BRINE SHRIMP LETHALITY TEST EKSTRAK KLOROFORM DAUN TUMBUHAN TEMBELEKAN (Lantana camara L.) BESERTA PROFIL KROMATOGRAFI LAPIS TIPISNYA SKRIPSI

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BRINE SHRIMP LETHALITY TEST EKSTRAK KLOROFORM DAUN TUMBUHAN TEMBELEKAN (Lantana camara L.) BESERTA PROFIL KROMATOGRAFI LAPIS TIPISNYA

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh: Aprilia Prahara NIM: 048114095

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2007


BRINE SHRIMP LETHALITY TEST EKSTRAK KLOROFORM DAUN TUMBUHAN TEMBELEKAN (Lantana camara L.) BESERTA PROFIL KROMATOGRAFI LAPIS TIPISNYA

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh: Aprilia Prahara NIM: 048114095

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2007 ii


iii


iv


HaLamAn peRseMbaHan EaCh mOrniNg, whEn i 0peN mY eYEs I sAy To my self; I, noT eVeNts, HavE a p0weR tO mAkE mE HapPy oR UnhApPy tOdAy. i caN cHo0sE whIcH iT shAll be. YesTeRDay iS dEaD, tomorrow haSn’T aRriVed yEt i hAvE jUsT 0Ne daY tOdaY AnD I’M goiNg t0 bE hapPy in iT…

I deDicaTed iT f0R:

JeSus mY sAviOr… My LuVlY FaMz…

‘pApa, MamA, kO Yan, heNRy’

mY bEst fRiEnDs…

‘noVi, NikE, laLA, yaSinTa, cHiKa’ ‘sElVi, liNDa, aNgEl, niTa, dHaNieL’ ‘aLmaMatErkU’ v


LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma : Nama Nomor Mahasiswa

: Aprilia Prahara : 048114095

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul : BRINE SHRIMP LETHALITY TEST EKSTRAK KLOROFORM DAUN TUMBUHAN TEMBELEKAN (Lantana camara L.) BESERTA PROFIL KROMATOGRAFI LAPIS TIPISNYA beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupaun memberikan royalty kepada saya selamA tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

Demikian pernyatan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : 08 April 2008 Yang menyatakan

(Aprilia Prahara)


PRAKATA

Puji syukur penulis haturkan kepada Tuhan Yang Maha Esa yang telah melimpahkan rahmat dan berkatnya untuk menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi yang berjudul Brine Shrimp Lethality Test Ekstrak Kloroform Daun Tumbuhan Tembelekan (Lantana camara L.) Beserta Profil Kromatografi Lapis Tipisnya. Penelitian ini dilakukan untuk memenuhi salah satu syarat tugas akhir untuk mencapai gelar sarjana ilmu Farmasi bidang studi Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis telah banyak mendapat bantuan, dukungan, bimbingan, dorongan, sarana, maupun fasilitas dari berbagai pihak dalam penulisan skripsi ini. Oleh karena itu penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada: 1.

Ibu Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2.

Ibu Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing atas kesabarannya dalam membimbing selama penelitian dan penyusunan skripsi, dan sebagai donatur sehingga penelitian ini dapat terlaksana.

3.

Bapak Yohanes Dwiatmaka,

M.Si. selaku dosen pembimbing atas

kesabarannya dalam membimbing selama penelitian dan penyusunan skripsi. 4.

Bapak Ipang Djunarko, S.Si, Apt. selaku dosen penguji yang telah memberikan masukan dan saran dalam penyusunan skripsi ini.

vi


5.

Ibu Erna Tri Wulandari, M.Si, Apt. selaku dosen penguji yang telah memberikan masukan dan saran dalam penyusunan skripsi ini.

6.

Papa, Mama, kakak dan adikku, atas cinta, pengorbanan, dukungan semangat, dan doa nya yang tak pernah berhenti.

7.

Mas Wagiran, Mas Sigit, Mas Sarwanto selaku staf laboratorium Farmakognosi Fitokimia. Terima kasih atas bantuan yang diberikan.

8.

Novi, Nike, Yasinta, Lala, Chika, Linda, Angel, Selvi, dan Nita sahabat dalam berbagi suka dan duka.

9.

Ci Lia, Mas Wondo, Novi, dan Mbak Rosa. Terima kasih atas kerja sama dan bantuannya selama penelitian.

10.

Teman-teman angk atan 2004, khususnya kelas FKK dan kelas C. Terima kasih atas kebersamaan dan kerja samanya selama ini.

11.

Pihak lain yang tidak dapat disebutkan satu persatu oleh penulis. Penulis menyadari masih ada kekurangan dalam penyusunan skripsi ini,

maka penulis sangat mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari berbagai pihak demi kemajuan dan kesempurnaan penelitian yang telah dilakukan. Semoga skripsi ini memberikan manfaat bagi kita semua. Yogyakarta, Januari 2008

Penulis

vii


PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Yogyakarta, Januari 2008 Penulis

Aprilia Prahara

viii


INTISARI Pengobatan dengan obat antikanker dirasa masih kurang memuaskan dan mahal sehingga pengobatan dengan obat tradisional menjadi pilihan alternatif. Salah satu obat tradisional yang telah digunakan sebagai antitumor adalah daun tumbuhan tembelekan (Lantana camara L.) (Raghu et al., 2004). Langkah awal untuk mengetahui apakah daun tumbuhan tembelekan beraktivitas antikanker dilakukan dengan menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test sehingga didapatkan informasi toksisitas ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan terhadap larva Artemia salina Leach (artemia). Penelitian ini bersifat eksperimental murni dengan rancangan posttest only control group design. Penelitian menggunakan artemia yang diberi perlakuan ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan berkonsentrasi 50, 100, 200, 400, dan 800 µg/ml. Setiap pengujian disertai kontrol berupa air laut buatan dan dilakukan 5 kali replikasi. Jumlah larva yang mati dihitung setelah didiamkan selama 24 jam perlakuan. Data persentase kematian larva artemia dianalisis menggunakan analisis probit untuk menghitung nilai LC 50 . Ekstrak dikatakan toksik jika nilai LC 50 < 1000 µg/ml, yang diharapkan berupa efek sitotoksik yang merupakan syarat utama senyawa yang beraktivitas antikanker. Ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan kemudian diidentifikasi kandungan senyawa flavonoid dan triterpenoidnya menggunakan kromatografi lapis tipis. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan bersifat toksik dengan LC 50 sebesar 221,7 µg/ml. Identifikasi kandungan senyawa kimia dengan kromatografi lapis tipis menunjukkan ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan diduga mengandung senyawa golongan triterpenoid.

Kata kunci : Brine Shrimp Lethality Test, Lantana camara L., Artemia salina Leach, toksisitas

ix


ABSTRACT

Medication using anticancer medicine is still considered less satisfying and expensive, so that traditional medicine is chosen as the alternative. One traditional medicine which has been used as antitumor is tembelekan leaves (Lantana camara L.) (Raghu et al., 2004). The first step to know whether tembelekan leaves has anticancer activity or not can be done by using Brine Shrimp Lethality Test method so that the information about the chloroform extract of tembelekan leaves toward Artemia salina Leach (artemia) larva. This research is a pure experimental research with a posttest only control group design. This research is using artemia which were given chloroform extract of tembelekan leaves with 50, 100, 200, 400, and 800 µg/ml concentrations. Every test was accompanied with a control that is artificial sea water and five-time replication. The dead larvas were counted after 24 hours treatment. The percentage of the dead artemia larva was analysed using probit analysis to count the value of LC 50 . An extract is considered as toxic when the value of LC 50 is below 1000 µg/ml, which is supposed to be a sitotoxic effect. It is the main requirement for a compound whose activity is anticancer. The flavonoid compound and triterpenoid of the chloroform extract of tembelekan leaves then was identified using thin- layered chromatography. This study shows that the chloroform extract of tembelekan leaves has toxic characteristics containing LC 50 221,7 µg/ml. The identification of chemical compound using thin- layered chromatography shows that chloroform extract of tembelekan leaves are suspected to contain a triterpenoid-class compound.

Key words: Brine Shrimp Lethality Test, Lantana camara L., Artemia salina Leach, toxicity

x


DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL...............................................................................................ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING.....................................................iii HALAMAN PENGESAHAN.................................................................................iv HALAMAN PERSEMBAHAN...............................................................................v PRAKATA..............................................................................................................vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA...............................................................viii INTI SARI...............................................................................................................ix ABSTRACT...............................................................................................................x DAFTAR ISI...........................................................................................................xi DAFTAR TABEL..................................................................................................xv DAFTAR GAMBAR............................................................................................xvi DAFTAR LAMPIRAN........................................................................................xvii DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG.....................................................xviii BAB I. PENGANTAR.............................................................................................1 A. Latar Belakang...................................................................................................1 1. Permasalahan................................................................................................3 2. Keaslian penelitian.......................................................................................3 3. Manfaat penelitian .......................................................................................3 B. Tujuan penelitian................................................................................................4 1. Tujuan umum...............................................................................................4 2. Tujuan khusus..............................................................................................4

xi


BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA......................................................................5 A. Tembelekan........................................................................................................5 1. Keterangan botani........................................................................................5 2. Deskripsi......................................................................................................5 3. Kandungan Kimia........................................................................................5 4. Khasiat dan kegunaan..................................................................................6 B. Senyawa yang diidentifikasi..............................................................................6 1. Flavonoid......................................................................................................6 2. Triterpenoid..................................................................................................8 C. Artemia salina Leach......................................................................................10 1. Morfologi...................................................................................................10 2. Klasifikasi hewan uji..................................................................................12 3. Brine Shrimp Lethality test (BST)..............................................................12 D. Uji toksisitas.....................................................................................................13 E. Kanker..............................................................................................................14 F. Kromatografi Lapis Tipis.................................................................................18 G. Maserasi...........................................................................................................19 H. Landasan teori..................................................................................................20 I. Hipotesis...........................................................................................................20 BAB III. METODOLOGI PENELITIAN..............................................................21 A. Jenis dan rancangan penelitian.........................................................................21 B. Variabel dan definisi operasional.....................................................................21 1. Variabel penelitian.....................................................................................21

xii


2. Definisi operasional...................................................................................22 C. Bahan penelitian...............................................................................................22 1. Bahan utama...............................................................................................22 2. Bahan untuk ekstraksi................................................................................22 3. Bahan untuk KLT.......................................................................................23 4. Bahan untuk pembuatan air laut buatan.....................................................23 5. Bahan untuk uji toksisitas (BST)...............................................................23 D. Alat-alat penelitian...........................................................................................24 1. Alat untuk ekstraksi....................................................................................24 2. Alat untuk uji BST.....................................................................................24 3. Alat untuk KLT..........................................................................................24 E. Tata cara penelitian..........................................................................................24 1. Determinasi tumbuhan...............................................................................24 2. Pengumpulan bahan...................................................................................25 3. Pembuatan ekstrak kloroform daun tembelekan........................................25 4. Pembuatan air laut buatan..........................................................................26 5. Penetasan siste artemia...............................................................................26 6. Penyiapan sampel uji toksisitas..................................................................26 7. Uji toksisitas...............................................................................................27 8. Identifikasi kualitatif senyawa aktif dengan KLT......................................27 F. Analisis data.....................................................................................................28 BAB IV. HASIL dan PEMBAHASAN.................................................................29 A. Determinasi tanaman........................................................................................29

xiii


B. Pengumpulan bahan dan penyarian zat aktif....................................................29 C. Pembuatan air laut buatan................................................................................32 D. Penetasan Siste.................................................................................................32 E. Uji toksisitas dengan BST................................................................................33 F. Hasil uji kualitatif kandungan senyawa aktif...................................................36 BAB V. KESIMPULAN dan SARAN...................................................................44 A. Kesimpulan......................................................................................................44 B. Saran.................................................................................................................44 DAFTAR PUSTAKA............................................................................................45 LAMPIRAN...........................................................................................................48 BIOGRAFI PENULIS...........................................................................................59

xiv


DAFTAR TABEL

Tabel I

Pedoman umum bercak flavonoid dengan sinar tampak dan UV 365 nm................................................................................................8

Tabel II

Keterangan anatomi skematik kepala larva artemia ..........................11

Tabel III

Data kematian larva artemia karena pengaruh ekstrak kloroform daun tembelekan setelah 24 jam ........................................................34

Tabel IV

Hasil KLT pemeriksaan flavonoid dalam ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan ..............................................................37

Tabel V

Hasil KLT pemeriksaan triterpenoid dalam ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan dengan deteksi vanilin asam sulfat ......41

xv


DAFTAR GAMBAR

Gambar 1.

Struktur umum flavonol ....................................................................6

Gambar 2.

Mekanisme kematian sel yang terprogram (apoptosis) pada sel normal dan sel tumor yang kekurangan p53 menyebabkan kanker.................................................................................................7

Gambar 3.

Struktur Lantadene A .........................................................................9

Gambar 4.

Mekanisme penghambatan enzim topoisomerase..............................10

Gambar 5.

Anatomi skematik kepala larva artemia.............................................11

Gambar 6.

Skema siklus sel.................................................................................14

Gambar 7.

Jalur

Transduksi

sinyal

yang

berhubungan

dengan

perkembangan kanker ........................................................................16 Gambar 8.

Kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan..............................................35

Gambar 9.

Reaksi flavonoid dengan uap ammonia.......... ...................................37

Gambar 10.

Reaksi flavonoid dengan AlCl3 ..........................................................37

Gambar 11.

Kromatogram ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan untuk pemeriksaan flavonoid dengan jarak pengembangan 10 cm.......................................................................................................38

Gambar 12.

Reaksi triterpenoid dengan vanilin asam sulfat ........................... .....41

Gambar 13.

Kromatogram ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan untuk pemeriksaan triterpenoid dengan jarak pengembangan 10 cm.......................................................................................................42

xvi


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat keterangan determinasi tumbuhan tembelekan.........................48 Lampiran 2. Foto tumbuhan tembelekan ...............................................................49 Lampiran 3. Foto aquarium untuk uji BST.............................................................49 Lampiran 4.

Orientasi untuk mendapatkan seri konsentrasi yang akan digunakan dalam pengujian ..............................................................50

Lampiran 5.

Jumlah kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak kloroform daun tumbuha n tembelekan .............................................55

Lampiran 6.

Perhitungan data statistik SPSS 10.00 dengan analisis probit terhadap ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan ..................56

xvii


DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG

1. ALB

= Air Laut Buatan

2. AlCl3

= aluminium klorida

3. CaCl2

= kalsium klorida

4. cm

= centimeter

5. KCl

= kalium klorida

6. KLT

= Kromatografi Lapis Tipis

7. LC50

= Median Lethal Concentration

8. LD50

= Median Lethal Dose

9. mm

= millimeter

10. mg

= milligram

11. MgCl2

= magnesium klorida

12. MgSO4

= magnesium sulfat

13. ml

= milliliter

14. NaHCO3

= natrium bikarbonat

15. NaCl

= natrium klorida

16. nm

= nanometer

17. rpm

= rotasi per menit

18. UV

= ultraviolet

19. °C

= derajat celcius

20. %

= persen

21. µg/ml

= microgram per milliliter

22. µl

= microliter

xviii


BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Penyakit kanker termasuk penyakit yang sukar disembuhkan dan dapat menyebabkan kematian bagi penderitanya. Saat ini telah banyak obat antikanker yang ditemukan dan dikembangkan namun hasil yang dirasakan masih kurang memuaskan dan biayanya pun sangat mahal. Hal ini yang membuat masyarakat mulai melakukan pengobatan alternatif dengan menggunakan obat tradisional. Bahan alam yang mulai diteliti aktivitas antikankernya adalah Lantana camara L. (tembelekan). Tumbuhan ini cukup mudah ditemukan dan tiap organnya memiliki khasiat tertentu, salah satunya bagian daun yang beracun digunakan untuk antitumor, antibakteri dan antihipertensi (Raghu, Ashok, Dhanaraj, Suresh, Vijayan, 2004). Bagian daun yang paling sering dimanfaatkan karena cara pengambilan dan pengolahannya yang mudah, dan jumlahnya yang banyak (Anonim, 2005). Brine Shrimp Lethality Test (BST) merupakan metode pengujian toksisitas sederhana produk alam untuk menentukan Median Lethal Concentration (LC50 ) dalam µg/ml dengan menggunakan larva Artemia salina Leach (artemia). Penggunaan artemia ini memang tidak spesifik untuk antikanker ataupun zat aktif fisiologis tertentu, tetapi dapat menunjukkan kemampuan untuk memonitor kemungkinan adanya efek sitotoksik. Suatu senyawa dikatakan toksik jika nilai LC50 < 1000 µg/ml. Metode uji ini dapat dijadikan uji awal senyawa sitotoksik

1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 2

karena mudah, murah dan cepat (Meyer, Ferrigni, Putnama, Jacobsen, Nicholas, Mclaughlin, 1982). Senyawa yang dikenal memiliki aktivitas sitotoksik adalah senyawa flavonoid dan triterpenoid. Flavonoid diketahui dapat menginduksi apoptosis (Middleton, Kandaswami, Theoharides, 2000). Senyawa ini merupakan senyawa polar yang umumnya larut pada pelarut polar, namun adanya aglikon yang kurang polar menyebabkan fla vonoid lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform (Markham, 1988). Senyawa triterpenoid terutama golongan pentasiklik triterpenoid dapat menghambat kerja enzim topoisomerase I dan II serta menghambat RNA polymerase sehingga mengakibatkan kematian sel (Lee, Fang, Wang, Li, Cook, 1991). Biasanya terpenoid diekstraksi dengan menggunakan eter minyak bumi, eter atau kloroform (Harborne, 1984). Penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya dengan menggunakan daun tumbuhan tembelekan antara lain oleh Sugianti (2007) yang mengekstrak daun dengan pelarut etanol. Dari penelitian ya ng telah dilakukan tersebut diketahui bahwa ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan bersifat toksik terhadap larva artemia dengan LC 50 sebesar 60,4 µg/ml. Efek toksik ini diduga karena kandungan flavonoid dan triterpenoid yang larut dalam ekstrak etanol tersebut. Berdasarkan penelitian tersebut peneliti ingin melakukan penelitian alternatif dengan mengganti larutan penyari etanol dengan kloroform karena diketahui senyawa golongan flavonoid dan triterpenoid juga dapat larut dalam kloroform.


Daun tumbuhan tembelekan diketahui memiliki kandungan flavonoid dan triterpenoid pentasiklik (lantadene A dan B). Oleh karena itu untuk mengetahui apakah kandungan triterpen pentasiklik dan flavonoid ini memiliki efek sitotoksik maka perlu dilakukan uji dan salah satu uji yang dapat dilakukan adalah BST dengan menggunakan ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan tersebut. Hasil uji ini dapat menjadi dasar awal untuk melanjutkan ke tahap uji untuk mencari aktivitas antikanker berikutnya jika hasil BST menunjukkan adanya efek toksik dari ekstrak tersebut. 1. Permasalahan a. Apakah ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan bersifat toksik terhadap larva artemia? b. Berapa besar LC 50 ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan terhadap larva artemia? c. Apakah terdapat senyawa golongan flavonoid dan / atau triterpenoid dalam ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan? 2. Keaslian penelitian Sejauh penelusuran pustaka belum pernah dilakukan penelitian mengenai toksisitas ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan terhadap larva artemia. 3. Manfaat penelitian a.

Manfaat praktis penelitian ini adalah memberikan informasi tentang tingkat ketoksikan ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan terhadap larva artemia dan membantu pengembangan dan penggunaan daun tumbuhan tembelekan sebagai antikanker.


b.

Manfaat teoritis penelitian ini adalah memberikan sumbangan ilmiah bagi perkembangan ilmu pengetahuan terutama dalam bidang farmasi mengenai ada tidaknya aktivitas ketoksikan ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan terhadap larva artemia. B. Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum Tujuan umum penelitian ini, yaitu untuk mengenali tumbuhan yang mungkin mengandung senyawa sitotoksik yang bermanfaat dalam pengobatan. 2. Tujuan khusus Tujuan khusus penelitian ini, yaitu untuk: a. Mengetahui ketoksikan ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan terhadap larva artemia b. Mengetahui nilai LC 50 ekstrak klorofo rm daun tumbuhan tembelekan c. Mengetahui kandungan senyawa flavonoid dan/atau triterpenoid pada ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Tumbuhan Tembelekan 1. Keterangan botani Tumbuhan tembelekan (Lantana camara L.) termasuk dalam kingdom Plantae, filum Embryophyta, kelas Magnoliopsida, ordo Lamiales, familia Verbenaceae, dan genus Lantana. Tumbuhan ini mempunyai sinonim antara lain Lantana aculeata L., Lantana antillana Rafin., Lantana mutabilis Salisb., Lantana polyacanthus SCH., Lantana scabrida Soland (Backer & Brink Jr., 1963). Nama daerah tumbuhan tembelekan ini antara lain: tembelekan, kembang telek, bunga pagar, kayu singapur, tahi ayam (Sumatera); kembang telek, oblo, puyengan, pucengan, tembelek, tembelekan, teterapan, waung, wilweran (Jawa); kembang satek, saliyara, saliyare, tahi hayam, tahi kotok, cente (Sunda); kamanco, mainco, tamanjho (Madura) (Hembing, 2000). 2. Deskripsi Daun tembelekan tersusun berhadapan, jarang melingkar, dan semakin padat pada bagian atas mendekati pucuk (Backer & Brink Jr., 1963). 3. Kandungan kimia Daun tembelekan mengandung lantadene A (0,31-0,68%), lantadene B (0,2%), lantanolic acid, lantic acid, humulene (mengandung minyak menguap 0,16 - 0,2%), Beta-caryophyllene, gamma-terpidene, alpha-pinene, p-cymene, dan flavonoid (Anonim,2005).

5


4. Khasiat dan kegunaan Bagian daunnya yang bersifat sedikit beracun digunakan untuk menghilangkan gatal (anti pruritus), antitoxic, perangsang muntah (emetikum), dan menghilangkan pembengkakan (anti-swelling) (Anonim, 2005), antitumor, antibakteri dan antihipertensi (Raghu, Ashok, Dhanaraj, Suresh, Vijayan, 2004). B. Senyawa yang Diidentifikasi 1. Flavonoid Flavonoid adalah golongan senyawa alam yang strukturnya terdiri dari 2 cincin aromatik yang dihubungkan oleh atom karbon membentuk rangka dengan sistem C6 -C3-C6 . Flavonoid sebenarnya terdapat pada semua bagian tumbuhan termasuk daun, akar, kayu, kulit, nektar, bunga, buah, dan biji (Markham, 1988) Flavonoid merupakan senyawa polar, maka pada umumnya flavonoid larut pada pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetilsulfoksida, dan air. Adanya gula yang terikat pada flavonoid cenderung menyebabkan flavonoid lebih mudah larut dalam air. Sebaliknya, aglikon yang kurang polar seperti isoflavon, flavonon, flavon, dan flavonol yang termetoksilasi cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform (Markham, 1988).

O

OH O

flavonol

Gambar 1. Struktur umum flavonol (Harborne, 1984)


Flavonoid jenis flavonol diketahui dapat menginduksi terjadinya apoptosis (mekanisme kematian yang terprogram) pada sel kanker salah satunya dengan mencegah terjadinya mutasi p53. Dengan adanya apoptosis, sel yang telah rusak (abnormal) dan tidak berfungsi lagi akan mati dengan sendirinya, tidak terus menerus membelah dan menghasilkan sel neoplastik yang dapat berkembang menjadi sel tumor dan kanker (Middleton, Kandaswami, Theoharides, 2000).

Gambar 2. Mekanisme kematian sel yang terprogram (apoptosis) pada sel normal (A) dan sel tumor yang kekurangan p53 menyebabkan kanker (B) (Albert, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter, 2002) Senyawa flavonoid dapat dianalisis dengan kromatografi lapis tipis (KLT). Fase diam yang digunakan adalah selulosa dan fase geraknya seperti nbutanol, asam asetat, air (4:1:5 v/v lapisan atas); kloroform, etil asetat (60:40 v/v); atau kloroform, aseton, asam format (75:16,5:8,5 v/v). Deteksi terhadap bercak yang timbul setelah pengembangan dapat menggunakan sinar UV, pereaksi


semprot seperti sitroborat, pereaksi aluminium klorida, dan antimon triklorida (Wagner, Brady, Zgainski, 1984). Tabel I. Pedoman umum bercak flavonoid dengan sinar tampak dan UV 365 nm (Geissman, 1962) Gol. Flavonoid Flavon

Vis Kuning lemah

UV 365 nm Coklat gelap, coklat merah, kuning coklat

NH3 Kuning

Flavonol

Kuning lemah

Kuning terang, kuning hijau, coklat

Kuning

Isoflavon

Tidak berwarna

Tidak berwarna

Flavonon

Tidak berwarna

Ungu padam, kuning lemah Tidak berwarna

Tidak berwarna

NH3 /UV Kuning terang, kuning hijau, ungu gelap Kuning terang, kuning hijau, coklat Ungu padam, kuning lemah Tidak berwarna, kuning gelap, kuning hijau

AlCl3 Kuning pucat

AlCl3/ UV Fl. Hijau, kuning hijau

Kuning

Fl. Kuning, hijau

Tidak berwarna

FL. Kuning

Tidak berwarna

Fl. Hijau, kuning, biru pucat

2. Triterpenoid Terpenoid berasal dari molekul isoprena CH2 =C(CH3 )-CH=CH2 . Terpenoid terdiri atas beberapa senyawa berdasarkan jumlah satuan yang terdapat dalam senyawa tersebut, yaitu: komponen minyak atsiri [monoterpena dan seskuiterpena yang mudah menguap (C 10 dan C15 )], diterpena yang lebih sukar menguap (C 20 ), senyawa yang tidak menguap [triterpenoid dan sterol (C 30 )], dan pigmen karotenoid (C 40 ) (Harborne, 1984). Triterpenoid adalah senyawa yang kerangka karbonnya berasal dari enam satuan isoprena dan secara biosintesis diturunkan dari hidrokarbon C30 asiklik, yaitu skualena. Senyawa ini berstruktur siklik yang nisbi rumit, kebanyakan


berupa alkohol, aldehida, atau asam karboksilat. Mereka berupa senyawa tanwarna, berbentuk kristal, sering sekali bertitik leleh tinggi dan aktif optik, yang umumnya sukar dicirikan karena tak ada kereaktifan kimianya. Uji yang banyak digunakan adalah reaksi Lieberman-Burchard (anhidra asetat – H2 SO4 pekat) yang dengan kebanyakan triterpena dan sterol memberikan warna hijau-biru (Harborne, 1984). Triterpen akan memberikan warna biru, biru-violet dengan pereaksi vanilin asam sulfat (Wagner, 1984).

Gambar 3. Struktur Lantadene A (Sharma, Sharma, Bansal, Singh, 2007) Triterpenoid yang paling penting dan paling tersebar luas ialah pentasiklik triterpenoid. Senyawa pentasiklik triterpenoid yang diketahui tersebar luas adalah a-amirin dan ß-amirin serta asam turunannya yaitu asam ursolat dan asam oleanolat (Evans and Trease, 2002). Pentasiklik triterpenoid dapat menghambat kerja enzim topoisomerase I dan II serta menghambat RNA polymerase sehingga mengakibatkan kematian sel (Lee et al., 1991). Lantadene A yang merupakan salah satu kandungan dalam daun tembelekan merupakan triterpenoid pentasiklik yang telah dievaluasi dapat menginduksi apoptosis pada human leukimia HL-60 cell line (Sharma et al., 2007).


Gambar 4 . Mekanisme penghambatan enzim topoisomerase (Albert et al., 2002) KLT praktis selalu digunakan pada lapisan silika gel. KLT silika gel AgNO3 digunakan untuk memisahkan triterpenoid takjenuh berdasarkan jumlah ikatan rangkap terisolasi yang ada dalam molekul. Metode ini dapat menggunakan fase gerak seperti heksan, etil asetat (1:1); kloroform, metanol (10:1); atau toluene : etil asetat (93:7). Sebagai deteksi dapat digunakan penyemprotan dengan asam sulfat pekat, diteruskan dengan pemanasan pada 100°C - 105°C sampai pembentukan warna sempurna (Harborne, 1984). Untuk senyawa terpenoid, akan menghasilkan warna abu-abu, merah violet atau ungu (Wagner et al.,1984). C. Artemia salina Leach 1. Morfologi Istilah telur artemia yang benar adalah siste yaitu telur yang telah berkembang lebih lanjut menjadi embrio yang tebal dan kuat. Apabila telur-telur


artemia yang kering direndam dalam air laut yang bersuhu 25°C, akan menetas dalam waktu 24-36 jam, dan dari cangkangnya keluarlah burayak (larva) yang juga dikenal dengan istilah nauplius (Mudjiman, 1991).

Gambar 5. Anatomi Skematik Kepala Larva Artemia (Anonim, 2007) Tabel II. Keterangan Anatomi Skematik Kepala Larva Artemia (Anonim, 2007) #

nama

keterangan

1 naupliar eye

Ada sejak larva instar awal hingga akhir

2 antenna 1

Juga disebut antennulae

3 compund eyes

-

4 antenna 2

Larva jantan mempunyai antenna 2 lebih besar untuk memegang larva betina selama kopulasi

5 mandible

Digunakan untuk menyaring partikel makanan

6 maxillary gland

Digunakan untuk regulasi osmotik (ekskresi garam)

7 labrum

Menutupi permukaan ventral kepala, termasuk mulut; digunakan untuk memegang makanan dalam posisi untuk mengunyah dan menelan

8 gut

Saluran pencernaan

9 maxilla 2

Digunakan untuk memproses makanan

10 maxilla 1

Digunakan untuk memproses makanan

11 mouth & esophagus

Diantara mandibles; esofagus,; memanjang secara dorsal dari mulut ke perut

12 digestive cecum

plural: ceca

13 heart

Panjang, “pipa” sempit; mamanjang hampir di seluruh badan

14 stomach

Menghabiskan daerah gut di bagian tengah kepala

Dalam perkembangan selanjutnya, burayak akan mengalami 15 kali perubahan bentuk (metamorfosis). Setiap kali burayak mengalami perubahan bentuk merupakan satu tingkatan (instar). Burayak yang baru menetas masih


dalam tingkatan instar I. Warnanya kemerah- merahan karena masih banyak mengandung makanan cadangan, sehingga mereka masih belum perlu makan (Mudjiman, 1991). Sekitar 24 jam setelah menetas, burayak akan berubah menjadi instar II dimana burayak mulai mempunyai mulut, saluran pencernaan dan dubur; dan cadangan makanan mulai habis. Oleh karena itu burayak mulai mencari makanan untuk kelangsungan hidupnya. Masa burayak akan berakhir setelah menjadi instar XV (artemia dewasa), yaitu saat kakinya sudah lengkap 11 pasang. Proses ini biasanya berlangsung antara 1-3 minggu atau rata-rata sekitar 2 minggu atau 14 hari (Mudjiman, 1991). 2. Klasifikasi hewan uji Artemia merupakan zooplankton yang diklasifikasikan dalam genus artemia dan spesies Artemia salina Leach (Oemarjati dan Wardhana, 1990) 3. Brine Shrimp Lethality Test (BST) Brine Shrimp Lethality Test (BST) merupakan metode penelitian toksisitas sederhana untuk produk alam dengan hewan uji artemia. Tingkat toksisitas suatu campuran bahan aktif dan ekstrak dinyatakan dalam nilai LC50 yang dinyatakan dalam µg/ml. Artemia dapat digunakan untuk skrining awal secara sederhana dan murah untuk senyawa yang sitotoksik (Solis, Wright, Anderson, Gupta, Phillipson, 1993), karena diduga ada kaitan antara uji toksisitas dengan sitotoksisitas jika harga LC 50 dari suatu senyawa kurang dari 1000 µg/ml (Meyer et al., 1982).


Penggunaan artemia memang tidak spesifik untuk anti tumor maupun zat aktif fisiologis tertentu, namun dapat menunjukkan kemungkinan adanya efek sitotoksik

secara

lebih

cepat

dibanding

dengan

prosedur

pemeriksaan

sitotoksisitas yang umum, misalnya dengan biakan sel tumor (Meyer et al., 1982). Penggunaan larva artemia ini juga dikarenakan adanya kesamaan sistem enzim dengan mamalia, yaitu pada DNA-dependent RNA polymerase dan ouabaine sensitive Na+ and K+ dependent ATPase (Solis et al., 1992). Artemia sebagai organisme uji toksisitas memiliki keuntungan karena tidak memerlukan kondisi steril, waktu pelaksanaan singkat (24 jam), sederhana dan murah. Disamping itu jumlah yang besar dapat diterapkan untuk memenuhi tuntutan statistik, karena pembiakan artemia sangat mudah, menggunakan peralatan yang sederhana dan jumlah cuplikan yang dibutuhkan relatif sedikit, yaitu kurang lebih 50 mg untuk ekstrak kasar (Meyer et al., 1982). D. Uji Toksisitas Toksisitas merupakan suatu sifat relatif yang biasa digunakan untuk membandingkan apakah zat kimia yang satu lebih toksik dari zat kimia yang lain. Perbandingan antara zat kimia seperti informasi tentang mekanisme biologi yang dipermasalahkan dan dalam kondisi di mana zat kimia tersebut berbahaya (Loomis, 1978). Pengamatan aktivitas biologi yang dilakukan pada uji toksisitas dapat berupa pengamatan-pengamatan gejala khas, kematian hewan uji atau pengamatan histopatologi organ. Adapun data yang diperoleh pada uji toksisitas dapat berupa


data kuantitatif yang dapat dinyatakan dengan LD50 (Median Lethal Dose) atau LC50 (Median Lethal Concentration) (Loomis, 1978). Kriteria dan petunjuk yang dapat digunakan untuk zat-zat baru (yang belum dikenal) ada bermacam- macam. Kriteria awal yang biasa digunakan dalam evaluasi toksikologi dengan me nggunakan kematian sebagai indeks untuk memperkirakan dosis letal yang mungkin terjadi pada manusia (Amdur et al., 1975). E. Kanker Kanker ialah suatu penyakit sel dengan ciri gangguan atau kegagalan mekanisme pengatur multiplikasi dan fungsi homeostasis lainnya pada organisme multiseluler (Nafrialdi, 1995).

Gamba r 6. Skema siklus sel. Lingkaran luar: I=Interfase, M=Metafase; dalam lingkaran: M=Mitosis, G1 =Gap 1, G2 =Gap 2, S=Sintesis; tidak dalam lingkaran: G0 =Gap 0/istirahat (Wikipedia, 2007). Proses pembelahan sel terjadi dalam beberapa tahap/fase. Sel akan membelah dan diikuti dengan periode dormansi. Sebagian sel tumor selalu berada dalam fase G0 dimana sel yang istirahat hampir tidak tercapai oleh sitostatika. Fase G0 berhubungan dengan fase G1 yang kemudian diikuti dengan fase S dimana DNA secara aktif disintesis. Selanjutnya adalah fase G2 yang merupakan


periode premitotik dimana kromosom terdapat dalam bentuk kromatid. Fase terakhir adalah fase M yaitu sel masuk pada tahapan mitosis (profase, metafase, anafase, dan telofase) dan terjadilah pembelahan sel dimana material inti diturunkan identik kepada sel anak (Gringauz, 1997). Kanker diperkirakan berkembang dari sel dimana mekanisme kontrol pertumbuhan dan proliferasinya berubah. Fase pertama adalah inisiasi yang membutuhkan serangan senyawa karsinogenik terhadap sel normal. Karsinogen ini menyebabkan kerusakan genetik yang jika tidak diperbaiki dapat mengakibatkan mutasi seluler ireversibel. Fase kedua adalah fase promosi dimana karsinogen atau faktor lain mengubah lingkungan agar mendukung pertumbuhan populasi sel termutasi melebihi sel normal. Fase akhir dari pertumbuhan neoplastik disebut progresi, yaitu meningkatnya perubahan genetik yang memicu peningkatan proliferasi sel. Bagian kritis dari fase ini termasuk invasi tumor ke dalam jaringan lokal dan perkembangan metastasis (Dipiro, Talbert, Yee, Matzke, Wells, Posey, 2005). Terdapat dua kelompok utama gen yang memicu karsinogenesis, yaitu onkogen dan gen supresi tumor. Onkogen berkembang dari sel normal (protoonkogen) dan mempunyai peranan penting pada semua fase karsinogenesis. Protoonkogen terdapat dalam semua sel dan penting sebagai pengatur fungsi sel normal, termasuk siklus sel. (Dipiro et al., 2005). Gen supresi tumor mengatur dan menghambat pertumbuhan sel dan proliferasi yang tidak benar. Contoh umum gen supresi tumor adalah gen protein 53 (p53). Gen normal menghasilkan p53 yang bertanggungjawab untuk regulasi


negatif siklus sel, menghentikan siklus sel untuk perbaikan, koreksi, dan merespon sinyal dari luar lainnya. Inaktivasi p53 menyebabkan mutasi dapat terjadi. Fungsi penting lain p53 adalah mungkin memodulasi efek obat sitotoksik. Hilangnya p53 diasosiasikan dengan resistensi terhadap obat antineoplastik (Dipiro et al., 2005).

Gambar 7. Jalur Transduksi sinyal yang berhubungan dengan perkembangan kanker (Rang 2003) Onkogen dan gen supresi tumor dapat menstimulasi dan menginhibisi sinyal yang utamanya mengatur siklus sel. Sinyal ini bertemu pada sistem molekular dalam nukleus yang dikenal sebagai cell cyle clock. Fungsinya dalam jaringan normal adalah untuk mengitegrasikan input sinyal dan menentukan kapan siklus sel harus dimulai. Cell cyle clock terdiri dari beberapa protein yang berinteraksi, yang paling penting adalah cyclin dan cyclin-dependent kinase


(CDKs). CDKs inhibitor telah diidentifikasikan sebagai regulator negatif yang penting dalam siklus sel (Dipiro et al., 2005). Saat mekanisme regulator normal untuk pertumbuhan sel gagal, sistem pertahanan cadangan dapat diaktifkan. Pertahanan sekunder termasuk apoptosis dan cellular senescence (aging). Apoptosis merupakan mekanisme kematian sel normal yang dibutuhkan untuk homeostasis jaringan. Proses ini diatur oleh onkogen dan gen supresi tumor dan juga merupakan mekanisme kematian sel setelah serangan agent sitotoksik. Studi menunjukkan p53 juga mengatur apoptosis. Kehilangan p53 mengganggu jalannya apoptosis normal (Dipiro et al., 2005). Cellular senescence merupakan mekanisme pertahanan lainnya. Sekali saja populasi sel mengalami preset penggandaan maka pertumbuhan terhenti dan sel mati. Hal ini dikenal sebagai senescene, sebuah proses yang diregulasi oleh telomer. Telomer adalah segmen DNA atau ujung akhir kromosom yang bertanggunag jawab untuk melindungi ujung akhir DNA dari kerusakan. Tiap replikasi, panjang telomer semakin pendek. Setelah telomer menjadi pendek hingga panjang kritis, senescence bertindak untuk menghitung dan membatasi jumlah penggandaan sel. Pada sel kanker, fungsi telomer diatasi oleh ekspresi berlebihan enzim telomerase. Telomerase menggantikan bagian telomer yang hilang pada tiap pembelahan, sehingga menghindari senescence dan mengizinkan penggandaan sel dengan jumlah yang terbatas (Dip iro et al., 2005). Anti kanker diharapkan memiliki toksisitas selektif, artinya mampu menghancurkan sel kanker tanpa merusak sel normal. Pada umumnya anti


neoplastik menekan pertumbuhan/proliferasi sel dan menimbulkan toksisitas, karena menghambat pembelahan sel normal yang proliferasinya cepat misal sumsum tulang, epitel germinativum, mukosa saluran cerna, folikel rambut dan jaringan limfosit. Terapi hanya dapat dikatakan berhasil baik, apabila dosis yang digunakan dapat mematikan sel tumor yang ganas dan tidak terlalu mengganggu sel normal yang berpoliferasi (Nafrialdi, 1995). F. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Kromatografi lapis tipis merupakan metode pemisahan fisikokimia. Metode ini didasarkan atas pembagian campuran senyawa dalam dua fase yaitu fase diam dan fase gerak (Stahl, 1969). Fase diam meliputi adsorben sedangkan fase gerak meliputi suatu larutan pengembang. Adsorben dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai penunjang fase diam. Fase gerak akan merayap sepanjang fase diam sehingga terbentuklah kromatogram. Materi pelapis lempeng pada umumnya digunakan silika gel, tetapi kadangkala bubuk selulosa, tanah diatome dan kieselguhr (Khopkar, 1990). Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada KLT lebih baik dikerjakan dengan pereaksi lokasi kimia dan reaksi-reaksi warna. Jika pereaksi kimia digunakan untuk lokasi, maka dapat dilakukan dengan penyemprotan (Hardjono, 1983). Pada umumnya identifikasi menggunakan harga Rf, meskipun kurang tepat. Harga Rf dapat didefinisikan sebagai berikut: Rf =

Jarak bercak senyawa dari titik asal Jarak pelarut dari titik awal

(Stahl, 1969)


Kelebihan khas KLT adalah keserbagunaan, kecepatan dan kepekaannya dibandingkan dengan kromatografi kertas. Keserbagunaan KLT disebabkan oleh kenyataan bahwa disamping selulosa, sejumlah plat kaca atau penyangga lain dan digunakan untuk kromatografi (Harborne, 1984). G. Maserasi Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana, yang dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari, cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan zat aktif di luar sel, maka larutan yang terpekat didesak keluar. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan konsent rasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel (Anonim, 1986). Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari dan tidak mengandung zat yang mudah mengembang dalam cairan penyari dan tidak mengandung benzoin atau stirak. Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, campuran air etanol atau pelarut lain yang cocok, untuk cairan penyari air perlu ditambah pengawet pada awal penyarian untuk mencegah timbulnya kapang. Keuntungan cara maserasi ini adalah cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sangat sederhana dan mudah diusahakan, sedangkan kerugiannya pengerjaannya butuh waktu lama dan hasil penyarian kurang sempurna. Cara maserasi ini dapat dipercepat dengan menggunakan mesin pengaduk yang terus menerus berputar sehingga mempersingkat waktu maserasi menjadi 6-24 jam (Anonim, 1986).


H. Landasan Teori Tembelekan merupakan salah satu tumbuhan obat yang cukup banyak digunakan masyarakat dan dilaporkan toksik pada binatang yang memakan daunnya. Toksisitas tumbuhan tembelekan ini disebabkan karena kandungan lantadene A yang merupakan triterpenoid pentasiklik dan flavonoid nya. Triterpenoid dan flavonoid yang aglikonnya yang kurang polar diketahui dapat larut dalam pelarut non polar, salah satunya adalah kloroform. Triterpenoid bekerja dengan menghambat kerja enzim topoisomerase I dan II serta menghambat RNA polymerase, dan flavonoid bekerja dengan menginduksi apoptosis sehingga mengakibatkan kematian sel. Toksisitas daun tumbuhan tembelekan diuji menggunakan metode BST yang merupakan pengujian toksisitas tahap awal. Metode ini adalah pengujian bioaktivitas suatu bahan dengan organisme uji berupa larva artemia. Digunakan larva ini karena terdapat kesamaan sistem enzim dengan mamalia, yaitu pada DNA-dependent RNA polymerase dan ouabaine sensitive Na+ and K+ dependent ATPase. Senyawa dikatakan toksik jika nilai LC50 kurang dari 1000 µg/ml. Jika senyawa tersebut berefek toksik terhadap larva artemia, maka senyawa tersebut dapat diuji lebih lanjut untuk mengetahui efeknya sebagai antikanker dengan menggunakan biakan sel kanker. I. Hipotesis Ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan diduga bersifat toksik terhadap larva artemia.


BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Brine Shrimp Lethality Test (BST) ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan terhadap larva artemia merupakan jenis penelitian eksperimental murni denga n rancangan Posttest Only Control Group Design. Lokasi penelitian adalah

laboratorium

Farmakognosi-Fitokimia Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta. B. Variabel dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian a. Variabel bebas: konsentrasi ekstrak kloroform daun tumb uhan tembelekan, yaitu 50, 100, 200, 400, dan 800 µg/ml yang diujikan pada larva artemia. b. Variabel tergantung: jumlah larva artemia yang mati akibat pemberian ekstrak

kloroform

daun

tumbuhan

tembelekan

dengan

berbagai

konsentrasi. c. Variabel pengacau terkendali, yaitu: 1. Umur larva artemia, yaitu 48 jam 2. Lingkungan tempat percobaan yang meliputi: pH air laut buatan antara 7-8 dengan kadar garam 5 per mil, cahaya untuk mempercepat penetasan larva artemia dengan menggunakan sinar lampu 5 watt, serta suhu lingkungan yang optimal bagi kelangsungan hidup larva artemia yang berkisar antara 25-30°C. 3. Faktor jenis atau varietas tumbuhan tembelekan.

21


4. Teknik dan lamanya penyarian daun tumbuhan tembelekan. d. Variabel pengacau tak terkendali: kondisi lingkungan tempat tumbuh tumbuhan tembelekan. 2. Definisi operasional a. Median Lethal Concentration (LC 50 ) adalah konsentrasi larutan senyawa uji yang menyebabkan kematian separuh dari hewan uji dengan perlakuan selama 24 jam dan merupakan data kuantitatif yang diperoleh pada uji BST, dinyatakan dalam µg/ml. b. Larva artemia yang mati adalah larva yang tidak menunjukkan adanya kehidupan yang ditandai dengan tidak adanya gerakan sekecil apa pun dari larva. c. Ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan adalah ekstrak kental atau kering yang dib uat dengan menyari daun tembelekan dalam pelarut kloroform dengan cara maserasi selama 48 jam. d. Larva artemia adalah larva yang telah berumur 48 jam hasil penetasan siste artemia. C. Bahan Penelitian 1. Bahan utama Bahan penelitian ini berupa daun tumbuhan tembelekan yang diperoleh dari Kaliurang, Yogyakarta pada bulan Agustus 2006. 2. Bahan untuk ekstraksi Bahan untuk ekstraksi adalah kloroform pro analysis (p.a) (MERCK).


3. Bahan untuk KLT Semua bahan untuk KLT berderajat p.a kecuali serbuk Liquiritiae Radix yang berderajat farmasetis. 1. Untuk uji flavonoid. Bahan yang digunakan antara lain selulosa (MERCK), n-butanol, asam asetat, aquadest, ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan, pembanding rutin 1%, uap ammonia, dan pereaksi AlCl3 . 2. Untuk uji triterpenoid. Bahan yang digunakan antara lain silika gel GF 254 (MERCK), toluene, etil asetat, ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan, ekstrak kloroform Liquiritiae Radix dan pereaksi semprot vanilin asam sulfat. 4. Bahan untuk pembuatan air laut buatan Semua bahan kimia untuk pembuatan air laut buatan berderajat teknis. Bahan-bahan tersebut adalah kalium klorida, kalsium klorida, magnesium klorida, magnesium sulfat, natrium bikarbonat, natrium klorida, aquadest, aquadest bebas CO2 , dan aquadest panas. 5. Bahan untuk uji toksisitas (BST) a. Larva artemia yang berumur 48 jam merupakan hasil penetasan siste Artemia salina Viper (Jeannie Hoo., LTD, China) dalam air laut buatan berkadar 5 permil. b. Larutan ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan dengan konsentrasi 50, 100, 200, 400, dan 800 µg/ml. c. Air laut buatan berkadar 5 permil. d. Suspensi Sacharomyces cerevisiae (ragi) sebagai makanan bagi larva artemia.


D. Alat-alat Penelitian 1. Alat untuk ekstraksi Alat-alat yang digunakan untuk ekstraksi antara lain: blender, shaker (Innova 2100), gelas ukur (Pyrex), Erlenmeyer (Pyrex), gelas Beker (Pyrex), sendok, pipet ukur, pipet volume, kertas saring, Vaccum Rotary Evaporator (Janke & Kunkel), Waterbath (Memert), neraca analitik (Mettler Toledo AB 204), batang pengaduk, dan cawan porselen. 2. Alat untuk uji BST Alat-alat yang digunakan untuk uji BST antara lain: flakon, bak penetas artemia, mikropipet (Socorex ISBA S.A), lampu 5 watt (dop), aerator (Niko NK 1200), pipet tetes, pipet khusus BST, neraca analitik (Mettler Toledo AB 204), dan Vortek (Dijkstra). 3. Alat untuk KLT Alat-alat yang digunakan untuk KLT antara lain: pipet kapiler, bejana kromatografi, alat semprot, kertas saring, dan lampu UV 254 dan 365 nm. E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tumbuhan Determinasi dilakukan untuk memastikan jenis tumbuhan tembelekan yang akan digunakan untuk penelitian. Determinasi tumbuhan tembelekan dilakukan di Laboratorium Kebun Obat, Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta serta dengan menggunakan buku acuan menurut Van Stenis (1981).


2. Pengumpulan bahan Daun tumbuhan tembelekan dikumpulkan dari Kaliurang, Yogyakarta pada bulan Agustus 2006. Daun tumbuhan tembelekan yang telah dikumpulkan diambil daunnya, dicuci dengan menggunakan air mengalir, dikeringkan dengan dijemur secara tidak langsung dengan ditutupi kain hitam. Setelah kering kemudian diserbuk dengan cara diblender. 3. Pembuatan ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan Sebanyak 30 gram serbuk daun tumbuhan tembelekan ditimbang dan dimasukkan dalam Erlenmeyer dengan ditambah 225 ml kloroform. Erlenmeyer ditutup dengan aluminium foil kemudian diletakkan pada shaker dengan laju konstan (120 rpm) selama 24 jam lalu larutan disaring dengan kertas saring. Maserat ditampung dan disimpan pada suhu kamar sedangkan ampasnya dimaserasi lagi dengan 225 ml kloroform menggunakan shaker 120 rpm selama 24 jam, lalu disaring dan maserat ditampung untuk digabungkan dengan maserat hasil maserasi 24 jam pertama. Maserat yang terkumpul lalu dipekatkan dengan vaccum rotary evaporator sampai kental (volume kira-kira 1/3 nya). Setelah itu, dengan menggunakan cawan porselen yang sudah ditimbang terlebih dahulu, ekstrak diuapkan di atas waterbath dengan suhu 50°C dan dengan kipas angin sampai didapatkan ekstrak kering. Ekstrak kering ini kemudian dibungkus rapat dan disimpan dalam eksikator.


4. Pembuatan air laut buatan Air laut buatan diperoleh dengan cara melarutkan: 5,0 g natrium klorida (NaCl); 1,3 g magnesium sulfat (MgSO4 ); 1,0 g magnesium klorida (MgCl2 ); 0,3 g kalsium klorida (CaCl2 ); 0,2 g kalium klorida (KCl2 ); dan 2,0 g natrium bikarbonat (NaHCO3 ) dalam sebagian aquadest dengan menggunakan labu takar 1 liter. Khusus untuk magnesium sulfat dilarutkan dalam aquadest panas, sedangkan natrium bikarbonat dilarutkan dalam air bebas CO2 . Bahan-bahan tersebut lalu dicampur dan ditambahkan aquadest sampai volume tepat 1 liter, sehingga diperoleh air laut buatan dengan kadar garam 5 per mil. 5. Penetasan siste artemia Siste artemia ditetaskan dengan media air laut buatan berkadar 5 permil dalam bak penetasan artemia yang disekat menjadi 2 bagian, bagian terang dan bagian gelap, dengan lubang sekat 1 cm. Bagian gelap merupakan tempat siste artemia ditaburkan. Siste menetas setelah kira-kira 24 jam kemudian menjadi larva. Larva yang aktif akan bergerak menuju tempat yang terang melalui lubang pada sekat. Larva berumur 48 jam yang aktif inilah yang akan digunakan untuk BST. 6. Penyiapan sampel uji toksisitas Ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan dibuat seri konsentrasi 50, 100, 200, 400, dan 800 µg/ml. Seri konsentrasi 50, 100, dan 200 µg/ml dibuat dari pengenceran larutan ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan berkonsentrasi 10 mg/ml (larutan A), sedangkan seri konsentrasi 400 dan 800 µg/ml dibuat dari pengenceran larutan ekstrak kloroform daun tumbuhan


tembelekan berkonsentrasi 1 mg/ml (larutan B). Kelompok ini merupakan kelompok perlakuan. Selain itu dilakukan pengujian terhadap kelompok kontrol, yaitu larutan kloroform yang tidak mengandung ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan. Dilakukan replikasi sebanyak 5 kali. 7. Uji toksisitas Uji dilakukan dengan menggunakan larva artemia yang berumur 48 jam. Sepuluh ekor larva artemia yang berumur 48 jam diambil secara random, dimasukkan ke dalam flakon yang berisi sampel dengan konsentrasi tertentu dan air laut buatan sebanyak 3 ml yang telah divortex. Kemudian ditambah air laut buatan sampai 5 ml dan 1 tetes ragi (1,5 mg/5 ml) sebagai makanan. Setiap pengujian selalu disertai dengan kontrol dan tiap konsentrasi dibuat dalam 5 kali ulangan. Flakon dijaga agar selalu mendapat penerangan. Selama 24 jam, jumlah larva yang mati dihitung untuk mengetahui nilai probit dan dianalisis untuk mengetahui harga LC 50 (Meyer et al., 1982). 8. Identifikasi kualitatif senyawa aktif dengan KLT Ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan (larutan A) ditotolkan pada plat KLT (3 totol). Plat KLT dimasukkan ke dalam bejana yang telah jenuh dengan fase gerak lalu dielusi sampai jarak rambat 10 cm, kemudian diangkat dan dikeringkan. Untuk memastikan letak dan warna bercak sampel serta pembandingnya maka dilakukan deteksi dengan menggunakan pereaksi semprot yang sesuai.


a. flavonoid 1). Fase diam

: selulosa

2). Fase gerak : n-butanol:asam asetat:air (4:1:5 v/v fase atas) 3). Standar 4). Deteksi

: rutin : visibel, UV 254 nm dan UV 365 nm sebelum dan sesudah diuapi amonia dan dengan pereaksi AlCl3

b. triterpenoid 1). Fase diam

: silika gel GF 254 (MERCK)

2). Fase gerak

: toluen:etil asetat (93:7 v/v)

3). Pembanding

: ekstrak etanol Liquiritiae Radix

4). Deteksi

: visibel, UV 254 nm dan UV 365 nm, dan vanillin asam sulfat (pemanasan 100-110 °C, 10 menit) F. Analisis Data

Data persentase kematian larva artemia yang diperoleh dianalisis probit SPSS untuk menghitung harga LC 50 . Jika pada kontrol ada larva artemia yang mati, maka persen kematian ditentukan dengan rumus Abbot (Kumar, Prasad, Singh, 2005). % kematian terkoreksi =

%kematian perlakuan − % kematian kontrol × 100 % 100 − % kematian kontrol

(Kumar et al., 2005)


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Determinasi Tanaman Tujuan dilakukan determinasi tanaman adalah untuk memastikan kebenaran tanaman yang digunakan dalam penelitian ini. Determinasi dilakukan di Laboratorium Kebun Obat, Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta serta dengan menggunakan buku acuan (Van Steenis, 1981). Berdasarkan determinasi yang telah dilakukan (lampiran 1), diperoleh kesimpulan bahwa tumbuhan yang digunakan adalah benar-benar tumbuhan Lantana camara L.. B. Pengumpulan Bahan dan Penyarian Zat Aktif Daun tumbuhan tembelekan diperoleh di Kaliurang, Yogyakarta pada bulan Agustus 2006. Tumbuhan yang telah dikumpulkan diambil daunnya. Daun yang diambil merupakan daun ke-4 sampai ke-5 dari ujung tangkai. Pemilihan ini bertujuan agar daun yang digunakan memiliki umur yang relatif sama sehingga kadar senyawa aktifnya tidak berbeda secara bermakna (Anonim, 1985). Daundaun tersebut kemudian dicuci dengan air mengalir agar tanah dan pengotor lainnya dapat terlepas. Kemudian daun dikeringkan dengan dijemur secara tidak langsung dengan ditutup kain hitam. Tujuan pengeringan secara tidak langsung adalah agar senyawa aktif yang terdapat di dalam tanaman tidak rusak karena paparan panas, sedangkan tujuan pengeringan adalah untuk mempermudah penyerbukan simplisia, menurunkan kadar air sehingga tidak ditumbuhi jamur, meminimalkan reaksi enzimatis, dan untuk menjamin agar kualitasnya tetap baik sehingga dapat disimpan dalam waktu ya ng cukup lama (Anonim, 1986).

29


Pengeringan dilakukan hingga kadar air dalam simplisia kurang dari 10% yang ditandai dengan daun yang mudah hancur ketika diremas. Simplisia yang telah kering kemudian diserbuk menggunakan blender. Penyerbukan ini bertujuan untuk memperluas permukaan yang kontak dengan larutan penyari sehingga kandungan kimia yang dapat terlarut selama proses penyarian akan lebih banyak dan penyarian dapat berjalan lebih sempurna (Anonim, 1986). Pada penelitian ini penyarian dilakukan dengan metode maserasi dengan larutan penyari kloroform. Maserasi merupakan salah satu metode ekstraksi dengan cara dingin. Pemilihan metode ini dipilih didasarkan pada pelarut yang digunakan, yaitu kloroform yang mempunyai sifat sangat mudah menguap pada suhu kamar, sedangkan kloroform dipilih sebagai pelarut karena kloroform mampu menarik senyawa aglikon flavonoid yang kurang polar (Markham, 1988). Selain itu kloroform merupakan salah satu pelarut yang biasa digunakan untuk mengekstraksi senyawa golongan terpenoid yang bersifat kurang polar (Harborne, 1984). Pada proses maserasi, bahan tumbuhan direndam dalam suatu wadah tertutup rapat selama kurang lebih 48 jam dan selama masa perendaman tersebut dilakukan

penggojokan

sesering

mungkin.

Penggojokan

berulang

ini

memungkinkan pelarut masuk ke seluruh permukaan bahan serbuk dan kesetimbangan konsentrasi bahan ekstraktif yang lebih cepat ke dalam penyarian karena keadaan diam selama maserasi menyebabkan turunnya perpindahan bahan aktif.


Pada penelitian ini digunakan 30 gram serbuk daun tembelekan dan 225 ml kloroform (perbandingan 10 : 75) yang dimasukkan dalam Erlenmeyer yang kemudian ditutup rapat dengan aluminium foil. Hal ini bertujuan untuk menghindari terjadinya oksidasi senyawa dan agar kloroform tidak menguap sehingga penyarian dapat maksimal. Setelah itu Erlenmeyer diletakkan pada shaker dengan laju konstan (120 rpm) selama 2 x 24 jam, dengan tiap 24 jam disaring dan diganti pelarutnya. Penyarian dilakukan selama 2 x 24 jam untuk memastikan bahwa zat aktif yang terkandung dalam daun tumbuhan tembelekan sudah tersari dengan sempurna. Maserat yang didapat kemudian dikeringkan vaccum rotary evaporator hingga sepertiga bagiannya dan dilanjutkan dengan dipekatkan dalam wadah cawan porselen menggunakan waterbath dengan suhu 50° C. Vaccum rotary evaporator digunakan karena alat ini dapat diatur tekanannya (474 mmHg untuk kloroform), sehingga diharapkan hanya kloroform saja yang menguap. Suhu 50° C merupakan suhu optimal untuk penguapan di atas waterbath. Ekstrak kering yang didapatkan dari proses ekstraksi di atas sebanyak 1,32 gram. Ekstrak kering dalam cawan porselen ini kemudian ditutup dengan aluminium foil dan dimasukkan ke dalam eksikator agar tidak ada udara, air, ataupun uap air

yang dapat masuk yang dapat menyebabkan ekstrak menjadi

rusak. Selain itu eksikator ini juga dapat menarik sisa air dalam ekstrak sehingga ekstrak akan semakin kering jika pengeringan yang dilakukan sebelumnya kurang sempurna.


C. Pembuatan Air laut Buatan Air laut buatan yang digunakan untuk menetaskan siste dan sebagai tempat hidup artemia berkadar 5 per mil (1 ml aquadest mengandung 5 mg natrium klorida) agar dicapai hasil penetasan yang optimal. Apabila digunakan air berkadar garam tinggi dikhawatirkan siste tidak akan menetas karena tekanan osmose di luar telur lebih tinggi, sehingga siste tidak dapat menyerap air yang cukup untuk proses metabolismenya. Pada pembuatan air laut buatan magnesium sulfat dilarutkan dalam aquadest panas karena magnesium sulfat lebih mudah larut dalam air panas, sedangkan natrium bikarbonat dilarutkan dalam air bebas CO2 . Agar mencegah kekeruhan, maka larutan natrium bikarbonat dalam air bebas CO2 tersebut dicampurkan terakhir kali dengan bahan lainnya. Penambahan natrium bikarbonat bertujuan untuk mempertahankan pH air laut buatan agar tetap berkisar antara 8-9. pH berpengaruh terhadap penetasan siste karena pemecahan cangkang siste dibantu oleh kegiatan enzim penetasan yang membutuhkan pH sekitar 8-9. D. Penetasan Siste Siste artemia yang kering (kadar air kurang dari 10%) berisi embrio dalam keadaan diapauze (metabolisme terhenti untuk sementara). Sebelum ditetaskan, siste artemia ini direndam dalam aquadest selama satu jam sehingga terjadi penyerapan air ke dalam siste. Penyerapan ini berlangsung secara hiperosmotik

(tekanan

osmose

di

dalam

siste

lebih

tinggi

dibanding

lingkungannya). Dalam satu jam kadar air dalam siste diperkirakan sudah mencapai 65% sehingga metabolisme embrio yang semula berada dalam keadaan


diapauze menjadi aktif kembali (Kristiana, 2005). Setelah direndam selama satu jam, siste disaring dan ditiriskan selama satu jam untuk mengurangi sisa-sisa aquadest. Kemudian telur dimasukkan ke dalam bak penetasan bagian kompartemen gelap berisi 500 ml air laut buatan yang telah diaerasi selama kurang lebih dua jam dengan aerator. Tujuan aerasi ini adalah untuk memberikan oksigen yang cukup bagi kelangsungan hidup larva artemia. Dalam waktu 24-36 jam siste artemia akan menetas dan berkembang menjadi larva. Larva yang baru menetas (instar I) berwarna kemerah- merahan karena masih banyak mengandung cadangan makanan. Oleh karena itu, larva artemia masih belum membutuhkan makanan. Setelah larva berumur 24 jam, larva berubah menjadi instar II dan mulai mempunyai mulut, saluran pencernaan, dan dubur. Bersamaan dengan itu, cadangan makanan larva habis sehingga perlu diberi makanan berupa suspensi ragi dengan konsentrasi 1,5 mg dalam 5 ml air laut buatan. E. Uji Toksisitas dengan BST Metode BST dikerjakan sebagai skrining awal untuk mengetahui tingkat ketoksikan suatu senyawa dalam tanaman terhadap larva artemia. Tingkat toksisitas itu dilihat pada harga LC 50 , yaitu konsentrasi senyawa uji yang mampu mengakibatkan terbunuhnya 50% jumlah hewan uji. Jika nilai LC 50 yang lebih kecil dari 1000 µg/ml dikatakan toksik; sebaliknya nilai LC 50 yang lebih besar dari 1000 µg/ml dikatakan tidak toksik. Tingkat ketoksikan tersebut memberikan makna terhadap potensi aktivitasnya (Meyer et al., 1982).


Uji toksisitas ini menggunakan artemia yang berumur 48 jam karena pada umur 48 jam tersebut artemia telah mencapai instar 2 dan 3 di mana memiliki sensitivitas yang besar terhadap senyawa yang diuji (Carballo, Hernandez-Inda, Perez, Garcia-Gravalos, 2002). Toksisitas diperoleh dengan menghitung jumlah larva artemia yang mati setelah 24 jam perlakuan dan untuk setiap konsentrasi uji dilakukan replikasi lima kali. Berdasarkan jumlah larva yang mati, dapat ditentukan persentase kematiannya menggunakan rumus Abbot (tabel III). Adapun cara perhitungan dapat dilihat pada lampiran 5 dan 6. Kemudian harga LC 50 dihitung dengan analisis probit. Nilai probit didapat dengan mengubah prosentase kematian berdasarkan tabel probit, kemudian dibuat kurva antara log konsentrasi versus nilai probit. Tabel III. Data kematian larva artemia karena pengaruh ekstrak kloroform daun tembelekan setelah 24 jam Konsentrasi (µg/ml) replikasi

1 2 3 4 5

50

100

Kontrol 200

0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 Persentase kematian (%)

400

800

50

100

0 0 0 1 0

1 0 1 1 1

3 3 3 3 1 22,92

4 3 5 4 4 36,17

Perlakuan 200 400 6 5 6 5 4 48,94

6 7 7 5 5 59,18

800 8 6 7 9 8 73,91

Dari data persentase kematian kemudian dihitung harga LC 50 dengan metode analisis probit dengan menggunakan program komputer SPSS10.0. Analisis probit dapat digunakan dalam penentuan LC 50 karena dapat memberikan nilai regresi yang menghasilkan garis linear. Berdasarkan analisis probit, maka diperoleh persamaan garis lurus: y = 1,10880x – 2,60102 seperti yang terlihat pada gambar 8.


Probit Transformed Responses ,8 ,6 ,4 ,2 0,0 -,2

Probit

-,4 -,6 -,8

Rsq = 0,9954

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

2,8

3,0

Log of KONS

Gambar 8. Kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan Dari gambar di atas didapatkan nilai Rsq yang merupakan koefisien determinasi yang mengukur tingkat ketepatan dari regresi linier sederhana, yaitu merupakan persentase sumbangan X terhadap variasi (naik atau turunnya) Y. Dari analisis didapatkan nilai Rsq sebesar 0,9954 yang berarti bahwa persentase sumbangan X (konsentrasi ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan) terhadap variasi Y (jumlah kematian artemia) sebesar 99,54%. Dari nilai Rsq juga dapat dihitung nilai r yaitu akar dari Rsq. Dari penelitian ini didapatkan nilai r sebesar 0,9977. Nilai r merupakan koefisien korelasi dalam hubungan dua variabel X dan Y yang mengukur kuatnya hubungan antara X dan Y. Berdasarkan tabel nilai r denga n taraf kepercayaan 95% dan derajat bebas 3 diketahui nilai r sebesar 0,878. Nilai r hasil penelitian lebih besar daripada nilai r tabel. Hal ini menunjukkan hubungan korelasi yang linier antara konsentrasi dengan nilai probit dimana meningkatnya konsentrasi diikuti dengan meningkatnya respon.


Hasil analisis probit menunjukkan nilai LC 50 ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan sebesar 221,7 µg/ml. Nilai LC 50 ini lebih besar dari nilai LC50 ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan hasil penelitian Sugianti (2007), yaitu 60,4 µg/ml. Dengan demikian ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan dikatakan bersifat toksik terhadap larva artemia, tetapi lebih kurang toksik jika dibandingkan dengan ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan. F. Hasil Uji Kualitatif Kandungan Senyawa Aktif Metode ini dilakukan untuk memperoleh gambaran mengenai golongan senyawa yang terdapat dalam ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan. Pemeriksaan kandungan kimia ekstrak klororform daun tumbuhan tembelekan dilakukan terhadap senyawa golongan flavonoid dan triterpenoid. Deteksi dilakukan secara visibel, di bawah sinar UV 254 nm dan 365 nm, dan menggunakan pereaksi-pereaksi yang spesifik. Pada KLT digunakan pereaksi-pereaksi yang terbatas macamnya, sehingga hasil yang diperoleh baru dapat memberikan informasi pendahuluan tentang golongan senyawa yang kemungkinan terdapat dalam ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan, namun belum memberikan informasi mengenai anggota golongan senyawa yang lebih terperinci. Hasil identifikasi golongan senyawa ekstrak klororform daun tumbuhan tembelekan dengan metode KLT adalah sebagai berikut: 1. Identifikasi flavonoid Pemeriksaan flavonoid menggunakan fase diam selulosa, fase gerak BAW (4:1:5), dan pembanding rutin yang merupakan glikosida flavonol. Deteksi


yang digunakan adalah dengan sinar ultraviolet, yang merupakan deteksi umum untuk senyawa yang memiliki ikatan rangkap terkonjugasi. Flavonoid mempunyai ikatan rangkap terkonjugasi maka dapat menunjukkan pita serapan pada daerah spektrum UV. Selain itu juga dideteksi dengan uap ammonia yang menunjukkan bercak berwarna kuning yang mantap (Wagner et al.,1984). Dengan pereaksi AlCl3 , flavonoid akan membentuk kompleks berwarna kuning (Mabry, 1970). O OH O HO

O

O

O

+ 4 NH3

OH

+ 4 NH4

O rhamnoglucosyl

O rhamnoglucosyl

O

OH O

O

Gambar 9. Reaksi flavonoid dengan uap ammonia O OH HO HO

O

OH O rhamnoglucosyl

OH

O

Rutin

O

+ 2 AlCl 3

Al Cl O

+ 3 HCl

O rhamnoglucosyl O O Al Cl Cl

Kompleks warna kuning

Gambar 10. Reaksi flavonoid dengan pereaksi AlCl3 Tabel IV. Hasil KLT pemeriksaan flavonoid dalam ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan Uap amonia Uap ammonia UV 365 nm AlCl3 Bercak Rf Warna Rf Warna Rf Warna 1. sampel 0,95 Hijau 0,95 Coklat 0,95 Hijau kuning kemerahan kuning 2. rutin 0,64 Kuning 0,64 Biru gelap 0,64 Kuning


A

B

C

Gambar 11. Kromatogram ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan untuk pemeriksaan flavonoid dengan jarak pengembangan 10 cm. Keterangan: Fase diam

: selulosa

Fase gerak

: n-butanol:asam asetat:air (4:1:5 v/v)

Deteksi

: A. Uap ammonia visibel B. Uap ammonia dengan UV 365 nm C. Pereaksi AlCl3 visibel

1. Sampel

: ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan

2. Standar

: rutin

Hasil penelitian menunjukkan bahwa harga Rf bercak sampel dan standar berada cukup jauh dan warna kedua bercak tersebut berbeda. Harga Rf bercak sampel yaitu 0,95 dan harga Rf bercak rutin yaitu 0,64. Pada deteksi uap ammonia visible dan deteksi dengan pereaksi AlCl3 visible, bercak sampel tampak berwarna hijau kuning sedangkan bercak rutin berwarna kuning. Pada deteksi uap amonia


UV 365 nm, bercak sampel berwarna coklat kemerahan sedangkan bercak rutin berwarna biru gelap. Berdasarkan hasil yang diperoleh tersebut dengan kedua bercak yang memiliki harga Rf dan warna bercak yang berbeda maka ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan tidak mengandung senyawa flavonoid golongan flavono l. Pada penelitian Sugianti (2007) ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan diduga mengandung senyawa flavonoid jenis flavon atau flavonol yang tidak mengandung 5-OH. 2. Identifikasi triterpenoid Identifikasi triterpenoid menggunakan fase diam silika GF 254, fase gerak toluene : etil asetat (93:7), dan pembanding ekstrak kloroform Liquiritiae Radix. Silika gel GF 254 mengandung gypsum (CaSO4 ) dan indikator flouresensi yang dapat berfluoresensi di bawah sinar ultraviolet 254 nm. Jika suatu senyawa memiliki ikatan rangkap terkonjugasi atau cincin aromatik maka bercak akan meredam pada panjang gelombang 254 nm dan akan berfluoresensi pada panjang gelombang 365 nm. Triterpenoid mengandung sedikit kromofor sehingga bercak akan memberikan warna lemah di bawah sinar UV tanpa indikator. Oleh itu digunakan indikator fluoresensi pada silika gel GF 254 untuk memperjelas bercak ketika dideteksi. Pembanding yang digunakan adalah ekstrak kloroform Liquiritae Radix karena komponen utama penyusun Liquiritae Radix adalah triterpenoid. Deteksi dilakukan dengan menggunakan 3 macam deteksi, yaitu dengan sinar UV 254 nm dan 365 nm, dan menggunakan pereaksi vanilin asam sulfat dengan pemanasan


110°C selama 10 menit karena vanilin asam sulfat merupakan pereaksi yang spesifik untuk triterpenoid. Triterpenoid yang bereaksi dengan vanilin asam sulfat akan memberikan warna biru, biru-violet (Wagner, 1984). H

H

H H

CH3O HOOC C C C O

O

O

H

H 3C

+ H 2SO 4 +

O

C H

H O

H3 C

H

Vanilin

Lantadene

H

H OH

O H3 C

C

C

O

+ HSO4 + H +

CH3O

H

HOOC C O

C H

H O

H3 C

H

H

H

O

H

O H C

CH3O

HOOC

C

O

C

C

H

+ H 2SO4

H

H3 C O CH3

OH

H

H O OH

CH3 O

H C

C

C

C

HOOC O

H

H

H3C O CH3

OH

- H2 O H

H C

CH3 O

HOOC

C

O

C

H

O

C

H

H

H3 C O OH

CH3


H

H O

CH3 O

H C

C

C

C

HOOC O

H

H

H3C O O

CH3

H

(Warna ungu)

Gambar 12. Reaksi triterpenoid dengan vanilin asam sulfat Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat bercak sampel dan bercak pembanding yang memiliki harga Rf dan warna yang hampir sama, yaitu bercak c sampel dengan bercak b pembanding; dan bercak f sampel dengan bercak c pembanding. Bercak a sampel memiliki harga Rf hampir sama dengan bercak a pembanding namun warnanya berbeda. Bercak c sampel memiliki harga Rf 0,3 dengan warna ungu muda, sedangkan bercak b pembanding memiliki harga Rf 0,28 dengan warna ungu muda juga. Bercak f sampel memiliki harga Rf 0,89 dengan warna ungu tua dan bercak c pembandingnya memiliki harga Rf 0,87 dengan warna bercak ungu muda. Tabel V. Hasil KLT pemeriksaan triterpenoid dalam ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan dengan deteksi vanilin asam sulfat Sampel Pembanding Bercak Rf Warna Rf Warna a 0,06 Ungu muda 0,07 Merah b 0,19 Ungu muda 0,28 Ungu muda c *) 0,30 Ungu muda 0,87 Ungu muda d 0,50 Ungu muda E 0,63 Ungu muda ) f* 0,89 Ungu tua Keterangan:* ) bercak senyawa triterpenoid


Gambar 13. Kromatogram ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan untuk pemeriksaan triterpenoid dengan jarak pengembangan 10 cm. Keterangan: Fase diam

: silika gel GF 254

Fase gerak

: toluene : etil asetat (93:7)

Deteksi

: vanillin asam sulfat (110°C, 10 menit)

1. Sampel

: ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan

2. Pembanding

: ekstrak kloroform Liquiritiae Radix

Hasil uji KLT (gambar 13 dan table V) menunjukkan bahwa ekstrak kloroform

daun

tumbuhan

tembelekan

mengandung

senyawa

golongan

triterpenoid. Pada penelitian Sugianti (2007), ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan juga mengandung senyawa golongan triterpenoid. Triterpenoid yang terkandung dalam ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan diduga berbeda dengan triterpenoid pada ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan. Jenis triterpenoid yang terkandung dalam ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan bersifat non polar, sedangkan pada ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan


bersifat polar. Hal ini karena adanya perbedaan polaritas penyari, dimana kloroform bersifat non polar sedangkan etanol bersifat polar. Pada prinsipnya larutan penyari akan melarutkan senyawa yang memiliki kepolaran yang mirip. Hasil KLT ini belum dapat memberikan informasi yang pasti mengenai senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan karena metode ini hanya metode sederhana sebagai uji awal yang memberikan kemungkinan adanya senyawa yang terdapat dalam ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan. Berdasarkan hasil KLT di atas maka senyawa yang diduga bersifat toksik terhadap larva artemia adalah triterpenoid. Diketahui senyawa triterpenoid dapat menghambat enzim topoisomerase I dan II. Topoisomerase merupakan enzim yang berperan penting dalam transkripsi dan replikasi DNA, di antaranya dalam menguraikan untaian DNA dan untuk memasangkan DNA dengan pasangannya selama replikasi. Mekanisme kerja triterpenoid dalam menghambat replikasi DNA diduga dapat melalui dua cara yaitu dengan berikatan dengan DNA menggantikan

kedudukan

enzim

topoisomerase,

atau

dengan

mengikat

topoisomerase sehingga DNA tidak dapat bereplikasi. Selain itu, triterpenoid ini juga dapat menghambat enzim RNA polymerase yang mengkatalis sintesis RNA. Penghambatan enzim ini akan menyebabkan kematian sel karena DNA dan protein yang tidak dapat terbentuk.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan 1. Ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan bersifat toksik terhadap larva artemia. 2. LC50 ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan sebesar 221,7 µg/ml. 3. Ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan mengandung senyawa triterpenoid.

B. Saran 1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai toksisitas fraksi aktif dari ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan dengan BST. 2. Perlu dilakukan identifikasi lebih lanjut terhadap jenis triterpenoid yang diduga terkandung dalam ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan.

44


DAFTAR PUSTAKA Albert B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., and Walter P., 2002, Molecular Biology of The Cell, fourth edition, Garland Science, Taylor & Francis Group, AS Anonim, 1985, Cara Pembuatan Simplisia, Direktorat Jandral Pengawasan Obat dan Makanan, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Anonim, 1986, Sediaan Galenik, Departemen kesehatan RI, Jakarta Anonim, 2005, Tanaman Obat Indonesia, Jakarta, http://www.iptek.net.id/ind/pd_tanobat/view.php?id=65, diakses tanggal 12 Agustus 2006 Anonim, 2007, Artemia Salina Sea Monkeys Anatomy & Taxonomy, http://www.captain.at/artemia-anatomy-taxonomy.php, diakses 28 Oktober 2007 Asterina, R., 1994, Pemeriksaan Flavonoid dan Verbakosid Daun Tembelekan, Skripsi, Fakultas Farmasi ITB, Bandung Backer, C.A. and Brink Jr., R.C.B.V.D., 1963, Flora of Java, Vol I, N.V.P. Noordoff, Groningen, The Netherlands Carballo, J.L., Hernandez-Inda, Z.L., Perez, P., and Garcia-Gravalos, M.D., 2002, A Comparison Between Two Brine Shrimp Assays to Detect in Vitro Cytotoxicity in Marine Natural Products, Mexico, http://www.biomedcentral.com/1472-6750/2/17, diakses 11 Juli 2007 Dipiro, J.T., Talbert, R.L., Yee, G.C., Matzke, G.R., Wells, B.G., and Posey, L.M., 2005, Pharmacotherapy: A Pathophysiologic Approach, 6th edition, McGraw-Hill Companies Inc, USA Harborne, J.B., 1984, Phytochemical Methods, diterjemahkan oleh Padmawinata, K., Soediro, I., ITB, Bandung Hardjono, 1983, Kromatografi, Liberty, Yogyakarta Hembing, W., 2000, Ensiklopedi Milenium Tumbuhan Berkhasiat Indonesia, Prestasi Insan Indonesia, Jakarta Gringauz, A., 1997, Introduction to Medical Chemistry, How Drugs Act and Why, Wiley-VCH Inc., Canada Khopkar, S.M., 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, diterjemahkan oleh Saptorahardjo, A., UI Press, Jakarta 45


Kristiana, M., 2005, Uji Brine Shrimp Lethality Test (BST) Perasan dan Ekstrak Kloroform Buah Apel (Pyrus malus L.) Beserta Profil Kromatografi Lapis Tipisnya, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Kumar, S., Prasad, S., and Singh,R.N., 2005, Resurgence of Spider Mite Tetranychus ludeni Zacher (Acarina: Tetranychidae) Against Acaricides and Botanical Pesticides on Cowpea, Resistant Pest Management Newsletter. Lee, Yue-Wei; Fang, Qi-Cheng; Wang, Zhen-Guo; Li, De-Hua; and Cook, C. E.; 1991, Pentacyclic triterpenoid compounds as topoisomerase inhibitors or cell differentiation inducers, http://www.freepatentsonline.com/5064823.html, diakses 25 Januari 2007 Loomis, T.A., 1978, Essential of Toxicology, edisi III, diterjemahkan oleh Donatus, I.A., IKIP Semarang, Semarang Markham, K.R., 1988, Techniques of Flavonoid Identification, diterjemahkan oleh Padmawinata, K., Penerbit ITB, Ba ndung Meyer B.N., Ferrigni N.R., Putnama J.E, Jacobsen L.B., Nicholas D.E., and Mclaughlin J.L., 1982, Brine shrimp: A convenient General Bioassay for Active Plant Constituents, Planta Medica Middleton, E., Kandaswami, C., and Theoharides, T.C., 2000, Pharmacological Review, http://pharmrev.aspetjournals.org/cgi/content/full/52/4/673, diakses 11 Juni 2007 Mudjiman, A., 1991, Makanan Ikan, Penebar Swadaya, Jakarta Nafrialdi dan Sulistia, G., 1995, Antikanker dan imunosupresan dalam Farmakologi dan Terapi (Anonim), Ed. IV, Bagian Farmakologi, Fakultas Kedokteran, UI, Jakarta Oemarjati. B. S. dan Wardhana, W., 1990, Taksonomi Avertebrata, Universitas Indonesia Press, Jakarta Raghu, C., Ashok, G., Dhanaraj, S.A., Suresh, B., Vijayan, P., 2004, In vitro cytotoxic activity of Lantana camara Linn, http://www.ijponline.com/article.asp?issn=02537613;year=2004;volume=36;issue=2;sp age=94;epage=95;aulast=Raghu, diakses 11 Juni 2007 Rang, H.P., Dale, M.M., Ritter, J.M., and Moore, P.K., 2003, Pharmacology, 5th edition, Churchill Livingstone, USA


Sharma, M., Sharma, P.D., Bansal, M.P., and Singh, J., 2007, India, Lantadene Ainduced apoptosis in human leukemia HL-60 cells, http://www.ijponline.com/text.asp?2007/39/3/140/33433, diakses 27 September 2007 Solis, P.N., Wright, C.W., Anderson, M.M., Gupta, M.F., and Phillipson, J.D., 1993, A Microwell Cytotoxicity Assay using Artemia salina (Brine Shrimp), Planta Medica Stahl, E., 1969, Thin-Layer Chromatography, 2nd edition, diterjemahkan oleh Ashworth, M.R.F., Toppan Printing Co, (S) Ptc. Ltd, Singapore Steenis, V.C.G.G.J., Bloembergen, S., and Eyma, P.J., 1981, Flora, Untuk Sekolah di Indonesia, edisi III, diterjemahkan oleh Surjowinoto, M., Pradnya Paramita, Jakarta Sugianti, N., 2007, Brine Shrimp Lethality Test Ekstrak Etanol Daun Tumbuhan Tembelekan (Lantana camara L,) Beserta Profil Kromatografi Lapis Tipisnya, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Wagner, H., Brady, S., and Zgainski, E. M., 1984, Plant Drug Analysis A Thin Layer Chromatography Atlas, Springer-Verlag, Berlin Wikipedia, 2007, Cancer, United States, http://id.wikipedia.org/wiki/cancer, diakses tanggal 14 Mei 2007 Wikipedia, 2007, Cell Cycle, United States, http://id.wikipedia.org/wiki/cellcycle , diakses tanggal 13 Mei 2007


Lampiran 1. Surat keterangan determinasi tumbuhan tembelekan


Lampiran 2. Foto tumbuha n tembelekan

Lampiran 3. Foto aquarium untuk uji BST


Lampiran 4. Orientasi untuk mendapatkan seri konsentrasi yang akan digunakan dalam pengujian A. Pembuatan larutan A dan larutan B 1. Larutan A (10 mg/ml) Larutan A dibuat dengan menimbang 100 mg ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan kemudian dilarutkan dalam kloroform sampai 10 ml. 2. Larutan B (1 mg/ml) Larutan B dibuat dengan mengambil 1 ml dari larutan A kemudian dilarutkan dalam kloroform sampai 10 ml. B. Pembuatan larutan dengan konsentrasi 10,100,1000 µg/ml Dari larutan B (1 mg/ml), dibuat seri konsentrasi 10 dan100 µg/ml. 1. Konsent rasi 10 µg/ml = 0,01 mg/ml V1 x C1

= V2 x C2

V1 x 1 mg/ml = 5 ml X 0,01 mg/ml V1

=

5mlx 0,01mg / ml = 0,05 ml 1mg / ml

2. Konsentrasi 100 µg/ml = 0, 1 mg/ml V1 x 1 mg/ml = 5 ml X 0, 1 mg/ml V1

=

5mlx 0,1mg / ml = 0, 5 ml 1mg / ml


Untuk konsentrasi 1000 µg/ml dibuat dari larutan A. 3. Konsentrasi 100 µg/ml = 1 mg/ml V1 x 10 mg/ml = 5 ml X 1 mg/ml V1

=

5mlx1mg / ml = 0, 5 ml 10mg / ml

C. Jumlah larva artemia yang mati tiap 10 ekor Replikasi

Kontrol (µg/ml)

Perlakuan (µg/ml)

10

100

1000

10

100

1000

1

2

1

1

0

4

5

2

1

2

2

1

7

7

3

1

0

0

3

7

6

4

0

2

2

1

10

9

5

0

2

2

0

5

6

% rata-rata

8

14

14

10

33

33

% rata-rata=

jumlah x100% 50

D. Perhitungan % kematian dengan rumus Abbot: % kematian pada tes uji – % kematian pada kontrol % kematian =

X 100% 100 – % kematian pada kontrol

1. Konsentrasi 10 µg/ml =

10% − 8% x100% = 2,17% 100 − 8%



66% − 14% x100% = 60,47% 100 − 14% 66% − 14% x100% = 60,47% 100 − 14%


Dari hasil diatas dibuat perkiraan konsentrasi dimana % kematiannya diantara 20-80%. Konsentrasi terendahnya adalah 50 µg/ml dan konsentrasi tertingginya adalah 1600 µg/ml.

E. Pembuatan larutan dengan konsentrasi 50, 200, 800, 1600 µg/ml Dari larutan B (1 mg/ml), dibuat seri konsentrasi 50 dan 200 µg/ml. 1. Konsentrasi 50 µg/ml = 0,05 mg/ml V1 x C1

= V2 x C2

V1 x 1 mg/ml = 5 ml X 0,05 mg/ml V1

=

5mlx 0,05mg / ml = 0,25 ml 1mg / ml

2. Konsentrasi 200 µg/ml = 0,2 mg/ml V1 x 1 mg/ml = 5 ml X 0,2 mg/ml V1

=

5mlx 0,2mg / ml = 1 ml 1mg / ml

Dari larutan A (10 mg/ml), dibuat seri konsentrasi 800 dan 1600 µg/ml. 3. Konsentrasi 800 µg/ml = 0,8 mg/ml V1 x 10 mg/ml = 5 ml X 0,8 mg/ml V1

=

5mlx 0,8mg / ml = 0,4 ml 10mg / ml


4. Konsentrasi 1600 µg/ml = 1,6 mg/ml V1 x 10 mg/ml = 5 ml X 1,6 mg/ml V1

=

5mlx1,6mg / ml = 0,8 ml 10mg / ml

F. Jumlah larva artemia yang mati tiap 10 ekor Replikasi

Kontrol (µg/ml) 200 800 1 0 2 2 1 0 3 2 2 4 0 2 5 2 0 % rata-rata 10 12 jumlah % rata-rata= x100% 50 50 0 0 0 0 0 0

1600 2 2 1 0 2 14

50 3 4 6 1 3 34

Perlakuan (µg/ml) 200 800 7 9 7 7 6 8 6 9 7 8 66 82

1600 10 10 9 8 7 88

G. Perhitungan % kematian dengan rumus Abbot: % kematian pada tes uji – % kematian pada kontrol % kematian =

X 100% 100 – % kematian pada kontrol


34% − 0% x100% = 34% 100 − 0%


66% − 10% x100% = 62,2% 100 − 10%


82% − 12% x100% = 79,5% 100 − 12%


88% − 14% x100% = 86% 100 − 14%


Dipilih konsentrasi yang % kematiannya antara 20%-80%, sehingga dipilih konsentrasi terendah yaitu 50 µg/ml dan konsentrasi tertinggi yaitu 800 µg/ml.

H. Penentuan seri konsentrasi F=

n −1

LD / SD

ket:

F= faktor pengali n= jumlah seri konsentrasi yang diinginkan LD = konsentrasi terbesar SD = konsentrasi terkecil

F=

5 −1

800 / 50

= 4 16 = 2

Seri konsentrasi: 1. Dosis terendah =50 µg/ml

= 0,05 mg/ml

2. 50 µg/ml x 2 = 100 µg/ml

= 0,1 mg/ml

3. 100 µg/ml x 2 = 200µg/ml

= 0,2 mg/ml

4. 200 µg/ml x 2 = 400 µg/ml = 0,4 mg/ml 5. 400 µg/ml x 2 = 800 µg/ml = 0,8 mg/ml I. Pembuatan larutan dengan konsentrasi 50, 100, 200, 400, dan 800 µg/ml Dari larutan B (1 mg/ml), dibuat seri konsentrasi 50, 100, dan 200 µg/ml. Konsentrasi

Jumlah yang diambil

(µg/ml)

dari larutan B (ml)

50

0,25

100

0,5

200

1


Dari larutan A (10 mg/ml), dibuat seri konsentrasi 400 dan 800 µg/ml.

Lampiran 5.

Konsentrasi

Jumlah yang diambil

(µg/ml)

dari larutan A (ml)

400

0,2

800

0,4

Jumlah kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak kloroform daun tumbuhan tembelekan

A. Jumlah larva artemia yang mati tiap 10 ekor Replikasi

Kontrol (µg/ml)

Perlakuan (µg/ml)

50

100

200

400

800

50

100

200

400

800

1

0

0

1

0

1

3

4

6

6

8

2

0

1

1

0

0

3

3

5

7

6

3

1

1

0

0

1

3

5

6

7

7

4

0

1

0

1

1

3

4

5

5

9

5

1

0

1

0

1

1

4

4

5

8

% rata2

4

6

6

2

8

26

40

52

60

76

B. Data % kematian dengan umus Abbot: Konsentrasi

% kematian larva

(µg/ml)

artemia

50

22,92

100

36,17

200

48,94

400

59,18

800

73,91


Lampiran 6. Perhitungan data statistik SPSS 10.00 dengan menggunakan analisis probit terhadap ekstrak klorofrom daun tumbuhan tembelekan * * * * * * * * * * * * * * * * * * * DATA

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *

Information

5 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *

Parameter estimates converged after 9 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: BX): Regression Coeff. KONS

Pearson

Standard Error 1,10880

Intercept

(PROBIT(p)) = Intercept +

Coeff./S.E. ,14129

Standard Error

7,84756

Intercept/S.E.

-2,60102 ,33130 Goodness-of-Fit Chi Square = ,315

-7,85100 DF = 3 P =

,957

Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *

Observed and Expected Frequencies

KONS

Number of Subjects

Observed Responses

Expected Responses

Residual

1,70

100,0

22,9

23,662

-,742

Prob

,23662


2,00

100,0

36,2

35,070

1,100

2,30

100,0

48,9

48,020

,920

2,60

100,0

59,2

61,185

-2,005

2,90

100,0

73,9

73,169

,741

,35070 ,48020 ,61185 ,73169

* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S

Confidence Limits for Effective KONS

Prob

KONS

,01 ,02 ,03 ,04 ,05 ,06 ,07 ,08 ,09 ,10 ,15 ,20 ,25 ,30 ,35 ,40 ,45 ,50 ,55 ,60 ,65 ,70 ,75 ,80 ,85 ,90 ,91 ,92 ,93 ,94 ,95 ,96 ,97 ,98 ,99

1,76898 3,11582 4,46228 5,84652 7,28359 8,78186 10,34711 11,98393 13,69634 15,48812 25,76706 38,61546 54,63779 74,61994 99,60654 131,01210 170,79222 221,71701 287,82593 375,22054 493,52616 658,78407 899,71493 1273,02447 1907,80113 3173,94378 3589,16479 4102,03075 4750,93493 5597,72475 6749,20365 8408,14598 11016,43483 15777,03014 27789,17398

95% Confidence Limits Lower Upper ,35609 ,75492 1,21550 1,73870 2,32585 2,97880 3,69983 4,49159 5,35703 6,29938 12,29610 20,84839 32,65328 48,58012 69,65206 96,96280 131,53475 174,31303 226,63657 291,10559 372,43449 478,58878 623,32700 832,51681 1161,87993 1760,85525 1946,05287 2169,07875 2443,55503 2790,90318 3247,12527 3878,46695 4823,98237 6444,58396 10166,52366

4,67438 7,37563 9,85534 12,26016 14,64653 17,04381 19,47013 21,93801 24,45697 27,03472 41,02038 57,34100 76,75927 100,30761 129,54313 166,96580 216,68468 285,28599 382,84405 524,73179 735,90608 1060,39000 1582,87657 2484,79129 4219,80556 8246,64364 9699,27307 11570,38231 14049,07723 17452,92489 22356,60298 29911,65222 42794,67622 68916,64261 146136,93791

* * * * *


Probit Transformed Responses ,8 ,6 ,4 ,2 0,0 -,2

Probit

-,4 -,6 -,8

Rsq = 0,9954

1,6

1,8

2,0

Log of KONS

2,2

2,4

2,6

2,8

3,0


BIOGRAFI PENULIS

Aprilia Prahara dilahirkan di Surakarta pada tanggal 19 April 1986 sebagai putri pertama dari pasangan Eric Prahara dan Lanny Setiawati. Penulis menempuh pendidikan di Taman Kanak-Kanak Xaverius II pada tahun 1990-1992, dan pada tahun 1998 menyelesaikan pendidikan di Sekolah Dasar Xaverius II Jambi. Pada tahun 1998-2000, penulis menempuh pendidikan di Sekolah Menengah Pertama Xaverius I Jambi, dan menyelesaikan tahun terakhir masa Sekolah Menengah Pertama di Sekolah Menengah Pertama Kristen Satya Wacana Salatiga. Pada tahun 2001-2004 penulis menempuh pendidikan di Sekolah Menengah Umum Kristen Satya Wacana Salatiga. Pada tahun 2004, penulis melanjutkan pendidikan ke jenjang Strata Satu (S1) Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama kuliah penulis pernah menjadi panitia Seminar Nasional “Terapi Kanker dan Pengelolaan Sitostatika”.

BRINE SHRIMP LETHALITY TEST EKSTRAK KLOROFORM DAUN TUMBUHAN TEMBELEKAN (Lantana camara L.) BESERTA PROFIL KROMATOGRAFI LAPIS TIPISNYA SKRIPSI

Recommend Documents