MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA
Ústav zoologie, rybářství, hydrobiologie a včelařství
BIOAKUMULACE TĚŽKÝCH KOVŮ V HOSTITELI A JEHO PARAZITECH Diplomová práce
Vedoucí práce: Ing. Marie Borkovcová, Ph.D.
Vypracovala: Bc. Radka Petrboková
BRNO 2009
PROHLÁŠENÍ
Prohlašuji, že jsem diplomovou práci s názvem Bioakumulace těžkých kovů v hostiteli a jeho parazitech vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně.
Dne......……………………………………….......... Podpis autora………………………………………
PODĚKOVÁNÍ
Ráda bych poděkovala Ing. Ivana Jankovské, PhD. a Ing. Marie Borkovcové, Ph.D. za poskytnutou pomoc a ochotu při zpracování této diplomové práce.
ABSTRAKT Tato práce porovnávala 2 skupiny hostitelsko – parazitických systémů (drobní savci a jejich paraziti; ovce domácí a její tasemnice Moniezia expansa z hlediska bioakumulace těžkých kovů v tkáních hostitele a měla za úkol zjistit, zda existuje rozdíl mezi akumulací těžkých kovů živočichy napadenými parazitickými helminty a těmi bez helmintů. V práci bylo zjištěno, že helminti drobných savců vykazovali nízkou diverzitu. Čtyři ze všech studovaných těžkých kovů, Cd, Cr, Mn a Zn, měly významný vliv na abundanci parazitů drobných savců. Při analýze těžkých kovů v játrech, ledvinách, svalovině
a
krvi
helmintologicky
pozitivních
drobných
savců
ve
srovnání
s helmintologicky negativními jedinci bylo zjištěno, že napadení hostitelé měli podobný obsah těžkých kovů v játrech a ledvinách jako hostitelé bez parazitů. V ledvinách byl nalezen významně vyšší obsah Pb, Cd, Cr, Cu a Ni než v játrech. Ale obsah Mn byl výrazně vyšší v játrech než v ledvinách. Obsah Zn se nelišil v játrech ani v ledvinách. U ovcí byly zjištěny významné rozdíly v zatížení těžkými kovy mezi tkáněmi (játra, ledviny, svaly a krev) u neinfikovaných jedinců a u jedinců nakažených tasemnicemi Moniezia expansa. Ovce, které neměly ve střevech tasemnice (Moniezia expansa), měly významně vyšší koncentrace Pb v játrech a ledvinách oproti ovcím infikovaných tasemnicemi.
Klíčová slova: drobní savci, helminti, Moniezia expansa, ovce, paraziti, těžké kovy
ABSTRACT This paper compared two groups of host – parasite systems (small mammals and their parasites, and domestic sheep and their tapeworms Moniezia expansa). Here, It is compared the view of the bioaccumulation of heavy metals in the host tissues and my commitment was to find out if exists any difference between the accumulation of heavy metals in animals attacked by parasitical helminthes and those without them. In this work was shown that small animal‘s helminthes embody low diversity. Four from all studied heavy metals, Cd, Cr, Mn and Zn had an important influence in the abundance of parasites in small animals. In the analysis, heavy metals in the liver, kidney, muscles and blood positive helminthological small animals in comparison with the negative helminthological individua was found that attacked hosts had similar content of heavy metals in the liver and kidney as the individua without parasites. In the kidney was found considerably higher contents of Pb, Cd, Cr, Cu and Ni than in the liver. But the content of Mn was markedly higher in the liver than in kidney. The content of Zn did not differentiated in concentration between the liver and the kidney. In sheep were determined important differences in the heavy metal's burdened between tissues (liver, kidney, muscles and blood) in no-infected individuals and in individuals infected with tapeworms Moniezia expansa. The sheep, that did not have tapeworms in their guts (Moniezia expansa), had markedly higher Pb concentration in the liver and kidney compared to sheep with tapeworms.
Key words: heavy metals, helminths, Moniezia expansa, parasites, sheep, small mammals
1. ÚVOD.......................................................................................................................6 2. CÍL PRÁCE ..............................................................................................................7 3. LITERÁRNÍ PŘEHLED ...........................................................................................8 3.1 Těžké kovy ..........................................................................................................8 3.2 Paraziti jako indikátoři znečištění prostředí..........................................................9 3.3 Vliv znečištění prostředí na populace a komunity parazitů ...................................9 3.3.1 Eutrofizace..................................................................................................10 3.3.2 Okyselení vody a acidifikace půd................................................................11 3.3.3 Kontaminovaný sediment............................................................................12 3.3.4 Odpadní vody .............................................................................................13 3.4 Rozdělení parazitů na „effect indicators“ a „accumulation indicators“ .............15 3.5 „Effect indicators“ (indikátoři určitého vlivu) ..............................................16 3.6 „Accumulation indicators“ (sentineloví indikátoři).......................................17 3.6.1 Parazitičtí helminti jako sentinelové organismy...........................................18 3.6.2 Ideální sentinelové organismy (accumulation indicators).............................19 3.6.3 Kritéria pro ideální sentinely .......................................................................19 3.6.4 Paraziti jako akumulující indikátoři stavu prostředí .....................................20 3.6.5 Vhodnost/použití jednotlivých druhů endohelmintů ....................................20 3.6.6 Potřeba nových sentinelových organismů....................................................22 4. MATERIÁL A METODIKA...................................................................................25 4.1 Drobní savci a jejich helminti ............................................................................25 4.1.1 Laboratorní postup ......................................................................................27 4.1.2 Analytické metody ......................................................................................27 4.1.3 Statistické analýzy ......................................................................................28 4.2 Ovis ammon f. aries a tasemnice Moniezia expansa ...........................................29 4.2.1 Pokusný vzorek...........................................................................................29 4.2.2 Odběr vzorků a analytické metody…. .........................................................30 4.2.3 Statistická analýza …..................................................................................31 5. VÝSLEDKY ...........................................................................................................32 5.1 Drobní savci a jejich helminti ............................................................................32 5.1.1 Experiment I ...............................................................................................32 5.1.2 Experiment II..............................................................................................33 5.1.3 Experiment III.............................................................................................36 5.2 Ovis ammon f. aries A tasemnice Moniezia expansa ..........................................37 5.2.1 Experiment I…. ..........................................................................................37 5.2.2 Experiment II a IV ......................................................................................39 5.2.3 Experiment II..............................................................................................41 6. DISKUSE................................................................................................................44 7. ZÁVĚR ...................................................................................................................47 8. POUŽITÁ LITERATURA ......................................................................................50
1. ÚVOD Schopnost organismů koncentrovat škodliviny z prostředí do svého těla byla poznána již počátkem 20. století. V poslední době roste zájem o vzájemný vztah mezi parazitismem a znečištěním prostředí - především těžkými kovy, ale také pesticidy, kaly, odpadní vodou aj. Nejvíce prostudovaná oblast v tomto směru je vodní prostředí, kde především vrtejši a tasemnice ve střevě ryb akumulují těžké kovy v takových koncentracích, které jsou několikanásobně vyšší, než tyto koncentrace v tkáni jejich hostitele nebo ve vnějším prostředí. Použití těchto sentinelových organismů je výhodné ve srovnání s přímou analýzou polutantů (např. ve vzorcích vody nebo sedimentu), protože pouze frakce, které jsou biologicky dostupné, jsou přijímány a koncentrovány živočichy. Navíc tzv. akumulující indikátoři mohou integrovat polutanty postupem doby a jsou tudíž schopni detekovat substance, i když nejsou permanentně přítomny v prostředí (Sures, 2004). Informace o parazitech obratlovců žijících v suchozemských ekosystémech jako sentinelech pro zatížení prostředí těžkými kovy jsou vzácné. Tento fenomén (fenomén silné akumulace těžkých kovů parazity) a jeho využití jak při environmentálním monitoringu v daném ekosystému, tak pro vztah mezi zatížením těžkými kovy u hostitele majícím ve střevech parazity (především tasemnice) a hostitelem bez parazitů (tasemnic) je předmětem této práce.
6
2. CÍL PRÁCE Cílem práce bylo porovnat 2 skupiny hostitelsko-parazitárních systémů (býložravý, všežravý) z hlediska bioakumulace těžkých kovů v tkáních hostitele (játra, ledviny, popř. svalovina – která u býložravců (ovcí) dále slouží jako potrava masožravců, včetně člověka) a zjistit/ověřit, zda existuje rozdíl mezi akumulací těžkých kovů živočichy napadenými parazitickými helminty a těmi bez helmintů. Jako první byl testován model všežravý hostitel drobní savci a jejich tasemnice, jako druhý model tasemnice ovčí (Moniezia expansa) – ovce domácí (Ovis ovis).
V práci byla uskutečněna následující sledování: 1, zjištění napadení helminty drobných savců odchycených v oblasti zatížené i nezatížené průmyslovými imisemi 2, analýza těžkých kovů v játrech, ledvinách popř. svalovině helmintologicky pozitivních ve srovnání s helmintologicky negativními jedinci 3, analýza TK v parazitických helmintech nalezených u helmintologicky pozitivních jedinců
7
3. LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Těžké kovy Těžké kovy v ovzduší představují závažnou potenciální zátěž ostatních složek životního prostředí (Internet 1, 2001). S rozvojem moderní techniky roste velmi rychle produkce a spotřeba kovů a metaloidů (Bencko, 1995). Pojem těžké kovy je v oblasti ochrany prostředí používán pro skupinu kovů a metaloidů se specifickou hmotností prvku větší než 4 g.cm-3. Patří sem As, Cd, Cr, Cu, Hg, Ni, Pb a Zn (Internet 1, 2001). Toxické kovy představují důležitý faktor životního prostředí, který se může pozitivně nebo negativně projevit v metabolických dějích v organismu (Halačka, 1972). Zvyšování koncentrace výše uvedených kovů v životním prostředí člověka - v ovzduší, vodě, půdě a poživatinách - je vážný hygienický problém, jehož rozsah neustále vzrůstá. Při zvyšování obsahu toxických kovů v půdě se v mnoha případech zvyšuje jejich obsah v poživatinách rostlinného původu i v živočišných produktech, což může mít pro člověka neblahé následky (Bencko, 1995). Mezi významné zdroje emisí TK patří energetika (velké elektrárny a teplárny), některé technologické procesy (metalurgie, výroba skla a cementu), a v případě olova také doprava (Internet 2, 2008). Většina těžkých kovů patří mezi látky, které jsou toxické, některé již ve velmi nízkých koncentracích. Působí nepříznivě na člověka, ale jejich toxicita se může daleko více projevit u nižších organismů, jak terestrických, tak vodních. Jejich specifickou vlastností je, na rozdíl od kontaminantů organického charakteru, že nepodléhají rozkladným procesům. Jsou perzistentní, v životním prostředí zůstávají, pouze mění formy, ve kterých jsou v prostředí přítomny. (Internet 3, 2008) Některé těžké kovy jsou ve stopových množstvích obsaženy v živých organismech a jsou důležitou součástí biochemických reakcí organismu (např. kobalt, měď, mangan, molybden a zinek). U ostatních těžkých kovů jako je rtuť, olovo a kadmium nejsou známy žádné pozitivní účinky na organismy, a jejich akumulace v organismu může způsobit vážné zdravotní poruchy. Jejich toxicita záleží na formě, v jaké se v prostředí vyskytují (rozpustné nebo nerozpustné) a na vazbě, jakou jsou ve sloučenině vázány (Internet 4, 2006-2007).
8
Dle Bencka (1995) problémy s toxickými kovy s ekologického hlediska nesporně narůstají a jsou mimořádně složité a dosud málo probádané.
3.2 Paraziti jako indikátoři znečištění prostředí Některé organismy mohou svojí přítomností či absencí poskytovat informace o stavu zatížení jejich životního prostředí chemickými látkami. Jiné organismy, které jsou méně ovlivněné toxickými látkami v prostředí a mohou koncentrovat tyto toxické látky do svých tkání (MacKenzie, 1999). Parazity lze využívat k odhadu kvality prostředí. Existuje řada způsobů, jak změny prostředí ovlivňují parazity. Parazitismus může vzrůstat, jestliže podnět (vliv člověka apod.) snižuje hostitelovu rezistenci nebo roste hustota mezihostitele nebo definitivního hostitele. Parazitismus může ale také klesat, pokud denzita mezihostitele nebo definitivního hostitele klesá nebo paraziti trpí vyšší mortalitou, buď přímo toxickým efektem na parazity nebo nepřímo infikovaný hostitel trpí různě vysokou mortalitou (Lafferty, 1997). Jako bioindikátor je označován organismus nebo společenstvo, jehož životní funkce závisejí na faktorech prostředí tak těsně, že mohou sloužit jako jejich ukazatele. Biologická indikace vychází z principu ekologické valence, přičemž druhy stenovalentní (druh s úzkou ekologickou valenci – specializovaný, mající specifické nároky na prostředí a tím i omezené rozšířeni) jsou lepšími indikátory než druhy euryvalentní (druh s širokou ekologickou valencí)- tj. mají vyšší indikační hodnotu (váhu). Vlastnosti ideálního bioindikátoru jsou taxonomická spolehlivost a snadná determinace, kosmopolitní rozšíření, vysoká početnost, nízká genetická a ekologická variabilita, dostatečná velikost, omezená pohyblivost a dlouhověkost, dostatek autekologických informací, vhodnost pro laboratorní studie. Bioindikátorů se běžně využívá pro potřeby monitoringu kvality prostředí.
3.3 Vliv znečištění prostředí na populace a komunity parazitů V poslední době roste počet prací, které se při hledání indikátorových organismů pro sledování dopadů činnosti člověka na životní prostředí věnují parazitům (MacKenzie, 1999; Lafferty, 1997; Overstreet, 1999; Sures, 2003; Pietrock a 9
Marcogliese, 2003 a další). Paraziti jsou užiteční bioindikátoři, především pokud je monitorováno antropogenní znečištění prostředí. Kromě zatížení prostředí těžkými kovy, mezi nejčastější znečišťovatele životního prostředí patří: eutrofizace neboli obohacování vod o živiny (zejména dusík a fosfor), okyselení vody, kontaminovaný sediment, odpadní vody a další.
3.3.1 Eutrofizace
Přirozená eutrofizace je proces trvající tisíce až desetitisíce let. Eutrofizace indukovaná (antropogenní), představuje významné zkrácení procesu na roky až desítky let, je především způsobena metodami užívanými
zemědělství, průmyslové
technologii a vypouštěním odpadních vod (Internet 5, 2005 - 2008). Eutrofizace neboli obohacování vod o živiny, zejména dusík a fosfor, např. při vyluhování dusíku a fosforu z půdy a rozkladu odumřelých organismů, nebo splachem dusíkatých a fosforečných hnojiv z polí, splaškovými vodami se zvýšeným obsahem fosforečnanů (saponáty, fekálie atd.) zvyšuje druhovou bohatost některých parazitů (Broeg et al., 1999) Na její průběh má vliv zejména koncentrace fosforu (ve formě ortofosforečnanů – PO43-), neboť tento prvek je v prostředí zpravidla zastoupen v menší míře než dusík. Řasy a sinice po určité době odumírají a vlivem rozkladných procesů může dojít k částečnému nebo úplnému vyčerpání kyslíku rozpuštěného ve vodě. To způsobí hromadný úhyn dalších organismů, zejména vodních živočichů. Při rozkladu se do vody zároveň uvolňuje velké množství organických látek (Internet 6, 2003/2004). U společenství parazitů plotice obecné (Rutilus rutilus) a okouna říčního (Perca fluviatilis), ale také brousilek (Trichodina sp.) - parazitických nálevníků u platýze bradavičnatého (Platichthys flesus) měla eutrofizace za následek zvýšenou prevalenci, abundanci, intenzitu a denzitu těchto parazitů (Valtonen et al., 1997).
10
Obr.1: Schéma eutrofizace (Internet 7, 2008)
3.3.2 Okyselení vody a acidifikace půd
Hlavní příčiny kyselé atmosférické depozice, označované populárně jako kyselý déšť, jsou emise oxidu siřičitého (SO2), který vzniká zejména spalováním hnědého uhlí, a emise oxidů dusíku (NOx) způsobené hlavně vysokoteplotním spalováním v automobilových motorech. SO2 a NOx v atmosféře a na povrchu vegetace dále oxidují za vzniku kyseliny sírové a kyseliny dusičné, které snižují pH srážkové vody. Tato kyselá voda startuje řetěz reakcí vedoucích k okyselení půd a povrchových vod, jehož důsledkem jsou uhynulé horské lesy, kyselé povrchové vody bez ryb, podzemní vody s vysokým obsahem toxických kovů uvolněných z půd a hornin. V České republice hraje nejdůležitější roli v okyselování půd kyselina sírová. Z atmosféry se na zemský povrch dostává dvěma mechanizmy. Prvním je vlastní kyselý déšť, správněji "mokrá depozice", druhým je "suchá depozice" síry. Ta se uplatňuje v oblastech s vysokými koncentracemi SO2 v ovzduší. Mechanizmus suché depozice je zhruba následující: SO2 a síranový aerosol z atmosféry se zachycují na povrchu vegetace, kde SO2 oxiduje na H2SO4, která je při nejbližším dešti spláchnuta do půdy. Nejvíc síry zachycuje smrkové jehličí, listnaté opadavé dřeviny jí zachytí výrazně méně. Suchá depozice síry tvoří na území ČR zhruba dvě třetiny celkové depozice a je rozhodujícím faktorem okyselování zalesněných oblastí. Vedle množství depozice rozhodují o stupni okyselení vlastnosti půd, zejména množství bazických kationtů ( Ca2+, Mg2+, Na+, K+), jejichž zdrojem je zvětrávání
11
podložních hornin. Čím více je v půdách bazických kationtů, tím jsou odolnější, protože mohou déle neutralizovat kyselý přísun z atmosféry. Nejméně odolné jsou horské půdy, které mají malou mocnost a přirozeně nízké množství bazických kationtů. V horách se devastující vliv kyselých dešťů projevuje nejdříve, protože jsou v nich vysoké srážky, časté mlhy, vysoká rychlost větru a převaha smrkových monokultur. To celkovou depozici síry výrazně zvětšuje (Internet 8, 1996/7) Halmetoja et al. (2000) uvádějí, že komunita parazitů cizopasící u okounů říčních (Perca fluviatilis) při okyselení vody redukuje svoji diverzitu. Společenství parazitů u křečka bavlníkového (Sigmodon hispidus) syn. myš hrubosrstá nebo bavlníková krysa, reagovalo na prostředí zatížené petrochemikáliemi sníženým počtem druhů helmintů (Faulkner a Lochmiller, 2000). Také společenství parazitů plžů (Physella columbiana, Lymnaea palustris) reagovalo na prostředí zatížené těžkými kovy nižší diverzitou a intenzitou infekce (Lefcort et al, 2002). Stejně tak společenství parazitů jelce tlouště (Leuciscus cephalus) reagovalo na organické znečištění vody poklesem druhové bohatosti (Dušek et al., 1998) Mercoglies a Cone (1996) studovali parazity amerických úhořů (Anquilla rostrata) v místech, které se liší kyselostí vod (pH od <4,7 do >5,4 v závislosti na pufrovací kapacitě podložního sedimentu. Zjistili, že parazitární bohatost měla hodnotu 4 při nejnižší kyselosti pH >5,4; hodnotu okolo 2,5 při mírné kyselosti vod (pH 4,7-5,4); a hodnotu 2 při nejvyšší kyselosti vod (pH <4,7). Autoři přisuzují tento pokles diverzity, z části, absenci plžů (a tím i motolic) v místech s nejvyšší kyselostí vod. Zatímco Monogenea (korelační koeficient R= -0,408) a motolice (R= -0,383 a R= -0,496) ubývají s vyšší kyselostí vod, vrtejši (R=0,323) přibývají s kyselostí vody a tasemnice (R=-0,222) s Copepoda (R=0,135) jsou relativně nedotčeny (R>0,4004 pro P<0,05). Tento rozdílný výsledek naznačuje větší komplex reakcí na kyselost vody než jen pokles diverzity parazitů (Lafferty, 1997).
3.3.3 Kontaminovaný sediment
Kontaminované zeminy a sedimenty patří k problematickým odpadům, protože jde o velké objemy odpadů. Značný podíl v objemech odpadů představuje především výkopová zemina, která vzniká při sanaci starých zátěží a při stavební činnosti. Dalším 12
materiálem, patřícím do této skupiny, jsou sedimenty a usazeniny vytěžené ze dna rybníků, drobných vodních toků a závlahových kanálů. Usazeniny ze dna jednotlivých prvků hydrografické sítě jsou většinou materiály přirozeného původu, vznikající díky přírodním procesům. I v případě, že sedimenty vyhovují požadavkům na obsah těžkých kovů a dalších rizikových látek, stávají se po vytěžení odpadem. Při aplikaci materiálů do zemědělské půdy musí být řešen problém možné kontaminace půd, vstupu rizikových látek do půdního prostředí a tím i do dalších složek ekosystému. Kontaminované sedimenty se nevyskytují jen v blízkosti silných zdrojů znečištění, ale mohou také představovat vážný problém v plošně znečištěných oblastech, při revitalizaci toků a čištění říčních koryt a nádrží (Internet 9, 2007). Zvýšený obsah rozpuštěných látek v povrchových vodách je také jedním z důsledků lidské činnosti. Značný podíl těžkých kovů, které přicházejí do prostředí z různých zdrojů, přechází dříve či později do ekosystému povrchových vod. Zde jsou z vodního prostředí odčerpávány vodními rostlinami a živočichy (plankton a bentos), jejich největší podíl se však ukládá v sedimentech vodních toků a nádrží, kde se hromadí (Internet 10, 2008). Využitím sedimentů vracíme do půdy částice, o které byla ochuzena erozí a dalšími degradačními vlivy. Avšak při sedimentaci těchto částic ve vodním prostředí dochází k interakcím s dalšími látkami přítomnými ve vodě a může docházet k obohacování sedimentů rizikovými prvky. Je proto nutné posoudit obsah těchto rizikových prvků a stanovení limitů před aplikací do půdy (Internet 9, 2007). Kontaminovaný sediment měl za následek úbytek brousilek (Trichodina sp.) u platýze drsného (Hippoclossoides platessoides), ale vyšší abundanci žábrohlístů (Gyrodactylus sp.), žádný vliv neměl na motolice (Digenea) v zažívacím traktu platýze drsného (Hippoclossoides platessoides) (Marcogliese et al, 1998).
3.3.4 Odpadní vody
Odpadní vody definuje § 22 zákona č. 138/1973 Sb., vody použité v sídlištích, obcích, domech, závodech, ve zdravotnických zařízeních a jiných objektech či zařízeních, pokud po použití mají změněnou jakost (složení nebo teplotu), jakož i jiné vody z nich odtékající, pokud mohou ohrozit jakost povrchových nebo podzemních vod. 13
Ke klíčovým problémům patří znečišťování povrchových toků odpadními vodami obsahujícími zvýšené množství toxických kovů. Jsou-li tyto odpadní vody čištěny, vzniká další problém likvidace vznikajících kalů. Při nadměrném nebo nevhodném používání jako hnojiva mohou zvýšit riziko penetrace toxických kovů do potravinového řetězce člověka (Bencko, 1995). Dodržování limitů kanalizačního řádu má vliv i na obsah těžkých kovů ve vyhnilém kalu, který je jedním z produktů čištění odpadních vod. Snížení obsahu těžkých kovů v odpadních vodách by umožnilo opětovné využívání vyhnilého kalu v zemědělství (Internet 11, 1998). Tab 1. Obsah vybraných kovů ve vyhnilém odvodněném kalu v ÚČOV v letech 1997–2005 v porovnání s rokem 1989 [v mg/kg] (Internet 12, 2006)
Rok
Chrom Olovo Měď
Zinek
1989
742,0
400,0
713,0
2 333,0 22,8
121,0 –
1997
73,1
191,8
338,1
1 395,0 5,3
58,4
5,2
2,7
1998
79,6
125,1
326,2
1 198,0 4,2
46,5
5,5
2,6
1999
149,6
93,3
266,0
1 144,0 4,0
42,0
8,9
3,9
2000
193,0
89,0
308,0
1 314,0 5,1
41,1
10,1
4,4
2001
227,0
81,0
298,0
1 612,0 3,8
46,5
9,3
3,8
2002
311,0
83,0
322,0
1 544,0 3,6
55,3
9,8
3,1
2003
271,0
119,0
359,0
2 424,0 6,7
67,2
8,7
4,0
2004
254,0
84,0
335,0
2 837,0 2,9
74,0
10,0
3,6
2005
92,0
124,0
332,0
1 179,0 2,8
51,0
9,8
3,0
Max 2005
190,0
470,0
370,0
1 900,0 4,3
75,0
15,0
4,6
Limit
dle 1 000,0 500,0
Kadmium Nikl
Kobalt Rtuť
1 200,0 3 000,0 13,0
200,0 –
10,0
500,0
100,0 –
4,0
ČSN Vyhláška
200,0
200,0
2 500,0 5,0
č. 382/01 Sb .
14
Odpadní voda, je voda, jejíž kvalita byla zhoršena lidskou činností. Komunální odpadní voda vzniká každodenní lidskou činností - pochází z domácností, škol, úřadů, od živnostníků a podobně. Splašky mají přibližně stejné složení. Kromě splašků obsahuje v případě jednotné kanalizace i oplachové vody (vodu z mytí ulic) a dešťovou vodu ze srážek. Zpracovává se na městských čistírnách odpadních vod (ČOV). Množství znečištění přiváděného na městskou ČOV se vyjadřuje jako počet ekvivalentních obyvatel. Průmyslová odpadní voda vzniká v průmyslových podnicích. Míra a charakter znečištění vody záleží na druhu průmyslu, ale i použité technologii výroby. Průmysl produkuje odpadní vody jednak z technologických vod (což je voda přímo použitá ve výrobě) a jednak z chladicích vod (což je voda používaná na chlazení zařízení, ta bývá znečištěná „pouze“ tepelně). Průmyslová odpadní voda se čistí buď přímo v podniku (tam někdy stačí vodu předčistit a pak vypustit do kanalizace, nebo přímo v městské ČOV (Internet 13, 2008). Odpadní vody z papíren a celulózek měly za následek sníženou abundanci a malý počet druhů žábrohlístů z čeledi Dactylogyridae parazitující u plotice obecné (Rutilus rutilus) (Siddall et al, 1997), avšak vyšší abundancí a intenzitu infekce motolice Rhipidocotyle fennica (Digenea) (Jeney et al., 2002) a vyšší prevalenci a intenzitu vrtejše parazitující u pyskouna (Tautugolabrus adspersus) (Biliard a Khand, 2003).
3.4 Rozdělení parazitů na „effect indicators“ a „accumulation indicators“ Paraziti mohou reagovat na environmentální znečištění různými způsoby. Na jedné straně zasahují do bioindikačních procesů svým vlivem na fyziologii a chování hostitele, což může vést k falešně negativním, nebo k falešně pozitivním projevům znečištění prostředí. Na druhé straně paraziti mohou být využiti jako tzv. effect indicators nebo jako accumulation indicators, podle způsobu, kterými reagují na antropogenní znečištění (Sures 2004).
15
3.5 „Effect indicators“ (indikátoři určitého vlivu) Indikátoři určitého vlivu mohou poskytovat hodnotné informace o chemickém stavu jejich prostředí změnami jejich fyziologie a/nebo chování. Jestliže např. škeble (slávky) změní svoji frekvenci v otevírání lastur, tyto změny mohou indikovat přítomnost toxinů ve vodě (Borcherding a Wolf, 2001). Použití jednotlivých organismů pro indikace určitého vlivu může být možná použitím přímé toxicity látek na volně žijící parazitická stádia. Navzdory početným parazitům majícím volně žijící larvální stádia, většina toxikologických studií byla provedena s použitím miracídií a cerkárií motolic. V těchto studiích, známý počet larválních stádií byl vystaven chemikáliím a byla analyzována následná přežitelnost, životaschopnost a infekčnost těchto stádií. Z toho vyplývá, že vysoké koncentrace environmentálních škodlivin, jako jsou těžké kovy, snižují počet testovaných organismů, kvůli vázání toxikantů, které způsobují deaktivaci řady enzymů. Při srovnání s tradičním vlivem indikačních procedur, jako např. monitor otevírání mušlí, systémy testu cerkárií se zdají být méně slibné. Z důvodu relativně krátké životnosti cerkárií,
by
měl
být
monitoringový
system
používající
tyto
organismy
nekomplikovaný, aby mohl být rutinně používán (Pietrock a Marcogliese, 2003). Nicméně studie citované v práci (Pietrock a Marcogliese, 2003) mohou být použity k vyhodnocení vlivu znečištění na přenos parazitů a následné složení parazitů. Trichodiny (brousilky) žaberní paraziti ryb se jeví být úzce spjaty se znečištěním vody. Stresované ryby v přeplněných nádržích s nízkou kvalitou vody jsou silně náchylné k žaberním parazitům (Skinner, 1982). Intenzita nebo prevalence nálevníků vzrůstá se znečištěním ropnými látkami nebo odpadní vodou (Khan, 1990). Nárůst parazitických nálevníků se zdá být způsoben nárůstem citlivosti ryb, protože toxické podmínky oslabují jejich imunitní systém (Palm a Dobberstein, 1999). Zjištění, že intenzita infekce parazitickými nálevníky může být shodná s ostatními formami patologie jako je úbytek lymfocytů, žaberní hyperplazie, jaterní anomálie podporují tuto domněnku. Patologie, která se zdá nejvíce související s nálevníky je zvýšená produkce slizu jako hlavní obrana ryb proti žaberním parazitům (Lafferty, 1997). Také Yeomans et al. (1997) uvádí, že vliv organického znečištění vody se projevil zvýšenou hustotou brousilek (Trichodina sp.) u koljušky tříostné (Gasterosteus aculeatus). 16
Změny v životním prostředí mohou ovlivňovat také motolice v řadě stádií jejich složitého životního cyklu. Je potřeba dokonalé porozumění životnímu cyklu všech druhů motolic a odlišit druhy profitující ze znečištění prostředí od druhů, které to poškozuje. Pozorování malé městské populace rohatých plžů Cerithidea californica odebraných z bahniska parkoviště hraničící s rušnou křižovatkou, kde viditelně chyběli ptáci (hlavní predátoři plžů), ukázalo, že plži zde byli neinfikovaní ve srovnání s plži v přilehlých močálech s prevalencí infekce 25%. To naznačuje, že znečištění prostředí v tomto případě snižuje prevalenci motolic v populaci plžů (Lafferty, 1997). Autoři (Heinonen. et al., 1999 a 2000, Ruus et al., 2001,) se domnívají, že prevalence motolic v prostředí koresponduje se stupněm degradace daných lokalit. Cort et al. (1960) jako první vyšetřovali tyto souvislosti a zjistili, že diverzita a druhová bohatost larev motolic poklesla oproti studiím provedeným před 20-ti lety. Zaznamenali také zvýšené znečišťování prostředí člověkem a pokles populace pobřežních ptáků. Kees a Blankespoon (1998) sledovali tyto stanoviště a zjistili pokračující poklesy diverzity a druhové bohatosti larev motolic, avšak některé druhy, pravděpodobně ty, které se asociovaly s lidmi, svoji početnost zvýšili. Příkladem je např. prudký nárůst dermatitid plavců v Moskvě asociovaný se znečištěním prostředí člověkem. Zde eutrofizace zlepšila kondici plžů. K tomu navíc populace kachen, které unikly z okolních farem a adaptovaly se na město, podporují životní cyklus motolice Trichobilharzia ocellata. Tyto příklady podtrhují potřebu porozumění životnímu cyklu všech druhů motolic a odlišit druhy profitující ze znečištění prostředí od druhů, které to poškozuje (Lafferty, 1997). Někteří paraziti (helminti) se jeví jako vhodné sentinelové organismy více jiné méně.
3.6 „Accumulation indicators“ (sentineloví indikátoři) Akumulující indikátoři neboli sentinely efektivně akumulují substance z prostředí a příjem příslušných substancí je vyrovnán jejich exkrecí. Toxické efekty na organismus většinou nedoprovázejí příjem a biokoncentraci těchto substancí. Použití sentinelových organismů je výhodné ve srovnání s přímou analýzou polutantů 17
(např. ve vzorcích vody nebo sedimentu), protože jen frakce, které jsou biologicky dostupné, jsou přijímány a koncentrovány živočichy. Navíc akumulující indikátoři mohou integrovat polutanty postupem doby a jsou tudíž schopni detekovat substance, které nejsou permanentně přítomni v prostředí (Sures et al., 1999). Sentinelový organismus je bioakumulující indikátor, který kumuluje ve svém těle polutanty z prostředí. Analýza tkání sentinelových organismů umožňuje odhad polutantu v prostředí. Ideální sentinelový organismus vykazuje především dvě následující vlastnosti (Helawell, 1986): 1. Musí existovat jednoduchý, vždy platný vzájemný vztah mezi obsahem polutantu v těle organismu a v prostředí 2. Organismy musí snášet i maximální koncentrace polutantu v prostředí a rozmnožovat se za těchto podmínek Bioakumulační monitoring sleduje akumulaci škodlivin ve tkáních testovaných organismů (sentinelových organismů - senzorů) vystavených účinkům prostředí ve zkoumané lokalitě. Koncentrace znečišťujících látek je často na nebo pod hranicí detekčního limitu stanovitelnosti konvenčních analytických metod a navíc analýza vody či sedimentu neposkytuje přímé údaje i biodostupnosti (bioavailability) (Internet 14, 2008).
3.6.1 Parazitičtí helminti jako sentinelové organismy
Parazitičtí helminti jsou užitečnými sentinelovými organismy, indikátory zatížení prostředí, kde žijí, těžkými kovy. Především vrtejši a některé tasemnice mají největší kapacitu akumulovat těžké kovy (Sures 2001, 2003; Sures et al., 1997, 1999; Turčeková et al., 2002; aj). Avšak jen jedna hlístice (Philometra cyprinirutili dříve ovata byla zjištěna jako akumulující těžké kovy ve vysokých koncentracích. Baruš et al. (2007) potvrdili tuto skutečnost (akumulaci těžkých kovů) také pro Philometra ovata která je tudíž také vhodný bioindikátorový druh pro zatížení prostředí těžkými kovy, srovnatelný s vrtejši a tasemnicemi. Avšak přítomnost hlístice Philometra ovata v práci Baruš et al. (2007) neměla žádný vliv na obsah Cr, Cd, Cu, Pb, Ni a Zn ve svalovině hostitelských ryb hrouzka obecného (Gobio gobio), autoři nezjistili signifikantní rozdíly v množství těchto prvků mezi svalovinou ryb infikovaných a neinfikovaných touto hlísticí. 18
V přehledu Sures (2004) jen dva druhy hlístic Philometra cyprinirutili (Pb, Cd, Cr) a Anisakis simplex (Pb, Cd, Cu, Zn) byly uvedeny, že akumulují velké množství těžkých kovů. Baruš et al. (2007) toto potvrdili také pro hlístici Philometra ovata
3.6.2 Ideální sentinelové organismy (accumulation indicators)
Schopnost organismů koncentrovat polutanty z jejich prostředí do svého těla byla poznána již počátkem 20. století. Použití sentinelů je výhodné ve srovnání s přímou analýzou polutantů (např. ve vzorcích vody nebo sedimentu), protože jen frakce, které jsou biologicky dostupné, jsou přijímány a koncentrovány živočichy. Navíc akumulující indikátoři mohou integrovat polutanty postupem doby - jsou tudíž schopni detekovat substance, i když nejsou permanentně přítomni v prostředí. Konečně sentinely mohou být použity jako pomocná chemická analýza v případech, kde ačkoliv koncentrace polutantů v prostředí jsou relativně nízké, nicméně oni jsou důležití pro monitoringové procedury, jako je monitoring ušlechtilých kovů, radionuklidů nebo polutantů v původních oblastech (Sures, 1999). Pro environmentální posouzení by měli být používáni paraziti hojných hostitelů a ti, kteří jsou geograficky široce rozšíření (Sures, 2004).
3.6.3 Kritéria pro ideální sentinely
Ideální sentinelové organismy musí mít vysoký akumulační potenciál a stejnou souvztažnost (korelaci) mezi obsahem polutantů v jejich těle a průměrnou koncentrací polutantů v prostředí ve všech místech a za všech podmínek. Při maximálním možném množství polutantů v prostředí nesmějí umírat nebo být neschopni dlouhodobé reprodukce. Musí být nestěhovaví nebo s dobře definovatelným home-range (domovskou lokalitou/okrskem), v blízkosti studované plochy. Tyto organismy by měli mít velké tělo, k poskytnutí dostatečné tkáně pro analýzu. Měl by to být hojný druh, ze kterého může být odebrán velký počet jedinců beze změn věkové struktury nebo nějakého signifikantního vlivu na populaci. Široce rozšířený druh k usnadnění srovnání mezi různými oblastmi. Druh snadno sebratelný a identifikovatelný, s dobře prostudovanou fyziologií, včetně vlivu věku, velikosti, sezony a reprodukční aktivity na asimilaci polutantů (přizpůsobení se škodlivinám). Tyto organismy by měli být 19
dlouhověcí dovolující integraci polutantů po dlouhou dobu (Sures, 2004).
3.6.4 Paraziti jako akumulující indikátoři stavu prostředí
Paraziti jsou nejčastěji využíváni jako indikátoři akumulující těžké kovy ze svého prostředí tj. z těla hostitele. Dokonce, když paraziti neakumulují organické polutanty, jsou schopni změnit příjem chemických látek svého hostitele, včetně těžkých kovů (Evans et al., 2001; Bergey et al., 2002). Tento fenomén může souviset se zjištěním, že paraziti ovlivňují fyziologii jejich hostitele mnoha způsoby. Ovlivňováním základních procesů může být spuštěn komplex fyziologických kaskád (Sures, 2004). Nejvíce prací, sledujících akumulaci těžkých kovů parazity, bylo provedeno na helmintech ryb, kteří akumulují kovy ve větší míře, než jsou jejich koncentrace v okolním prostředí a to tisíckrát více než jejich hostitel. Pro tyto účely jsou nejvhodnější mnohobuněční endoparaziti (endohelminti), jelikož parazitičtí prvoci jsou příliš malí pro poskytnutí dostatečného materiálu pro spolehlivou chemickou analýzu. Ektoparaziti, jako např. monogenea, korýši a pijavky, jsou obvykle predominantně ovlivněny okolním prostředím (vodou) a jsou pravděpodobněji svoji akumulací více podobní volně žijícím organismům. Z důvodu těchto omezení je většina publikací zaměřena na endohelminty (Sures, 2004).. V současné době se jako významné bioindikátory environmentálního znečištění těžkými kovy využívají endohelminti ryb (hlavně Acanthocephala, Cestoda). Velká část výzkumu se zabývá právě problematikou bioindikátorů ve vodním prostředí, zatímco parazité pozemních obratlovců jsou jako bioindikátory opomíjeni.
3.6.5 Vhodnost/použití jednotlivých druhů endohelmintů
Bylo zjištěno, že hlístice nejsou jako sentinely příliš vhodné, naopak vysoká kapacita pro akumulaci těžkých kovů byla zjištěna u tasemnic a ještě více u vrtejšů (Sures, 2004). Na rozdíl od řady prací zabývajících se vyšetřováním parazitů ve vodním prostředí, mnohem méně informací je dostupných o parazitech suchozemských zvířat. V suchozemských systémech existuje však urgentní potřeba sentinelů (akumulujících organismů). Studie s endohelminty savců se týkaly nejčastěji parazitů potkanů (Scheef et al., 2000; Sures et al., 2000b), prasat (Sures et al, 1998; Sures et al., 2000), ale také 20
skotu (Sures et al, 1998) nebo ptáků (Baruš et al., 2000, 2001; Tenora 2000, 2001). Několik zpráv bylo publikováno o koncentraci těžkých kovů u hlístic, které jak již bylo zmíněno nepatří mezi vhodné sentinelové organismy. Greichus a Greichus (1980) sledovali chemické složení škrkavky prasečí (Ascaris suum) a zjistili 1-10x vyšší koncentrace kadmia, mědi, železa, manganu, olova, selenu a zinku v ledvinách prasete ve srovnání s A. suum. Množství kovů v parazitech bylo průměrně jen tak vysoké, jako ve svalovině prasat. Tudíž hlístice parazitující u savců podobně jako hlístice parazitující u ryb se rovněž jeví jako neúčinní akumulující indikátoři vzhledem k nízkému množství kovů zachycených v jejich těle (Sures, 2004). Vyšetřování skotu přirozeně nakaženého motolicí jaterní (Fasciola hepatica) přineslo odlišné výsledky. Ačkoliv obsah kadmia v motolici byl 10x nižší než v játrech a 30x nižší než v ledvinách skotu, koncentrace olova v motolici byla 172, 115 a 53x vyšší než jednotlivé koncentrace ve svalovině, ledvinách a játrech hostitele (Sures et al., 1998). Jak bylo popsáno pro vodní prostředí, tasemnice a vrtejši jsou nejslibnější skupiny pro akumulaci kovů z okolního prostředí. Práce v terénu s vrtejšem obrovským (Macracanthorhinchus hirudinaceus) z přirozeně nakažených prasat v Bolivii odhalila, že některé kovy (Ba, Cd, Cu, Fe, Mg, Mn, Ni, Pb, Se a Sr) jsou bioconcentrovány 160x více ve vrtejších ve srovnání s množstvím kovů ve svalovině, játrech, ledvinách a střevech hostitele (Sures, 2000). Avšak rozsah definitivního hostitele je omezen pouze na prasata (Taraschewski, 2000). Macracanthorhinchus hirudinaceus může být použit jako akumulující indikátor jen za určitých okolností, jako je venkovní chov domácích prasat, kde mají příležitost se nakazit nebo ze zastřelených divokých prasat. Obdobně experimentální studie byly provedeny použitím vrtejše Moniliformis moniliformis parazitujícího u krys a potkanů (Sures et al., 2000; Scheef et al., 2000). Po orálním podání kadmia krysám, vrtejši obsahovali 20x, 23x a 119x více Cd než ledviny, játra a střevo hostitele (Scheef et al., 2000), podobné výsledky zjistil Sures et al. (2000) u olova. Bohužel Moniliformis moniliformis není tak běžný u krys a potkanů jako ostatní paraziti. Další skupina parazitů často nalézána ve střevě hlodavců, dokonce v městských ekosystémech, jsou tasemnice (např. druhy rodu Hymenolepis). Sures et al. (2002) laboratorně zjišťovali akumulační schopnost tasemnice H.diminuta parazitující u krys a potkanů pro olovo. Po experimentální infekci potkanů cysticerkoidy H.diminuta a 21
následném orálním podáním olova se ukázalo, že tyto tasemnice měly 17x vyšší koncentrace olova v těle, než potkani v ledvinách. Následné vyšetřování v terénu poblíž Káhiry (Egypt) prováděné autory Sures et al. (2003), se stejným hostitelskoparazitárním systémem, potvrdilo příjem a biokoncentraci olova také v terénních podmínkách. H.diminuta měla 87x, 87x a 11x vyšší koncentrace olova v těle než potkani ve střevě, v játrech a v ledvinách. Tudíž hostitelsko-parazitární systém, potkan - H.diminuta se zdá být užitečný a slibný bioindikační sytém přinejmenším pro olovo v městských ekosystémech, protože potkani a tasemnice jsou globálně rozšířené a snadno přístupné. Narozdíl od ptáků, kteří kvůli své mobilitě jsou spolu se svými parazity nevhodní k monitorování znečištění prostředí.
3.6.6 Potřeba nových sentinelových organismů
Ačkoliv existují dobré argumenty pro používání parazitů jako sentinelů, ekologové preferují pro indikační záměry používání živočichů, jako jsou mušle, korýši a ryby, (Rosenberg a Resh, 1993) protože jsou zvyklí, pracovat s těmito organismy (ne s jejich parazity). Naproti tomu, proč bychom potřebovali nové a dokonce více citlivé akumulační indikátory, než ty zaběhnuté? Použitím vrtejšů v pracích o dopadech na prostředí, mohou být detekované velmi nízké koncentrace těžkých kovů v prostředí, kvůli enormní akumulační kapacitě těchto červů. Toto je výhoda např. pro stanovení přítomnosti a existence antropogenního znečištění v původních oblastech (Sures, 2004), jako např. Antarktida, kde se použili vrtejši pro stanovení přítomnosti olova a stříbra, ačkoliv oba prvky nebyly vůbec, nebo jen velmi slabě detekovatelné v tkáni hostitele (ryby), v tkáni těla vrtejšů byli detekovatelné (Sures a Reimann, 2003). Proto zvláště v nepřístupných, vzdálených oblastech je extrémně důležité mít co nejúčinnější indikátory (Sures, 2004). Nové člověkem způsobené zatížení těžkými kovy pochází z aut, která jsou vybavena katalytickými konventory (katalyzátory). Zaváděním automobilových katalyzátorů jsou emitovány s výfukovýmié plyny PGE (platinium group elements) palladium Pd, platinum Pt a rhodium Rh. Práce v terénu ukazují kumulativní nárůst koncentrací PGE v silničním prachu a půdě podél silně frekventovaných cest (Hoppstock a Sures, 2005). V nových
studiích
o
evropských
úhořích
přirozeně
infikovaných
vrtejši 22
Paratenuisentis ambiguus, který byl experimentálně vystaven materiálu z katalyzátorů, paraziti přijali a akumulovali platinu a rhodium, zatímco ve vyšetřovaných tkáních hostitele žádný příjem kovů nebyl zjištěn (Sures et al., 2003). Tyto výsledky demonstrují, že bioakumulace PGE v parazitech by mohla usnadnit analytické procedury jako je pre-koncentrační krok před vlastní detekcí kovů. Analýza dostupné literatury o parazitech - sentinelech odhalila, že jen málo parazitů je vhodných využít jako akumulující indikátory. Mezi rozmanitými parazity ve vodě žijících hostitelů, kteří byli doposud vyšetřováni/zkoumáni je vrtejš Pomphorhynchus laevis obzvláště důležitý. Tento parazit vykazuje velmi vysokou schopnost akumulace kovů (Sures et al., 2003; Sures a Siddall, 2003) a je běžným a široce rozšířeným parazitem jelců a parem, kteří jsou globálně rozšířeni. Navíc P. laevis se zdá být rozštěpen na sladkovodní kmen zjištěný u lososovitých ryb, parem a jelců a na euryhalinní kmen nalezený u úhořů a platýsů/flunder, přinejmenším v UK (Taraschewski, 2000). Použití úhořů a platýsů/flunder jako definitivních hostitelů P. laevis, může být v budoucnu také aplikováno jako sentinel v brakických a mořských lokalitách. Zatímco P. bulbocolli a P. lucyi parazitují u různých druhů sladkovodních ryb jako u definitivního hostitele, P.rocci a P. tereticollis jsou primárními parazity Morone saxalis a ostatních mořských a brakických druhů ryb (Amin, 1998). Tudíž rod Pomphorhynchus se zdá být slibným sentinelem v řadě vodních oblastí na celém světě (Sures, 2004). Kvůli urgentní potřebě sentinelů v suchozemském a obzvláště městském prostředí (Schubert, 1991), střevní paraziti potkanů a krys jako je M. moniliformis a zejména H. diminuta se také ukazují jako slibné sentinely. Tasemnice jsou široce rozšíření a běžní paraziti savců, jsou snadno identifikovatelné a poskytují dost tkáně pro analýzu těžkých kovů. Potkani jako definitivní hostitelé H. diminuta jsou také širo rozšíření a hojní ve všech typech suchozemského prostředí na světě. Tudíž potkani a jejich tasemnice mohou být používáni jako velmi užitečný nástroj při biomonitoringu prostředí. Avšak existují také některé vlastnosti akumulujících indikátorů, které jsou potřeba ještě prostudovat, zejména zda tasemnice splňují kriteria ideálních sentinelových organismů (Sures, 2004). Je potřeba více studií provedených v terénu i experimentálně pro vyhodnocení vztahu mezi bioakumulací parazitem a zatížení prostředí kovy. Stále chybí dostatek informací o I) vlivu parazitů na běžné bioindikační procedury, jako je analýza 23
biomarkerů/ukazatelů (Pokud se podíváme na biomarkery jako na biochemické a molekulární cíle/terče organismů a buněk, paraziti mohou být důležití jako faktor ovlivňující fyziologickou homeostátu jejich hostitele). II) potřebujeme mnohem více znalostí o základních fyziol. vlivech parazita na hostitele v době nákazy, vývoje a reprodukce. Pokud porozumíme základním procesům, ekotoxikologický výzkum by z toho mohl profitovat, např. s ohledem na zhodnocení významnosti reakcí biomarkerů na znečištění. To je pole rostoucí důležitosti, kde parazitologové by mohli zkusit kombinovat své znalosti a expertýzy s toxikologya ekotoxikology. Navíc se ukazuje, že paraziti sami mohou být vhodní efektový indikátoři, pokud se sledují změny populace nebo komunity. To je především výhoda pro indikaci vhodnosti/citlivosti dlouhodobých změn ekosystému (Sures, 2004). Je potřeba více informací pro ustanovení určitého hostitelsko-parazitárního systému jako efektního indikačního systému. Je nutné neustále hledat nové sentinelové organismy pro suchozemské prostředí.
24
4. MATERIÁL A METODIKA 4.1 Drobní savci a jejich helminti Vždy v červnu a říjnu r. 2003 byly ve sledované oblasti odchytáváni drobní savci (myšice a hraboši), kteří byli po otevření tělní dutiny, určení stáří, pohlaví a pohlavní aktivity uchováváni v mrazícím boxu až do následného vyšetření, při kterém z něj byly vyjmuty játra, ledviny a zažívací trakt k dalšímu prošetření. Po makroskopickém prozkoumání byla játra a ledviny vloženy do označených epruvet a znovu zamražena. Zažívací trakt byl rozdělen na žaludek, tenké a tlusté střevo a každá část byla mikroskopicky vyšetřena na přítomnost parazitických helmintů. Nalezení helminti byli shromažďováni v označených epruvetách a uchováváni v 96% alkoholu, až do analýzy těžkých kovů v jejich těle.
Experiment I. Při prvním pokusu jsme se zaměřili na porovnání koncentrací těžkých kovů těžkých kovů v játrech a ledvinách hlodavců. Množství těžkých kovů (Cd, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb a Zn) bylo stanoveno pomocí metody ICP OES. Společenství helmintů hlodavců z monitorované oblasti vykázalo nízkou diverzitu.
Pokusný vzorek Jako pokusný vzorek pro bylo použito 25 hlodavců (15 Apodemus flavicolis a 10 Microtus agrestris), kteří byli napadeni hlísticemi (Mastophorus muris) nebo tasemnicemi (Paranoplocephala sp.) (tab. 1). Tito hlodavci pocházeli z imisně zatížené oblasti Krušných hor. Hostitelé byli rozděleni do skupin po 3 (nebo 4) hlodavcích podle pohlaví, váhy, věku a podle parazitologického zatížení.
25
Tab 2: Parazitologické zatížení hlodavců použité pro analýzu těžkých kovů
Vzorek
Hostitel
(počet)
1
Apodemus flavicolis (3)
2
Apodemus flavicolis (3)
3
Apodemus flavicolis (3)
4
Apodemus flavicolis (3)
5 6 7 8
Apodemus flavicolis (3) Microtus agrestris (3) Microtus agrestris (4) Microtus agrestris (3)
Helminti (počet) Mastophorus muris (3x3) Mastophorus muris (3x4) Mastophorus muris (3x5) Mastophorus muris (3x2) Mastophorus muris Paranoplocephala sp. Paranoplocephala sp. Paranoplocephala sp.
Odchytová oblast Hlodavci byli odchytáváni v imisně zatížené oblasti v Krušných horách (obr. 1) do sklapovacích pastí, které byly rozmístěny ve stálých kvadrátech o velikosti 1ha. Hlodavci byli shromážděni v červnu 2003, uloženi v plastových sáčcích a uchováni zmraženi při teplotě –20°C, dokud nebyly provedeny laboratorní analýzy. Obr. 2: Odchytová oblast: Krušné hory Česká republika (černá barva znázorňuje oblast nejvíce zatíženou průmyslovými imisemi) (Janovská et al., 2008)
Hlodavci byli shromážděni v červnu 2003, uloženi v plastových sáčcích a uchováni zmraženi při teplotě –20°C, dokud nebyly provedeny laboratorní analýzy. 26
Experiment II. Při druhém pokusu jsme se zaměřili na koncentraci těžkých kovů v játrech a ledvinách drobných savců helmintologicky pozitivních ve srovnání s helmintologicky negativními jedinci. Množství těžkých kovů (Cd, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb a Zn) bylo stanoveno pomocí metody ICP OES. Společenství helmintů drobných savců z monitorované oblasti vykázalo nízkou diverzitu. Pokusný vzorek V první skupině bylo 35 ks drobných savců (14 Apodemus flavicolis, 6 Clethrionomys glareolus, 7 Microtus agrestris, 3 Mus musculus a 5 Mus musculus) ze dvou odchytových míst v ČR s různým stupněm zatížení prostředí těžkými kovy (imisní část Krušných hor a Komárovsko).
Experiment III. Při třetím pokusu jsme se zaměřili na analýzu těžkých kovů v parazitických helmintech hlodavců. Parazitičtí helminti byli vyjmuti z alkoholu a na katedře chemie zanalyzováni na přítomnost těžkých kovů v jejich těle.
4.1.1 Laboratorní postup Hlodavci byli rozmraženi při teplotě 0°C a poté jim byla vyjmuty játra, ledviny a trávicí trakt. Játra a ledviny (každá 0,2-5 g) byly omývány v dvakrát destilované vodě po dobu 1 min. Obsah těžkých kovů (kadmium, chrom, měď, olovo mangan, nikl a zinek) byl stanoven v tkáni jater a ledvin 1-3 hlodavců z každého druhu (tab. 1A, 1B). Trávicí trakt byl vyšetřen parazitologicky.
4.1.2 Analytické metody Obsah těžkých kovů (Cd, Cr, Cu, Pb, Mn, Ni, Zn) byl stanovován z ledvin a játer vzorových savců. Vzorky tkání (0.2 – 5 g) byly sušeny při teplotě 105°C a potom rozloženy postupem suché mineralizace popsané Maderem et al. (1989).Tento postup zahrnuje pět kroků: pálení materiálu na horké desce při 180-360°C, mineralizaci při 350-500°C, přidání mineralizační podpory (HNO3), opět mineralizaci organických 27
zbytků při 500°C, a louhování v 1.5 % HNO3 za pomoci ultrazvukové lázně. Koncentrace analytů
byla měřena pomocí techniky ICP OES Varian VistaPro
(Jankovská et al, 2008).
4.1.3 Statistické analýzy Srovnání obsahu těžkých kovů mezi infikovanými a neifikovanými hostiteli bylo provedeno pomocí Welchova t-testu, protože rozdíly v proměnné byly různé (Crawley, 2002). Obsah těžkých kovů (absolutní hmotnost) v játrech a ledvinách byl porovnán párovým t- testem, protože měření probíhala na stejném jedinci. Všechny tyto analýzy byly provedeny v rámci R (R Development Core Team 2004). Údaje o výskytu parazitů a obsahu těžkých kovů byly analyzovány s použitím multivariační metody CANOCO (Ter Braak & Šmilauer 2002), protože tam bylo šest odpovědí a sedm vysvětlujících proměnných.
Samostatné analýzy byly provedeny pro údaje z
jater a ledvin. Údaje o parazitově abundanci byly nejprve vystaveny detrendované korespondenční analýze (DCA) s cílem stanovit maximální délku libovolné osy, tj. tvar odpovědi. Krátká délka gradientu (2,8) předpokládá lineární odezvu mezi výskytem parazitů a obsahem těžkých kovů. Proto byly tyto údaje dále analyzovány pomocí redundanční analýzy (RDA). Vzhledem k malé velikosti vzorku byly zkoumány jen ty nejdůležitější výsledky. Individuální odpovědi parazitů k jednotlivým těžkým kovům byly nejprve testovány testem permutace Monte-Carlo s 499 permutacemi. Druhy, jejichž početnost nebyla výrazně ovlivněna (P> 0,05) obsahem těžkých kovů byly vynechány z maximálního modelu. Druhy, odpovídající na obsah těžkých kovů významnou vazbou byly formovány pomocí obecného lineárního modelu (GLM) s Poisson errors .
28
4.2 Ovis ammon f. aries a tasemnice Moniezia expansa Koncentrace olova a kadmia byly zjišťovány v tasemnici Moniezia expansa a v ledvinách, játrech, svalech a v krvi infikovaného a neinfikovaného hostitele Ovis ammon f. aries z malé farmy v Mrtníku (Česká republika).
4.2.1 Pokusný vzorek Všechny ovce byly náhodně rozděleny do skupin a poté se s nimi naložilo dle tabulky 3A (Pb) a 3B (Cd). Pokusné ovce byly přirozeně infikovány Moniezia expansa (skupiny, které nebyly infikovány Moniezia, byly odčerveny Ivomecem). Tab. 3A: Pokusný vzorek pro olovo
Skupina
n
Pb(CH3COO)2
Moniezia expansa.
A) Vystavení Pb
3
2g
-
B) Vystavení Pb a infekce
9
2g
+
C) Kontrolní infekce
6
-
+
Roztok olova byl připraven rozpuštěním 2g octanu olovnatého Pb(CH3COO)2 v 10 ml destilované vody a podával se ovcím orálně každý den po dobu jednoho týdne (7 dní).
Experiment I Při prvním pokusu byly vytvořeny tří skupiny (Tab.1A): první skupina (A) obsahovala neinfikované, Pb vystavené ovce, ve druhé skupině (B) se nacházeli infikované, Pb vystavené ovce a třetí skupina (C) se skládala z infikovaných ovcí, které nebyly vystaveny účinkům Pb. Srovnávalo se zatížení jednotlivých hostitelských tkání (ledvin, jater, svalů a krve) mezi jednotlivými skupinami (A, B, C).
Experiment II Při druhém pokusu (pouze u skupiny B) se porovnávala zátěž mezi hostitelskou tkání a parazitem (skupina B: vystavení Pb a infekci Moniezia).
29
Tab. 3B: Pokusný vzorek pro Cd
Skupina
n
CdCl2
Moniezia expansa
A) Vystavení Cd
6
0,2 g
-
B) vystavení Cd a infekce
6
0,2 g
+
C) Kontrola
3
-
CB) Kontrolní infekce
3
+
Roztok kadmia byl připraven rozpuštěním 0,2 g chlorid kademnatého (CdCl2) v 10 ml destilované vody a byl podáván ovcím orálně každý den po dobu jednoho týdne (7 dní).
Experiment III Při třetím pokusu byly vytvořeny 3 skupiny (Tab.1B): skupina A obsahovala neinfikované, Cd vystavené ovce a do její kontrolní skupina (CA) byly zařazeny neinfikované ovce, které nebyly vystaveny Cd; skupiny B obsahovala infikované Cd vystavené ovce a do její kontrolní skupiny (CB) byly zařazeny infikovaných, Cd nevystavené ovce. Srovnávalo se zatížení jednotlivých hostitelských tkání (ledvin, jater, svalů a krve) mezi jednotlivými skupinami (A, B, CA, CB).
Experiment IV Při čtvrtém pokusu (pouze u skupiny B) se porovnávala zátěž mezi hostitelskou tkání a parazitem (skupina B: vystavení Cd a infekci Moniezia).
4.2.2 Odběr vzorků a analytické metody Po vystavení ovcí Cd a Pb byly ovce poraženy a rozpitvány. Vzorky svaloviny, jater, ledvin a krve a i parazitů, byly odebrány nůžkami a kleštěmi z nerezavějící oceli, které byly předtím vyčištěny dvakrát destilovanou vodou. Z tasemnic byly vyjmuty střeva za použití stejných nástrojů. Všechny vzorky byly zmraženy na -26 ° C až do dalšího zpracování. Tlaková mineralizace mokrou cestou: Poměrná část vzorku (~ 500 mg sušiny) jater, ledvin, svalů a tasemnic nebo 1ml krevního vzorku ošetřeného EDTA byl zvážen do vyluhované nádoby. Byla přidána koncentrovaná kyselina dusičná (8.0 ml) 30
(ANALYTIKA, s r.o., Česká republika), a 30% H2O2 (2,0 ml) (ANALYTIKA, s r.o., Česká republika). Směs se zahřívala v Ethos 1 (MLS GmbH, Německo) mikrovlny pomáhaly mokrému digestčnímu systému po dobu 30 minut při 220 ° C. Po ochlazení byl výtah kvantitativně převeden do 20 ml skleněné trubice a byl doplněn neionizovanou vodou. Pro zajištění kvality analytických dat byl použit interní referenční materiál NSC-2 Hovězí játra (Mader et al., 1989). V tomto materiálu doporučené hodnoty jednotlivých prvků představují: 48,4 ± 5,7 mg/kg Cu, 304 ± 12 mg/kg Fe, 0,477 ± 0,089 mg/kg Pb a 110,3 ± 11,6 mg/kg Zn. V našem testu byly stanoveny v tomto materiálu tyto hodnoty: 49,2 mg/kg Cu, 312 mg/kg Fe, 0,407 mg/kg Pb a 109 mg/kg Zn . Stanovení prvků: Celkový obsah mědi, železa, manganu, olova a zinku ve výtahu byl stanoven emisní spektrometrií s indukčně vázaným plazmatem (ICP-OES, Varian VistaPro, Varian, Austrálie). Pro stanovení nízkého obsahu olova byla použita atomová absorpční spektrometrie s bezplamennou atomizací (GFAAS, Varian AA280Z, Varian, Austrálie vybaven GTA-110Z graphite furnace atomizer).
Kontrola kvality: RM BCR 185R Bovine Liver certifikováno
277±5
-
11.07±0.29
0.544±0.017
138.6±2.1
nalezeno
286
-
11.79
0.550
134.9
4.2.3 Statistická analýza Koncentrace těžkých kovů v parazitech a hostitelských tkání byla určeny jako µg/g čisté váhy a byla porovnána mezi tkáněmi a parazity pomocí Wilcoxonova testu.
31
5. VÝSLEDKY 5.1 Drobní savci a jejich helminti 5.1.1 Experiment I V ledvinách byl nalezen významně vyšší obsah Pb, Cd, Cr, Cu a Ni než v játrech (párový t-test, t12> 2.6, P <0.02, Graf 1, 2). Ale obsah Mn byl výrazně vyšší v játrech než v ledvinách (párový t-test, t12 = 2,9, P = 0,01, Graf. 2). Obsah Zn se nelišil v játrech ani v ledvinách. Pb
Cd
Cr
Cu
Mn
Ni
Zn
Játra
0,485
0,978
0,074
15,241
8,515
0,101
86,307
Ledviny
1,874
3,034
0,204
17,586
6,097
0,399
93,552
Graf 1: Porovnání koncentrace Pb, Cd, Cr a Ni v játrech a ledvinách hlodavců 3,5 3 2,5 mg/kg
2 Játra 1,5
Ledviny
1 0,5 0 Pb
Cd
Cr
Ni
32
Graf 2: Porovnání koncentrace Cu, Mn a Zn v játrech a ledvinách hlodavců
mg/kg
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Játra Ledviny
Cu
Mn
celkem
155
Zn
5.1.2 Experiment II Bylo
nalezeno
druhů
helmintů,
patřících
do
3
rodů
(Heligmosomoides polygyrus, Trichuris muris, Mastophorus muris) a 2 rodů (neznámé druhy) Paranoplocephala sp., Syphacia sp. (tab.4A, B). Více než tři druhy byly nalezeny ve střevě jednotlivého hostitelského exempláře. Mezi nimi se nejčastěji vyskytovaly tasemnice (Paranoplocephala sp.) a H. Polygyrus, přičemž H. Polygyrus se vyskytoval jako dominantní druh. Helminti hlodavců vykazovali nízkou diverzitu.
33
Tab. 4A. Zatížení helminty u drobných savců z obasti Krušné hory
Vzorek Hostitel (počet)
Helmint (počet v jednotlivém hostitely)
1
Clethrionomys glareolus (2)
Negativní
2
Clethrionomys glareolus (3)
3
Apodemus flavicolis (3)
Heligmosomoides polygyrus (2+1)
Heligmosomoides polygyrus (2+1) Syphacia sp. (10)
Heligmosomoides polygyrus (20 dospělých, 5 Apodemus flavicolis (3)
larválních)
Apodemus flavicolis (3)
Heligmosomoides polygyrus (3+1) Syphacia sp. (20+31)
Microtus arvalis (2)
Heligmosomoides polygyrus (2+1) Trichuris muris (2) Paranoplocephala sp. (2)
Microtus arvalis (3)
Heligmosomoides polygyrus (2) Trichuris muris (10+4) Paranoplocephala sp. (1+1)
8
Microtus arvalis (2)
Heligmosomoides polygyrus (11+4) Paranoplocephala sp. (3)
9
Sorex araneus (1)
Negativní
4
5
6
7
Čísla v závorkách (ve druhém sloupci) představují počet helmintů v jednotlivém hostiteli, tj. když jsou např. 2 ks Clethrionomys glareolus v prvním sloupci, tak to znamená, že jeden Clethrionomys glareolus měl 2 helminty a druhý 1 helminta.
34
Tab. 4B: Zatížení helminty u drobných savců z obasti Komárovsko
Sample Host (number)
Helminth (number)
I
Clethrionomys glareolus (1)
Mastophorus muris (3)
II
Apodemus flavicolis (3)
Heligmosomoides polygyrus (1+1)
III
Apodemus flavicolis (2)
Mastophorus muris (6)
IV
Mus musculus (3)
negativní
Sorex araneus (4)
negativní
Napadení hostitelé měli podobný obsah těžkých kovů v játrech a ledvinách jako hostitelé bez parazitů (Welch test, P> 0.08, Graf 3, Tab. 5).
Tab. 5: Koncentrace těžkých kovů v drobných savcích dle místa odchytu a dle zatížení parazity
Krušné hory
Komárovsko
Napadení parazity
106,150
120,413
Bez parazitů
128,839
116,391
Graf 3: Koncentrace těžkých kovů v drobných savcích dle místa odchytu a dle zatížení parazity 140 120 100 mg/kg
80
S parazity
60
Bez parazitů
40 20 0 Krušné hory
Komárovsko
35
5.1.3 Experiment III RDA na obsah těžkých kovů v ledvinách zobrazil první osy nevýznamně. Následný test permutace ukázal, že abundance Syphacia sp., T. muris a H. Polygyrus nebyla významně ovlivněna obsahem těžkých kovů. Tudíž tyto byly odejmututy z maximálního modelu. Minimální odpovídající model (λ1 = 0,503, P = 0,012) byl získán pouze u dvou druhů parazitů, M. muris (oblast Komárovsko) a Paranoplocephala sp. (oblast Krušné hory). Významný vztah byl zjištěn mezi obsahem Zn, Cd, Cr, Cu a abundancí M. muris a mezi obsahem Cr a abundancí Paranoplocephala sp. Obsah Mn a Ni neovlivnil početnost parazitů. RDA na obsah těžkých kovů v játrech, dala podobné výsledky. Minimální odpovídající model (λ1 = 0,496, P = 0,002) byl získán pouze s M. muris a Paranoplocephala sp. Čtyři ze všech studovaných těžkých kovů, Cd, Cr, Mn a Zn, měly významný vliv na abundanci parazitů. Čtyři ze všech studovaných těžkých kovů, Cd, Cr, Mn a Zn, měly významný vliv na abundanci parazitů. Abundance M. muris se zvýšila s obsah Cd, Cr, Cu a Zn Abundance tasemnic Paranoplocephala sp. se snížil s obsahem Cr, Cu, Ni a Zn.
36
5.2 Ovis ammon f. aries A tasemnice Moniezia expansa Tab. 6: Koncentrace Cd a Pb v tkáních Ovis ammon f. aries a Moniezia expansa (mg/kg čisté váhy; medián±SD) po 1 týdnu vystavení účinků Pb nebo Cd
Těžké
Ovis ammon f. aries
kovy Ledviny
Játra
Svalovina
Moniezia expansa
Cd
14.643±9.139
23.785±11.482
0.689±11.482
4.899±19.736
Pb
19,599±2,496
16.584±0,696
0,183±0,008
78.952±40,005
Při srovnání zatížení sledovaného modelu olovem vyšlo najevo, že nejvíce akumulovaly olovo tasemnice (Moniezia expansa) 78.952±40,005 mg/kg sušiny; v hostiteli (Ovis ammon f. aries) to pak byly ledviny (19,599±2,496 mg/kg sušiny), následovala játra (16,584±0,696 mg/kg sušiny) a nejméně olova bylo zjištěno ve svalovině (0,183±0,008 mg/kg sušiny). Játra ovcí s tasemnicemi ve střevě a s podáváním olova po dobu 1 týdne obsahovala 16.584±0,696 mg Pb/kg sušiny, játra ovcí bez tasemnic 22.046±0,751 mg/kg sušiny, ledviny ovcí napadených tasemnicemi obsahovaly 19,599±2,496 mg Pb/kg sušiny), ledviny ovcí bez tasemnic 39.173±1,595 mg/kg sušiny. Svalovina ovcí s tasemnicemi ve střevě byla zatížena pouze 0,183±0,008 mg Pb/kg; o něco více to bylo opět u ovcí bez tasemnic 0.600±0,057 mg/kg. U kadmia byly hodnoty následující: nejvíce zatížena byla játra hostitele (Ovis ammon f. aries) 23.785±11.482 mg Cd/kg sušiny; následovaly ledviny hostitele 14.643±9.139 mg Cd/kg sušiny; v tasemnicích (Moniezia expansa) byla zjištěna průměrná hodnota 4.899±19.736 mg Cd/kg sušiny; a nejmenší koncentrace Cd byla stejně jako u olova naměřena ve svalovině ovcí 0.689±11.482 mg Cd/kg sušiny.
5.2.1 Experiment I Průměrné koncentrace Pb v krvi, svalech, játrech a ledvinách z neinfikovaných zvířat vystavených účinkům Pb (skupina A) byly: 2,904 µg/ml (krev), 0,577 mg/kg (svaly), 39,109 mg/kg (ledviny) a 22,288 mg/kg (játra). Zatímco u infikovaných ovcí vystavených účinkům Pb (skupina B) byly průměrné koncentrace 1,321 µg/ml (krev), 0,184 mg/kg (svaly), 19,877 mg/kg (ledviny) a 16,262 mg/kg (játra). resp. Průměrné
37
koncentrace Pb infikovaných zvířat bez vystavení účinkům Pb (skupina C) byly <0.0800 µg/ml (krev), 0,169 mg/kg (svaly), 0,652 mg/kg(ledviny) a 0,519 mg/kg (játra). Tab. 7: Koncentrace Cd v krvi (µg/ml), v ledvinách, játrech a svalech (mg/kg) hostitele Ovis ammon f. aries
Skupina
Krev
Sval
Ledviny
Játra
A
2,904
0,577
39,109
22,288
B
1,312
0,184
19,877
16,262
C
<0.080
0,169
0,652
0,519
Graf 4: Porovnání průměrné koncentrace Pb v krvi ovcí jednotlivých pokusných skupinách
3 2,5 µg/ml
2
A
1,5
B
1
C
0,5 0 Krev
Graf 5: Porovnání průměrné koncentrace Pb ve svalech ovcí jednotlivých pokusných skupin
mg/kg
0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
A B C Sval
38
Graf 6: Porovnání průměrné koncentrace Pb v ledvinách ovcí jednotlivých pokusných skupin
40 30 mg/kg
A
20
B C
10 0 Ledviny
Graf 7: Porovnání průměrné koncentrace Pb v játrech ovcí jednotlivých pokusných skupin 25 20 mg/kg
15
A
10
B
5
C
0 Játra
S ohledem na parazity, průměrná koncentrace Pb v tasemnicích z ovcí, které byly vystaveny účinkům Pb (skupina B), byla 85,263 mg/kg sušiny, zatímco u tasemnic z ovcí, které nebyly vystaveny účinkům Pb (skupina C), byla průměrná koncentrace olova 0,145 mg/kg sušiny.
5.2.2 Experiment II a IV Tab. 8: Průměrné koncentrace Pb a Cd v tasemnici Moniezia expansa a ve tkáních ovcí (skupina B)
Koncentrace Pb
Koncentrace Cd
Krev (µg/ml)
1,312
0,018
Sval (mg / kg)
0,184
0,151
Ledviny (mg / kg)
19,877
2,792
Játra (mg / kg)
16,262
6,682
Moniezia expansa (mg /kg)
85,263
25,955
39
Průměrná koncentrace Cd (Cd parazita / Cd hostitele) byla v ovcích u krve 1441,94x nižší, u svalu 171,89x nižší, u ledvin 9,29x nižší a u jater 3,88x nižší než u tasemnice Moniezia expansa.
Graf 8: Průměrná koncentrace Cd v krvi, svalu, ledvinách a v játrech ovcí a v Moniezia expansa
30 mg/kg (u krve µg/ml)
25 20
Krev
15
Sval
10 5
Ledviny Játra Moniezia expansa
0
Koncentrace Cd
Průměrná koncentrace Pb (Pb parazita / Pb host) byla v ovcích u krve 62,98x nižší, u svalu 463,39x nižší, u ledvin 4,29x nižší a u jater 5,24x nižší než u tasemnice Moniezia expansa.
Graf 9: Průměrná koncentrace Pb v krvi, svalu, ledvinách a v játrech ovcí a v Moniezia expansa
100 mg/kg (u krve µg/ml)
80 60 40 20
Krev Sval Ledviny Játra Moniezia expansa
0
Koncentrace Pb
Byly zjištěny významné rozdíly v zatížení těžkými kovy mezi tkáněmi (játra, ledviny, svaly a krev) u neinfikovaných ovcí a ovcí nakažených tasemnicemi Moniezia expansa.
40
Ovce, které neměly ve střevech tasemnice (Moniezia expansa), měly významně vyšší koncentrace Pb v játrech a ledvinách oproti ovcím infikovaných tasemnicemi. . 5.2.3 Experiment II Průměrné koncentrace Cd v krvi, svalech, játrech a ledvinách z neinfikovaných zvířat vystavených účinkům Cd (skupina A) byly: 0,027 µg/ml (krev), 0,134 mg/kg (svaly), 2,308 mg/kg (ledviny) a 5,7 mg/kg (játra). Zatímco u infikovaných ovcí vystavených účinkům Cd (skupina B) byly průměrné koncentrace 0,018 µg/ml (krev), 0,150 mg/kg (svaly), 2,792 mg/kg (ledviny) a 6,682 mg/kg (játra). Průměrné koncentrace Cd neinfikovaných zvířat bez vystavení účinkům Cd (skupina CA) byly <0.005 µg/ml (krev), 0,002 mg/kg (svaly), 0,137 mg/kg(ledviny) a 0,103 mg/kg (játra). A průměrné koncentrace Cd infikovaných zvířat bez vystavení účinkům Cd (skupina CB) byly <0.005 µg/ml (krev), 0,001 mg/kg (svaly), 0,129 mg/kg(ledviny) a 0,077 mg/kg (játra). Tab. 9: Koncentrace kadmia v krvi (µg/ml), v ledvinách, játrech a svalech (mg/kg) hostitele Ovis ammon f. aries
Skupina
Krev
Sval
Ledviny
Játra
A
0,027
0,134
2,308
5,7
B
0,018
0,150
2,792
6,682
CA
<0.005
0,002
0,137
0,103
CB
<0.005
0,001
0,129
0,077
41
Graf 10: Porovnání průměrné koncentrace Cd v krvi ovcí dle pokusných skupin
0,03 0,025 µg/ml
0,02
A
0,015
B CA
0,01
CB
0,005 0 Krev
Graf 11: Porovnání průměrné koncentrace Cd
ve svalu ovcí dle pokusných skupin
0,15
mg/kg
0,1
A B CA
0,05
CB
0 Sval
Graf 12: Porovnání průměrné koncentrace Cd v ledvinách ovcí dle pokusných skupin
mg/kg
3 2,5 2 1,5 1 0,5 0
A B CA CB Ledviny
42
Graf 13: Porovnání průměrné koncentrace Cd v játrech ovcí dle pokusných skupin
mg/kg
7 6 5 4 3 2 1 0
A B CA CB
Játra
S ohledem na parazity, průměrná koncentrace Cd v tasemnicích z ovcí, které byly vystaveny účinkům Pb (skupina B), byla 21,455 mg/kg sušiny, zatímco u tasemnic z ovcí, které nebyly vystaveny účinkům Cd (skupina CB), byla průměrná koncentrace kadmia <0.010 mg/kg sušiny.
43
6. DISKUSE Současné experimentální a terénní výzkumy (Sures et al., 2002, 2003) prokázaly, že vhodnými bioindikátory olova díky své velké akumulační kapacitě, mohou být tasemnice parazitující u hlodavců, zejména Hymenolepis diminuta v potkanech (Rattus norvegicus). Autoři Torres et al. (2004) použili také běžnou čeleď tasemnic parazitujících u hlodavců, konkrétně tasemnici Gallegoides arfaai z čeledi Anoplocephalidae, což je střevní parazit myšice křovinné (A. sylvaticus). U této tasemnice autoři zjistili 6, 20 a 24x více olova než v ledvinách, játrech a svalovině hostitele, myšice A. sylvaticus z nepříliš znečištěných oblastí Katalánska. Tyto hodnoty jsou srovnatelné s výsledky z Hulbanu, silně znečištěného území v egyptské Káhiře. Na základě těchto a dalších dosavadních výsledků se zdá, že tasemnice hlodavců mohou být vhodnými bioindikátory znečištění životního prostředí olovem (Autoři Torres et al., 2006) V této práci byli použiti drobní savci, analýza se zaměřovala na imisně zatížené prostředí lesního ekosystému Krušných hor, oproti městskému prostředí, kde je model potkan- H. diminuta nejvhodnější. Torres et al. (2004) zjistili, že orgánem vykazujícím nejvyšší koncentraci kovů jsou ledviny. To je zřejmé zejména v případě kadmia, v relativně nižším stupni to platí i pro olovo, jehož koncentrace byla 4x nižší v tasemnici G. arfaai. Baruš et al. (2003) sledovali koncentrace Cd, Cu, Pb, Zn v hlístici Protospirura muricola a tasemnici Inermicapsifer arvicanthidis a v játrech a svalovině těmito parazity napadených nebo nenapadených hlodavců (Heliophobius argenteocinereus) žijících a africkém jezeře Malawi. Žádné rozdíly nebyly zjištěny v zatížení kovy mezi napadenými a nenapadenými hlodavci (Heliophobius argenteocinereus). Pb bylo vyšší v parazitech než v hostiteli, Zn a Cu bylo více v parazitech – rozdíly byly mezi hlísticemi a játry hostitele u Zn a mezi tasemnicemi a játry hostitele pro Cu. Cd bylo vyšší pouze u tasemnic. Při monitorování antropogenní kontaminace jsou paraziti využitelní jako bioindikátoři, protože jsou funkčně důležití ve společnostech obratlovců. Imise mohou zvýšit parazitismus, např. když obranné mechanismy hostitele jsou negativně ovlivněny, čímž se zvyšuje citlivost hostitele nebo se prostě zvýší hustota znečištění vhodného mezihostitele nebo definitivního hostitele. Nicméně, znečištění může také 44
snížit
parazitismus
za
předpokladu,
že
I.)
infikovaní
hostitelé
trpí
více
environmentálním ohrožením než neinfikovaní hostitelé II.) paraziti jsou náchylnější na konkrétní znečišťující látky, než jejich hostitelé; nebo III.) znečištění nezbytně vede mezihostitele a definitivní hostitele k vyhynutí (Sures et al., 2004) Negativní vliv kovů na abundanci parazitů studoval např. Cross et al. (2001, 2003). Autoři sledovali plavbu a dlouhověkost mořských motolic Cryptocotyle lingua. Plavba horizontálně a dlouhověkost byly výrazně sníženy u cerkárií ze znečištěného životního prostředí. Kvalita cerkárií byla, přímo nebo nepřímo, snížena rozvojem uvnitř hostitele akumulujícího kovy. Studie, ktrou prováděli Tmelen et al., 2004, byla zaměřena na testování hypotézy, že v parazitech (zejména v tasemnicích) se koncentrují kovy ve vyšší míře než v hostitelských tkáních. Vliv koncentrace těžkých kovů na parazity byl zkoumán zejména ve znečištěném prostředí (Landsberg et al., 1998; Turcekova et al., 2002; Thielen et al.; 2004). Podstatně méně literatury je k dispozici pro použití savčích endoparazitů při studiích dopadu na životní prostředí. Přesto je známo, že někteří parazité suchozemských hostitelů v sobě hromadí toxické prvky více, než tkáně jejich hostitelů. Zvláště Acantocephalans a tasemnice žijící ve střevech jejich konečného hostitele, jsou schopny účinně akumulovat těžké kovy (Sures et al., 2002). Reakce parazitů na obsah těžkých kovů byla druhově specifická. Hlístice M. muris ukázala pozitivní vztah s obsahem těžkých kovů. Naproti tomu, tasemnice Paranoplocephala sp. ukázala negativní reakce na obsah těžkých kovů ve vnitřních orgánech hostitelů. Tento negativní vztah může podporovat hypotéza, že tito parazité (chybí zažívací trakt) koncentrují těžké kovy ve větší míře než hostitelské tkáně (Thielen et al., 2004). Podobně Sures et al. (1998) zjistili, že koncentrace olova v parazitu Fasciola hepatica byla v průměru 100krát vyšší než ve svalu, ledvinách nebo játrech hostitele. Naopak, střevní hlístice Ascaris suum měla koncentrace olova a kadmia výrazně nižší než hostitelské tkáně.
Mechanismus, podle kterého se v
infikovaných zvířatech hromadí toxické látky méně než v jejich parazitech není známý, ale může to být částečně způsobeno jejich nižší rychlostí metabolismu (Bergey et al., 2002). Ledviny jsou orgánem, ve kterém jsou těžké kovy přítomny v nejvyšší koncentraci u suchozemských savců (Torres et al., 2004). Naše výsledky to také 45
potvrzují, s výjimkou manganu, který byl vyšší v játrech než v ledvinách. Torres et al. (2004) vyhodnotil koncentraci kadmia a olova pomocí drobných hlodavců Apodemus sylvaticus a jejich tasemnice Gallegoides arfaai. Testovali potenciální vhodnost tasemnic jako sentinelových organismů pro olovo a kadmium v přirozených podmínkách. Zjistili, že obsah olova v tasemnici byla 6 až 24krát vyšší než v tkáních (ledviny, játra a svaly)
hlodavců. To ukazuje, že tasemnice jsou schopny lepší
biokoncentrace kovů podle hodnot zjištěných u hostitelských tkání. Proto výsledky testů na znečištění prostředí mohou být nepřesné, pokud se testuje na infikovaných organizmech. Zdá se, že model drobných savců a jejich helmintů je slibný bioidikační systém pro hodnocení zatížení životního prostředí těžkými kovy pro suchozemská stanoviště, a to zejména v non-městských oblastech.
46
7. ZÁVĚR Cílem práce bylo porovnat 2 skupiny hostitelsko-parazitárních systémů (býložravý, všežravý) z hlediska bioakumulace těžkých kovů v tkáních hostitele a zjistit/ověřit, zda existuje rozdíl mezi akumulací těžkých kovů živočichy napadenými parazitickými helminty a těmi bez helmintů. Výzkumná část byla rozdělena na 2 části, a to 1. část zabývající se drobnými savci a jejich endoparazity a 2. část, která se zabývala ovcí domácí (Ovis ovis) a její tasemnicí (Moniezia expansa). U drobných savců jsme se zaměřili na koncentraci těžkých kovů v játrech a ledvinách drobných savců, kteří byli odchyceni v imisně zatížené části Krušných hor. Dále na porovnání koncentrací těžkých kovů v játrech a ledvinách drobných savců helmintologicky pozitivních ve srovnání s helmintologicky negativními jedinci. Tito drobní savci byli odchytáváni v oblastech s různým stupněm zatížení prostředí těžkými kovy (imisní část Krušných hor a Komárovsko). A nakonec jsme se zaměřili na analýzu těžkých kovů v parazitických helmintech hlodavců. Množství těžkých kovů (Cd, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb a Zn) bylo stanoveno pomocí metody ICP OES. Napadení drobní savci měli podobný obsah těžkých kovů v játrech a ledvinách jako hostitelé bez parazitů. U drobných savců byl v ledvinách nalezen významně vyšší obsah Pb, Cd, Cr, Cu a Ni než v játrech. Obsah Mn byl výrazně vyšší v játrech než v ledvinách. Čtyři ze všech studovaných těžkých kovů, Cd, Cr, Mn a Zn, měly významný vliv na abundanci parazitů. Abundance M. muris se zvýšila s obsahem Cd, Cr, Cu a Zn Abundance tasemnic Paranoplocephala sp. se snížil s obsahem Cr, Cu, Ni a Zn. U ovcí jsme zjišťovali koncentraci kadmia a olova v tasemnici Moniezia expansa a v ledvinách, játrech, svalech a v krvi infikovaného a neinfikovaného hostitele Ovis ammon f. aries z malé farmy v Mrtníku (Česká republika). Ovce byly rozděleny do skupin. 1. skupina byla vystavena Pb popř. Cd a odčervena, druhá byla vystavena Pb (Cd) a zároveň i infekci tasemnicí Monoezia expansa , třetí skupina nebyla vystavena těžkým kovů, ale byla infikována tasemnicemi a čtvrtá skupina nebyla vystavena těžkým kovům ani tasemnicím.
47
Při srovnání zatížení sledovaného modelu olovem vyšlo najevo, že nejvíce akumulovaly olovo tasemnice (Moniezia expansa); v hostiteli (Ovis ammon f. aries) to pak byly ledviny, následovala játra a nejméně olova bylo zjištěno ve svalovině. Játra ovcí s tasemnicemi ve střevě a s podáváním olova po dobu 1 týdne obsahovala méně mg Pb/kg sušiny než játra ovcí bez tasemnic. Ledviny ovcí napadených tasemnicemi obsahovaly méně mg Pb/kg sušiny než ledviny ovcí bez tasemnic. A svalovina ovcí s tasemnicemi ve střevě obsahovala opět o něco méně mg Pb/kg než svalovina ovcí bez tasemnic. U kadmia byly hodnoty následující: nejvíce zatížena byla játra hostitele (Ovis ammon f. aries), následovaly ledviny hostitele, pak tasemnice (Moniezia expansa) a nejmenší koncentrace Cd byla stejně jako u olova naměřena ve svalovině ovcí. Průměrné koncentrace olova v krvi, svalech, játrech a ledvinách z neinfikovaných zvířat vystavených účinkům Pb byly vyšší než u infikovaných zvířat vystavených účinkům Pb a u infikovaných zvířat bez vystavení účinkům Pb byly koncentrace nejnižší. Průměrné koncentrace Cd v krvi, svalech a ledvinách z neinfikovaných zvířat vystavených účinkům Cd byly vyšší než u infikovaných ovcí vystavených účinkům Cd. Zatímco u jater byly koncentrace Cd nižší u neinfikovaných zvířat vystavených účinkům Cd. Průměrné koncentrace Cd neinfikovaných zvířat bez vystavení účinkům Cd byly nižší než u zvířat vystavených účinkům Cd, ale vyšší než u infikovaných zvířat bez vystavení účinkům Cd. S ohledem na parazity, průměrná koncentrace Pb v tasemnicích z ovcí, které byly vystaveny účinkům Pb, byla vyšší než u tasemnic z ovcí, které nebyly vystaveny účinkům Pb. Průměrná koncentrace Cd v tasemnicích z ovcí, které byly vystaveny účinkům Pb (skupina B), byla vyšší než u tasemnic z ovcí, které nebyly vystaveny účinkům Cd. Průměrná koncentrace Pb (Pb parazita / Pb host) byla v ovcích u krve 62,98x nižší, u svalu 463,39x nižší, u ledvin 4,29x nižší a u jater 5,24x nižší než u tasemnice Moniezia expansa. Průměrná koncentrace Cd (Cd parazita / Cd hostitele) byla v ovcích u krve 1441,94x nižší, u svalu 171,89x nižší, u ledvin 9,29x nižší a u jater 3,88x nižší než u tasemnice Moniezia expansa.
48
Byly zjištěny významné rozdíly v zatížení těžkými kovy mezi tkáněmi (játra, ledviny, svaly a krev) u neinfikovaných ovcí a ovcí nakažených tasemnicemi Moniezia expansa. Ovce, které neměly ve střevech tasemnice (Moniezia expansa), měly významně vyšší koncentrace Pb v játrech a ledvinách oproti ovcím infikovaných tasemnicemi.
49
8. POUŽITÁ LITERATURA AMIN, O. Marine flora and fauna of the Eastern United States: Acanthocephala. 1998. NOAA Technical Report NMFS 135(1998) BARUŠ, V., et al. Heavy metal (Pb, Cd) concentrations in adult tapeworms (Cestoda) parasiting birds (Aves) . [s.l.] : [s.n.], 2000. s. 131-136. BARUŠ, V., et al. Cadmium and lead concentrations in Contracaecum rudolphii (Nematoda) and its host, the cormorant Phalacrocorax carbo (Aves). [s.l.] : [s.n.], 2001. s. 77-78. BARUŠ, V., et al. Relative concentrations of four heavy metals in the parasites Protospirura muricola (Nematoda) and Inermicapsifer arvicanthidis (Cestoda) in their definitive host silvery mole-rat (Heliophobius argenteocinereus: Rodentia). [s.l.] : [s.n.], 2003. s. 227-232. BARUŠ, V., et al. Philometra ovata (Nematoda: Philometroidae): a potential sentinel species of heavy metal accumulation. [s.l.] : [s.n.], 2007. s. 929-933. BENCKO, V., et al. Toxické kovy v životním a pracovním prostředí člověka. [s.l.] : [s.n.], 1995. 282 s. BERGEY, L., et al. Mercury uptake by the estuarine species Palaemonetes pugio and Fundulus heteroclitus compared with their parasites, Probopyrus pandalicola and Eustrongylides sp. . [s.l.] : [s.n.], 2002. s. 1046-1050. BILLIARD, S. M., KHAN, R. A. Chronic stress in cunner, Tautogolabrus adspersus, exposed to municipal and industrial effluents. [s.l.] : [s.n.], 2003. s. 9-18. BORCHERDING, J., WOLF, J. The influence of suspended particles on the acute toxicity of 2-chloro-4nitro-aniline, cadmium and pentachlorophenol on the valve movement response of the Zebra mussel (Dreissena polymorpha). [s.l.] : [s.n.], 2001. s. 497-504. BROEG, K., et al. The use of fish metabolic, pathological and parasitological indices in pollution monitoring. [s.l.] : [s.n.], 1999. s. 171-194. CROSS, M. A., et al. Effect of heavy metal pollution on swimming and longevity in cercariae of Cryptocotyle lingua (Digenea: Heterophyidae). [s.l.] : [s.n.], 2001. s. 499507.
50
CROSS, M. A., et al. Trematode parasite influence on copper, iron and zinc content of polluted Littorina littorea: infection, host sex and time effects. [s.l.] : [s.n.], 2003. s. 1269-1272. DUŠEK, L., et al. Biodiversity of parazites in a freshwater environment with respect to pollution: metazoan parasites of chub (Leuciscus cephalus L.) as a model for statistical evaluation. [s.l.] : [s.n.], 1998. s. 1555-1571. EVANS, D. W., et al. The effect of digenean (Platyhelminthes) infections on heavy metal concentrations in Littorina littorea. [s.l.] : [s.n.], 2001. s. 349-350 FAULKNER, B. C., LOCHMILLER, R. L. Ecotoxicity revealed in parasite communities of Sigmodon hisoidus in terrestrial environments contaminated with petrochemicals. [s.l.] : [s.n.], 2000. s. 135-145. GREICHUS, A., GREICHUS, Y. A. Identification of some elements in the hog roundworm, Ascaris lumbricoides suum, and certain tissues of its host. [s.l.] : [s.n.], 1980. s. 89-91. HALAČKA, K. Sborník VI. konference hygieniků výživy. [s.l.] : [s.n.], 1972. s. 1-5. HALMETOJA, A., et al. Perch (Perca fluviatilis) parasites reflect ecosystem conditions: a comparison of natural lake and two acidic reservoirs in Findland. [s.l.] : [s.n.], 2000. s. 1437-1444. HEINONEN, J., et al. The effects of parasites and temperature on the accumulation of xenobiotics in fresh water clam. [s.l.] : [s.n.], 1999. s. 475-481. HEINONEN, J., et al. Toxicokinetics of 2,4,5-trichlorophenol and benzo(a)pyrene in the clam Pisidium amnicum: effects of seasonal temperatures and trematode parasites. [s.l.] : [s.n.], 2000. s. 352-359. Internet 1: Znečištění ovzduší na území České republiky v roce 2000 [online]. 2001 [cit. 2009-03-24]. Dostupný z WWW:
. Internet 2 : MACHÁLEK, P., et al. Emise látek znečišťujících ovzduší v České republice [online].
2008
[cit.
2009-03-24].
Dostupný
z
WWW:
<:
http://www.chmi.cz/uoco/isko/groc/gr07cz/kap1.html>. Internet 3: Sediment Třeboňsko [online]. [2008] [cit. 2009-02-12]. Dostupný z WWW: .
51
Internet 4: GUTHOVÁ, Z., HRUBÝ-ROSA, P.. Těžké kovy [online]. 2006-2007 [cit. 2009-03-20].
Dostupný
z
WWW:
http://www.spotrebitele.info/kartoteka/index.php?page=233 Internet 5: Eutrofizace [online]. 2005-2008 [cit. 2008-12-02]. Dostupný z WWW: . Internet 6: KOČÁREK, E.. Vybrané kapitoly z lékařské ekologie a parazitologie [online].
2003-2004
[cit.
2009-01-10].
Dostupný
z
WWW:
. Internet 7: Schéma eutrofizace [online]. [2008] [cit. 2009-01-26]. Dostupný z WWW: . Internet 8: HRUŠKA, J., et al. Vliv kyselého deště na povrchové vody [online]. 19961997
[cit.
2009-02-15].
Dostupný
z
WWW:
. Internet 9: Autor: SVIS CENIA. Studie a souborné informace. Souhrnná zpráva o realizačních programech POH ČR – III. etapa [online]. 2007 [cit. 2009-02-10]. Dostupný
z
WWW:
edice.nsf/5262baa1b2012f9cc125723b003a63ed/b3dc4b97eda64a78c1257419002c27b5 ?OpenDocument>. Internet 10: Sediment Třeboňsko [online]. 2008 [cit. 2008-12-02]. Dostupný z WWW: . Internet 11: NESMĚRÁKOVÁ, E.. Voda : Odpadní voda [online]. 1998 [cit. 2008-1116].
Dostupný
z
WWW:
mesto.cz/rocenky/roc98/rocenk98/kap_023.htm. Internet 12: PVK, a.s.. Odpadní voda [online]. 2006 [cit. 2009-01-18]. Dostupný z WWW:
mesto.cz/(1adwqn4510kqw2zyp4a4sgmq)/zdroj.aspx?typ=2&Id=73532&sh=13660041 01>. Internet 13: Odpadní voda [online]. 2008 [cit. 2008-12-11]. Dostupný z WWW: . Internet 14 : Aplikovaná hydrobiologie - bioindikace kvality vodního prostředí [online]. 2008
[cit.
2009-04-10].
Dostupný
z
WWW:
. 52
JANKOVSKÁ et al. Heavy metal in rodents infected by cestodes or nematodes. [s.l.] : [s.n.], 2008. s. 581-588 JENEY, Z., et al. Effects of pulp and paper mill effluent (BKME) on physiological parameters of roach (Rutilus rutilus L.) infected by the digenean Rhipidocotyle fennica. [s.l.] : [s.n.], 2002. s. 103-108. LAFFERTY, K. D. Environmental parasitology: what can parasites tell us about human impacts on the environment? . [s.l.] : [s.n.], 1997. s. 251-255. LANDSBERG, J. H., et al. Parasites of fish as indicators of environmental stress. [s.l.] : [s.n.], 1998. s. 211-232. LEFCORT, H., et al. Indirect effects of heavy metals on parasites may cause shifts in snail species composition. [s.l.] : [s.n.], 2002. s. 34-41. MacKENZIE, K. Parasites as pollution indicators in marine ecosystems: a proposed early warning system. [s.l.] : [s.n.], 1999. s. 955-959. MARCOGLIESE, D. J., et al. Effects of exposure to contaminated sediments on the parasite fauna of American Plaice (Hippoglossoides platessoides). [s.l.] : [s.n.], 1998. s. 88-95. ORRES, J., et al. Cadmium and lead concentrations in Gallegoides arfaai (Cestoda : Anoplocephalidae) and Apodemus sylvaticus (Rodentia: Muridae) from Spain. . [s.l.] : [s.n.], 2004. s. 468-470. OVERSTREET, R. M. Parasitological data as monitors of environmental health. [s.l.] : [s.n.], 1997. s. 169-175. PALM, H., DOBBERSTEIN, R. C. Occurence of trichodinid ciliates (Peritricha: Urceolariidae) in the Kiel Fjord, Baltic Sea, and its possible use as a biological indicator. [s.l.] : [s.n.], 1999. s. 726-732. ROSENBERG, D. M., RESH, V. H. Freshwater Biomonitoring and Benthic Macroinvertebrates. [s.l.] : [s.n.], 1993. s. 1. RUUS, A., et al. Accumulation of the lipophilic environmental contaminant lindane in metacercariae of Bucephaloides gracilescens (Trematoda, Bucephalidae) in the central nervous system of bullrout Myoxocephalus scorpius. [s.l.] : [s.n.], 2001. s. 75-77. SIDDALL, R., et al. Dactylogyrus (Monogenea) infections on the gills of roach (Rutilus rutilus L.) experimentally exposed to pulp and paper mill effluent. [s.l.] : [s.n.], 1997. s. 439-446.
53
SCHEEF,
G.,
et
al.
Cadmium accumulation
in
Moniliformis
moniliformis
(Acanthocephala) from experimental infected rats. [s.l.] : [s.n.], 2000. s. 688-691. SCHUBERT, R. Bioindication in Terrestrischen Okosystemen. [s.l.] : [s.n.], 1991. SURES, B., et al. Relative concentrations of heavy metals in the parasites Ascaris suum (Nematoda) and Fasciola hepatica (Digenea) and their respective porcine and bovine definitive hosts. [s.l.] : [s.n.], 1998. s. 1173-1178. SURES, B., et al. Accumulation and distribution of lead in the acanthocephalan Moniliformis moniliformis from experimental infected rats. [s.l.] : [s.n.], 2000. s. 427433. SURES, B. The use of fish parasites as bioindicatods of heavy metals in aquatic ecosystems: a review . [s.l.] : [s.n.], 2001. s. 245-255. SURES, B., et al. Interaction between cadmium exposure and infection with the intestinal parasite Moniliformis moniliformis (Acantocephala) on the stress hormone levels in rats. [s.l.] : [s.n.], 2002. s. 333-340. SURES, B., et al. Lead concentrations in Hymenolepis diminuta adults and Taenia taeniaeformis larvae compared to their rat hosts (Rattus norvegicus) sampled from the city of Cairo, Egypt. [s.l.] : [s.n.], 2003. s. 483-487. SURES, B. Accumulation of heavy metals by intestinal helminths in fish: an overview and perspective. [s.l.] : [s.n.], 2003. s. S53-S60. SURES, B. Environmental parasitology: relevancy of parasites in monitoring environmental pollution. [s.l.] : [s.n.], 2004. s. 170-177. SURES, B., REIMANN, N. Analysis of trace metals in the Antartic host-parasite system Notothenia coriiceps and Aspersentis megarhynchus (Acentocephlala) caught at King George Islands, South Shetland Islands. [s.l.] : [s.n.], 2003. s. 608-686. SURES, B., SIDDALL, R. Pomphorhynchus laevis (Palaeacanthocephala) in the intestine of chub (Leuciscus cephalus). [s.l.] : [s.n.], 2003. s. 1617-1622. TERASCHEWSKI, H. Host parasite interactions in Acanthocephala - a morphological approach. [s.l.] : [s.n.], 2000. s. 1-179. TENORA, F., et al. Concentrations of some heavy metals in Ligula intestinalis plerocercoids (Cestoda) and Philometra ovata (Nematoda) compared to some of their hosts (Osteichtyes). [s.l.] : [s.n.], 2000. s. 15-18.
54
THIELEN, F., et al. The intestinal parasite Pomphorhynchus laevis (Acanthocephala) from barbel as a bioindicator for metal pollution in the Danube river near Budapest, Hungary. [s.l.] : [s.n.], 2004. s. 421-429. TURČEKOVÁ, L., et al. Concentration of heavy metals in perch and its endoparasites in the polluted water reservoir in Eastern Slovakia. [s.l.] : [s.n.], 2002. s. 23-28. VALTONEN, E. T., et al. Eutrophication, pollution, and fragmentation: effects on parasite communities in roach (Rutilus rutilus) and perch (Perca fluviatilis) in four lakes in central Findland. [s.l.] : [s.n.], 1997. s. 572-585. YEOMANS, W. E., et al. Use of protozoan communities for pollution monitoring. [s.l.] : [s.n.], 1997. s. 201-212.
55
