérési határ
Determination of Glyphosate residues in human urine samples from 18 European countries. Medical Laboratory Bemen 2013.
Analitika
A glifozát-maradék meghatározásának analitikai nehézségei
• • • • • •
Erősen poláros, Kicsiny molekula, Ennek ellenére nem illékony, Gyenge a fényelnyelése, Fluoreszcenciája nincsen, Fordított fázison gyenge a retenciója;
Ezért ismereteink szerint kevés laboratórium vállalkozik maradékainak meghatározására.
Analitikai módszer mezőgazdasági termékek vizsgálatához
A minta-előkészítés és mérés vázlatos leírása - Élelmiszer
• • • • • • • • • •
Homogenizálás, majd 5 g minta bemérése, Extrakció hangyasavas metanollal, Centrifugálás, szűrés, Térfogat-beállítás, Bemérés a HPLC autosampler-ébe, Elválasztás Hypercarb GCB oszlopon, MS/MS (Triple Quad) detektálás, Belső standerdek: 14C2 és 15N nuklidokkal jelzett glifozát standerddel, Jellemző ionátmenetek: 168/63 m/z, illetve a jelzett standerdekből 171/63 m/z; LOQ: 10 ng/g = 10 µg/kg
Glifozát kromatogramja – 10 ng/ml
Spike-olt minta kromatogramja – 10 µg/kg glifozáttartalommal
Glifozát kalibráció (2 ng/ml-100 ng/ml)
100 ng
50 ng
10 ng
A minta-előkészítés és mérés vázlatos leírása - Vízminta
• • • • • • • •
100 ml szűrt vízminta bemérése, 10 mg/ml FMOC-Cl + puffer hozzáadása Származékképzés 4 óra alatt, Oszlop: Zorbax XDB C-8 Eluens: 50 mM NH4Ac + H2O SIM ionok: 334 (AMPA) és 392 (Glyph) m/z Scan: 120 – 1000 m/z Mérési tartomány: 10 – 50 µg/L 100 ml vízmintából kiindulva
Vízmintákból származékképzés FMOC-val (Glifozát)
9-Fluorenilmetilkloroformát (FMOC)
HCl kilépése
N-foszfonometil-glicin (glifozát)
Vízmintákból származékképzés FMOC-val (AMPA)
9-Fluorenilmetilkloroformát (FMOC)
HCl kilépése
Aminometil-foszforsav (AMPA)
Glifozát és AMPA kromatogramja vízmintából
Glifozát
AMPA
Glifozát és AMPA kalibrációs görbéi vízvizsgálatokhoz
Glifozát
AMPA
Area
Area
1,4*107
8*106
8*106
4*106
2*106
1*106
300
ng/inj
200
ng/inj
További, egyedi módszerrel vizsgálható peszticidek
Etefon, ciromazin, klórmekvát és mepikvát.
Köszönöm a figyelmet!
