Bio – informatica Eline van Overbeeke 2011-2012 Biologische databanken = archieven met consistente data die worden opgeslagen op uniforme en efficiënte manier 2 soorten: Primaire / archiefdatabank → Bevatten informatie en annotatie van DNA – en proteïnesequenties, DNA – en proteïnestructuren en DNA – en proteïne – expressieprofielen Secundaire / afgeleide databanken → Bevatten resultaten van analyses op primaire bronnen, inclusief informatie over sequentiepatronen – of motieven, polymorfismen en mutaties, en evolutionaire verwantschappen Data – analyse = extraheren van betekenisvolle informatie uit massa gegevens
Databanken Nucleotide sequence databases Nucleotide sequence databases = collectie van alle publiek beschikbare nucleotidesequenties Vb: EMBL, NCBI Flatfile Flatfile = tekstbestand met karakters zonder opmaak Genbank – formaat 3 componenten: Header: algemene informatie Features: hoofdkenmerken CDS / Coding Sequence: join ( X … Y ) geeft aantal exonen X = base waar exon start Y = base waar exon eindigt
Sequentie
Bevat ook vaak een tabel/grafiek
1
FASTA – formaat 3 componenten: > : duidt aan waar nieuwe sequentie begint Sequence identifier: unieke code Sequentie
NCBI NCBI = National Center for Biotechnology Information
Exercise 1 NCBI-notepad-artemis • Find publication in PubMed with ID 8663200 Ga naar pubmed, laat database op pubmed staan en geef 8663200 in. Geeft: Alternatively spliced transcripts from the Drosophila eIF4E gene produce two different Cap-binding proteins. • Go to nucleotide via links Klik rechts onderaan op nucleotide Geeft: Drosophila melanogaster eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) gene, alternative splice products, complete cds GenBank: U54469.1 • Display Fasta, GenBank, and Graphics Te veranderen links boven aan bij siplay settings • Download GenBank formatted flatfile Klik op send complete record, file, Genbank opslaanals txt file.. door bij computer dit file te selecteren en bij organize: change name • Open NotePad++ (computers ghb: notepad) Open de file • Visualize/edit/analyze a GenBank-formatted sequence file locally: ‣ Example: open the GenBank file with the Artemis software - launch Artemis using Java Web Start Google: artemis sanger eerste link Klik op download Artemis for windows Open nu de file door naar file manager te gaan en op all files te klikken, hierna kan je de file zoeken in je bastanden en openen. - Select CDS for product 4E-II and “Create->Exon Features” Nu boven aan: Select al CDS features Create exon features ‣ Artemis has some basic sequence analysis features - example: plot the GC Content (%) along the sequence Bovenaan: graph GC Content % 2
‣ In Artemis you can also create new features and edit features Aanmaak nieuw exon feature van kleinste exon Create: New Feature Key: exon Location: 201 .. 224
EMBL EMBL = European Molecular Biology Laboratory Verschil met GenBank: indeling EMBL ook bruikbaar in Artemis
Exercise 2 • Find the corresponding record in the EMBL nucleotide sequence database ‣ Download in EMBL format Ga naar EMBL via google.. typ in de bovenste balk bij EMBL 8663200 Klik op Nucleotides Sequences Klik op in EMBL format Weer opslaan als txt, kan weer openen in artemis ‣ What are the differences between GenBank and EMBL format? GENBANK EMBL
3
RefSeq RefSeq = gecureerde secundaire database met als doel een begrijpbare, geïntegreerde, non – redundante set van sequenties aan te bieden Doel: referentiesequentie voor elk molecule in centraal dogma DNA, RNA en proteïnen Nucleotide – en proteïnesequenties zijn expliciet gelinked Distinct accession number: 2 letters _ 6 cijfers 2 types: - NT / NM / NP: genomic contigs - XM / XP: voorspellingen
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/key.html#query = site van refseq, geeft ook informative over het gebruik.
Exercise 3 • Restrict Entrez query to RefSeq collection ‣ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/key.html#query ‣ Use “Limit” in Entrez ‣ How many alternative transcripts are known today for Drosophila melanogaster eIF-4E? Ga naar NCBI, database: gene. Geef in: eIF-4E Ga naar limits: - include: enkel refseqs - D. Melanogaster search klik op eerste link - i.e., how many different RefSeqs? 7, helemaal onderaan te zien bij refseqs ‣ Go back to original publication of exercise 1 and use thelink “RefSeq” Pubmed: 8663200 Klik onderaan op nucleotides(refseq) Ook 7 resultaten
4
Protein sequence databases Kunnen vertaald worden uit nucleotidesequenties Worden bekomen door translatie van nucleotidesequenties. Daarom zijn secundaire databanken. Er zijn 2 types : -sequence repositories ( sequentie opslagplaats) ; data ligt opgeslagen met weinig of geen manuele tussenkomst vb. GenPept -curated databases ; experts beheren de originele data door toevoegen van nieuwe informatie vb. RefSeq, Uniprot
Uniprot Uniprot = eiwit - referentie Uniprot heeft 2 onderdelen: -Swiss-Prot: handmatig becommentarieerde verslagen, gebaseerd op informatie van de literatuur of beheerste, geëvalueerde computeranalyse. -TrEMBL: Computer analyse verslagen die nog handmatig becommentarieerd moeten worden. (info in verband met een proteïne in de databank bij dat proteïne zetten.)
Exercise 4a • Find the human hemoglobin alpha protein in Uniprot ‣ what is the entry name? Google: uniprot Laat UniProtKB staan query: human hemoglobin alpha protein Geeft lijst met “overeenkomstige” proteïnen Zoeken naar de juiste geeft: HBA_HUMAN • Look at the different sections of information in Swiss-Prot Klik op de entry P69905 ‣ Names ‣ General annotation (comments) ‣ Ontologies ‣ Interactions ‣ Sequence annotation (Features) ‣ References ‣ Cross-references (e.g., to 3D structure, etc) • Look at the flatfile (“Text”) Rechtsbovenaan staan de files: txt • What other formats are available? Naast txt: xml, rdf/xml, gff en fasta
5
GFF format Vb. van GFF format
Een GFF format telt 10 kolommen FASTA en GFF horen samen GFF = general feature format, gene-finding format en generic feature format GFF is een file formaat die wordt gebruikt voor het beschrijven van genen en andere kenmerken van DNA, RNA en eiwitsequenties. Men herkent deze documenten aan .GFF.
Exercise 4b • Save FASTA sequence of human hemoglobin alpha protein from UniProt Zoek human hemoglobin alpha protein van UniProt en open in FASTA file, opslaan als .txt • Save GFF formatted list of features Openen als GFF, opslaan als .txt • Load FASTA into Artemis and add GFF features ‣ Use “File->Read an entry..” Open de fasta file weer via file manager, all files Via read an entry de GFF file toevoegen
Exercise 4c • The DCC gene has a role in cellular differentiation and colorectal tumorigenesis (Hedrick et al. 1994) ‣ find the paper in PubMed Kopieren en plakken in pubmed ‣ based on the Swiss-Prot entry for the DCC precursor,which residues comprise the signal sequence? Klik op protein (refseq), hier staan nu onderaan overeenkomende eiwitten, Eiwitten met een P zijn swissprot eitwitten RecName: Full=Netrin receptor DCC; AltName: Full=Colorectal cancer suppressor; AltName: Full=Immunoglobulin superfamily DCC subclass member 1; AltName: Full=Tumor suppressor protein DCC; Flags: Precursor UniProtKB/Swiss-Prot: P43146.2
6
Specialized databases Entrez Gene Entrez Gene = centrale gendatabank waarin kenmerken van genen van verschillende organismen zijn opgeslagen Organismen: mens, muis, rat, fruitvlieg, zebravis Opbouw: Summary Beknopte informatie gen Grafische weergave Genomic context Genomic regions, transcripts, and products
Bibliography GeneRIF / Gene Reference Into Functions: geeft zinnen weer die informatie bevatten over gen
Interactions Interacties met andere genen General gene information Gene Ontology: - Function: moleculaire functie gen - Process: proces waarin gen betrokken is - Component: locatie gen
7
NCBI Reference Sequences (RefSeq) Aantal RefSeqs
Model organism databases Model organism databases = specifieke databanken voor welbepaalde organismen Soorten: MGI / Mouse Genome Informatics RGD / Rat Genome Database FlyBase (Drosophila melanogaster) WormBase (C. Elegans) SGD / Saccharomyces Genome Database (Gist) Ecogene (E. coli)
Gene Ontology Gene Ontology = beschrijving genproducten in termen van hun geassocieerde biologische processen, cellulaire componenten en moleculaire functies op een soort – onafhankelijke manier annotation of genes and proteins in genomic and protein databases Gene Ontology: geen vlakke lijst biologische termen Termen zijn gerelateerd binnen hiërarchie DAG: Directed Acyclic Graph Termen kunnen meer dan 1 ouder hebben Termen kunnen 0, 1 of meer kinderen hebben Structuur: Cellular component Waar genproduct werkt Enzymcomplexen refereren naar plaatsen Niet naar activiteiten
Molecular function Activiteiten genproduct Mogelijk meerdere functies Set van functies: biologisch proces
Biological process Algemeen herkenbare serie van gebeurtenissen Annotatie = categorisatie genproducten
8
GO databases: - FlyBase (Drosophila) - MGI (Mouse) - SGD (S. cerevisae) - TAIR (Arabadopsis) - TIGR (microbes including prokaryotes) - SWISS-PROT (several thousand species inc. human) - PSU (P. falciparum) - ZFIN (zebrafish) - PAMGO (plant pathogens) GO is a member of OBO: An umbrella project for grouping different ontologies in biological/medical field - a repository for ontologies with defined set of standards - Available from a single source: http://obo.sourceforge.net/ To be part of OBO, ontologies must: - Be open, can be used by all without any constraint - Be in a common shared syntax - Not overlap with other ontologies in OBO - Share a unique identifier space - Include text definitions of their terms
9
GO exercise • Find the GO annotation of the human PAX6 in UniProtKB, mouse Pax6 in MGI, and fly ey in Flybase. ‣ What is the function of PAX6/Pax6/ey? Is it conserved? Uniprot PAX6: Klik op het humane protein en ga helemaal onder aan naar GO Klik op Complete GO annotation...
MGI mouse pax6: Ga naar MGI, zoek pax6 en klik op dit eerste, ga nu naar Gene Ontology(GO) classifications Flybase fly ey: ga naar flybase geef ey in en klik op genen.. klik op de eerste: Zoek nu Gene Ontology: Function, Process & Cellular Component ( 22 unique terms )
‣ In which developmental process is PAX6/Pax6/ey involved? Is that also conserved? ‣ What is the cellular localization of PAX6/Pax6/ey? • Search for PAX6 at www.geneontology.org ‣ which organism has the most associations? Via gene or protein name Rattus norvegicus
• Search for cardiac development at www.geneontology.org - What is the correct GO term and identifier? -zoek ‘cardiac development’ op GO -correcte GO term (hier: heart development) en identifier zoeken (hier: 0007507). -klik op ‘view in tree’ en zet filters op homo sapiens voor mens en mus musculus voor muis - How many human gene products are known to be involved in cardiac development? And how many mouse gene products? 1.
Filter lineage gene product counts: species H. sapiens: 238 gene products M. musculus: 295 gene products
- How many GO terms are direct child terms of cardiac development? - Download all associations in a tab delimited text file 3119 gene product associations
tab delimited file
OMIM Exercise • How many genes are associated with Huntington Disease (HD), with Alzheimer Disease (AD) and with Parkinson Disease (PD)? OMIM via pubmed ‣ MIM ID #104300 ALZHEIMER DISEASE; AD 16 ‣ #143100. HUNTINGTON DISEASE; HD 1 ‣ #168600. PARKINSON DISEASE, LATE-ONSET; PD 4
10
Genomic databases UCSC UCSC Genome Browser: genomische annotatie in de vorm van tracks Elke track geeft ander kenmerk weer Vb: SNP’s, genen, … Sommige tracks: aanwezig voor alle species Vaak ook soort – specifieke tracks Opzoekingen: Genome Browser / Genome
Belangrijke eigenschappen:
Breedste banden = exonen Dunste banden = intronen
Kleurcodes: -
Zwart: corresponderende PDB / Protein Data Bank entry
-
Donkerblauw: corresponderende gevalideerde sequentie
-
Lichtblauw: niet – RefSeq sequentie
Annotation track menu: opties Hide: verwijdert track uit beeld
Dense: alle items worden op 1 regel geplaatst
11
Squish: elk item op een aparte regel, maar efficiënt gestapeld op 50 % van de grootte
Pack: elk item op een aparte regel, maar efficiënt gestapeld op 100 % van de grootte
Full: elk item op een aparte regel
DNA – sequentie:
Genome Browser: DNA Bevat Extended Case / Color Options
Genome Browser: track Description and Page Index: Sequence and Links Sequence and Links to Tools and Databases: Genomic Sequence
Exercises UCSC • “Genomes” ‣ Search for TP53, and download genomic sequence of longest transcript, including 5’UTR, CDS exons, 3’UTR, and introns (using “DNA”) (UCSC tutorial) Zoek TP53 in UCSC.. klik op langste transcript, nu staat hier onder Sequence and Links to Tools and Databases: Genomic Sequence (chr17:7,571,720-7,590,863) Klik hierop, 5’UTR, CDS exons, 3’UTR, and introns laten staan. Selecteer all uppercase (alles in hoofdletters) Download nu ‣ Obtain 10kb upstream sequence of ADAM10 (Baxevanis) Doe hetzlefde als bij TP53, nu alleen upstream en downstream laten staan met 10000. Weer all upercase.. download ‣ goto location on chromosome 3 around 120,564,000-120,610,000 (Human Mar 2006 assembly) - which gene is located there? Begin op begin pagina van ucsc genomes.. typ daar chr3-120,564,000120,610,000 en selecteer Mar 2006 CDGAP ligt hier 12
- which genes are upstream and downstream of this gene? Zoom out: TMEM39A en B4GALT4 ‣ Find Drosophila eIF-4E from the previous class Insect, D.melanogaster, eIF-4E - Can you find back the 7 RefSeqs? Ja bij refseq genes in tabel.. zijn er 7 - Are there UCSC genes annotated in the Drosophila genome? Nee
More exercises Genome Browsing • Find a coding exon of TP53 that is more than 250 bp long TP53, inzoomen op langste exon • How many non-synonymous coding SNPs are known in this exon?
13
• Retrieve the DNA sequence of this exon Klik op DNA, get DNA CCGTGCAAGTCACAGACTTGGCTGTCCCAGAATGCAAGAAGCCCAGACGG AAACCGTAGCTGCCCTGGTAGGTTTTCTGGGAAGGGACAGAAGATGACAG GGGCCAGGAGGGGGCTGGTGCAGGGGCCGCCGGTGTAGGAGCTGCTGGTG CAGGGGCCACGGGGGGAGCAGCCTCTGGCATTCTGGGAGCTTCATCTGGA CCTGGGTCTTCAGTGAACCATTGTTCAATATCGTCCGGGGACAGCATCAA ATCATCCATTGCTTGGGACGGCAAGGGGGACTGTA
• Design primers to amplify this exon using Primer3 Ga een stapje terug, klik op extended DNA Case/Color Options Ga naar primer3plus en plak sequentie hierin Klik rechtsbovenaan op pickprimers
14
• Test whether these primers generate a unique amplicon, using in silico PCR ga naar UCSC en klik op PCR. Sequentie van forward en reverse primer er naar kopiëren En submit
15
More exercises Genome Browsing • human PCNA ‣ how many different transcripts? 2 ‣ how many proteins? 9 ‣ any regulatory elements annotated? - use ORegAnno track (use hg18 assembly) ORegAnno track onder regulqtion op dense zetten Er zijn er 3
16
More exercises Genome Browsing • Find the signal peptide sequence of human DCC and use BLAT to locate this sequence in the human genome Ga naar uniprot: zoek DCC, zoek human: P43146DCC_HUMAN
‣ how many hits does BLAT give? scroll naar beneden tot sequence annotation signal peptide (op 1-25 klikken) Ga nu naar UCSC kopieer de sequentie van uniprot naar BLAT van ucsc en klik op submit
1 hit Als je nu op browser klikt krijg je genome browser • If you BLAT the same sequence against the mouse genome, do you also find a hit? Ga 1 klik terug vanaf je BLAT results, geef nu mouse in ipv human Ook 1 hit.
17
Ensembl Ensembl: onafhankelijke genannotatie
Ensembl exercise • Ensembl does independent gene annotation ‣ Ensembl genes (e.g., ENSG.... for human) • How many transcripts does Ensembl predict for the human gene ACHE? Ga naar ensemble, geef ACHe en human in 15 transcripts • Ensembl is good for orthologue predictions ‣ (reciprocal BLAST, see later) ‣ Exercise: Find the mouse orthologue of the human SSBP4 Ensembl – All species: SSBP4 By Feature Type – Gene: Homo sapiens (1) Artikel: SSBP4
Zijbalk: Comparative Genomics – Orthologues Zoeken naar Mouse: Ssbp4
‣ Does this gene have paralogues? 2
18
Database structures 3 grote structuren: Flatfile indexing system Geïndexeerde opslag in directories Vb: GenBank Relational database SQL / Structured Query Language Vb: GO, UCSC GUI / Graphical User Interface Web – based (HTML) en meer geavanceerde dynamische programmering
Flatfile database Flatfile database = geordende verzameling van gelijkaardige files, meestal geconformeerd naar een standaardformaat voor hun inhoud Doel indexering: optimale snelheid en kwaliteit in zoeken Extraheren specifiek attribuut uit file Koppeling aan naam en locatie Voorbeeld Voorbeeld flatfile database:
Probleem: enkel informatie in welk document woord voorkomt Geen informatie over frequentie / positie woord Boolean index
Relational database Relational database = opslag informatie in verzameling tabellen (relations), waarbij reeksen overeenkomen met individuele records (tuples) en de kolommen met attributen Software: MySQL SQL / Structured Query Language = database computertaal ontworpen voor het ophalen en beheer data in relationele database managementsystemen, aanmaak en modificatie databaseschema’s en database object access control management
19
3 – tier architectuur 3 niveau’s in architectuur:
Client / Presentation tier Eigen computer / software
Business Logic tier Presentation tier: informatie verkrijgen Data tier: informatie toevoegen / wijzigen
Data tier
UCSC Table Browser Table Browser: ‣ In the Human genome, search for simple repeats on a chromosome 4 location with copy number more than 10 and download the sequence. (UCSC tutorial) 1.
UCSC Genome Browser – Tables: Table Browser Eigenschappen: -
Genome: Human
-
Group: Variation and Repeats
-
Track: Simple Repeats
-
Table: simpleRepeat
-
Region – Position: chr4
20
2.
Filter: Create Filter on Fields from hg19.simpleRepeat CopyNum: > 10 Submit
3.
Output format: Sequence Get output: Simple Repeats Genomic Sequence Get sequence
21
Find simple repeats (copy number > 10) within known genes and download the sequence (UCSC tutorial) Intersection: Create Intersect with Simple Repeats All Simple Repeats records that have any overlap with UCSC genes Submit
22
Output format: Sequence Get output: Simple Repeats Genomic Sequence Get sequence
23
How many genes are located between the STS markers SWXD113 andDXS52? UCSC Genome Browser: SWXD113 Submit
SWXD113: STS Marker SWXD113 Coördinaten opschrijven: chrX:138,543,949-138,744,169
24
UCSC Genome Browser: DXS52 Submit
DXS52: STS Marker DXS7083 Coördinaten opschrijven: chrX:151,897,379-152,097,452
UCSC Genome Browser – Tables: Table Browser Eigenschappen: -
Group: Genes and Gene Prediction Tracks
-
Table: knownGene
-
Region – Position: chrX:138643949-151997542
Summary / Statistics: UCSC Genes (knownGene) Summary Statistics Item count: 247
25
Table Browser ‣ Download FASTA file containing all human 3’UTR sequences UCSC Genome Browser – Tables: Table Browser Eigenschappen: -
Group: Genes and Gene Prediction Tracks
-
Table: knownGene
-
Region: genome
-
Output format: sequence
Get output: Select sequence type for UCSC Genes Genomic: Submit UCSC Genes Genomic Sequence 3’ UTR Exons: Get sequence
‣ Download FASTA file containing all human 1kb proximal promoters UCSC Genome Browser – Tables: Table Browser Eigenschappen: -
Group: Genes and Gene Prediction Tracks
-
Table: knownGene
-
Region: genome
-
Output format: sequence
Get output: Select sequence type for UCSC Genes Genomic: Submit UCSC Genes Genomic Sequence Promot/upstream by 1000: Get sequence
26
Data – analyse Classificaties Biologische classificatie Analysis at nucleotide level:
Predictive methods using DNA sequences
Predictive methods using RNA sequences
SNP / Single Nucleotide Polymorphism
Analysis at protein level:
Predictive methods using protein sequences
Analysis of biological networks
Interfering relationships:
Pairwise sequence similarity
Multiple sequence alignment
Phylogenetic analysis
Comparative genomics
DNA microarrays to assay gene expression
Proteomics and protein identification
Technische classificatie
Web – based tools Draaien op server en beschikbaar via HTML – interface
Stand – alone tools 2 opties: -
Lokaal downloaden en installeren
-
Direct starten vanaf webpagina door Java Web Start
Vb: Artemis
Command line scripts en programma’s in Linux Bediening via CLI / Command Line Interface in Linux Vb: Emboss
Spreadsheet software Vb: Microsoft Excel, OpenOffice Calc
27
OS / Operating System OS / Operating System: behandelt low – level processen die hardware doen samenwerken Functies:
Voorziet omgeving waarin programma’s kunnen worden ontwikkeld / gebruikt
Voorziet makkelijke toegang tot files en programma’s
Unix Unix = OS van het World Wide Web Multi – user system: networking, multitasking, security
Linux Linux = open source – versie van Unix Principe: CLI / Command – Line Interface Interactie met OS of software door typen commando’s Functies CLI:
Uitvoeren Command – Line Programs / Scripts
Ontleding tekstfiles
Sorteren en knippen van informatie
Programma’s ‘in batch’ runnen
SSH / Secure Shell: verbonden aan Unix – machine F – Secure SSH Client (LUDIT) Inloggen: -
IP – adres:
10.33.126.50
-
Username:
user179
-
Paswoord:
user179
Thuis: inloggen op netwerk Link: http://extranet.kuleuven.be Na login: connectie maken met Linux – server
28
Belangrijke commando’s Commando
Output
ls
Weergave inhoud directory
ls –l ls –lt
Inhoud directory met informatie over naam, grootte, auteur Inhoud directory gesorteerd op datum van aanmaak
cd
Home directory van huidige directory
cd ..
Parent directory van huidige directory
mkdir
Creëert subdirectory in huidige directory
cat
Weergave inhoud file
Commando
Output
more
Weergave inhoud file met pauze op einde vol scherm en vraag om op toets te drukken
head
Weergave eerste aantal regels in file
tail
Weergave laatste aantal regels in file
grep
Selectie alle regels in file die zoekterm bevatten
sort
Alfabetische rangschikking
sort –n
Numerieke rangschikking
cut –f
Knippen geselecteerde velden uit elke regel van file
man
Linux manual
|
Creatie complexere commando’s
q
Quit
clear
Schoonvegen scherm
wc –l
Telt woorden in file
29
1.
F – Secure SSH Client: man who ( q ) Output: manual entry voor who
2.
F – Secure SSH Client: clear Output: leeg scherm
3.
F – Secure SSH Client: echo 5+4 | bc Output: oplossing berekening
30
Exercise linux Download a tab delimited file containing all annotated genes involved in the regulation of the cell cycle (using Gene Ontology), across species. Copy this file to your home account on the linux server: Use file transfer window (yellow button in F-Secure SSH client software) Note:from a terminal under linux or Mac OS use secure copy scp cellcyclegenes.txt 10.33.126.50: try in your home dir: cat cellcyclegenes.txt | wc -l less cellcyclegenes.txt cat cellcyclegenes.txt | grep MGI cat cellcyclegenes.txt | grep Ccnd cat cellcyclegenes.txt | grep -i Ccnd cat cellcyclegenes.txt | grep MGI | grep Ccnd > ccnd_mouse.txt cat cellcyclegenes.txt | sort -k3 cat cellcyclegenes.txt | cut -f7 | sort -u cat cellcyclegenes.txt | grep IDA | grep MGI | grep cyclin Gene Ontology – GO term or ID: cell cycle Term Search Results – GO:0007049 Artikel: cell cycle
31
Term Neighborhood for cell cycle GO:0007049 Filter lineage gene product counts – Species: M. musculus Gene products
Gene Product Associations to cell cycle: Gene Association Format Opslaan als .txt – file
F – Secure SSH Client: New File Transfer Window Sleep bestand naar Linux
F – Secure SSH Client: cat cellcycle.txt | wc –l
32
F – Secure SSH Client: less cellcycle.txt
F – Secure SSH Client: cat cellcycle.txt | grep MGI
F – Secure SSH Client: cat cellcycle.txt | grep Ccnd
F – Secure SSH Client: cat cellcycle.txt | grep -i Ccnd Output: case – insensitive zoekopdracht
33
F – Secure SSH Client: cat cellcycle.txt | grep MGI | grep Ccnd > ccnd_mouse.txt Aanmaak file in directory F – Secure SSH Client: cat cellcycle.txt | sort –k3
F – Secure SSH Client: cat cellcycle.txt | grep MGI | cut –f3 | sort –u | wc –l
34
Emboss EMBOSS = European Molecular Biology Open Software Suite Inloggen:
F – Secure SSH Client
Web interface Link: http://10.33.126.50/emboss
Emboss exercise 1 • accession L07770 ‣ download EMBL or GB formatted file, and name it xlrhodop.embl • man seqret • seqret (type “seq” then press tab key for tab completion) • seqret xlrhodop.embl -outseq l07770.fasta -feature ‣ cat l07770.gff • showfeat xlrhodop.embl: how many CDS features? • infoseq xlrhodop.embl: how long, what is GC content? • download EMBL or GB formatted file for accession number U23808 • extract FASTA and GFF using seqret EMBL Nucleotide Sequence Database: accession number L07770 View in EMBL format Opslaan als .embl – file
35
1e manier: F – Secure SSH Client F – Secure SSH Client: seqret
–sequence L07770.embl –outseq l07770.fasta –feature
F – Secure SSH Client: cat l07770.gff
F – Secure SSH Client: cat l07770.fasta
F – Secure SSH Client: showfeat –sequence L07770.embl –outfile L07770_showfeat.txt F – Secure SSH Client: cat L07770_showfeat.txt Aantal CDS features: 1684
F – Secure SSH Client: infoseq –sequence L07770.embl –outfile L07770_infoseq.txt F – Secure SSH Client: cat L07770_infoseq.txt GC – content: 45, 72 %
36
2e manier: EMBOSS Web Interface : google: emboss explorer EMBOSS Web Interface – Edit: Seqret Upload L07770.embl Run Seqret
EMBOSS Web Interface – Display: Showfeat Upload L07770.embl Run Showfeat
37
EMBOSS Web Interface – Information: Infoseq Upload L07770.embl Run Infoseq
38
Exercise emboss 2 • retrieve the sequence of the last coding exon of C.elegans gene mec-8 • translate this sequence using transeq (Emboss) ‣ how many nucleotides (use cat, pipe and wc) • reverse complement this sequence (revseq) UCSC Genome Browser: mec – 8 Clade: Nematode Genome: C. elegans Submit
RefSeq Genes: mec – 8 Inzoomen op laatste coderende exon
DNA: Get DNA Opslaan als .txt – file
39
Zorg ervoor dat je in notepad alles rond de sequentie weghaalt 1e manier: F – Secure SSH Client F – Secure SSH Client: transeq –sequence Mec8.txt –outseq Mec8_transeq.pep F – Secure SSH Client: cat Mec8_transeq.pep
user179@teach-srv-01:~$ cat mec8_transeq.pep | wc 3
3
109
Dus 109 nucleotides F – Secure SSH Client: revseq –sequence mec8.txt –outseq Mec8_revseq.txt F – Secure SSH Client: cat Mec8_revseq.txt
40
1.
2e manier: EMBOSS Web Interface EMBOSS Web Interface – Nucleic Translation: Transeq Upload Mec8.txt Run Transeq
2.
EMBOSS Web Interface – Edit: Revseq Upload Mec8.txt Run Revseq
41
Predictive methods using DNA sequences Genoom sequenced en geassembleerd: lokaliseren proteïnecoderende genen Moeilijker in eukaryoten: Grotere afstanden tussen naburige genen Exon – intronstructuur is moeilijk te voorspellen Huidige computermethodes: niet sterk genoeg Geen precieze voorspelling genstructuur grote sequentie Gevolg: terugvallen op compositional bias Indien geen bijkomende informatie: hypothetische voorspellingen
Methodes Gene prediction = voorspellen locatie genen in genoomsequentie door combinatie 1 / meer methodes Methodes: Zoeken op signaal Zoeken op inhoud Homology – based gene prediction Intrinsieke methoden Ab initio – methoden: intrinsiek Zoeken op signaal en inhoud Geen vergelijking met andere sequenties Dynamic programming = veel exonvoorspellingen samenvoegen tot genstructuur Vb: GeneID HMM / Hidden Markov Model: hulpmiddel voor genpredictie Definiëring complexe patronen Extrinsieke methoden Homology – based methoden: extrinsiek Soorten: BLASTX Vertaling nucleotiden vergelijken met proteïnedatabanken
EST / Expressed Sequence Tags BLAT / BLASTN
Comparative gene prediction Twee genomen vergelijken Geconserveerde domeinen zijn exonen
Exon – bepalende signalen Detectie: PMW / Position Weight Matrix Signalen: - Translation start site - 5’ donor splice site - 3’ acceptor splice site - Translation stop codon
Voorspelling en score exonen 3 types: Initiële exonen Aanduiding ORF door startcodon en 5’ – donorsite
Interne exonen Aanduiding ORF door 3’ – acceptorsite en 5’ – donorsite
Terminale exonen Aanduiding ORF door 3’ – acceptorsite en stopcodon
Coderende statistieken: gebruik andere codons in exonen en intronen
42
Exercise • Retrieve sequence of the first megabase of human chromosome 20 (use hg18) in linux ‣ download chr20 from http://hgdownload.cse.ucsc.edu/ goldenPath/hg19/chromosomes/ - copy link of chr20 and use wget on linux (then gunzip to unzip the .gz file) ‣ or use /home/saerts/chr20/chr20.fa ‣ use “extractseq” EMBOSS program to extract the first 1Mb • how to get the fasta sequence for this region using the UCSC Genome Browser, the UCSC Table Browser, or the Ensembl database? 1.
Internet Explorer: http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/chromosomes/ File: chr20.fa.gz
2.
F – Secure SSH Client: gunzip chr20.fa.gz
3.
F – Secure SSH Client: extractseq –sequence chr20.fa –regions 1:1000000 –outseq chr20_firstMB.fa
4.
UCSC Genome Browser: chr20:1-1000000 Submit
43
5.
DNA: Get DNA
6.
UCSC Genome Browser – Tables: Table Browser Region – Position: chr20:1-1000000 Get output
44
ORF exercise ‣ getorf (Emboss) [what are the default settings for minsize and maxsize?] - for example, the complete chr21 has 2006698 predicted ORFs - chr20:1-1000000: how many ORFs? • use grep and “wc -l” ‣ try plotorf (Emboss) - graphtype = “png” 1.
F – Secure SSH Client: getorf –sequence chr20_firstMB.fa –outseq ORFs.fa –minsize 100
2.
F – Secure SSH Client: cat ORFs.fa | grep “>” | wc –l
3.
F – Secure SSH Client: plotorf –sequence chr20_firstMB.fa –graph png
Openen door plotorf.1.png in gele mapje naar boven te slepen, hierna kan je het openen door naar mijn computer te gaan en dubbel te klikken.
45
Exercise coding statistics (1) • use the same 1 exon gene • use Emboss syco to calculate codon usage • codon usage file for human: Ehum.cut ‣ (ls -l /usr/share/EMBOSS/data/CODONS/*.cut ) 1.
UCSC Genome Browser – Tables: Table Browser Eigenschappen: - Track: RefSeq Genes - Table: refGene - Region – Position: chr4 - Output format: hyperlinks to Genome Browser
2.
Filter: Create Filter on Fields from hg19.refGene ExonCount = 1
3.
Hyperlinks to Genome Browser: NM 005172 at chr4:94750078-94751142
46
4.
DNA: Get DNA Opslaan als .txt – file
5.
F – Secure SSH Client: syco – sequence ATOH1.txt –cfile Ehum.cut –graph png –outfile ATOH1_syco.out
47
Exercise coding statistics (2) ‣ tcode combines codon usage with periodicity scores ‣ tcode -plot -graph cps ‣ tcode -sequence mySeq.fasta -outfile tcode.out -window 200 -plot -graph png 1.
F – Secure SSH Client: tcode –sequence ATOH1.txt –window 200 –outfile ATOH1.tcode –graph png –plot
48
GeneID GeneID = voorspelling genen in genomische sequenties
see http://genome.imim.es/software/geneid/ Hiërarchie:
Splice sites / startcodon / stopcodons
Building exons
Scoring exons
Finaal: samenstelling genstructuur
GeneID • see http://genome.imim.es/software/geneid/docs/ • geneid -P human3iso.param chr20_FirstMb.fa -G > chr20_FirstMb_geneid.gff ‣ -G for GFF format ‣ -v “verbose = display info messages” ‣ -P parameter file - located in /home/saerts/software/geneid/param directory F – Secure SSH Client: geneid –P home/saerts/software/geneid/param/human3iso.param chr20_firstMB.fa –G
49
a second geneid exercise ‣ Download 1Mb sequence around the human URO-D gene Genome browser: UROD Get DNA 500000 upstream en 500000 downstream -> 1 miljoen + gen Save als UROD.txt ‣ Use a gene prediction program (Geneid, or Genscan) to predict genes in this region ‣ Make a ‘custom track file’ in BED or GFF format, from the gene prediction output, containing genomic coordinates of the gene predictions (e.g., using Excel) ‣ Upload this file to create a custom track, and visualize your predictions in relation with UCSC and RefSeq gene annotations, in this region 1.
UCSC Genome Browser: chr1:44,977,830-45,977,829
2.
DNA: Get DNA Opslaan als .txt – file Bovenste regel Notepad++: chr1
50
3.
F – Secure SSH Client: File Transfer Window File uploaden
F – Secure SSH Client: geneid –P home/saerts/software/geneid/param/human3iso.param –G urod.fa > UROD_Mb_GeneID.gff
4.
Excel: Openen Alle bestanden: UROD_Mb_GeneID.gff Wizard: Volgende – Volgende – Voltooien
5.
Excel – Gegevens: Sorteren Sorteren op kolom A
51
6.
Excel: verwijder commentaren (#)
7.
Excel – kolom M: ingeven startpositie (44977830) Kolom J: =D1+$M$1-1 Rechtsonder klikken en slepen naar onder Kolom K: =E1+$M$1-1 Rechtsonder klikken en slepen naar onder
8.
Excel: kopieer kolom J en K Selecteer kolom D en E Start – Plakken: Waarden plakken Verwijder kolom J, K en M
52
9.
Opslaan als: Tekst Opslaan als .txt – file
10. UCSC Genome Browser – Tables: Table Browser Add Custom Tracks: Bladeren Submit
11. Manage Custom Tracks: Go to Genome Browser
12. Genomes – UCSC Genome Browser: UROD
53
13. RefSeq Genes: UROD at chr1:45477805-45481341
54
°Oef.1 (slide 145)
-Geneid is een programma om genen te voorspellen in een DNA sequentie. Gen voorspellen in UROD-seq: Zoeken op UCSC naar UROD , vervolgens 1 Mb errond met gen in het midden houden 500k naar links en 500k naar rechts via de position/searchs aanpassen zodat men exact 1Mbp heeft Vb. 1 Mb rond chr1: 45,250,417-45,252,835 44,750,000 tot 45,750,000 Of via alternatief via DNA en upstream/downstream aanduiden = 1 mil + URODgen dus meer dan 1 mil bp Genome browser: UROD Get DNA 500000 upstream en 500000 downstream -> 1 miljoen + gen Sequentie opvragen en vervolgens saven (save page as: text file): UROD_1Mb_flank.fa Is op toledo gezet Openen met WordPad Weten van waar tot waar het gen zit als referentie zie ID waar je het vandaan gehaald hebt. (Zie bovenaan voor de ID : chr1:44750417-45752835)
55
-lengte van sequentie = 1002418 Secure Shell: cat… (fasta file) grep-v °Geneid web server -https://genome.imim.es/geneid.html
56
Deze webinterface draait niet op onze server maar ergens in Spanje. Enige wat eigenlijk moet gebeuren is file opvragen want we werken in human, we willen een GFF en de rest is onbelangrijk, na het ingeven van de fasta file via browse verkrijgen we deze gff file op de server in Spanje: Organisme: mens Strands: forward en reverse Output: GF Rest laten zoals ‘t is Submit (net boven predictions options) Wat je krijgt => GFF Command: wat daar op linux server draait Geneid 2527kotnet… => file
-weergegeven in volgorde van kolommen: naam, source, beschrijving (first, terminal), start, stop, score, strand, frame, extra commentaar/naam. Na hekje: commentaar
- deze GFFoutput saven als text file selecteren, copy en pasten in text editor (WinEdit) of excel (openen, kies: all files)
57
- Pasted in WinEdit file save as Saven: UROD_1MbFlank_geneid.gff Uploaden naar UCSC genome browser -naam en van… tot… veranderen 1000+begin en 2000+begin (begin: 44,750,417) 1ste kolom moet chr1 komen te staan ipv hg… bij locatie moet niet 1700 maar 1700 locatie van het gen! Dit doen we in Excel Excel: GFF hierin openen (all files selecteren onderaan bij open file)
58
- Melding op excel: Commando’s: next, next, finish Excel zet file in kolommen
- Formules: C4: =A4+B4 (op vakjes klikken) Kopiëren: rechtsonder hokje vastnemen en naar beneden slepen
- GFF in Excel: Kolom D en E knippen en in N en O plakken (Start stop kolommen tijdelijk verplaatsen en formule intypen in originele plaats)
59
- Nieuwe getallen in D: Door de formule = 44750417 + naam rij/kolom (bv =44750417+N7-1), vervolgens 1 kolom naar rechts slepen, wordt de formule ingegeven. Daarna selecteren we de 2 formules en slepen we deze helemaal tot beneden. N7=1700 en -1, want anders 1 teveel (44,750,417 = 1 bij ons) Nieuwe getallen in E: kopiëren vanuit D (rechtsonder vastnemen en naar rechts slepen) Kopiëren in alle kolommen (rechtsonder vastnemen en naar beneden slepen)
-Naam hg… moet chr1 worden (maar eerst commentaren wegdoen, want storend) Links bovenaan (hoek tussen 1 en A): alles selecteren, data, sort, kolom ingeven (kolom N) Commentaarlijnen staan onderaan
60
Commentaarlijnen eruit knippen.
- vervolgens deleten we de laagste (niet kolomwaarden) - in kolom A moet chr 1 staan wanneer je kopieert: chr2, chr3,… in 2de hokje ook chr1, beide selecteren en naar beneden slepen of ctrl D (kopieert je formule in alle hokjes)
- Gedeelte dat we nodig hebben selecteren (kolom A tot I), ctrl+C, vervolgens ctrl+N: dit opent een nieuwe sheet en vervolgens klikken we op home dan paste en paste values want anders worden de formules mee gekopieerd en krijgen we foutieve waarden
Formules niet pasten, want hokjes zijn anders dus zullen formules niet kloppen Links boven: paste values selecteren Save as type: Text (Tab…) UROD_1MBflank_geneid_genomiccoord.gff Verschillende meldingen: altijd op ‘yes’ klikken
61
$-teken zorgt ervoor dat 1 bepaald vakje in de formule behouden blijft zodat men bv in heel de kolom N7 wordt opgeteld zet men deze tussen $-tekens - Omzetten naar text file door save as tekst save as text file tab delimited
62
Accuraatheid 3 maten:
Sensitiviteit Percentage echte positieven die voorspeld zijn als positieven Formule:
Specificiteit Percentage echte negatieven die voorspeld zijn als negatieven Formule:
PPV / Positive Predictive Value Percentage voorspelde genen die true positives zijn Formule:
Correlatie: combinatie SN en SP Tussen 1 en – 1: -
+ 1: volledig correcte voorspelling
-
– 1: volledig incorrecte voorspelling
63
Exercise on accuracy • Use the intersections of tracks in the Table Browser to estimate the specificity and sensitivity of your own gene predictions compared to the UCSC gene track ‣ at the ‘gene’ level (not at nucleotide or exon) • how many geneid predicted genes overlap with UCSC genes (i.e., how many true positives?) • how many and what kind of UCSC genes are missed by geneid (i.e., how many false negatives)? • how many genes are predicted by geneid that are no UCSC genes? (i.e., how many false positives) Oefening S.183 Werkwijze: 1.
UCSC Genome Browser – Tables: Table Browser Intersection: Create
2.
Intersect with User Track: All User Track records that have at least 80 % overlap with UCSC Genes Submit
3.
Table Browser: Summary / Statistics
64
4.
Tables: Table Browser Eigenschappen:
5.
-
Group: Genes and Gene Prediction Tracks
-
Track: RefSeq Genes
-
Table: RefGene
-
Region – Position: chr1:44,977,830-45,977,829
-
Intersection: Clear
Table Browser: Summary / Statistics Volgens RefSeq: 39 genen in dat gebied
65
66
Biological classification Pairwise sequence similarity Pairwise sequence similarity = nagaan verband tussen 2 sequenties door vergelijking Pairwise alignment = 2 sequenties positie per positie vergelijken
Similarity en homologie Similarity: kwantitatieve meting die weergeeft hoe gelijkend 2 sequenties zijn Basis: pairwise alignment Mechanisme: aantal gelijke residuen tellen Percent identity Hoog: gelijke functie / evolutionair verwante sequenties Homologie: hypothetische conclusie Basis: -
Orthologe genen Gescheiden door vorming nieuwe species
-
Paraloge genen Gescheiden door duplicatie
3 types mutaties:
Inserties
AAGA wordt AAGTA
Deleties
AAGA wordt AGA
Substituties
AAGA wordt AACA
Positieve score:
Perfect match
Negatieve score:
Mismatch Indels
Dotplots Dotplot: visuele manier van sequentievergelijking Dot: overeenkomst Identificatie regio’s: verbinden bolletjes
67
Oefening S.195 Werkwijze: 1.
PubMed – Nucleotide: AAB08987 FASTA: opslaan als fasta – file
2.
PubMed – Nucleotide: AAH02824 FASTA: opslaan als fasta – file
3.
1e manier: Google – Dotlet Input: HMG1 – sequentie ingeven Name: HMG1 Input: SOX10 – sequentie ingeven Name: SOX10
68
4.
Dotlet: overeenkomstige AZ naar 51 Compute
5.
Dotlet:Greyscale aanpassen Diagonalen
6.
2e manier: F – Secure SSH Client File Transfer Window: HMG1.fa en SOX10.fa uploaden
7.
F – Secure SSH Client: dotmatcher –asequence HMG1.fa –bsequence SOX10.fa Graph type [x11]: png
69
70
Scoring matrices Scoring matrix: in rekening brengen positie – overlap en eigenschappen residuen Belangrijk:
Conservatie
Frequentie
Evolutie
Nucleotide scoring matrix Normaal: alleen matches / mismatches Assumptie: 25 % kans op elke nucleotide
A
T
G
C
A
5
–4
–4
–4
T
–4
5
–4
–4
G
–4
–4
5
–4
C
–4
–4
–4
5
Gaps en gap penalties Gaps in alignments: compensatie InDels tussen vergelijkende sequenties Regel: niet meer dan 1 per 20 residuen
Affine gap penalty:
Vaste vermindering score voor maken gap
Bijkomende vermindering lengte gap
Regel:
G = gap opening penalty L = gap extension penalty n = lengte gap
G > L : lange gap is beter dan vele kleine gaps Non – affine gap penalty:
Geen vermindering score voor maken gap
Vaste mismatch vermindering per positie gap
71
Oefening S.201 Werkwijze: 1.
1e manier: EMBOSS Web Interface EMBOSS Web Interface – Alignment Global: Needle Sequenties ingeven
2.
EMBOSS Web Interface – Matrix File: EBLOSUM62 Eigenschappen: -
Gap opening penalty: 11
-
Gap extension penalty: 1
Run Needle
72
3.
2e manier: F – Secure SSH Client File Transfer Window: sequenties uploaden
4.
F – Secure SSH Client: needle –asequence Gap_Sequence1.txt –bsequence Gap_Sequence2.txt gapopen 11 –gapextend 1 –outfile Test_Needle.txt
73
Protein alignment Protein – based searches: krachtiger dan nucleotide – based searches Beter in:
Bepalen similarity
Bepalen homologie
Alignment algoritmes Naïeve benadering: alle mogelijke alignments voor 2 sequenties genereren Alignment met hoogste score kiezen Probleem: te tijdrovend Alignment algoritmes = gebruik van dynamisch programmeren om alignment met hoogste score te vinden 2 soorten:
Smith – Waterman
Lokaal
Needleman – Wunsch
Globaal
Globale vs. lokale sequentie – alignments Globale alignment = lokaliseren beste alignment over volledige sequenties
Lokale alignment = lokalisatie meest gelijkende regio’s in delen sequenties Voordeel: subsequenties ontdekken
BLAST BLAST / Basic Local Alignment Search Tool: meest gebruikte methode voor detective similarity Types: BLASTP Proteïnesequenties zoeken tegen proteïnedatabank
BLASTN
Nucleotidesequenties zoeken tegen nucleotidedatabank
TBLASTN
Proteïnesequenties zoeken tegen nucleotidedatabank
BLASTX
Nucleotidesequenties zoeken tegen proteïnedatabank
Ruwe scores: afhankelijk van opbouw query, doelsequenties, … Oplossing: berekening Expectation Value E / Expectation Value = aantal hoog – scorende segmentparen die puur door kans verwacht worden
74
Oefening S.215 Werkwijze: 1.
PubMed – Protein: Drosophila Melanogaster prospero protein isoform F Filter your results: RefSeq (1) FASTA: opslaan als fastafile
2.
Google – BLAST: BLASTP
3.
Bladeren: file uploaden Job Title: Prospero, isoform F BLAST
75
4.
Protein Sequence (1703 letters) Graphic Summary: aantal hits
5.
Homologie: Bits / E – value Lager in lijst: minder homologie en meer gaps
76
DNA microarrays to assay gene expression Microarray data processing Microarray data processing = analyse genexpressie met behulp van microarrays
Principe: aanmaak / binding oligonucleotiden op drager RNA: -
Controle: groen
-
Patiënt: rood
DNA: hybridisatie op plaat Competitie tussen controle en patiënt Resultaat: -
Controle: groen
-
Patiënt: rood
-
Controle + patiënt: geel
Meting: laser
Gene set – analyse Oefening S.230 Werkwijze: 1.
PubMed: Warner Nature Methods Limits
2.
Limits: Dates Published in the Last: Specify date range 2008 – 2008
77
Search
3.
Images from this publication: Free Text Scroll naar beneden – Supplementary Material: Supplementary Table 1 Opslaan als .xls – file
4.
Google: Ensembl Biomart Ensembl: Biomart Dataset:
78
5.
-
Ensembl Genes 62
-
Homo sapiens genes (GRCh37.p3)
Filters: Gene ID List Limit: RefSeq DNA ID(s) [e.g. NR_003682] Plakken: NM_XXXXXX (Cluster 0)
6.
Attributes – Features: Gene Ensembl: alles uitvinken
79
7.
Attributes – Features: External External References: UniProt / SwissProt ID Results
8.
Results: GO Opslaan als .txt – file
80
9.
Filters: Gene ID List Limit: EMBL ID(s) [e.g. AK090412] Plakken: overige Genbank / RefSeq ID’s (Cluster 0) Results
10. Results: GO Opslaan als .txt – file
11. Beide bestanden samenvoegen: Biomart_Export_EMBLRefSeq.txt 12. Google: http://go.princeton.edu/cgi-bin/GOTermFinder/GOTermFinder Required Basic Input Options: Biomart_Export_EMBLRefSeq.txt uploaden
81
13. Choose annotation: GOA – H. sapiens (Human) Search for GO Terms
82
Oefening S.238 Werkwijze: 1.
Ensembl Biomart Ensembl: Biomart Dataset:
2.
-
Ensembl Genes 62
-
Homo sapiens genes (GRCh37.p3)
Filters: Gene ID List Limit: UniProt / SwissProt ID(s) [e.g. YA23_HUMAN] Plakken: Biomart_Export_EMBLRefSeq.txt
83
3.
Attributes – Homologs: Gene Ensembl: alles uitvinken
4.
Attributes – Homologs: Orthologs Mouse Orthologs: Mouse Ensembl Gene ID Results
5.
Results: GO Opslaan als .txt – file
84
6.
Dataset: Ensembl Genes 62 Mus musculus genes (NCBIM37)
7.
Filters: Gene ID List Limit: Ensembl Gene ID(s) [e.g. ENSG00000139618] Plakken: Biomart_Export_Mouse.txt
8.
Attributes – Features: Gene Ensembl: alles uitvinken
85
9.
Attributes – Features: External External References: MGI ID Results
10. Results: GO Opslaan als .txt – file
11. Google: http://go.princeton.edu/cgi-bin/GOTermFinder/GOTermFinder Required Basic Input Options: Biomart_Export_Mouse_Homologs.txt uploaden
86
12. Choose annotation: MGI – M. musculus (Mouse) Search for GO Terms
13. Drosophila melanogaster Mus musculus
87
Pattern matching Elke letter x : AZ – residu Voorbeeld:
Verklaring:
x(4,7):
Minimum 4 en maximum 7 residuen tussen beide AZ
[NGH]:
Enkel N, G of H tussen beide AZ
x(2):
Exact 2 residuen tussen beide AZ
{GP}:
Alle residuen behalve Gly en Pro tussen beide AZ
88
Oefening S.242 Werkwijze: 1.
Toledo – Bioinformatica: Course Documents 102 NFkappaB targets
2.
Google: Ensembl Biomart Ensembl: Biomart Dataset:
3.
-
Ensembl Genes 62
-
Homo sapiens genes (GRCh37.p3)
Filters: Gene ID List Limit: RefSeq DNA ID(s) [e.g. ] Plakken: NF_KappaB_Targets.txt
89
4.
Attributes – Sequences: Sequences Sequences: Flank (Gene) Upstream flank: 1000
5.
Attributes – Sequences: Header Information Gene Information:
6.
-
Ensembl Gene ID uitvinken
-
Associated Gene Name aanvinken
Attributes – Sequences: Header Information Transcript information: Ensembl Transcript ID uitvinken Results
90
7.
Results: GO Opslaan als .txt – file
8.
1e manier: EMBOSS Web Interface EMBOSS Web Interface – Nucleic Motifs: Fuzznuc Upload Biomart_Export_NF_KappaB_Targets.txt Run Fuzznuc
91
9.
2e manier: F – Secure SSH Client F – Secure SSH Client: fuzznuc –sequence Biomart_Export_NF_KappaB_Targets.txt –rformat gff –outfile NF_KappaB_Fuzznuc.gff –pmismatch 0 –pattern GGGNNNNNCC –complement
10. F – Secure SSH Client: cat NF_KappaB_Fuzznuc.gff | grep –v ‘##’ | wc –l
11. Google: TOUCAN TOUCAN: Launch Now
12. TOUCAN – File: Load Seq File Name: Biomart_Export_NF_KappaB_Targets.fasta
92
13. TOUCAN – Annotation: Annotate GFF File Name: NF_KappaB_Fuzznuc.gff Blokje boven: + strand Blokje beneden: - strand
93
Oefening S.255 Werkwijze: 1.
PubMed – Protein: CTCF Artikel: CTCF [Homo Sapiens] FASTA: opslaan als fastafile
2.
F – Secure SSH Client: fuzzpro –sequence CTCF_Human.fa –outfile CTCF_human_ZincFinger.gff –rformat gff –pattern “C–x(2,4)Cx(3)[LIVMFYWC]x(8)Hx(3,5)H”
3.
F – Secure SSH Client: cat CTCF_Human_ZincFinger.gff | grep –v ‘##’ | wc –l
94
Python – permission krijgen: chmod a+x file.py OEFENING #!/usr/bin/env python # This program takes a DNA sequence (without checking) # and shows its length and the nucleotide composition DNASeq = "ATGTCTCATTCAAAGCA" #DNASeq = raw_input("Enter a sequence: ") DNASeq = DNASeq.upper() # Convert to upper case for .count() function DNASeq = DNASeq.replace(" ", "") # Remove spaces print 'Sequence:', DNASeq # Below an example of nested functions: first find the length, then make it float SeqLength = float(len(DNASeq)) print 'Sequence Length: ', SeqLength NumberA = DNASeq.count('A') NumberC = DNASeq.count('C') NumberG = DNASeq.count('G') NumberT = DNASeq.count('T') # Calculate percentage and output to 1 decimal print "A: {0:.1f}".format(100 * NumberA / SeqLength) print "C: {0:.1f}".format(100 * NumberC / SeqLength) print "G: {0:.1f}".format(100 * NumberG / SeqLength) print "T: {0:.1f}".format(100 * NumberT / SeqLength) # Calculating primer melting points with different formulas by length TotalStrong = NumberG + NumberC TotalWeak = NumberA + NumberT if SeqLength >= 14: # Formula for sequences >= 14 nucleotides long MeltTempLong = 64.9 + 41 * (TotalStrong - 16.4) / SeqLength print "Tm Long (>14): {0:.1f} C".format(MeltTempLong) else: # Formula for sequences less than 14 nucleotides long MeltTemp = (4 * TotalStrong) + (2 * TotalWeak) print "Tm Short: {0:.1f} C".format(MeltTemp)
OEFENING 1 #!/usr/bin/env python # Ask user for a DNA sequence and check the inputted sequence DNASeq = raw_input('Give a DNA Sequence: ') DNASeq = DNASeq.replace(" ", "") DNASeq = DNASeq.upper() # Calculate the CG content as percentage SeqLength = len(DNASeq) NumberC = DNASeq.count('C') NumberG = DNASeq.count('G') GCContent = 100.0 * (float(NumberG+NumberC)/SeqLength) print "The GC content for your sequence is {0:.1f} %.".format(GCContent)
95
OEFENING 2 #!/usr/bin/env python # Ask user for a DNA sequence and check the inputted sequence DNASeq = raw_input('Give a DNA Sequence: ') DNASeq = DNASeq.replace(" ", "") DNASeq = DNASeq.upper() # Display reverse complement for nucleotide in reversed(DNASeq): if nucleotide == 'A': print 'T', elif nucleotide == 'T': print 'A', elif nucleotide == 'G': print 'C', else: print 'G', print
PROTEIN EXERCISE #!/usr/bin/env python # This program takes a protein sequence # and determines its molecular weight # The look-up table is generated from a web page # throught a series of regular expression replacements # This program is described in Chapter 9 of PCfB AminoDict={ 'A':89.09, 'R':174.20, 'N':132.12, 'D':133.10, 'C':121.15, 'Q':146.15, 'E':147.13, 'G':75.07, 'H':155.16, 'I':131.17, 'L':131.17, 'K':146.19, 'M':149.21, 'F':165.19, 'P':115.13, 'S':105.09, 'T':119.12, 'W':204.23, 'Y':181.19, 'V':117.15, 'X':0.0, '-':0.0, '*':0.0 } #starting sequence string, on which to perform calculations ProteinSeq="FDILSATFTYGNR" MolWeight=0 # step through each character in the ProteinSeq string, # setting the AminoAcid variable to its value for AminoAcid in ProteinSeq: # look up the value corresponding to the current amino acid # add its value of the present amino acid to the running total MolWeight = MolWeight + AminoDict[AminoAcid] # once the loop is completed, print protseq and the molecular weight print "Protein:", ProteinSeq print "Molecular weight: {0:.1f}".format(MolWeight)
96
