UJI BRINE SHRIMP LETHALITY TEST (BST) FRAKSI AIR BROKOLI (Brassica oleracea var. italica) BESERTA PROFIL KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT) SKRIPSI

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

UJI BRINE SHRIMP LETHALITY TEST (BST) FRAKSI AIR BROKOLI (Brassica oleracea var. italica) BESERTA PROFIL KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh : Sinta Kiranawati NIM : 028114070

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2007

i


ii


iii


Ia membaringkan aku di padang yang berumput hijau, Ia membimbing aku ke air yang tenang; Ia menyegarkan jiwaku. Ia menuntun aku di jalan yang benar oleh karena nama-Nya. Mazmur 23:2-3

Orang yang paling sempurna bukanlah orang dengan otak yang sempurna melainkan orang yang dapat mempergunakan sebaik-baiknya dari bagian otaknya yang kurang sempurna * Aristoteles *

Kupersembahkan skripsi ini untuk : Bapak & Ibuku tercinta sebagai tanda hormat dan baktiku Kakak-kakakku (Mas Aji, Mba Dewi, dan Mba Ika) Almamaterku

iv


PRAKATA

Puji dan syukur penulis haturkan kepada Bapa Yang Maha Kasih atas limpahan karunia dan kasih yang diberikannya selama proses penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul Uji Brine Shrimp Lethality Test (BST) Fraksi Air Brokoli (Brassica oleracea var. italica) beserta Profil Kromatografi Lapis Tipis (KLT) sehingga dapat terselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) dari Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Selama pelaksanaan penelitian hingga terselesaikannya penyusunan skripsi ini, penulis tidak dapat lepas dari bantuan berbagai pihak. Oleh sebab itu, pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada: 1. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. 2. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku dosen pembimbing yang dengan penuh kesabaran dan ketulusan memberikan petunjuk, saran dan perhatian selama pelaksanaan penelitian dan penyusunan skripsi ini. 3. dr. Luciana Kuswibawati, M.Kes., selaku dosen penguji yang telah bersedia menguji, memberikan saran dan masukan yang sangat berguna dalam penyelesaian skripsi ini. 4. Christine Patramurti, M.Si., Apt., selaku dosen penguji yang telah bersedia menguji, memberikan saran dan masukan yang sangat berguna dalam penyelesaian skripsi ini. 5. Sri Hartati Yuliani, M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing akademik yang telah membantu selama proses perkuliahan.

v


6. Segenap dosen dan karyawan yang telah membantu selama penyelesaian skripsi ini. 7. Bapak dan ibuku tercinta atas segala kasih, kesabaran, perhatian, semangat dan doa yang telah dicurahkan kepadaku. 8. Kakak-kakak terbaikku (Mas Aji, Mba Dewi, dan Mba Ika) atas dukungan, perhatian, bantuan, kasih dan doanya. 9. Danang Eka Saputra atas ketulusan hati, kasih, kesabaran, bantuan dan keceriaan yang selalu menghiasi hari-hariku. 10. Pak Lik Gendro beserta keluarga atas bantuannya mencari tanaman brokoli serta dukungan dan doanya. 11. Ayu dan Prima atas kebersamaan kita dalam suka dan duka selama penelitian, dan yang selalu memberiku semangat, perhatian dan bantuan. 12. Fifi, Yuni, Kristin, Wira, Titin, Rosa dan Devi ’03 atas bantuan dan kebersamaan selama penelitian di laboratorium. 13. Lena yang telah membantuku selama penelitian menggunakan larva udang, Ulin, Lia ’03, Puri, Asti, Wenny, Tjun Liong, Didit, Peter, Beni, Yinni, Rika, Lian, Elay, dan Devi atas bantuan yang sangat berharga. 14. Teman-teman kelompok C atas kekompakan, keceriaan, dan kerjasamanya, serta teman-teman angkatan 2002 atas kebersamaannya. 15. Mas Wagiran, Mas Sigit, Mas Andri, Pak Mukmin, Mas Parlan, dan Mas Kunto, atas bantuan yang sangat berguna selama proses penelitian di laboratorium.

vi


16. Teman-teman “Kost Mawar”: Alin dan Mina atas persahabatan, perhatian dan bantuannya, Ica dan Mba Yessy atas dukungannya, Yogi, Agnes, Ika, Mei, Mba Virgin, Raras, Tina, Anas, Ana, Nana, Diah, Cici, Ani, Sisil, Ferry, Ata, Evrin, dan Putri atas keceriaan dan kebersamaannya. Dengan segala kerendahan hati, penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun. Akhir kata, penulis berharap skripsi ini dapat bermanfaat bagi pembaca dan perkembangan ilmu pengetahuan.

Penulis

vii


viii


INTISARI

Brokoli (Brassica oleracea var. italica) merupakan tumbuhan yang dimanfaatkan oleh masyarakat sebagai sayuran. Alil isotiosianat diketahui bersifat antikanker karena dapat menghambat pertumbuhan sel kanker serta menginduksi apoptosis. Brokoli mengandung alil isotiosianat dalam konsentrasi yang tinggi. Suatu senyawa antikanker memiliki toksisitas tertentu sehingga dapat membunuh sel kanker. Maka dari itu, perlu dilakukan uji Brine Shrimp Lethality Test (BST) untuk mengetahui efek toksik fraksi air brokoli yang dinyatakan oleh LC50. Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan penelitian post test only control group design. Pengujian efek toksik brokoli dibuat dalam bentuk fraksi air, karena alil isotiosianat memiliki kelarutan dalam air. Fraksi air diperoleh dengan cara brokoli dibuat jus dengan penambahan air kemudian disaring. Hasil penyaringan tersebut ditambah dengan pelarut kloroform untuk mengambil senyawa yang tidak larut air, kedua pelarut kemudian dipisahkan sehingga didapatkan fraksi air dan fraksi kloroform. Fraksi air dibuat seri konsentrasi 320; 580; 1000; 1900; dan 3400 µg/ml. Hewan uji yang digunakan adalah 10 larva Artemia salina LEACH (artemia) dengan replikasi lima kali dan dibandingkan dengan kontrol negatif untuk tiap-tiap seri konsentrasi. Data diperoleh dengan menghitung jumlah artemia yang mati setelah 24 jam perlakuan. Nilai LC50 dihitung dengan metode analisis probit. Nilai LC50 < 1000 µg/ml dinyatakan memiliki efek toksik. Hasil uji toksisitas dengan metode (BST) diperoleh nilai LC50 untuk fraksi air adalah 631 µg/ml. Dari hasil tersebut maka fraksi air memiliki efek toksik terhadap larva artemia. Setelah dilakukan uji kualitatif dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT), dapat diketahui bahwa dalam fraksi air brokoli terkandung senyawa kimia alil isotiosianat.

Kata kunci : Brassica oleracea var. italica, uji Brine Shrimp Lethality Test (BST), fraksi air, LC50, Kromatografi Lapis Tipis (KLT), dan alil isotiosianat.

ix


ABSTRACT

Broccoli (Brassica oleracea var. italica) is a kind of vegetable. Alyl Isothiocyanates is an anticancer that can supress the growth of cancer cells also induce apoptosis. Broccoli contain of alyl isothiocyanates in high concentration. Anticancer compound have certain toxicity that can kill cancer cell. Therefore, it is necessary to do Brine Shrimp Lethality Test (BST) to know the toxic effect of water fraction from broccoli stated by LC50. This research was the pure experimental with post test only control group design. The broccoli’s toxic effect test was made in the form of water fraction based on solubility from alyl isothiocyanates. Water fractions were obtained by juiceing and filtering the broccoli, and then it was added by chloroform to remove the compound that do not have solubility in water. It was separated to get water fraction and chloroform fraction. Water fraction was made concentration series 320; 580; 1000; 1900; dan 3400 µg/ml. The animal testee that was used are 10 Artemia salina LEACH (artemia) larvae with 5 times of replication and it is compared with negative control for each concentration series. Datas are obtained by counting the amount of dead artemia after 24 hours. The value of LC50 is counted by probit analysis method. The value of LC50 < 1000 µg/ml has toxic effect. The result toxicity test from BST show LC50 from water fraction was 631 µg/ml. The result shows that water fraction has toxic effect on artemia larvae. The qualitatif test with Thin Layer Chromatography (TLC) shows that water fraction of broccoli contain alyl isothiocyanates.

Key words : Brassica oleracea var. italica, Brine Shrimp Lethality Test (BST), water fraction, LC50, Thin Layer Chromatography (TLC), and alyl isothiocyanates.

x


DAFTAR ISI

Halaman HALAMAN JUDUL .................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ...................................................................... iii HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................... iv PRAKATA.................................................................................................... v PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ....................................................... viii INTISARI ..................................................................................................... ix ABSTRACT.................................................................................................... x DAFTAR ISI................................................................................................. xi DAFTAR TABEL......................................................................................... xv DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xvi DAFTAR LAMPIRAN................................................................................. xvii BAB I. PENDAHULUAN............................................................................ 1 A. Latar Belakang ................................................................................ 1 1. Perumusan masalah.................................................................... 2 2. Keaslian Penelitian..................................................................... 3 3. Manfaat Penelitian ..................................................................... 3 B. Tujuan Penelitian............................................................................. 3 BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA .......................................................... 4 A. Brokoli ............................................................................................ 4 1. Keterangan Botani ..................................................................... 4

xi


2. Morfologi dan Habitat Tanaman Brokoli................................... 4 3. Kandungan Kimia ...................................................................... 5 4. Khasiat dan Kegunaan ............................................................... 7 B. Artemia............................................................................................ 8 1. Keterangan Zoologi ................................................................... 8 2. Tahap Perkembangan Larva Artemia ........................................ 8 3. Perkembangbiakan dan Siklus Hidup Artemia .......................... 10 4. Cara Makan Artemia.................................................................. 11 5. Lingkungan Hidup Artemia ....................................................... 12 C. Brine Shrimp Lethality Test (BST) ................................................. 13 1. Pengertian BST .......................................................................... 13 2. Penggunaan Artemia salina LEACH pada Metode BST ........... 13 D. Kanker ............................................................................................. 16 1. Pengertian Kanker...................................................................... 16 2. Karsinogenesis ........................................................................... 17 E. Apoptosis ......................................................................................... 18 F. Siklus Sel ......................................................................................... 20 G. Toksisitas ........................................................................................ 21 H. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) .................................................... 21 I. Landasan Teori ................................................................................. 22 J. Hipotesis ........................................................................................... 23 BAB III. METODOLOGI PENELITIAN .................................................... 24 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ...................................................... 24

xii


B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ................................. 24 1. Variabel Penelitian..................................................................... 24 2. Definisi Operasional .................................................................. 24 C. Bahan Penelitian.............................................................................. 25 D. Alat Penelitian................................................................................. 26 E. Tata Cara Penelitian ........................................................................ 26 1. Determinasi Tanaman ................................................................ 26 2. Pengumpulan Bahan dan Penyarian........................................... 27 3. Pembuatan Air Laut Buatan....................................................... 27 4. Penetasan Siste Artemia............................................................. 28 5. Penentuan Nilai LC50 dengan Metode BST ............................... 28 6. Identifikasi Alil Isotiosianat dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ...................................................................... 30 F. Analisis Hasil................................................................................... 31 BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN............................. 32 A. Determinasi Tanaman ..................................................................... 32 B. Pengumpulan Bahan........................................................................ 32 C. Pembuatan Fraksi Air Brokoli......................................................... 33 D. Pembuatan Air Laut Buatan ............................................................ 33 E. Penetasan Siste Artemia .................................................................. 34 F. Penentuan Nilai LC50 dengan Metode BST..................................... 36 G. Uji Kualitatif Fraksi Air dengan Metode KLT ............................... 44 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ...................................................... 50

xiii


A. Kesimpulan ..................................................................................... 50 B. Saran................................................................................................ 50 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 51 LAMPIRAN.................................................................................................. 54 BIOGRAFI PENULIS .................................................................................. 67

xiv


DAFTAR TABEL

Halaman Tabel I.

Komposisi Bahan Untuk Pembuatan Air Laut Buatan (ALB) .......................................................................................... 28

Tabel II

Persentase Kematian Larva Artemia pada Berbagai Konsentrasi Fraksi Air ................................................................ 41

Tabel III. Hasil uji KLT fraksi air brokoli untuk pemeriksaan alil isotiosianat dengan fase diam silika gel GF254 dan fase gerak n-butanol, n-propanol, asam asetat glasial, air (30:10:10:10, v/v)......................................................................... 49

xv


DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 1.

Hidrolisis Glukosinolat oleh Enzim Mirosinase membentuk Aglikon Alil Isotiosianat ................................... 6

Gambar 2.

Struktur Kimia Alil Isotiosianat ............................................ 6

Gambar 3.

Perubahan Bentuk Burayak................................................... 9

Gambar 4.

Bagian-Bagian Tubuh Artemia Dewasa................................ 10

Gambar 5.

Siklus Hidup Artemia Biseksual ........................................... 11

Gambar 6.

Mekanisme Apoptosis........................................................... 18

Gambar 7.

Siklus Sel .............................................................................. 20

Gambar 8.

Mekanisme aktivitas isotiosianat dalam mematikan sel ....... 39

Gambar 9.

Kurva Hubungan Nilai Probit versus Log Konsentrasi Fraksi Air .............................................................................. 42

Gambar 10.

Kromatogram Fraksi Air Brokoli untuk Pemeriksaan Senyawa Alil Isotiosianat ..................................................... 45

Gambar 11.

Reaksi antara Alil Isotiosianat dengan Ninhidrin ................. 48

Gambar 12.

Tanaman Brokoli (Brassica oleracea var. italica)................ 55

Gambar 13.

Brokoli .................................................................................. 55

Gambar 14.

Larva Artemia salina LEACH .............................................. 56

Gambar 15.

Bak Penetasan untuk Larva Artemia salina LEACH............ 56

Gambar 16.

Kromatografi Lapis Tipis Fraksi Air dari Brokoli untuk Pemeriksaan Alil Isotiosianat ............................................... 57

xvi


DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1.

Surat Determinasi ................................................................. 54

Lampiran 2.

Foto Penelitian ...................................................................... 55

Lampiran 3.

Cara Pembuatan Pereaksi Semprot Ninhidrin ...................... 57

Lampiran 4.

Cara Pembuatan Ekstrak Alii sativi Bulbus dalam Pelarut Metanol sebagai Pembanding pada Uji KLT Senyawa Alil Isotiosianat ..................................................... 58

Lampiran 5.

Perhitungan untuk Membuat Larutan Stok Fraksi Air.......... 58

Lampiran 6.

Perhitungan untuk Membuat Variasai Konsentrasi Larutan Sampel dari Fraksi Air............................................. 59

Lampiran 7.

Data Kematian Larva Artemia salina Leach pada Kontrol Metanol dari Fraksi Air Setelah 24 jam .................. 61

Lampiran 8.

Data Kematian Larva Artemia salina Leach Karena Pengaruh Fraksi Air Setelah 24 jam ..................................... 62

Lampiran 9.

Perhitungan Persentase Kematian Larva Artemia pada Fraksi Air Menggunakan Rumus Abbot ............................... 62

Lampiran 10. Perhitungan Data Statistik Fraksi Air Menggunakan Analisis Probit....................................................................... 63

xvii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 1

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Kanker dianggap sebagai penyebab kematian kedua setelah penyakit kardiovaskuler (Dipiro et al., 1997). Penanganan kanker hingga saat ini yang tersedia pada umumnya adalah operasi, terapi radiasi, kemoterapi, terapi hormon, dan terapi imun (Anonim, 2005). Namun pengobatan dengan metode tersebut dapat memberikan efek samping yang merugikan. Maka dari itu, pengobatan tradisional dari bahan alam mulai dicari dan digunakan. Sayuran selain digunakan sebagai bahan makanan, ternyata juga dapat digunakan sebagai obat tradisional yaitu untuk mencegah atau mengobati penyakit kanker. Tanaman brokoli (Brassica oleracea var. italica) mengandung glukosinolat dalam konsentrasi tinggi (Misiewicz, Skupinska, and Guttman, 2003). Ketika jaringan tanaman dihancurkan, glukosinolat yang terdapat dalam vakuola sel akan dilepaskan dan dihidrolisis oleh enzim mirosinase yang terdapat dalam sitoplasma (Krul et al., 2002). Enzim mirosinase akan melepaskan glukosa, sehingga dihasilkan aglikon dari glukosinolat yang memiliki aktivitas sebagai antikanker salah satunya adalah alil isotiosianat. Alil isotiosianat memiliki kelarutan dalam air (Anonim, 2001), oleh karena itu fraksi air dari brokoli mengandung senyawa alil isotiosianat. Alil isotiosianat dapat menghambat proliferasi sel kanker, aktivitas antiproliferasi alil isotiosianat dalam melawan sel kanker disebabkan oleh karena kemampuannya dalam menahan sel pada fase M serta dapat menginduksi


apoptosis (Xiao et al., 2003). Hal ini yang menyebabkan brokoli dapat dikatakan sebagai salah satu jenis sayuran yang memiliki aktivitas antikanker. Suatu senyawa yang bersifat antikanker akan memiliki toksisitas tertentu sehingga dapat digunakan untuk membunuh sel-sel kanker (Katzung, 2004). Oleh karena itu, toksisitas dari senyawa alil isotiosianat perlu diketahui. Pencarian obat tradisional yang mengandung senyawa antikanker dari tanaman, dapat dilakukan dengan cara skrining uji toksisitas menggunakan hewan uji Artemia salina LEACH dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BST) (Meyer et al., 1982). Prinsip metode ini yaitu uji toksisitas akut terhadap larva artemia dengan penentuan nilai LC50 setelah perlakuan 24 jam. Artemia dalam uji ini digunakan B

B

karena memiliki kesamaan sistem enzim dengan mamalia, misalnya DNAdependent RNA polymerase, dan ouabaine sensitive Na+ & K+ dependent ATPase P

P

P

P

(Solis, Wright, Anderson, Gupta, and Phillipson, 1993). Dari latar belakang diatas, maka penggunaan brokoli sebagai obat antikanker perlu diketahui toksisitasnya dengan metode BST. Toksisitas brokoli dapat diketahui dengan menguji efek toksik fraksi air brokoli yang dinyatakan dengan nilai LC50 (Lethal Concentration 50). LC50 merupakan konsentrasi suatu B

B

B

B

larutan yang dapat menyebabkan kematian 50% hewan uji. Jika nilai LC50 < 1000 B

B

µg/ml maka suatu larutan senyawa dikatakan memiliki efek toksik (Meyer et al., 1982), sehingga diharapkan senyawa tersebut bersifat sitotoksik. 1. Perumusan masalah a. Apakah fraksi air brokoli bersifat toksik terhadap larva artemia dan seberapa besar efek toksiknya yang dinyatakan dengan nilai LC50? B

B


b. Bagaimana profil Kromatograi Lapis Tipis senyawa alil isotiosianat yang terdapat dalam fraksi air brokoli? 2. Keaslian penelitian Dari hasil penelusuran pustaka yang telah dilakukan, belum pernah dilakukan penelitian mengenai uji BST tanaman brokoli. 3. Manfaat penelitian a. Manfaat teoritis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi yang berguna bagi perkembangan ilmu pengetahuan khususnya dalam bidang farmasi mengenai besarnya efek toksik brokoli terhadap larva artemia dengan metode BST. b. Manfaat praktis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tambahan bagi masyarakat mengenai khasiat brokoli selain sebagai bahan makanan juga dapat digunakan untuk mencegah ataupun mengobati penyakit kanker.

B. Tujuan Penelitian 1. Mengetahui apakah fraksi air brokoli bersifat toksik terhadap larva artemia dan seberapa besar efek toksiknya yang dinyatakan dengan nilai LC50. B

B

2. Mengetahui bagaimana profil Kromatograi Lapis Tipis alil isotiosianat yang terdapat dalam fraksi air brokoli.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Brokoli 1. Keterangan botani Berdasarkan klasifikasinya (Mills, 2001), brokoli termasuk ke dalam varietas Brassica oleracea var. italica, serta anggota dari famili Cruciferaceae. Brokoli memiliki nama asing broccoli (Inggris), dengan nama simplisia Brassicae oleraceae (brokoli). 2. Morfologi dan habitat tanaman brokoli Brokoli memiliki tangkai daun agak panjang dan helai daun berlekuklekuk memanjang. Massa bunga brokoli (curd) tersusun secara kompak membentuk bulatan bewarna hijau tua atau hijau kebiru-biruan, dengan diameter antara 15 - 20 cm atau lebih. Pada kondisi lingkungan yang sesuai, massa bunga brokoli dapat tumbuh memanjang menjadi tangkai bunga yang penuh dengan kuntum bunga. Tiap bunga terdiri atas empat helai daun kelopak (calyx), empat helai daun mahkota bunga (corolla), enam benang sari yang komposisinya empat memanjang dan dua pendek. Bakal buah terbagi dua ruang, dan setiap ruang berisi bakal biji (Rukmana, 1995). Menurut Rukmana (1995), brokoli cocok ditanam pada suhu rendah yaitu berkisar antara 15,5 - 18ºC dan maksimum 24ºC. Sedangkan tempat yang cocok untuk menanam tanaman brokoli pada umumnya yaitu pada daerah dataran tinggi, dengan ketinggian diatas 700 m dari permukaan laut.


Pemanenan brokoli dapat dilakukan setelah umurnya mencapai 60 - 90 hari sejak ditanam, sebelum bunganya mekar, dan sewaktu massa bunganya masih berwarna hijau. Jika bunganya telah mekar, tangkai bunganya akan memanjang dan keluarlah kuntum-kuntum bunga berwarna kuning. Brokoli tidak tahan dengan pemasakan yang terlalu lama, selain itu pemanasan terlalu lama akan mengurangi khasiat brokoli (Dalimartha, 2000). 3. Kandungan kimia Tanaman yang termasuk dalam genus Brassica memiliki kandungan lemak yang sedikit sehingga rendah energi, selain itu tanaman ini merupakan sumber vitamin, mineral, dan serat yang berguna dalam mencegah penyakit kanker. Tanaman ini juga mengandung sejumlah besar senyawa aktif, dimana beberapa diantaranya dapat digunakan untuk melawan kanker. Senyawa aktif ini meliputi glukosinolat, isotiosianat, karotenoid, kumarin, ditioltion, flavonoid, indol, fenol, dan terpen (Nestle, 1997). Tanaman

brokoli

(Brassica

oleracea

var.

italica)

mengandung

glukosinolat dalam konsentrasi tinggi (Misiewicz, Skupinska, and Guttman, 2003). Ketika jaringan tanaman dihancurkan, glukosinolat yang terdapat dalam vakuola sel akan dilepaskan dan dihidrolisis oleh enzim mirosinase yang terdapat dalam sitoplasma (Krul et al., 2002). Enzim mirosinase yang terdapat dalam sitoplasma akan melepaskan glukosa dan aglikon dari glukosinolat yaitu isotiosianat, nitril dan beberapa produk lainnya. Pemanasan brokoli dapat merusak enzim mirosinase, namun glukosinolat masih dapat mencapai usus besar untuk didegradasi oleh mikroflora


usus. Glukosinolat dihidrolisis oleh Bacteroides thetaiotaomicron yang terdapat di dalam tubuh manusia membentuk alil isotiosianat (Krul et al., 2002). T

T

Ilmuwan dari Johns Hopkins University School of Medicine menyatakan bahwa glukosinolat tidak memiliki sifat sebagai antikanker sedangkan isotiosianat bersifat antikanker (Surjadi, 2005). Selain itu, metabolisme isotiosianat memiliki bioavailabilitas enam kali lebih tinggi dari pada glukosinolat (Shapiro, Fahey, Wade, Stephenson, & Talalay, 2001).

Gambar 1. Hidrolisis Glukosinolat oleh Enzim Mirosinase membentuk Aglikon Alil Isotiosianat (Krul et al., 2002). T

T

Salah satu isotiosianat dalam brokoli yang memiliki aktivitas antikanker adalah alil isotiosianat (gambar 2). Alil isotiosianat memiliki kelarutan dalam air (Anonim, 2001), oleh karena itu fraksi air dari brokoli mengandung senyawa alil isotiosianat. CH CH2

N CH2

C S

Gambar 2. Struktur Kimia Alil Isotiosianat (Anonim, 2001)


4. Khasiat dan kegunaan Brokoli akan mempercepat proses penyembuhan setelah sakit berat serta dapat digunakan untuk mencegah dan menghambat perkembangan sel kanker (Dalimartha, 2000). Alil isotiosianat dapat menghambat proliferasi sel kanker, aktivitas antiproliferasi alil isotiosianat dalam melawan sel kanker disebabkan oleh karena kemampuannya dalam menahan sel pada fase M serta dapat menginduksi apoptosis (Xiao et al., 2003). Isotiosianat dapat menghambat aktifitas Na+ & K+-ATPase (Breier et al., P

P

P

P

1995). Isotiosianat banyak mendapat perhatian karena aktivitasnya sebagai antikanker. Sebagai senyawa antikanker isotiosianat memiliki kemampuan untuk mematikan sel kanker, hal ini dapat dilihat dari aktivitasnya dalam menginduksi apoptosis dan menghentikan pertumbuhan sel pada fase S (sintesis DNA) dan fase M (mitosis) dalam siklus hidup sel (Li Tang et al., 2006). Isotiosianat yang merupakan hasil hidrolisis dari senyawa glukosinolat dapat menginduksi p53, dimana p53 merupakan tumor suppressor gene atau gen penekan tumor yang dapat menyebabkan terjadinya apoptosis (Pappa et al., 2006). Aktivitas p53 dalam menghentikan siklus hidup sel terjadi pada fase G1. B

B

Ketika terjadi kerusakan DNA, p53 akan menginduksi p21 untuk berikatan dan menginaktivasi cdk2 (cyclin-dependent kinase 2 yang berperan penting dalam tahap transisi fase G1/S), sehingga proses transisi dari fase G1 ke fase S menjadi B

B

B

B

terhambat hingga terjadi perbaikan DNA. Namun apabila tidak terjadi perbaikan


DNA yang efektif, p53 akan memerintahkan sel untuk menjalani program bunuh diri atau apoptosis (Best, 2006).

B. Artemia 1. Keterangan zoologi Artemia termasuk spesies Artemia salina LEACH yang merupakan anggota dari famili Artemiidae. Artemia biasa disebut juga dengan udang renik air asin dan memiliki nama asing brine shrimp. Artemia hidup dalam air laut yang berkadar garam tinggi (Mudjiman, 1989). 2. Tahap perkembangan larva artemia a. Telur Istilah untuk telur artemia adalah siste, yaitu telur yang telah berkembang lebih lanjut menjadi embrio dan kemudian diselubungi oleh cangkang yang tebal dan kuat. Cangkang ini berguna untuk melindungi embrio terhadap pengaruh kekeringan, benturan keras, sinar ultra violet, dan mempermudah pengapungan (Mudjiman, 1989). b. Burayak Siste artemia yang kering, jika direndam dalam air laut yang bersuhu 25ºC, akan menetas dalam waktu 24 - 36 jam. Dari dalam cangkangnya keluarlah burayak (larva) yang juga dikenal dengan istilah nauplius. Dalam perkembangan selanjutnya, burayak akan mengalami 15 kali perubahan bentuk (metamorfosis). Setiap kali burayak mengalami perubahan bentuk merupakan satu tingkatan.


Burayak tingkat I dinamakan instar I, tingkat II instar II, demikian seterusnya sampai instar XV dan menjadi artemia dewasa (Mudjiman, 1989). Burayak yang baru saja menetas masih dalam tingkatan instar I. Bentuknya bulat lonjong dengan panjang sekitar 400 µm dan beratnya 15 µg. Warnanya kemerah-merahan karena masih banyak mengandung makanan cadangan. Oleh karena itu, mereka belum memerlukan makanan (Mudjiman, 1989). Sekitar 24 jam setelah menetas, burayak akan berubah menjadi instar II. Lebih lama lagi akan berubah menjadi instar III. Pada tingkatan instar II, burayak sudah mempunyai mulut, saluran pencernaan, dan dubur. Oleh karena itu, mereka mulai mencari makanan. Bersamaan dengan itu, cadangan makanannya sudah mulai habis. Pengumpulan makanannya mereka lakukan dengan menggerakgerakkan antena II-nya. Antena II tersebut juga berguna untuk bergerak. Tubuh instar II dan instar III sudah lebih panjang dari instar I (Mudjiman, 1989).

Gambar 3. Perubahan bentuk burayak (Mudjiman, 1989)


c. Artemia dewasa Artemia dewasa bentuknya telah sempurna, dengan ukuran panjang sekitar 1 cm dan beratnya 10 mg. Torakopodanya yang sudah lengkap sebanyak 11 pasang (Mudjiman, 1989).

Gambar 4. Bagian-bagian tubuh Artemia dewasa (Mudjiman, 1989) 3. Perkembangbiakan dan siklus hidup artemia Menurut Mudjiman (1989), artemia dapat berkembang biak secara ovovivipar maupun ovipar. Pada cara ovovivipar yang keluar dari induknya sudah berupa burayak jadi sudah langsung hidup sebagai artemia muda. Sedangkan pada cara ovipar, yang keluar dari induknya berupa telur yang bercangkang, dan untuk menjadi burayak harus mengalami proses penetasan terlebih dahulu.


Gambar 5. Siklus hidup Artemia biseksual (Mudjiman, 1989) 4. Cara makan artemia Artemia memiliki cara makan yang sederhana yaitu dengan jalan menyaring makanan (filter feeder). Sebagai penyaring makanan artemia menelan apa saja yang ukurannya kecil (± 50 mikron), baik benda hidup, benda mati, benda keras maupun benda lunak. Artemia tidak dapat membedakan mana makanan dan yang bukan makanan. Sehingga apa yang terdapat dalam perut artemia belum tentu merupakan makanan (Mudjiman, 1989). Pada artemia dewasa pengambilan makanannya dibantu oleh kaki-kakinya (torakopoda), sedangkan burayak dibantu oleh antena II-nya. Kaki-kaki artemia akan bergerak terus-menerus, karena selain berfungsi sebagai alat gerak juga berfungsi sebagai alat pernafasan. Dengan demikian, selama makanannya tersedia, ia akan makan terus-menerus pula (Mudjiman, 1989).


5. Lingkungan hidup artemia a. Suhu Artemia tidak dapat bertahan hidup pada suhu kurang dari 6ºC atau lebih dari 35ºC. Namun, hal ini tergantung pada ras dan kebiasaan tempat hidupnya, untuk pertumbuhan artemia sebaiknya berkisar antara 25 - 30ºC (Mudjiman, 1989). b. Kadar garam Kadar garam memberikan pengaruh terhadap proses pertumbuhan siste. Pertumbuhan siste ternyata membutuhkan air yang kadar garamnya rendah yaitu berkisar antara 5 - 7 permil. Batas ini berlainan untuk tiap jenis artemia. Apabila kadar garam terlalu tinggi, maka siste tidak akan menetas karena tekanan osmosis di luar siste lebih tinggi, sehingga siste tidak dapat menyerap air yang cukup untuk proses metabolismenya (Mudjiman, 1989). c. Oksigen terlarut Artemia dapat menyesuaikan diri terhadap perubahan kadar oksigen terlarut. Pada kadar garam yang hanya 1 ppm (bagian per juta), artemia masih dapat bertahan. Sebaliknya, mereka pun dapat hidup pada kejenuhan oksigen lebih dari 150 persen (Mudjiman, 1989). d. Asam basa (pH) Pengaruh pH terhadap kehidupan artemia muda dan dewasa masih belum jelas.Yang sudah jelas adalah pengaruh pH terhadap penetasan siste. Apabila pH air untuk penetasan kurang dari 8, maka efisiensi penetasannya akan menurun.


Siste banyak yang tidak menetas atau waktu penetasannya menjadi lebih panjang (Mudjiman, 1989).

C. Brine Shrimp Lethality Test (BST) 1. Pengertian BST BST merupakan metode pengujian toksisitas suatu senyawa menggunakan hewan uji larva artemia. Prinsip metode ini adalah uji toksisitas akut terhadap larva artemia dengan penentuan nilai LC50 setelah perlakuan 24 jam. B

B

Metode BST sebenarnya tidak spesifik untuk antitumor namun metode BST memiliki manfaat untuk memonitor aktivitas sitotoksik senyawa dalam waktu yang singkat dan biaya yang cukup murah jika dibandingkan dengan pengujian sitotoksisitas dengan biakan sel kanker. Beberapa keuntungan lain dari metode BST yaitu peralatan yang digunakan sederhana dan tidak memerlukan kondisi yang steril, serta jumlah sampel yang dibutuhkan tidak terlalu banyak (Meyer et al., 1982). 2. Penggunaan Artemia salina LEACH pada metode BST Artemia salina Leach digunakan untuk pengujian senyawa aktif biologis karena artemia mempunyai kesamaan dengan sistem enzim mamalia, misalnya tipe DNA-dependent RNA polymerase, dan ouabaine sensitive Na+ dan K+ P

P

P

P

dependent ATPase (Solis et al, 1993). DNA-dependent RNA polymerase merupakan sistem yang berperan dalam proses sintesis protein. RNA polymerase akan berikatan dengan DNA pada tahap transkripsi di dalam nukleus dimana DNA berperan sebagai cetakan dalam pembuatan nukleotida RNA yang baru.


Jenis molekul RNA yang dimaksud yaitu RNA messenger (mRNA) yang akan membawa pesan genetika dari DNA kebagian-bagian pensintesis protein dari sel tersebut. Pesan genetik yang dibawa oleh mRNA akan ditafsirkan oleh tRNA pada tahap translasi di dalam sitoplasma, tRNA juga akan mentransfer asam amino dari sitoplasma ke ribosom (Campbell, Recee, and Mitchell, 2002). Tiap molekul tRNA akan menghubungkan kodon mRNA tertentu dengan asam amino tertentu, kemudian asam amino spesifik tersebut akan dibawa ke ujung rantai polipeptida yang sedang tumbuh di ribosom. Polipeptida akan dihubungkan dengan asam amino oleh ikatan peptida, rRNA berfungsi untuk mengkatalisis proses pembentukan ikatan peptida. Selama proses dan sesudah sintesisnya, suatu rantai polipeptida mulai menggulung dan melipat secara spontan membentuk protein fungsional dengan konformasi yang spesifik (Campbell et al., 2002). Di dalam sel terdapat mekanisme transport ion Na+ dan K+, untuk P

P

P

P

mengontrol keseimbangan antara keluar dan masuknya ion Na+ dan K+ maka P

P

P

P

diperlukan suatu protein membran plasma yang terdapat dalam jumlah yang cukup banyak pada neuron yang disebut pompa natrium-kalium (Corwin, 1996). Na+/K+ ATPase ditemukan dalam semua bagian tubuh manusia. Na+/K+ P

P

P

P

P

P

P

P

ATPase mengkatalisis hidrolisis ATP ke ADP serta menggunakan tenaga untuk mengeluarkan 3 Na+ dari sel dan mengambil 2 K+ ke dalam tiap sel bagi tiap mol P

P

P

P

ATP yang dihidrolisis, aktivitas Na+/K+ ATPase dihambat oleh ouabain (Ganong, P

1995).

P

P

P


Pada hewan, pemeliharaan tekanan dan volume sel yang normal tergantung atas pompa Na+ dan K+. Tanpa pompa ini, Cl- dan Na+ akan memasuki P

P

P

P

P

P

P

P

sel menuruni perbedaan konsentrasinya, serta air akan mengikuti sepanjang perbedaan osmotik yang diciptakan sehingga menyebabkan sel membengkak (Ganong, 1995). Sel yang membengkak selanjutnya bisa mengalami lisis sehingga sel tersebut mati. Artemia cukup akurat digunakan sebagai model sel kanker, hal ini telah dibuktikan melalui penelitian yang dilakukan oleh Carballo et al. Penelitian ini bertujuan untuk melihat sensitivitas larva artemia dalam mendeteksi aktivitas sitotoksik suatu ekstrak isopropanolik dari 14 jenis invertebrata laut dan 6 jenis makroalga. Sensitivitas larva artemia dibandingkan dengan sel kanker paru-paru dan sel kanker kolon. Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa ekstrak yang memiliki aktivitas sitotoksik yang cukup tinggi bahkan dapat mematikan sel kanker juga dapat memberikan efek yang sama pada larva artemia. Aktivitasnya yaitu dapat menghambat proses penetasan larva serta menyebabkan kematian larva dengan nilai persen kematian yang cukup tinggi. Salah satu contohnya yaitu ekstrak dari Pacifigorgia adamsii memiliki aktivitas sitotoksik 127% GI (growth inhibition) terhadap sel kanker paru-paru dan 86% GI terhadap sel kanker kolon, ekstrak ini dapat menghambat penetasan larva artemia sebesar 76% dan memberikan persen kematian yang cukup tinggi yaitu sebesar 68% (Carballo et al., 2002). Aktivitas sitotoksik diatas 60% dikatakan bersifat aktif, sedangkan diatas 100% dikatakan dapat menyebabkan kematian sel. Larva artemia yang digunakan


berumur 48 jam karena pada umur ini larva memiliki sensitivitas maksimal terhadap ekstrak yang memiliki aktivitas sitotoksik (Carballo et al., 2002). Disamping artemia memiliki persamaan dengan mamalia, alasan lain digunakan artemia yaitu karena mudah didapatkan dan harganya murah serta tahan lama bila disimpan dalam bentuk telur kering. Namun, penggunaan hewan uji artemia juga memiliki kelemahan yaitu ketidakmampuan artemia mendeteksi senyawa yang dalam aktivitas fisiologisnya memerlukan aktivasi di dalam sel tubuh mamalia, misalnya senyawa 6-merkaptopurin (Solis et al., 1993).

D. Kanker 1. Pengertian kanker Kanker dianggap sebagai penyebab kematian kedua setelah penyakit kardiovaskuler. Kanker dapat ditandai dengan pertumbuhan sel yang tidak terkontrol, kerusakan jaringan setempat dan sekitarnya, serta kanker dapat menyebar luas (Dipiro et al., 1997). Dalam keadaan normal sel hanya akan membelah diri bila tubuh membutuhkan, misalnya ada sel-sel yang perlu diganti karena mati atau rusak. Sedangkan sel kanker akan membelah meskipun tidak diperlukan, sehingga terjadi sel-sel baru yang berlebihan. Sel-sel baru mempunyai sifat seperti induknya yang sakit yaitu sel-sel yang tidak mempunyai daya atur (Kuswibawati, 2000). Kanker merupakan tumor yang ganas, namun kanker berbeda dengan tumor jinak. Tumor jinak memiliki sifat tidak menginvasi dan tidak merusak jaringan sehat, pertumbuhannya hanya terbatas pada jaringan tertentu saja.


Biasanya apabila dilakukan pembedahan akan sembuh total. Tumor dikatakan ganas apabila menginvasi dan merusak organ tubuh lainnya yang masih sehat, serta akan mengalami metastasis (Anonim, 2005). 2. Karsinogenesis Kanker atau neoplasma terbentuk dari sel yang mengalami perubahan mekanisme normal dalam mengontrol pertumbuhan dan proliferasi. Mekanisme terbentuknya kanker meliputi beberapa tahap yaitu a. inisiasi Tahap pemaparan substansi karsinogenik terhadap sel normal yang menyebabkan kerusakan genetik, apabila tidak diperbaiki akan menyebabkan mutasi seluler bersifat irreversibel. b. promosi Zat karsinogen atau faktor lain akan mengubah lingkungannya menjadi berpotensi untuk tumbuhnya sel mutasi dari pada sel normal. Perbedaan antara promosi dengan inisiasi yaitu pada tahap promosi bersifat reversibel. Hal ini yang menyebabkan kemoprevensi dapat dilakukan, diantaranya dengan perubahan gaya hidup dan diet. c. progresi Terjadi perubahan genetik yang lebih lanjut sehingga menyebabkan peningkatan proliferasi sel. Pada tahap ini terjadi invasi tumor ke jaringan sekitar dan mengalami metastase (Dipiro et al., 1997).


E. Apoptosis Apoptosis berbeda dengan nekrosis, nekrosis yaitu kematian sel yang terjadi karena kerusakan sel secara akut sedangkan apoptosis yaitu suatu program kematian sel. Apoptosis merupakan suatu proses biologi normal. Sebagai contoh pada saat pembentukan jari tangan dan jari kaki embrio, sel diantara jari-jari perlu melakukan proses apoptosis sehingga jari-jari bisa terpisah (Anonim, 2006). Proses

apoptosis

masih

kontroversial

dan

tidak

mudah

untuk

mendefinisikannya. Apoptosis ditandai dengan kondensasi kromatin, penyusutan sitoplasma, dilatasi retikulum endoplasmik, dan pembengkakan membran. Sel yang telah mati akan difagositosis oleh makrofag (Henkart, 1999).

Gambar 6. Mekanisme Apoptosis (Anonim, 2007)


Berdasarkan hasil studi (Henkart, 1999), yang menstimuli proses apoptosis adalah kerusakan DNA. Apabila siklus sel mendeteksi ada DNA yang rusak di dalam sel, maka tumor suppressor gen yang disebut p53 akan menghentikan sel untuk membelah diri, hingga kerusakan DNA sudah diperbaiki. Apabila sel tidak dapat memperbaiki DNA yang rusak, p53 memerintahkan sel untuk menjalani program bunuh diri (progammed cell death atau apoptosis). Programmed cell death adalah bagian yang normal dari kehidupan sel, dan dikontrol secara ketat oleh banyak gen terutama oleh p53 (Anonim, 2005). Tumor suppressor gen berfungsi sebagai pengatur pertumbuhan sel, apabila diaktifkan maka akan menghentikan siklus pembelahan sel, sehingga dapat mencegah pembelahan sel selanjutnya (Anonim, 2005). Di dalam sel kanker terdapat satu atau beberapa mutasi yang menghambat p53 menjalani tugasnya, sehingga p53 membiarkan sel melanjutkan pembelahan diri walaupun terdapat DNA yang rusak (Anonim, 2005). Apabila terjadi gangguan pada pengaturan p53 dapat merusak jalur apoptosis sehingga memungkinkan terbentuknya tumor (Anonim, 2007). Menurut Best (2006), untuk mematikan sel, p53 akan menginduksi transkripsi beberapa gen yang meliputi apaf-1 (apoptosis protease-activating factor) dan protein BAX. Protein BAX merupakan anggota dari protein sitoplasma yg mengatur terjadinya apoptosis. Protein BAX terdapat pada mitokondria, dimana BAX akan melepaskan sitokrom c. Apaf-1 dan sitokrom c dapat membentuk caspase-9 yang menyebabkan terjadinya apoptosis.


F. Siklus Sel

Gambar 7. Siklus Sel (Best, 2006) Siklus sel dapat dibagi menjadi empat fase yaitu fase M, fase G1, fase S, B

B

dan fase G2. Siklus sel dimulai dari fase M yang merupakan fase mitosis dimana B

B

sel akan mengalami pembelahan. Fase G1 merupakan growth phase yang pertama, B

B

pada fase ini terjadi sintesis protein dan pertumbuhan sel untuk memperoleh ukuran sel yang normal sebelum membelah menjadi dua secara mitosis. Fase S merupakan fase terjadinya sintesis DNA (replikasi DNA) dalam persiapan pembelahan sel. Fase G2 ditandai dengan perbaikan DNA yang rusak pada saat B

B

replikasi DNA, dan terjadi persiapan untuk mitosis selanjutnya. Pada akhir fase G1, terdapat fase G0 yang merupakan fase istirahat dalam siklus sel (Best, 2006). B

B

B

B

Jika sebuah sel menerima sinyal untuk membelah, sel itu biasanya akan menyelesaikan siklusnya dan membelah. Tetapi jika sel itu tidak menerima sinyal untuk membelah, sel akan keluar dari siklus dan beralih ke keadaan tidak membelah yang disebut fase G0. B

B


G. Toksisitas Toksisitas merupakan kemampuan suatu zat menyebabkan kerusakan (Katzung, 1989). Ketoksikan akut adalah derajat efek toksik sesuatu senyawa yang terjadi dalam waktu singkat setelah pemberiannya dalam dosis tunggal. Batasan waktu singkat disini adalah rentang waktu selama 24 jam setelah pemberian senyawa. Tujuan utama uji ketoksikan akut adalah untuk menetapkan potensi ketoksikan akut yang berupa tolok ukur ketoksikan kuantitatif (LD50/LC50) dan tolok ukur ketoksikan kualitatif (gejala klinis, wujud, dan B

B

B

B

mekanisme efek toksik). Dalam metode BST, yang ditetapkan adalah tolok ukur ketoksikan kuantitatif yaitu LC50. LC50 (Lethal Concentration 50) merupakan konsentrasi B

B

B

B

yang dapat menyebabkan kematian lima puluh persen hewan uji. Menurut Meyer et al. (1982), apabila harga LC50 < 1000 µg/ml maka senyawa tersebut dapat B

B

dikatakan bersifat toksik.

H. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan metode pemisahan suatu senyawa berdasarkan kelarutannya. Lapisan yang dipakai untuk pemisahan terdiri atas bahan-bahan berbutir (fase diam), ditempatkan pada penyanggah berupa pelat gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisahkan berupa larutan yang ditotolkan sehingga membentuk bercak atau pita. Setelah itu pelat atau lapisan dimasukkan kedalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan


pengembang yang cocok. Pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan) (Stahl, 1973). KLT dapat dipakai dengan dua tujuan, yaitu yang pertama dapat dipakai sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, atau preparatif. Sedangkan yang kedua dapat dipakai untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang sesuai dengan sifat senyawa (Gritter, Bobbitt, & Schwarting, 1991). Metode ini memiliki beberapa keuntungan, yaitu hanya memerlukan perlengkapan

yang

sedikit,

menggunakan

waktu

yang

singkat

untuk

menyelesaikan analisis, memerlukan jumlah cuplikan yang sangat sedikit, hasil palsu yang disebabkan oleh komponen sekunder tidak mungkin terjadi, dan penanganannya sederhana (Stahl, 1973).

I. Landasan Teori Brokoli (Brassica oleracea var. Italica) merupakan salah satu jenis sayuran yang memiliki aktivitas antikanker. Hal ini disebabkan antara lain oleh adanya alil isotiosianat dalam tanaman brokoli, alil isotiosianat bersifat sebagai antikanker karena dapat menginduksi jalur apoptosis serta dapat menghentikan pertumbuhan sel pada fase M dalam siklus hidup sel. Metode BST digunakan untuk pengujian toksisitas akut senyawa yang memiliki aktivitas sebagai antikanker menggunakan hewan uji larva artemia. Larva artemia digunakan karena memiliki kesamaan sistem enzim dengan mamalia, misalnya tipe DNA-dependent RNA polymerase, dan ouabaine sensitive Na+ dan K+ dependent ATPase. Selain itu larva artemia yang berumur 48 jam P

P

P

P


memiliki sensitivitas maksimal terhadap ekstrak yang memiliki aktivitas sitotoksik. Hubungan antara isotiosianat dengan kedua sistem enzim ini yaitu isotiosianat dapat menghambat aktifitas Na+/ K+-ATPase. P

P

P

P

Aktivitas alil isotiosianat dalam menginduksi apoptosis dan menghentikan siklus hidup sel, menyebabkan brokoli sangat mungkin bersifat toksik terhadap larva artemia. Oleh karena itu, dalam uji BST senyawa antikanker dalam brokoli dapat teramati dengan menghitung jumlah kematian larva artemia. Selanjutnya dapat dianalisis untuk mengetahui nilai LC50. B

B

J. Hipotesis Fraksi air brokoli memiliki efek toksik terhadap larva artemia.


BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan menggunakan rancangan post test only control group design.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian a. Variabel bebas Variasi konsentrasi fraksi air yaitu 320; 580; 1000; 1900; dan 3400 µg/ml. b. Variabel tergantung Jumlah kematian larva artemia akibat pemberian fraksi air brokoli dengan variasi konsentrasi. c. Variabel pengacau terkendali 1) Subyek uji, meliputi umur larva atemia yaitu 48 jam. 2) Lingkungan tempat percobaan, yang meliputi cahaya untuk mempercepat proses penetasan larva artemia yaitu dengan sinar lampu 5 watt, pH air laut buatan antara 8 - 9, kadar garam 5 permil, dan komposisi air laut buatan. 2. Definisi operasional a. Metode BST merupakan salah satu uji skrining untuk menentukan ketoksikan suatu ekstrak atau senyawa terhadap larva artemia yang dinyatakan dengan nilai LC50. B

B


b. Brokoli yang digunakan adalah bagian massa bunga brokoli (curd), massa bunga terdiri dari bakal bunga yang belum mekar, tersusun atas lebih dari 5.000 kuntum bunga dengan tangkai pendek. c. Larva artemia yang digunakan sebagai hewan uji pada metode BST yaitu larva yang telah berumur 48 jam. d. Larva artemia dikatakan mati jika larva tidak lagi memperlihatkan gerakan. e. Fraksi air merupakan bagian dari sari brokoli dalam pelarut air setelah dipisahkan dari fraksi kloroform.

C. Bahan Penelitian 1. Bahan tanaman Brokoli yang digunakan dalam penelitian ini merupakan tanaman budidaya dan diperoleh dari Ketep, Muntilan, Jawa Tengah pada bulan Februari 2006. 2. Bahan untuk BST a. Telur artemia (Artemia, Viper) b. Ragi sebagai makanan bagi larva artemia. c. Air laut buatan yang berkadar garam 5 permil. 3. Bahan untuk pembuatan air laut buatan (ALB) NaCl, MgSO4, MgCl2, CaCl2, KCl, NaHCO3, dan aquadest yang diperoleh B

B

B

B

B

B

B

B

dari laboratorium. 4. Bahan untuk KLT Silika gel GF254 (MERCK), n-butanol, n-propanol, asam asetat glasial, air, B

dan pereaksi ninhidrin.

B


D. Alat Penelitian 1. Alat untuk penyarian dan pengeringan Vacuum rotary evaporator (Janke & Kunkel RV 05-ST), waterbath (Memmert), blender (National), labu takar (Pyrex), Beakerglass (Pyrex), corong pisah (Pyrex), gelas ukur (Pyrex), corong, batang pengaduk, kain, dan cawan porselen. 2. Alat untuk BST Neraca analitik (Mettler Toledo AB 204), pipet volume 5 ml (Pyrex), mikropipet (Socorex), bak penetasan artemia (lokal), lampu 5 watt (Dop), aerator, pipet tetes, dan flakon. 3. Alat untuk ALB Gelas ukur (Pyrex), Beakerglass (Pyrex), labu takar 1 liter (Pyrex), pengaduk, sendok, dan pH meter. 4. Alat untuk uji KLT Pipa kapiler, lempeng kaca, gelas ukur, bejana kromatografi, atomizer, kertas saring, Oven (Memmert), lampu UV 254 nm dan UV 365 nm.

E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman Untuk memastikan bahwa jenis tanaman yang digunakan untuk penelitian benar-benar brokoli, maka dilakukan determinasi. Determinasi brokoli (Brassica oleracea var. italica) dilakukan dengan cara membandingkan habitus tanaman (yang terdiri dari akar, daun, curd, dan bunga) dengan pustaka (Mills, 2001).


2. Pengumpulan bahan dan penyarian Pemanenan brokoli dilakukan pada saat massa bunga sudah mencapai ukuran maksimal dan telah padat, tetapi kuncup bunganya belum mekar. Umur panen berkisar antara 60 - 90 hari setelah tanam, tergantung pada varietas tanaman. Brokoli yang telah dikumpulkan dicuci menggunakan air mengalir dan dirajang kecil-kecil untuk dibuat jus, kemudian sebanyak 500 gram brokoli dimasukkan ke dalam blender dan ditambah 100 ml aquadest. Setelah dibuat jus, dilanjutkan dengan proses pemerasan dan penyaringan untuk memperoleh fraksi air. Fraksi air ini ditambah dengan kloroform kemudian dipisahkan menggunakan corong pisah, sehingga diperoleh fraksi air dan fraksi kloroform. Namun fraksi kloroform tidak digunakan. Fraksi air yang diperoleh, dipekatkan menggunakan vacum rotary evaporator kemudian diuapkan untuk mendapatkan fraksi kental. 3. Pembuatan air laut buatan Air laut buatan dengan kadar garam 5 permil dibuat dengan melarutkan berbagai bahan (Tabel I). Bahan-bahan seperti natrium klorida, magnesium klorida, kalsium klorida, dan kalium klorida dilarutkan dalam aquadest dengan menggunakan labu takar 1 liter. Khusus untuk magnesium sulfat dilarutkan dalam aquadest panas, sedangkan natrium hidrokarbonat dilarutkan dalam air bebas karbondioksida. Bahan-bahan tersebut kemudian dicampur dan ditambahkan aquadest sampai volume tepat 1 liter, sehingga diperoleh air laut buatan dengan kadar garam 5 permil (Mudjiman, 1989).


Tabel I. Komposisi Bahan Untuk Pembuatan Air Laut Buatan (ALB) (Mudjiman, 1989) No.

Nama Bahan

Jumlah (gram)

1.

Natrium klorida (NaCl)

5

2.

Magnesium sulfat (MgSO4)

1,3

3.

Magnesium klorida (MgCl2)

1,0

4.

Kalsium klorida (CaCl2)

0,3

5.

Kalium klorida (KCl)

0,2

6.

Natrium hidrokarbonat

2,0

B

B

B

B

B

B

(NaHCO3) B

7.

B

Aquadest

sampai 1 liter

4. Penetasan siste artemia Siste artemia ditetaskan dengan media air laut buatan berkadar garam 5 permil. Artemia ditetaskan dalam bak penetasan artemia yang terdiri dari dua ruangan tidak sama besar yang disekat menjadi dua bagian, bagian terang dan bagian gelap, dengan lubang pada sekat 1 cm. Bagian gelap merupakan tempat siste artemia ditaburkan dan berukuran lebih kecil dari pada bagian terang. Bagian terang diberi penerangan lampu listrik. Siste menetas setelah kira-kira 24 - 36 jam, kemudian menjadi larva. Larva yang aktif akan bergerak menuju tempat yang terang melalui lubang pada sekat. Larva yang telah berumur 48 jam dan aktif inilah yang akan digunakan untuk uji BST. 5. Penentuan nilai LC50 dengan metode BST B

B

a. Pembuatan larutan stok Penyiapan larutan stok untuk uji BST adalah sebagai berikut : ekstrak kental fraksi air ditimbang sebanyak 100 mg dan dilarutkan dalam 10 ml metanol


sebagai larutan A. Sedangkan larutan B dibuat dengan mengambil 1 ml dari larutan A dan dilarutkan dalam 10 ml metanol. Untuk membuat seri kadar, diambil 50 µl dari larutan B, 500 µl dari larutan B, dan 500 µl dari larutan A, sehingga didapatkan kadar 10, 100, dan 1000 µg/ml. Kontrol fraksi air yang digunakan yaitu metanol (Meyer et al., 1982). Seri konsentrasi larutan stok dan kontrol yang telah diperoleh diuapkan diatas waterbath hingga kering, kemudian ditambah dengan air laut buatan yang telah diaerasi sebanyak 3 ml. Larva artemia yang telah berumur 48 jam (cirinya sudah berwarna kecoklatan) diambil secara random dan dimasukkan ke dalam flakon. Tambahkan air laut buatan hingga volume tepat 5 ml. Sebagai makanan larva artemia, ke dalam tiap-tiap flakon diberi satu tetes suspensi ragi (3 mg ragi dalam 5 ml air laut buatan). Flakon dijaga agar selalu mendapat penerangan. Setelah 24 jam, jumlah larva artemia yang mati dihitung untuk mengetahui besarnya nilai persen kematian. Pengulangan dilakukan sebanyak tiga kali. b. Pembuatan larutan sampel Dari data persen kematian larutan stok, maka dapat diketahui small dose dan large dose dari fraksi air yang kemudian digunakan untuk memperkirakan lima seri konsentrasi larutan sampel. Konsentrasi larutan sampel yang dapat ditentukan yaitu 320; 580; 1000; 1900; dan 3400 µg/ml (Lampiran 6). Larutan sampel dari fraksi air diberi perlakuan yang sama seperti pada larutan stok dan dilakukan pengulangan sebanyak lima kali. Dari hasil persen kematian yang diperoleh, selanjutnya digunakan untuk menentukan nilai probit dan dianalisis untuk mengetahui harga LC50. B

B


6. Identifikasi alil isotiosianat dengan metode KLT Ekstrak kental fraksi air ditimbang sebanyak 50 mg dilarutkan dengan metanol p.a. hingga 10 ml, sehingga konsentrasi fraksi air 5 µg/µl. Dengan menggunakan pipet kapiler 5 µl, larutan tersebut ditotolkan pada plat KLT sebanyak 6 kali. Sebagai pembanding digunakan ekstrak bawang putih (Alii sativi Bulbus) dalam pelarut metanol. Cara membuat larutan pembanding yaitu dengan menimbang bawang putih sebanyak 1 gram kemudian direbus dalam 50 ml metanol selama 5 menit dan diamkan selama 1 jam dengan sekali-kali digojog. Bagian yang bening diambil, selanjutnya diuapkan hingga 5 ml. Plat KLT dimasukkan dalam bejana yang berisi fase gerak lalu dikembangkan sampai jarak rambat 10 cm, kemudian diangkat dan dikeringkan. Setelah itu dilakukan deteksi untuk memastikan letak dan warna bercak sampel serta pembandingnya. Deteksi dilakukan dengan menggunakan pereaksi ninhidrin yang disemprotkan pada plat KLT, kemudian dipanaskan pada suhu 110ºC selama 5 menit. Setelah itu diamati bercak yang timbul secara visible (secara langsung). Fase diam

: silika gel GF254 (MERCK)

Fase gerak

: n-butanol : n-propanol : asam asetat glasial : air

B

B

(30:10:10:10, v/v) P

P

B

B

Pembanding

: ekstrak bawang putih dalam pelarut metanol

Deteksi

: pereaksi ninhidrin

Jarak rambat

:10 cm


F. Analisis Hasil Persentase kematian larva udang dapat diketahui dengan menggunakan rumus Abbot, hal ini dikarenakan pada kontrol terdapat kematian larva artemia. % Kematian terkoreksi =

Persen kematian teramati - Persen kematian pada kontrol x 100 100 - Persen kematian pada kontrol

(Kumar, Prasad, & Singh, 2005) Data persentase kematian larva artemia yang diperoleh selanjutnya dianalisis menggunakan probit untuk menentukan nilai LC50. Penentuan nilai LC50 B

B

B

B

dan perhitungan statistik dilakukan dengan menggunakan program statistik SPSS 10.00. Dalam uji BST suatu ekstrak dikatakan bersifat toksik apabila memiliki nilai LC50 < 1000 µg/ml (Meyer et al., 1982). Adanya kandungan alil isotiosianat B

B

dalam fraksi air dipastikan melalui uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT).


BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tanaman Determinasi tanaman dilakukan untuk memastikan bahwa tanaman yang digunakan untuk penelitian adalah benar brokoli. Proses determinasi dilakukan dengan cara membandingkan habitus tanaman (yang terdiri dari akar, daun, curd, dan bunga) dengan kunci determinasi menurut Mills (2001). Berdasarkan hasil determinasi tersebut maka dapat disimpulkan bahwa tanaman brokoli yang digunakan dalam penelitian ini memiliki nama botani Brassica oleracea var. italica.

B. Pengumpulan Bahan Brokoli dipanen pada saat massa bunga sudah mencapai ukuran maksimal dan telah padat, tetapi kuncup bunganya belum mekar. Brokoli yang masih muda memiliki kandungan kimia dalam konsentrasi tinggi dibandingkan dengan brokoli yang sudah tumbuh besar. Umur tanaman pada saat dipanen yaitu berkisar antara 60 - 90 hari setelah tanam. Pengumpulan bahan dilakukan dalam satu kali pengambilan pada tempat tumbuh yang sama untuk menjaga agar senyawa yang terkandung dalam brokoli tetap sama.


C. Pembuatan Fraksi Air Brokoli Brokoli dicuci dengan air mengalir untuk membersihkannya dari kotoran yang menempel, dan dirajang kecil-kecil untuk mempermudah pembuatan jus. Aquadest yang ditambahkan pada saat pembuatan jus dimaksudkan untuk mengambil senyawa yang larut dalam air, terutama adalah alil isotiosianat. Alil isotiosianat memiliki kelarutan yang cukup baik dalam air sehingga dibuat fraksi air yang diharapkan dapat menarik semua senyawa alil isotiosianat yang terdapat dalam brokoli. Pelarut kloroform ditambahkan untuk memisahkan senyawasenyawa yang tidak dapat larut dalam pelarut air.

D. Pembuatan Air Laut Buatan Siste artemia dapat menetas dengan baik pada lingkungan yang berkadar garam berkisar antara 5 - 7 permil, yang artinya dalam 1 ml aquadest mengandung 5 – 7 mg natrium klorida, sehingga air laut buatan yang dibuat juga harus memenuhi batas tersebut. Air laut buatan dibuat dari campuran natrium klorida, magnesium sulfat, magnesium klorida, kalsium klorida, kalium klorida, dan natrium hidrokarbonat. Semua itu dilarutkan dalam 1 liter aquadest. Namun khusus untuk magnesium sulfat, sebelum dicampur dengan bahan-bahan lainnya, perlu dilarutkan tersendiri lebih dahulu dengan air panas untuk mempercepat proses pelarutan. Sedangkan natrium hidrokarbonat dilarutkan dalam air bebas karbondioksida untuk mencegah terbentuknya endapan. Kadar garam dari air laut buatan yang telah dibuat adalah sebesar 5 permil.


Selain kadar garam 5 permil, agar proses penetasan siste artemia baik maka perlu juga diperhatikan pH dari air laut buatan yang sebaiknya berkisar antara 8 - 9. Hal ini dikarenakan terjadinya pemecahan cangkang siste yang keras itu dibantu oleh kegiatan enzim. Kegiatan enzim tersebut memerlukan pH lebih dari 8 (antara 8 – 9), sehingga sebelum air laut buatan digunakan harus diperhatikan pH-nya menggunakan pH meter.

E. Penetasan Siste Artemia Siste merupakan telur yang telah berkembang lebih lanjut menjadi embrio dan kemudian diselubungi oleh cangkang yang tebal dan kuat. Cangkang ini berguna untuk melindungi embrio terhadap pengaruh kekeringan, benturan keras, sinar ultra violet, dan mempermudah pengapungan. Oleh karena itu, siste sangat tahan menghadapi keadaan lingkungan yang buruk. Untuk menetaskan siste artemia yang telah kering (kadar air kurang dari 10%) yang embrionya dalam keadaan diapauze (metabolisme terhenti sementara), perlu dilakukan perendaman. Siste direndam dalam air tawar selama kurang lebih 1 jam. Sesuai penjelasan Mudjiman (1989), saat larva direndam terjadi proses penyerapan air ke dalam siste yang berlangsung secara hiperosmotik, yaitu adanya tekanan osmosis di dalam telur yang lebih tinggi dari pada di luarnya. Selama satu jam siste akan menggembung dan diperkirakan kadar airnya telah mencapai lebih dari 65% sehingga metabolismenya telah aktif kembali. Air laut buatan yang akan digunakan untuk menetaskan larva artemia diaerasi terlebih dahulu selama kurang lebih 2 jam. Tujuan aerasi ini yaitu untuk


meningkatkan kadar oksigen yang terkandung dalam air laut buatan yang berkadar garam 5 permil, sehingga siste dapat menetas dengan baik. Siste yang telah ditiriskan dipindah ke dalam bak penetasan yang berisi air laut buatan. Bak penetasan terdiri dari dua bagian yaitu bagian gelap dan bagian terang yang dipisahkan oleh sebuah sekat yang bercelah. Bagian yang gelap ditutup dengan kaca yang berwarna gelap, sedangkan bagian terang ditutup dengan kaca bening agar cahaya lampu masih dapat masuk. Siste dimasukkan dalam bagian yang gelap, siste dapat menetas dalam waktu 24 – 36 jam. Setelah larva menetas, larva akan berpindah dari tempat yang gelap menuju tempat yang terang. Ini dikarenakan artemia memiliki sifat fototropik positif atau bergerak menuju ke arah cahaya. Larva yang telah menetas dan berumur 48 jam diambil dengan memakai pipet tetes, kemudian dipindahkan ke dalam suatu tempat yang juga berisi air laut buatan berkadar garam 5 permil dan telah diaerasi. Hal ini dilakukan untuk mempertahankan kondisi larva yang telah berumur 48 jam serta untuk memudahkan pengambilan larva yang akan digunakan sebagai hewan percobaan. Larva artemia yang digunakan berumur 48 jam karena pada umur ini larva memiliki sensitivitas maksimal terhadap ekstrak yang memiliki aktivitas sitotoksik (Carballo et al., 2002). Larva yang berumur lebih dari 48 jam, tubuhnya sudah terselubungi membran yang terbentuk dari kitin yang disebut karapak, membran ini akan menghalangi masuknya senyawa antikanker ke dalam tubuh larva. Larva yang berumur kurang dari 48 jam, organ tubuhnya belum memiliki struktur yang


sempurna sehingga mudah mati bukan karena senyawa toksik tapi karena tidak dapat beradaptasi denngan lingkungannya, sehingga kurang tepat digunakan sebagai hewan uji. Larva yang berumur 48 jam sebenarnya juga telah terselubungi membran namun masih sangat tipis, sehingga masih dapat ditembus oleh senyawa antikanker. Selain itu, larva yang berumur 48 jam berada pada tahap instar II dimana pada tahap ini larva sudah mulai memiliki saluran pencernaan. Senyawa antikanker dapat memasuki tubuh larva artemia melalui 2 cara yaitu menembus kulit dan melalui saluran pencernaan.

F. Penentuan Nilai LC50 dengan Metode BST B

B

Isotiosianat yang terdapat dalam brokoli merupakan senyawa kimia yang memiliki aktivitas antikanker. Menurut Katzung (2004) senyawa antikanker pada umumnya memiliki toksisitas tertentu. Untuk melihat toksisitas dari senyawa ini digunakan metode BST yang merupakan skrining awal terhadap senyawa antikanker. Metode ini menggunakan organisme uji berupa larva artemia. Larva artemia ini digunakan karena memiliki kesamaan dengan sistem enzim pada mamalia, beberapa enzim itu antara lain tipe DNA-dependent RNA polymerase, dan ouabaine sensitive Na+ & K+ dependent ATPase (Solis et al., P

P

P

P

1993). Sehingga apabila suatu senyawa dapat menyebabkan efek toksik pada larva artemia, maka senyawa tersebut juga dapat memberikan efek yang sama pada mamalia. Namun, perkembangan larva artemia tidak dapat dihubungkan secara langsung dengan perkembangan sel kanker karena memang tidak ada penelitian yang menegaskan hal tersebut.


Alil isotiosianat merupakan salah satu senyawa yang termasuk dalam golongan isotiosianat, sehingga memiliki kesamaan aktivitas sebagai antikanker dengan isotiosianat secara umum. Breier et al. (1995) menyatakan bahwa isotiosianat dapat menghambat aktifitas enzim Na+/K+-ATPase, kemungkinan P

P

P

P

isotiosianat berpengaruh besar pada tempat ikatan ATP dari molekul enzim. Na+/K+-ATPase ditemukan dalam semua bagian badan mamalia, fungsi enzim ini P

P

P

P

yaitu untuk mengkatalisis hidrolisis ATP (adenosin trifosfatase) menjadi ADP (adenosin difosfat) serta menggunakan tenaga dari ATP untuk mengeluarkan 3 Na+ dari sel dan memasukkan 2 K+ ke dalam sel. Penghambatan ikatan ATP oleh P

P

P

P

isotiosianat dapat mengganggu transport aktif pompa natrium dan kalium, karena apabila ATP tidak terbentuk maka tidak ada tenaga untuk menggerakkan pompa ion tersebut. Isotiosianat memiliki kemampuan dalam menghentikan siklus hidup sel yaitu pada fase S (sintesis DNA) dan fase M (mitosis) dalam siklus hidup sel. Hal ini disebabkan oleh karena isotiosianat akan mengacaukan gelendong mitotik dalam proses mitosis sehingga pembelahan sel tidak dapat terjadi (Li Tang et al., 2006). Apabila siklus hidup sel berhenti, maka sel tidak dapat hidup sehingga diharapkan sel kanker yang dihentikan siklus hidupnya mengalami kematian. Aktivitas isotiosianat sebagai senyawa antikanker dapat diketahui dalam menginduksi p53 yang akan menyebabkan terjadinya apoptosis yaitu suatu program kematian sel (Pappa et al., 2006). Di dalam sel kanker terjadi mutasi yang dapat menghambat fungsi p53, namun dengan adanya senyawa isotiosianat


akan menginduksi p53 yang merupakan protein penekan tumor sehingga p53 dapat memerintahkan sel untuk melakukan program bunuh diri. Aktivitas p53 dalam menghentikan siklus hidup sel terjadi pada fase G1. B

B

Ketika terjadi kerusakan DNA, p53 akan menginduksi p21 untuk berikatan dan menginaktivasi cdk2 (cyclin-dependent kinase 2) yang berperan penting dalam tahap transisi fase G1/S, sehingga proses transisi dari fase G1 ke fase S menjadi B

B

B

B

terhambat hingga terjadi perbaikan DNA. Namun apabila tidak terjadi perbaikan DNA yang efektif, p53 akan memerintahkan sel untuk menjalani program bunuh diri atau apoptosis (Best, 2006). Menurut Best (2006), untuk mematikan sel, p53 menginduksi transkripsi beberapa gen yang meliputi apaf-1 (apoptosis protease-activating factor) dan protein BAX. Protein BAX terdapat pada mitokondria, dimana BAX akan melepaskan sitokrom c. Apaf-1 dan sitokrom c dapat membentuk caspase-9 yang menyebabkan terjadinya apoptosis (gambar 8). Terjadinya apoptosis ditandai dengan kondensasi sel nukleus dan menghancurkannya menjadi serpihan-serpihan. Sitoplasma juga akan mengalami kondensasi dan terpecah membentuk membran yang mengelilingi badan apoptosis. Kromosom juga akan terpecah menjadi serpihan yang mengandung sejumlah nukleosom (Jakubowski, 2002). Sel yang telah hancur ini akan difagositosis oleh makrofag, maka tingkat kematian artemia yang disebabkan oleh fraksi air dapat dikatakan sebagai efek sitotoksik fraksi air brokoli.


Isotiosianat

merusak gelendong mitotik

menghambat fase M

menginduksi p53

induksi p21

apaf-1

BAX

apaf 1

sitokrom c

inaktivasi cdk2

mengambat fase G1/S B

menghentikan siklus sel

B

caspase-9

apoptosis

SEL MATI Gambar 8. Mekanisme aktivitas isotiosianat dalam mematikan sel

Isotiosianat diketahui dapat menyebabkan kematian sel, agar dapat mematikan sel maka isotiosianat harus dapat masuk ke dalam tubuh larva artemia melalui kulit larva yang belum terselubungi oleh karapak. Larva yang digunakan adalah larva yang berusia 48 jam dan termasuk pada tahap instar II, pada tahap ini larva belum terselubungi karapak. Isotiosianat dapat masuk dalam tubuh larva melalui mekanisme difusi pasif, dimana molekul-molekul isotiosianat akan bergerak melewati membran semipermeabel. Pada proses ini, molekul bergerak dari sisi yang kadarnya lebih tinggi menuju ke sisi lain yang kadarnya lebih rendah. Pengujian terhadap larva artemia ini menggunakan lima seri konsentrasi yaitu 320; 580; 1000; 1900; dan 3400 µg/ml. Selain kelima seri konsentrasi


tersebut, juga dibutuhkan kontrol negatif yang tidak berisi sampel. Kontrol ini berfungsi untuk mengetahui bahwa larva artemia yang mati tidak disebabkan oleh pelarut yang digunakan, namun kematian larva artemia tersebut disebabkan oleh zat aktif yang terkandung dalam fraksi air. Pelarut metanol diuapkan sehingga yang tersisa hanya fraksi kental saja yang berisi zat aktif. Dalam pembuatan seri konsentrasi fraksi air, digunakan pelarut metanol untuk mempercepat melarutnya fraksi air dalam bentuk kental dan mempercepat pula proses penguapan, karena jika tetap menggunakan air maka dibutuhkan waktu yang cukup lama. Pelarut metanol dipilih karena alil isotiosianat dalam brokoli selain larut dalam air juga memiliki kelarutan dalam metanol. Jadi alil isotiosianat masih tetap ada dalam pelarut metanol. Pelarut metanol juga digunakan sebagai kontrol negatif. Pada saat pengambilan larva dapat terlihat larva yang masih sangat muda (baru menetas) dan yang sudah berumur 48 jam. Untuk membedakannya, larva yang telah berumur 48 jam akan berwarna agak kecoklatan sedangkan yang masih terlalu muda berwarna putih tipis. Maka larva yang diambil adalah larva artemia yang berwarna agak kecoklatan. Larva artemia memakan apa saja yang berukuran kecil. Apabila persediaan makanan berlebih, jumlah makanan yang ditelan juga berlebih, akibatnya makanan yang belum sempat dicerna dengan sempurna terdesak oleh makanan baru yang masuk terus-menerus dalam jumlah banyak. Dengan demikian, makanan itu akan keluar lagi dari usus dalam keadaan belum tercerna dengan baik, dan belum diserap sarinya oleh usus. Bila hal ini terjadi, ia akan kelaparan


dalam timbunan makanan (Mudjiman, 1989) sehingga pemberian makanan untuk larva artemia cukup dengan satu tetes suspensi ragi. Dalam menentukan nilai LC50 dengan metode BST, waktu yang B

B

dibutuhkan untuk menghitung jumlah kematian larva yaitu 24 jam. Maka setelah 24 jam dihitung persentase kematian pada tiap konsentrasi dan kontrol, larva dikatakan hidup apabila masih terlihat ada pergerakan. Berdasarkan data kematian larva artemia pada kontrol metanol dan sampel fraksi air brokoli (Lampiran 7 dan 8), dapat digunakan untuk menghitung besarnya persentase kematian larva artemia menggunakan rumus Abbot. Digunakan rumus Abbot karena pada kontrol masih terdapat kematian larva artemia. Dari hasil perhitungan (Lampiran 9), dapat diperoleh data persentase kematian (Tabel II). Tabel II. Persentase Kematian Larva Artemia pada Berbagai Konsentrasi Fraksi Air Konsentrasi (µg/ml) 320 580 1000 1900 3400

Persentase Kematian (%) 32,6 45,7 68,9 75,6 80

Persentase kematian yang diperoleh dari fraksi air ini memenuhi rentang yang diharapkan yaitu 20 - 80%. Dari data (tabel II), terlihat bahwa semakin tinggi konsentrasi larutan yang digunakan, maka makin besar pula persentase kematiannya. Persentase

kematian

yang

telah

diperoleh

kemudian

dianalisis

menggunakan probit untuk memperoleh nilai LC50. Metode probit digunakan B

B


dalam penentuan nilai LC50 karena analisis probit dapat mengamati efek yang B

B

terjadi dari suatu konsentrasi, selain itu dapat memberikan nilai regresi yang menghasilkan garis linear sehingga memudahkan dalam penentuan nilai LC50. B

B

Pada analisis probit, konsentrasi sampel ditransformasikan menjadi log konsentrasi dan persen kematian dicari nilai probitnya. Konsentrasi sampel yang telah ditransformasikan ke dalam logaritma ditetapkan sebagai variabel tetap (absis). Sedangkan nilai probit dari setiap persentase kematian ditetapkan sebagai variabel terikat (ordinat). Analisis probit ini dilakukan dengan menggunakan program SPSS. Setelah dianalisis dengan analisis probit, maka diperoleh persamaan garis linear untuk fraksi air yaitu y = 1,34939 x – 3,77872 (Gambar 9) dan dapat diketahui bahwa nilai LC50 yang dihasilkan adalah 631 µg/ml (Lampiran 10). B

B

Probit Transformed Responses 1.0 .8 .6 .4 .2 -.0

Probit

-.2 -.4 -.6

Rsq = 0.9435

2.4

2.6

2.8

3.0

3.2

3.4

3.6

Log of KONSENTR

Gambar 9. Kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi fraksi air


Dari kurva (gambar 9), dapat terlihat adanya hubungan antara konsentrasi dengan efek, dimana semakin tinggi konsentrasi larutan yang digunakan maka jumlah kematian larva artemia juga semakin meningkat. Hal ini digambarkan dalam kurva dengan semakin tinggi konsentrasi, makin tinggi pula nilai probit. Menurut Supranto (1986), dalam hal dua variabel Y dan X, koefisien determinasi Rsq digunakan untuk mengukur tingkat ketepatan dari regresi linier sederhana yaitu merupakan persentase sumbangan X terhadap variasi Y, sehingga dalam praktek Rsq lebih penting dari pada r. Makin dekat Rsq dengan satu, makin tepat garis regresinya. Dari hasil analisis diperoleh nilai Rsq sebesar 0,9435. Nilai tersebut sudah mendekati satu sehingga dapat digunakan sebagai suatu kriteria untuk mengukur cocok tidaknya suatu garis regresi, dan selanjutnya digunakan untuk memperkirakan variabel terikat Y. Meskipun nilai Rsq dianggap lebih penting dari pada r, namun nilai r masih dapat digunakan untuk memastikan kelinieritasan garis dengan cara membandingkan nilai r yang diperoleh dengan nilai r tabel. Apabila nilai r yang diperoleh lebih besar dari pada nilai r tabel, maka kurva tersebut dapat dikatakan linier. Nilai r pada fraksi air adalah 0,971 sedangkan nlai r tabel adalah 0,878. Dari data tersebut, dapat dikatakan bahwa kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi dari fraksi air brokoli adalah linier. Dalam uji BST suatu ekstrak dikatakan bersifat toksik terhadap larva artemia apabila memiliki nilai LC50 < 1000 µg/ml (Meyer et al., 1982). Dari hasil B

B

penelitian diperoleh nilai LC50 untuk fraksi air adalah 631 µg/ml. Dengan B

B


demikian fraksi air brokoli dikatakan bersifat toksik sehingga diharapkan dapat memberikan efek sitotoksik terhadap sel kanker.

G. Uji Kualitatif Fraksi Air dengan Metode KLT Identifikasi senyawa yang terkandung dalam brokoli dilakukan dengan uji KLT (Kromatografi Lapis Tipis). Uji KLT dilakukan dengan pembanding ekstrak bawang putih (Alii sativi Bulbus) dalam pelarut metanol. Bawang putih digunakan sebagai pembanding karena salah satu senyawa yang terkandung di dalamnya sama dengan brokoli yaitu alil isotiosianat. Oleh karena itu, profil KLT dari ekstrak bawang putih yang dihasilkan dapat digunakan sebagai pembanding untuk senyawa alil isotiosianat dalam brokoli. Dalam uji kualitatif digunakan fase diam silika gel GF254. Silika gel GF254 B

B

B

B

merupakan silika gel yang mengandung gypsum (CaSO4) yang berfungsi sebagai B

B

perekat agar silika gel lebih terikat pada lempeng pendukungnya, dan mengandung indikator fluoresensi yang dapat berfluoresensi pada panjang gelombang 254 nm. Sampel dan pembanding yang telah ditotolkan pada pelat KLT kemudian dideteksi secara langsung (visible). Senyawa alil isotiosianat dideteksi menggunakan pereaksi semprot ninhidrin, menurut Wagner (1984) senyawa kimia yang mengandung sulfur dapat dideteksi menggunakan pereaksi semprot ninhidrin, namun pereaksi ini tidak dapat secara langsung menunjukkan bahwa senyawa yang terdeteksi adalah alil isotiosianat karena belum ada pustaka yang menyebutkan harga Rf dan warna bercak yang pasti untuk senyawa alil isotiosianat. Tetapi berdasarkan persamaan


warna dan Rf antara sampel dan pembanding yang diperoleh maka dapat diperkirakan bahwa senyawa tersebut adalah benar merupakan alil isotiosianat. Reaksi yang terjadi antara alil isotiosianat dengan pereaksi ninhidrin dapat dejelaskan pada gambar 11.

A

B

Gambar 10. Kromatogram fraksi air brokoli untuk pemeriksaan senyawa alil isotiosianat

Keterangan : Jarak pengembangan 10 cm. Fase diam : Silika gel GF254 (MERCK) Fase gerak : n-butanol : n-propanol : asam asetat glasial : air (30:10:10:10, v/v) A. Pembanding : Ekstrak bawang putih dalam pelarut metanol B. Sampel : Ekstrak kering brokoli dalam pelarut metanol Deteksi : Perekasi Ninhidrin B

P

B

P

B

B


O

O OH

+

H+

C

OH2

C

- H2O

OH

OH

O

O

Ninhidrin O

+

C

+ CH2

CH

CH2

N

OH Alil Isotiosianat O CH2CHCH2

O

N

S

C

+

C OH O CH2CHCH2

O

+

N

S

C

C OH O O

+

C

N

OH O

C

S + CH2CHCH2

+

C

S


O O +

C

N

O O

S + CH2CHCH2

C

OH

H

H

+

C

H

O

H

N

C

S

O O OH

C

N

C

+ S + H

O O

O +

OH

OH2

C

C OH

OH

O

O

O

O

C+

+ S

C

N

C

OH OH O

O

- H2O


O

O

+

C

C

S OH

N

C

OH

O

O

O

O

+

C

S OH

C

O

N

C

H

O

O

O

O

C

S

C

N

C

+ H+ - H2O

OH

O

O

O

O

O

C

S

C

N

C

O O

-

O

warna orange kuning Gambar 11. Reaksi antara alil isotiosianat dengan pereaksi ninhidrin


Tabel III. Hasil uji KLT fraksi air brokoli untuk pemeriksaan senyawa alil isotiosianat dengan fase diam silika gel GF254 dan fase gerak nbutanol : n-propanol : asam asetat glasial : air (30:10:10:10, v/v) B

B

P

Bercak

Sampel

Pembanding

No. 1. 2. 3. 4. 5. 1. 2. 3. 4. 5.

P

B

B

Pereaksi Ninhidrin Rf Warna 0,15 Orange 0,31 Orange kuning 0,39 Orange kuning 0,49 Orange muda 0,61 Orange muda 0,20 Orange tua 0,31 Orange 0,39 Orange kuning 0,51 Orange muda 0,59 Orange tua

Dari Gambar 10 dan Tabel III dapat terlihat 5 bercak yang muncul setelah proses pengembangan menggunakan fase gerak n–butanol, n–propanol, asam asetat glasial, dan air. Bercak yang muncul cukup banyak karena senyawa isotiosianat dan senyawa yang mengandung sulfur dalam brokoli maupun bawang putih bukan hanya alil isotiosianat saja namun masih ada beberapa senyawa lainnya. Dalam brokoli juga terdapat benzil isotiosianat, fenil isotiosianat, sulforafan, erusin, organosulfida, dan iberin, dalam bawang putih juga terdapat benzil isotiosianat, dialil sulfida, dan alil metil trisulfida. Dari kelima bercak ini yang paling menunjukkan kemiripan yaitu pada bercak nomor 3. Hal ini dapat terlihat dari nilai Rf yang berharga sama yaitu 0,39 serta warna yang sama setelah disemprot dengan pereaksi ninhidrin yaitu orange kuning. Dari persamaan Rf dan warna bercak nomor 3 antara sampel dengan pembanding, maka dapat dikatakan dalam fraksi air brokoli terkandung senyawa alil isotiosianat.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan 1. Fraksi air brokoli memiliki efek toksik terhadap larva Artemia salina LEACH dengan nilai LC50 sebesar 631 µg/ml. B

B

2. Hasil KLT menunjukkan bahwa dalam fraksi air brokoli terkandung senyawa alil isotiosianat.

B. Saran Perlu dilakukan pengujian lebih lanjut yaitu dengan uji biakan sel kanker untuk mengetahui sitotoksisitas dari fraksi air brokoli.


DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2001, The Merck Index, 13th edition, 312-313, Merck & Co., INC., New York. P

P

Anonim, 2007, Apoptosis, http://en.wikipedia.org/wiki/Apoptosis. Diakses pada 28 Januari 2007. HT

TH

Balmer, C., and Valley, A.W., 1997, Basic Principles of Cancer Treatment and Cancer Chemotherapy in Dipiro, J.T., Talbert, R.L., Yee, G.C., Matzke, G.R., Wells, B.G., and Posey, L.M., (Eds.), Pharmacotherapy A Pathophysiologic Approach, third edition, 2403-2408, Appleton & Lange, Stamford. Best, B., 2006, Cancer Death -- Causes & Prevention, http://www.benbest.com/ health/cancer.html. Diakses pada 6 Desember 2006. HT

TH

Breier, A., Ziegelhoffer, A., Stankovicova, T., Docolomansky,P., Gemeiner, P., and Vrbanova, A., 1995, Inhibition of (Na/K)-ATPase by electrophilic substances: functional implications, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=7494549&dopt=Abstract Diakses pada 7 Maret 2007. HT

TH

Campbell, N.A., Recee, J.B., and Mitchell, L.G., 2002, BIOLOGY, diterjemahkan oleh Rahayu Lestari, Edisi 5, Jilid 1, 322-328, Penerbit Erlangga, Jakarta. Chaulk, J. and Park, J., 2002, Artemia salina : The Common Brine Shrimp as A Useful Biological Indicator, Environmental Science 1000, 1-5. Corwin, J.E., 1996, Handbook of Pathophysiology, diterjemahkan oleh Brahm U. Pendit, 206, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta. Dalimartha, S., 2000, Atlas Tumbuhan Obat Indonesia, jilid 2, 25-27, Trubus Agriwidya, Jakarta. Ganong, W.F., 1995, Buku Ajar Fisiologi Kedokteran, diterjemahkan oleh dr. Petrus Andrianto, Edisi 14, 27-29, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta. Gollman, B., 2001, Phytopia’s Top 10, http://www.phytopia.com/oldsite/ top10.htm. Diakses pada 8 Februari 2007. HT

TH

Gritter, R.J., Bobbitt, J.M., and Schwarting, A.E., 1991, Introduction to Chromatography, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, edisi 2, 108109, ITB, Bandung.


Henkart, P., 1999, Apoptosis Interest Group, http://www.nih.gov/sigs/aig/ Aboutapo.html. Diakses pada 6 Desember 2006. HT

TH

Jakubowski, 2002, Apoptosis: Programmed Cell Death, http://employees.csbsju. edu/ hjakubowski/classes/ch331/signaltrans/apoptosis.htm. Diakses pada 28 Januari 2007. HT

TH

Katzung, B.G., 1989, Farmakologi Dasar dan Klinik, edisi 3, 857-859, Buku Kedokteran EGC, Jakarta. Katzung, B.G., 2004, Farmakologi Dasar dan Klinik, buku 3, edisi 8, 298-302, Salemba Medika, Jakarta. Krul, C., 2002, Metabolism of sinigrin (2-propenyl glucosinolate) by the human colonic microflora in a dynamic in vitro large-intestinal model, http://carcin.oxfordjournals.org/cgi/content/full/23/6/1009. Diakses pada 20 April 2007. HT

TH

Kumar, S., Prasad, S., and Singh, R.N., 2005, Resurgence of Spider Mite Tetranychus ludeni Zacher (Acarina : Tetranychidae) Against Acaricides and Botanical Pesticides on Cowpea, Resistant Pest Management Newsletter, 1-3. Kuswibawati, L., 2000, Apa Itu Kanker? dalam Yuswanto, Ag., Sinaradi, F., (Eds.), KANKER, 103-145, USD, Yogyakarta. Li Tang, Zhang, Y., Jobson, H.E., Jun Li, Stephenson, K.K., Wade, K.L., and Fahey, J.W., 2006, Potent Activation of Mitochondria-Mediated Apoptosis and Arrest in S and M phases of Cancer Cells by a Broccoli Sprout Extract, http://mct.aacrjournals.org/cgi/content/abstract/5/4/935. Diakses pada 12 Januari 2007. HT

TH

Meyer, B.N., Ferrigni, N.R., Putnam, J.E., Jacobsen, L.B., Nicholas, D.E., McLaughlin, J.L., 1982, Brine Shrimp : Convenient General Bioassay for Active Constituents, Planta Medica, 45, 31-34. Mills, H.A., 2001, Vegetable Crops : Broccoli (Brassica oleracea var. italica), http://www.uga.edu/vegetable/broccoli.html. Diakses pada 16 September 2006. HT

TH

Misiewicz, I., Skupinska, K., and Guttman T.K., 2003, Sulforaphane and 2oxohexyl Isothiocyanate Induce Cell Growth Arrest and Apoptosis in L1210 Leukemia and ME-18 Melanoma Cells, http://147.52.72.117/or/2003/ volume10/number6/2045.pdf. Diakses pada 6 Desember 2006. HT

TH

Mudjiman, A., 1989, Udang Renik Air Asin, 15-18, Bhatara, Jakarta.


Nestle, M., 1997, Broccoli sprouts as inducers of carcinogen-detoxifying enzyme systems: clinical, dietary, and policy implications, http://www.sproutnet. com/Nutrition/Research/broccoli_sprouts_as_inducers_of.htm. Diakses pada 20 April 2007. HT

TH

Rouzaud, G., Young, S.A., and Duncan, A.J., 2004, Hydrolysis of Glucosinolates to Isothiocyanates after Ingestion of Raw or Microwaved Cabbage by Human Volunteers, http://cebp.aacrjournals.org/cgi/content/full/13/1/125. Diakses pada 12 Januari 2007. T

T

HT

TH

Rukmana, R., 1995, Budidaya Kubis Bunga dan Broccoli, 15-16, 56, Penerbit Kanisius, Yogyakarta. Shapiro, T.A., Fahey, J.W., Wade, K.L., Stephenson, K.K., and Talalay, P., 2001, Chemoprotective glucosinolates and isothiocyanates of broccoli sprouts: metabolism and excretion in humans, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=11352861&dopt=Abstra ct. Diakses pada 17 April 2007. HT

TH

Solis, P.N., Wright, C.W., Anderson, M.M., Gupta, M.P., and Phillipson, J.D., 1993, A Microwell Cytotoxicity Assay Using Artemia Salina (Brine Shrimp), Planta Medica, 59, 250-252. Stahl, E., 1985, Thin-Layer Chromatography, A Laboratory Handbook, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata & Iwang Sudiro, 266-273, ITB, Bandung. Supranto, J., 1986, Pengantar Probabilitas dan Statistik Induktif, jilid 2, 221-235, Erlangga, Jakarta. Surjadi, H., 2005, Pustaka Tani : Brokoli Berkhasiat Menghambat Pertumbuhan Kanker Kandung Kemih, http://www.pustakatani.org/BeritaGlobal/Tabid/ 54/ctl/ArticleView/mid/368/articled/33/. Diakses pada 27 Oktober 2006. HT

TH

Wagner, H., Bladt, S., & Zgainski, E.M., 1984, Plant Drug Analysis, translated by Th. A. Scott, 255-256, Springer-Verlag, Berlin. Xiao, D., et al, 2003, Allyl isothiocyanate, a constituent of cruciferous vegetables, inhibits proliferation of human prostate cancer cells by causing G2/M arrest and inducing apoptosis, http://carcin.oxfordjournals.org/cgi/content/full/24/ 5/891. Diakses pada 27 April 2007. T

T

B

HT

TH

TH

B



Lampiran 1. Surat Determinasi

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA (KAMPUS 11/) Paingan Maguwoharjo, Depok, Sleman, Yogyakarta 55281 Telp. (0274) 8833037,883968, Fax. (0274)886529 - Telegram: SADHAR YOGYA E-Mail: [email protected]

SURAT PENGESAHAN DETERMINASI No: 390/LKTO/far-USD/09/06

Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, menyatakan bahwa telah melakukan determinasi terhadap satu contoh tanaman, dengan nama: Brassiea oleraeea var. italiea. (Brokoli) Determinasi telah dilakukan secara benar sesuai dengan: Mills, H.A., 2001, Vegetable Crops: Broccoli (Brassica oleracea var italica) http://www.uga.edul Vegetable/broccoli.html. Diakses 16 September 2006.

Hingga katagori: varietas Tanaman tersebut dipakai dalam penelitian: Uji Brine Shrimp Lethality Test (BST) Fraksi Air Bunga Brokoli (Brassiea oleraeea var italiea.) Beserta Profil Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Oleh

: Sinta Kiranawati

Dari

: Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Herbarium disimpan Laboratorium Biologi Umum, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, dengan nomor katalog: Demikian surat pengesahan determinasi ini dibuat untuk dapat dipergunakan sebagai mana mestinya


Lampiran 2. Foto Penelitian

Gambar 12. Tanaman Brokoli (Brassica oleracea var. italica)

Gambar 13. Brokoli


Gambar 14. Larva Artemia salina LEACH

Gambar 15. Bak Penetasan untuk Larva Artemia salina LEACH


A

B

Gambar 16. Kromatografi Lapis Tipis Fraksi Air Brokoli untuk Pemeriksaan Alil Isotiosianat

Keterangan : Jarak pengembangan 10 cm. Fase diam : silika gel GF254 (MERCK) Fase gerak : n-butanol:n-propanol:asam asetat glasial:air (30:10:10:10, v/v) Pembanding : Ekstrak bawang putih dalam pelarut metanol Sampel : Ekstrak kering brokoli dalam pelarut metanol Deteksi : Perekasi Ninhidrin dilihat secara visible B

B

P

Lampiran 3. Cara Pembuatan Pereaksi Semprot Ninhidrin Timbang 0,3 gr serbuk ninhidrin

Larutkan dalam 100 ml butanol

Tambahkan 3 ml asam asatat glasial

P

B

B


Lampiran 4. Cara Pembuatan Ekstrak Alii sativi Bulbus dalam Pelarut Metanol sebagai Pembanding pada Uji KLT Senyawa Alil Isotiosianat Timbang 1 gram biji Alii sativi Bulbus, kemudian direbus dalam 50 ml metanol selama 5 menit Diamkan selama 1 jam dengan sekali-kali digojog Ambil bagian yang bening dan diuapkan sampai volumenya tinggal 5 ml

Larutan pembanding ini diambil dengan menggunakan pipet kapiler 5 µl sebanyak 6 kali totolan sehingga konsentrasinya 150 µg/µl.

Lampiran 5. Perhitungan untuk Membuat Larutan Stok Fraksi Air Timbang sebanyak 100 mg fraksi air dan dilarutkan dalam 10 ml metanol, sehingga konsentrasinya adalah 10 mg/ml (larutan A)

Dari larutan A diambil 1 ml dan dilarutkan juga dalam 10 ml metanol, sehingga konsentrasinya adalah 1 mg/ml (larutan B)

Larutan A dan B ini digunakan untuk membuat variasi konsentrasi 10, 100, dan 1000 µg/ml. Perhitungan •

Larutan A 100 mg fraksi air dalam 10 ml metanol C1 = 100 mg : 10 ml B

B

= 10 mg/ml


•

Larutan B C1 x V1 = C2 x V2 B

B

B

B

B

B

B

B

10 mg/ml x 1 ml = C2 x 10 ml B

B

C2 = 1 mg/ml B

•

B

Konsentrasi 10 µg/ml Dibuat dengan menggunakan larutan B (1 mg/ml) C1 x V1 = C2 x V2 B

B

B

B

B

B

B

B

1 mg/ml x V1 = 0,01 mg x 5 ml B

B

V1 = 0,05 ml B

•

B


B

B

B

B

B

B

B

1 mg/ml x V1 = 0,1 mg x 5 ml B

B

V1 = 0,5 ml B

•

B

Konsentrasi 1000 µg/ml Dibuat dengan menggunakan larutan A (10 mg/ml) C1 x V1 = C2 x V2 B

B

B

B

B

B

B

B

10 mg/ml x V1 = 1 mg x 5 ml B

B

V1 = 0,5 ml B

B

Lampiran 6. Perhitungan untuk Membuat Variasai Konsentrasi Larutan Sampel dari Fraksi Air Larutan sampel dibuat berdasarkan hasil orientasi, dimana untuk fraksi air dapat memberikan respon kematian pada larva artemia dengan konsentrasi


tertinggi (Large Dose (LD)) yaitu 1000 µg/ml dan konsentrasi terendah (Small Dose (SD)) yaitu 100 µg/ml. Kemudian ditentukan faktor pengalinya (F) menggunakan rumus : F = n -1

LD SD

1000 100 F = 1,8 F = 5-1

(Malone & Robichaud, 1962 cit Thompson, 1985) dimana : F : faktor pengali (increment factor)

SD : small dose

n : jumlah peringkat waktu

LD : large dose

Sehingga diperoleh 5 seri konsentrasi yaitu 320; 580; 1000; 1900; dan 3400 µg/ml. Volume larutan yang harus diambil untuk tiap-tiap konsentrasi adalah : •


B

B

B

B

B

B

B

1 mg/ml x V1 = 0,320 mg x 5 ml B

B

V1 = 1,6 ml B

•

B


B

B

B

B

B

B

B

10 mg/ml x V1 = 0,580 mg x 5 ml B

V1 = 0,3 ml B

B

B


•


B

B

B

B

B

B

B

10 mg/ml x V1 = 1,000 mg x 5 ml B

B

V1 = 0,5 ml B

•

B


B

B

B

B

B

B

B

10 mg/ml x V1 = 1,900 mg x 5 ml B

B

V1 = 0,95 ml B

•

B


B

B

B

B

B

B

B

10 mg/ml x V1 = 3,400 mg x 5 ml B

B

V1 = 1,7 ml B

B

Lampiran 7. Data Kematian Larva Artemia salina Leach pada Kontrol Metanol dari Fraksi Air Setelah 24 jam

Konsentrasi (µg/ml) 320 580 1000 1900 3400

Jumlah larva artemia yang mati tiap flakon (ekor) I II III IV V 1 1 1 1 0 2 0 1 0 1 1 0 1 1 2 2 1 0 0 2 2 1 1 1 0

Persentase Kematian (%) 8 8 10 10 10


Lampiran 8. Data Kematian Larva Artemia salina Leach Karena Pengaruh Fraksi Air Setelah 24 jam

Konsentrasi (µg/ml) 320 580 1000 1900 3400

Jumlah larva artemia yang mati tiap flakon (ekor) I II III IV V 4 3 4 4 4 5 4 5 5 6 8 6 9 9 7 8 6 9 9 9 9 6 9 9 10

Persentase Kematian (%) 38 50 72 78 82

Lampiran 9. Perhitungan Persentase Kematian Larva Artemia pada Fraksi Air Menggunakan Rumus Abbot

% Kematian terkoreksi =

Persen kematian teramati - Persen kematian pada kontrol x 100 100 - Persen kematian pada kontrol

(Kumar, Prasad, & Singh, 2005) Konsentrasi 320 µg/ml % Kematian terkoreksi =

38 - 8 x 100 100 - 8

% Kematian terkoreksi = 32,6 % Konsentrasi 580 µg/ml % Kematian terkoreksi =

50 - 8 x 100 100 - 8


72 - 10 x 100 100 - 10

% Kematian terkoreksi = 68,9 %


Konsentrasi 1900 µg/ml % Kematian terkoreksi =

78 - 10 x 100 100 - 10


82 - 10 x 100 100 - 10

% Kematian terkoreksi = 80 %

Lampiran 10. Perhitungan Data Statistik Fraksi Air Menggunakan Probit * * * * * * * * *

DATA

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * * * * * *

Information

5 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested.

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


* * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * * * * * *

Parameter estimates converged after 12 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: BX): Regression Coeff.

Standard Error

Coeff./S.E.

1.34939

.53507

2.52189

Intercept

Standard Error

Intercept/S.E.

-3.77872

1.60963

-2.34758

KONSENTR

Pearson

(PROBIT(p)) = Intercept +

Goodness-of-Fit

Chi Square =

.385

DF = 3

P =

.943

Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits.

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

* * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * * * * * *

Observed and Expected Frequencies

KONSENTR

Number of Subjects

Observed Responses

Expected Responses

Residual

2.51 2.77 3.02 3.28 3.53

10.0 10.0 10.0 10.0 10.0

3.3 4.6 6.9 7.6 8.0

3.479 4.814 6.171 7.397 8.381

-.219 -.244 .719 .163 -.381

Prob .34789 .48144 .61712 .73969 .83814


* * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * * * * * *

Confidence Limits for Effective KONSENTR

Prob

KONSENTR

.01 .02 .03 .04 .05 .06 .07 .08 .09 .10 .15 .20 .25 .30 .35 .40 .45 .50 .55 .60 .65 .70 .75 .80 .85 .90 .91 .92 .93 .94 .95 .96 .97 .98 .99

11.92116 18.98167 25.49805 31.83657 38.13782 44.47458 50.89133 57.41854 64.07895 70.89074 107.70607 150.17940 199.74095 258.04432 327.16202 409.79332 509.55308 631.41335 782.41665 972.88756 1218.60974 1545.01683 1995.99941 2654.71048 3701.58171 5623.90514 6221.74379 6943.45160 7834.00336 8964.28510 10453.73792 12522.79452 15635.81542 21003.57248 33443.29858

95% Confidence Limits Lower Upper .00000 .00002 .00007 .00020 .00044 .00087 .00159 .00272 .00444 .00696 .04466 .19469 .68438 2.10004 5.87344 15.34629 37.90793 88.36101 189.98986 359.43031 577.70866 812.57935 1061.96380 1348.99613 1717.93034 2266.21489 2416.61259 2589.20743 2790.90436 3032.13589 3329.66769 3712.80176 4239.37897 5048.23723 6628.75467

86.51926 113.16268 134.29437 152.84180 169.87744 185.93358 201.32019 216.23719 230.82328 245.18026 315.80471 388.28078 466.43734 554.19316 657.03628 784.27750 954.30125 1209.25980 1661.17189 2639.20188 5121.17658 12072.72440 33679.25348 111957.61353 471262.47595 2954422.18449 4615002.39726 7498185.83335 12796438.3605 23266236.5153 46052554.2087 102824294.372 276377432.516 1030520055.35 8224948863.37


Probit Transformed Responses 1.0 .8 .6 .4 .2 -.0

Probit

-.2 -.4 -.6

Rsq = 0.9435

2.4

2.6

2.8

Log of KONSENTR

3.0

3.2

3.4

3.6


BIOGRAFI PENULIS

Sinta Kiranawati. Lahir di Purbalingga pada tanggal 13 Juli 1984 sebagai putri keempat

dari

empat

bersaudara,

dari

pasangan Bapak Sachid Hadi Prayitno & Ibu Agatha Ambar Rukmi Amir Retno. Penulis mulai menempuh jenjang pendidikan di Taman Kanak - Kanak Pertiwi, Purbalingga pada tahun 1988 sampai tahun 1990. Dan melanjutkan pendidikan ke Sekolah Dasar di SD Negeri Gembong II, Purbalingga dari tahun 1990 sampai tahun 1996. Pendidikan Lanjutan Tingkat Pertama ditempuh oleh penulis dari tahun 1996 sampai tahun 1999 di SMP Negeri I Purbalingga, dan pendidikan Lanjutan Tingkat Atas di SMU Negeri I Purbalingga dari tahun 1999 sampai tahun 2002. Penulis melanjutkan pendidikan di Fakutas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Selama kuliah di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, penulis pernah aktif sebagai anggota Paduan Suara Farmasi “Veronika” pada tahun 2003 sampai tahun 2005 serta pernah aktif mengikuti beberapa kepanitiaan.

UJI BRINE SHRIMP LETHALITY TEST (BST) FRAKSI AIR BROKOLI (Brassica oleracea var. italica) BESERTA PROFIL KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT) SKRIPSI

Recommend Documents