UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep bioanalyse Laboratorium voor Toxicologie Academiejaar 2008-2009
BEPALING VAN GHB EN VERWANTE MOLECULEN IN BIOLOGISCHE MATRICES VIA GC-MS
Anneleen VAN HOVE Eerste Master in de Farmaceutische Zorg PROMOTOR Prof. Dr. Apr. W. Lambert
COMMISSARISSEN Dr. Apr. C. Stove Dr. K. Van Uytfanghe
AUTEURSRECHT
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”
20 mei 2009
Promotor,
Prof. Dr. Apr. W. Lambert
Auteur,
Anneleen Van Hove
DANKWOORD In de eerste plaats wil ik Prof. Dr. Apr. W. Lambert bedanken voor de algemene leiding bij de masterproef. In het bijzonder wil ik Apr. Ann-Sofie Ingels bedanken voor de begeleiding, het geduld en de hulp bij het schrijven van mijn scriptie. Ik heb je enthousiasme en je hulp enorm geapprecieerd. Verder wil ik ook nog alle mensen van het labo bedanken voor de toffe sfeer en de behulpzaamheid.
En als laatste, maar daarom niet minder belangrijk, wil ik mijn ouders, mijn vriend Kristof en mijn familie bedanken voor de enorme steun die ik al die jaren al van jullie heb gekregen.
INHOUDSTAFEL
1.INLEIDING ........................................................................................................................... 1 1.1. GAMMA-HYDROXYBOTERZUUR............................................................................ 1 1.1.1. Algemeen ................................................................................................................. 1 1.1.2. Farmacokinetiek..................................................................................................... 2 1.1.3. Therapeutisch gebruik........................................................................................... 2 1.1.4. Misbruik.................................................................................................................. 3 1.1.5. Toxiciteit en ontwenningsverschijnselen.............................................................. 4 1.2 ANALOGEN EN PRECURSOREN VAN GHB............................................................. 4 1.2.1. 1,4-Butaandiol......................................................................................................... 4 1.2.2. Gamma-butyrolacton............................................................................................. 5 1.2.3. Gamma-aminoboterzuur (GABA)........................................................................ 5 1.2.4. L-Glutaminezuur.................................................................................................... 5 1.2.5. Succinic semialdehyde............................................................................................ 5 1.2.6. Beta-hydroxyboterzuur ......................................................................................... 6 1.2.7. Gabapentine............................................................................................................ 6 1.2.8. Vigabatrine ............................................................................................................. 7 1.3 ANALYSE VAN GHB EN AFGELEIDEN .................................................................... 7 1.3.1. Algemeen ................................................................................................................. 7 1.3.2. Derivatisatie ............................................................................................................ 8 1.3.2.1. Silylering ........................................................................................................... 9 1.3.2.2. Acylering ........................................................................................................... 9 1.3.2.3. Alkylering........................................................................................................ 10 1.3.3. Principe van gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) ..................... 10
2. OBJECTIEVEN ................................................................................................................. 15
3. MATERIALEN EN METHODEN ................................................................................... 16 3.1. REAGENTIA EN SOLVENTEN ................................................................................. 16 3.1.1. Bereiding van de standaarden............................................................................. 16 3.1.2. Bereiding van de mix............................................................................................ 16
3.2. STAALVOORBEREIDING ......................................................................................... 17 3.2.1. Belasting van plasma............................................................................................ 17 3.2.2. Derivatisatie .......................................................................................................... 17 3.3. GC-MS CONDITIES .................................................................................................... 17 3.4. ONTWIKKELING VAN EEN SIM-METHODE ........................................................ 18 3.4.1. Full-scan monitoring ............................................................................................ 18 3.4.2. SIM-monitoring.................................................................................................... 18 3.5. OPTIMALISATIE VAN DE GC-MS METHODE ...................................................... 19 3.5.1. Staalintroductie .................................................................................................... 19 3.5.1.1. Solvent............................................................................................................. 19 3.5.1.2. Injectietemperatuur.......................................................................................... 20 3.5.1.3. Purge activation time....................................................................................... 20 3.5.1.4. Pulsed splitless injectie en pulse tijd ............................................................... 21 3.5.2. Scheiding op de kolom ......................................................................................... 21 3.5.2.1. Kolomkeuze .................................................................................................... 21 3.5.2.2. Draaggas en flow rate...................................................................................... 22 3.5.2.3. Optimalisatie van het temperatuursprogramma .............................................. 23 3.6. METHODEVALIDATIE.............................................................................................. 24 3.6.1. Precisie................................................................................................................... 24
4. RESULTATEN EN DISCUSSIE ...................................................................................... 25 4.1. ONTWIKKELING VAN EEN SIM-METHODE ........................................................ 25 4.1.1. Algemeen ............................................................................................................... 25 4.1.2. Full-scan monitoring ............................................................................................ 26 4.1.3. SIM-monitoring.................................................................................................... 29 4.2. OPTIMALISATIE VAN DE GC-MS METHODE ...................................................... 31 4.2.1. Staalintroductie .................................................................................................... 31 4.2.1.1. Solvent............................................................................................................. 31 4.2.1.2. Injectietemperatuur.......................................................................................... 32 4.2.1.3. Purge activation time....................................................................................... 34 4.2.1.4. Pulsed splitless injectie en pulse tijd ............................................................... 35
4.2.2. Scheiding op de kolom ......................................................................................... 39 4.2.2.1. Kolomkeuze .................................................................................................... 39 4.2.2.2. Draaggas en flow rate...................................................................................... 40 4.2.2.3. Optimalisatie van het temperatuursprogramma .............................................. 41 4.3. METHODEVALIDATIE.............................................................................................. 43 4.3.1. Precisie................................................................................................................... 43
5. CONCLUSIE ...................................................................................................................... 45
6. LITERATUURLIJST ........................................................................................................ 47
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN
BHB: beta-hydroxybutyraat CZS: centraal zenuwstelsel EDS: excessive daytime sleepiness EI: electron impact FDA: Food and Drug Administration GABA: gamma-aminoboterzuur GABA-T: gamma-aminoboterzuur transaminase GAD: glutamaat decarboxylase GC: gaschromatografie GBL: gamma-butyrolacton GHB: gamma-hydroxyboterzuur GHBDH: gamma-hydroxyboterzuur dehydrogenase HFB-OH: heptafluorobutanol HPLC: high performance liquid chromatography LSD: lyserginezuurdiëthylamide MDMA: methyleendioxymethamphetamine MS: massaspectrometrie MS/MS: tandem massaspectrometrie PFPA: pentafluoropropionyl-anhydride PFP-OH: pentafluoropropanol rpm: rotaties per minuut SIM: selected ion monitoring SSA: succinic semialdehyde SSADH: succinic semialdehyde dehydrogenase SSR: succinic semialdehyde reductase TIAFT: The International Association of Forensic Toxicologists TFAA: trifluoro acetic anhydride TIC: total ion chromatogram UV: ultraviolet VC: variatiecoëfficiënt
1.INLEIDING Een schematische voorstelling van het metabolisme van elke component (Bijlage 1) en een overzichtstabel met de endogene en therapeutische concentraties (Bijlage 2) zijn terug te vinden in de losse bijlage en achteraan de inleiding. 1.1. GAMMA-HYDROXYBOTERZUUR 1.1.1. Algemeen Gamma-hydroxyboterzuur (GHB) is een korte keten vetzuur dat endogeen aanwezig is in het centraal zenuwstelsel (CZS) en daar een rol heeft als neuromodulator of neurotransmitter. De precieze functie van GHB is echter nog niet gekend. Natrium oxybaat (Xyrem®) is het natriumzout van GHB, gebruikt voor orale toediening (Bessman et al.,1963).
De endogene synthese van GHB uit gamma-aminoboterzuur (GABA) gebeurt via het enzyme GABA transaminase (GABA-T) dat GABA omzet tot succinic semialdehyde (SSA). SSA wordt gereduceerd tot GHB via SSA reductase (SSR) of kan via SSA dehydrogenase (SSADH) omgezet worden tot succinaat, dat in de Krebs cyclus wordt gemetaboliseerd tot CO2 en H2O (Bijlage 1) (Drasbek et al., 2006). Exogene precursoren van GHB zijn 1,4-butaandiol en gamma-butyrolacton (GBL). 1,4-Butaandiol
wordt
na
inname
door
alcohol
dehydrogenase
tot
gamma-
hydroxybutyraldehyde gemetaboliseerd. Gamma-hydroxybutyraldehyde wordt op zijn beurt omgezet tot GHB via een aldehyde dehydrogenase. GBL wordt tot GHB omgezet via serum lactonases (Zvosec et al., 2001). Studies in ratten toonden aan dat 1,4-butaandiol en GBL ook in zeer minieme concentraties endogeen aanwezig kunnen zijn (Doherty et al., 1975 & Barker et al., 1985).
GHB bindt op receptoren in het hersenweefsel, namelijk op de GABAB receptoren en specifieke GHB receptoren, die G-proteïne gekoppeld zijn. Binding van GHB lokt verschillende
effecten
uit.
Enerzijds
zijn
er
verschillende
interacties
met
de
neuromodulatorische systemen in het CZS zoals het dopaminerg systeem, het serotoninerg en cholinerg systeem. Anderzijds interageert GHB met opioïden, neurosteroïden en groeihormoon (Figuur 1.1) (Drasbek et al., 2006).
1
FIGUUR 1.1 INWERKING VAN GHB OP DE VERSCHILLENDE NEUROMODULATORISCHE SYSTEMEN (Drasbek et al., 2006).
1.1.2. Farmacokinetiek De absorptie van GHB in het lichaam na exogene toediening wordt beïnvloed door verzadiging van transportsystemen in de darm, waardoor de biologische beschikbaarheid gelimiteerd is. De distributie van GHB verloopt snel en via een 2-compartimenteel model. In vitro studies toonden aan dat het niet gebonden is aan plasmaproteïnen. De eliminatie gebeurt niet lineair (0de orde) en is dus dosisafhankelijk (Drasbek et al., 2006). Aangezien GHB een korte halfwaardetijd van minder dan 1 uur heeft, is het zeer belangrijk om snel plasma- of urinestalen te verkrijgen voor de screening naar GHB. Plasmastalen worden best binnen de 6 tot 8 uur na inname van GHB afgenomen en urinestalen binnen de 10 tot 12 uur (Bechtel & Holstege, 2007).
1.1.3. Therapeutisch gebruik GHB werd in de jaren ’60 gesynthetiseerd als GABA analoog voor exogene toediening. In tegenstelling tot GABA geraakt het snel door de bloed-hersenbarrière en oefent daar gelijkaardige functies uit, maar wordt het trager gemetaboliseerd (Laborit, 1964).
Blumenfeld et al. omschreven in 1962 de eerste studie waarin het gebruik van GHB als anestheticum bij chirurgische ingrepen werd onderzocht bij 26 patiënten. Deze studie toonde aan dat GHB CZS depressie induceert met minimale effecten op de ademhaling en het circulatoir systeem en zonder al te significante neveneffecten (Blumenfeld et al., 1962).
2
De laatste jaren is het gebruik van GHB als anestheticum fel achteruitgegaan door een onvoorspelbare werkingstijd en onvoldoende analgesie. Bijwerkingen zoals nausea en braken zorgden er ook voor dat het gebruik van GHB op de achtergrond werd geschoven (Drasbek et al., 2006).
GHB wordt momenteel therapeutisch gebruikt voor de behandeling van de symptomen van narcolepsie. Dit is een ziekte die wordt gekenmerkt door excessive daytime sleepiness (EDS1), cataplexie2, hallucinaties en slaapverlamming3 (Mahmood & Black, 2005). Er werd in verschillende studies vastgesteld dat GHB, onder de vorm van natrium oxybaat, een belangrijke eerste-lijnsbehandeling is bij narcolepsie, hoewel de exacte werking niet gekend is. Het werd hiervoor in juli 2002 door de VS Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurd en wordt nu verkocht onder de naam Xyrem
®
(Pardi & Black, 2006).
GHB heeft ook nog andere therapeutische doeleinden. Zo is er de hypothese dat GHB, gezien zijn gelijkenissen met ethanol, kan dienen als substituent van alcohol om alcoholisme te verhelpen. Mogelijke problemen die hiermee gepaard kunnen gaan, zijn terugval van de patiënt, non-responders en GHB-afhankelijkheid (Ferrara et al., 1992).
1.1.4. Misbruik GHB wordt echter niet enkel therapeutisch gebruikt. Het is een drug die steeds meer aan populariteit wint en die de bijnaam ‘liquid ecstasy’ krijgt. GHB trekt jonge mensen aan door de euforie die het veroorzaakt en de ongeremdheid op zowel sociaal als sexueel vlak (Sumnall et al., 2008). Het gebruik ervan komt vaak terug zowel op ‘rave parties’ als in fitnessclubs door bodybuilders, aangezien GHB ook anabole effecten zou hebben (Drasbek et al., 2006). Vaak wordt GHB samen ingenomen met o.a. alcohol, methyleendioxymethamphetamine (MDMA, ecstasy), cocaïne, lyserginezuurdiëthylamide (LSD) of cannabis
(Rodgers &
Ashton, 2004).
1
Constant gevoel van slaperigheid, zelfs na adequate nachtelijke slaap. Wordt gekenmerkt door plots in slaap vallen op ongepaste momenten tijdens de dag. 2 Plotse spierzwakte, vb. van de gezichtsspieren of knieën. Zelfs volledige collaps is mogelijk. 3 Het lichaam blijft verlamd wanneer de hersenen ontwaken uit de REM slaap.
3
Een verontrustend feit is dat GHB niet enkel voor eigen gebruik wordt aangewend, maar ook als ‘rape drug’ of verkrachtingsdrug. GHB is geurloos en kleurloos en kan dus makkelijk in drankjes gegoten worden. Het werkt snel en zorgt voor relaxatie van de spieren, waardoor het slachtoffer zich niet kan verweren. Wat GHB nog geschikter maakt als verkrachtingsdrug is de snelle eliminatie uit het lichaam en het feit dat het slachtoffer zich achteraf weinig kan herinneren. Hierdoor wordt het zeer moeilijk de dader op te sporen (Schwartz & Milteer, 2000).
In 1990 heeft de FDA de over-the-counter verkoop van GHB verboden omwille van het steeds toenemende misbruik. In maart 2000 werd GHB in de Schedule 1 gezet (http://www.usdoj.gov/dea/pubs/scheduling.html). Dit is een lijst met stoffen waarvan het bezit of verkoop zonder licentie in de VS illegaal is. In juni 2003 werd GHB in de ‘Misuse of Drugs Act’ gezet (Rodgers & Ashton, 2004).
1.1.5. Toxiciteit en ontwenningsverschijnselen GHB gebruik kan ernstige problemen opleveren: hoge doses kunnen leiden tot diepe sedatie, coma en zelfs de dood (Drasbek et al., 2006). Verlengd gebruik kan afhankelijkheid en soms ernstige ontwenningsverschijnselen zoals angsten, slapeloosheid en tremor teweegbrengen. Deze kunnen snel overgaan in delirium, hallucinaties en/of psychoses en zelfs tot plastische veranderingen in de hersenen (Dyer et al., 2001). De voornaamste symptomen van een GHB overdosis zijn bewusteloosheid of coma, bradycardie, ademhalingsdepressie, hypothermie, braken en miose of mydriase (Liechti et al., 2006). Er werden ook paradoxale reacties ontdekt zoals agitatie, agressiviteit of bizar gedrag zoals zelfverwonding (Zvosec & Smith, 2005).
1.2 ANALOGEN EN PRECURSOREN VAN GHB 1.2.1. 1,4-Butaandiol 1,4-Butaandiol is een alifatisch alcohol en een precursor van GHB met gelijkaardige effecten. Daarom wordt het niet alleen industrieel gebruikt als solvent, maar ook als drug. 1,4-Butaandiol wordt omgezet tot GHB in 2 enzymatische stappen. Eerst gebeurt een oxidatiestap d.m.v. alcohol dehydrogenase tot gamma-hydroxybutyraldehyde en vervolgens wordt deze omgezet tot GHB via aldehyde dehydrogenase (Zvosec et al., 2001).
4
Aangezien 1,4-butaandiol nog steeds niet in de verboden lijsten van de VS staat ( cf. Schedule 1 waarin GHB wel vermeld staat), is het gemakkelijk te verkrijgen via internet en wordt het meer en meer ingenomen ter vervanging van GHB. Het is ook potenter dan GHB, waarschijnlijk omdat het sneller doorheen de bloed-hersenbarrière penetreert (Carai et al., 2002).
1.2.2. Gamma-butyrolacton Gamma-butyrolacton (GBL) wordt niet alleen industrieel gebruikt maar is net zoals 1,4butaandiol een prodrug van GHB. Het is een lacton dat snel wordt omgezet tot GHB in het lichaam d.m.v. perifere lactonases of buiten het lichaam door niet-enzymatische hydrolyse via NaOH. Omwille van de hogere lipofiliciteit dan GHB, wordt GBL sneller geabsorbeerd en heeft het dus een hogere biologische beschikbaarheid (Carai et al., 2008).
1.2.3. Gamma-aminoboterzuur Gamma-aminoboterzuur (GABA) is een belangrijke inhiberende neurotransmittor die gevormd wordt uit zijn precursor L-glutamaat via glutamaat decarboxylase (GAD). Het is ook een endogene precursor van GHB. De omzetting van GABA tot succinic semialdehyde (SSA) gebeurt via GABA transaminase, waarna SSA op zijn beurt kan omgezet worden tot GHB via succinic semialdehyde reductase (SSR) (Bak et al., 2006). 1.2.4. L-Glutaminezuur L-Glutaminezuur is het meest voorkomende vrije aminozuur in de hersenen en kan fungeren als neurotransmittor en als precursor voor de biosynthese van GABA in neuronen. Het kan goed door de bloed-hersenbarrière d.m.v. een transportsysteem (Smith, 2000).
1.2.5. Succinic semialdehyde Succinic semialdehyde (SSA) kan gevormd worden uit GABA via GABA-T. Het gevormde SSA kan omgezet worden tot succinaat door succinic semialdehyde dehydrogenase (SSADH) of tot GHB via SSR. Omgekeerd kan GHB ook omgezet worden tot SSA d.m.v. GHB dehydrogenase, om dan in de Krebs cyclus verder afgebroken te worden (Drasbek et al., 2006).
5
Mensen met een SSADH deficiëntie zullen verhoogde GABA- en GHB-concentraties in hun hersenen hebben. Het is een autosomaal recessieve stoornis van het metabolisme van de inhiberende neurotransmittor GABA. Aangezien SSADH verantwoordelijk is voor de oxidatie van SSA tot succinaat, zal bij enzymdeficiëntie het katabolisme van GABA verstoord zijn. Dit leidt tot opstapeling van zowel GABA als SSA in de hersenen. Deze laatste kan op zijn beurt omgezet worden tot GHB d.m.v. SSR. De verhoogde GHB concentratie zal zorgen voor prominente neurologische symptomen zoals psychomotorische retardatie, ataxie, hypotonie, spraakvertraging en epileptische aanvallen (Drasbek et al., 2008).
1.2.6. Beta-hydroxyboterzuur Beta-hydroxyboterzuur (BHB) (zoutvorm: Na-3-hydroxybutyraat) is een structureel isomeer van GHB en kan bij de analytische bepaling van GHB voor interferenties zorgen omdat het ook aanwezig kan zijn in biologische vloeistoffen (Paul et al., 2006). Het is een ketonlichaam dat vnl. wordt gevormd bij een toestand van vasten, slecht behandelde diabetes en chronisch alcoholisme. BHB wordt gevormd uit acetyl-coënzyme A (acetyl-CoA) en speelt samen met aceton en azijnzuur een belangrijke rol in de energievoorziening van de hersenen bij een glucosetekort. Bij onbehandelde diabetespatiënten kan de hoeveelheid ketonlichamen in de urine en het bloed zodanig hoog worden dat het kan leiden tot ketoacidose4. De concentratie van BHB in lichaamsvloeistoffen wordt ook gebruikt als een indirecte merker van alcoholische ketoacidose. Sterk verhoogde BHB concentraties (> 315 µg/ml) zijn zelfs dodelijk (Kadiš et al., 1999) (Bijlage 2). 1.2.7. Gabapentine ®
Gabapentine (Neurontin ) is een GABA analoog dat onveranderd door de bloedhersenbarrière kan en o.a. therapeutisch gebruikt wordt als anticonvulsivum en als analgeticum bij neuropathische pijn (Rose & Kam, 2002). Gabapentine wordt niet metabool omgezet tot GABA of een GABA-agonist en is geen inhibitor van de GABA opname of afbraak (http://www.drugs.com/pro/gabapentin.html).
4
Toestand waarbij zodanig hoge hoeveelheden ketonlichamen opstapelen in het bloed, waardoor de pH gevaarlijk laag wordt. Komt veel voor bij slecht behandelde diabetespatiënten en chronisch alcoholisme.
6
1.2.8. Vigabatrine Vigabatrine (gamma-vinyl-GABA) is een structuuranaloog van GABA en wordt therapeutisch gebruikt als anticonvulsivum. Het is een selectieve irreversibele inhibitor van GABA-T, het katabole enzyme van GABA. Daardoor verhogen de GABA levels in de hersenen, mede doordat vigabatrine ook de vrijstelling van GABA stimuleert (Willmore et al., 2009). 1.3 ANALYSE VAN GHB EN AFGELEIDEN 1.3.1. Algemeen GHB en zijn precursoren GBL en 1,4-butaandiol kennen hun opmars als ‘party drugs’ of ‘rape drugs’. Een overdosis treedt makkelijk op omdat het gehalte van de aangeboden GHB vaak sterk varieert. Na orale inname wordt GHB via 0de orde kinetiek geëlimineerd, waardoor de eliminatiesnelheid dosis-afhankelijk is. Door zijn snelle eliminatie is het belangrijk zo snel mogelijk biologische specimens zoals bloed, speeksel of urine te verkrijgen voor toxicologische testen.
Er werden al verscheidene vloeistofchromatografische methoden beschreven voor de detectie van GHB in preparaten en biologische stalen. De Vriendt et al. (2001) ontwikkelden een techniek voor de analyse van GHB in het plasma van ratten via hoge druk vloeistofchromatografie (HPLC) met ultraviolet-detectie (UV). Mesmer & Satzger (1998) bepaalden GHB via HPLC met massaspectrometrie (MS). Door Wood et al. (2004) werd een gevoeliger en snelle methode beschreven voor de simultane analyse van GHB en diens precursoren in urine via vloeistofchromatografie (LC) met tandem-massaspectrometrie (MS/MS).
De meeste bepalingen van GHB in preparaten en biologische stalen gebeuren echter via gaschromatografie (GC). Zo beschreven Kimura et al. (2003) een methode voor de GHBbepaling in urine via GC-MS en publiceerden De Paoli & Bell in 2008 een artikel over de bepaling van GHB in speeksel via GC-MS. Paul et al. (2006) ontwikkelden een GC-MS/MS methode voor de analyse van GHB in bloed en urine.
7
Het voordeel van gaschromatografie gekoppeld aan MS/MS is dat het veel selectiever is dan GC-MS door de extra selectiviteit, waardoor interferentie door structurele isomeren van GHB zoals alfa- en beta-hydroxybutyraat quasi onmogelijk wordt (Paul et al., 2006).
De analyse van GHB via GC is niet zo eenvoudig gezien zijn chemische eigenschappen. Zo heeft GHB een lage moleculaire massa waardoor de massaspectra minder specifiek zijn. Hierbij komt nog dat GHB polair is door de aanwezige hydroxyl- en carboxylgroep waardoor het te weinig vluchtig is om een performante chromatografie te bekomen. Deze problemen kunnen verholpen worden door enkele chemische wijzigingen aan te brengen.
Enerzijds kan GHB omgezet worden onder zure omstandigheden tot zijn lactonvorm, GBL, dat minder polair en ook vluchtiger is. Anderzijds kan de derivatisatie van GHB een oplossing bieden. De omzetting van GHB tot GBL wordt o.a. beschreven door Doherty et al. (1975) en Ferrara et al. (1993). Een nadeel van deze techniek is dat de moleculaire massa nog steeds laag is terwijl bij derivatisatie de moleculaire massa hoger wordt. Elian (2000) en Kimura et al. (2003) gebruikten silylering als derivatisatietechniek, wat voor de detectie van GHB de meest gebruikte methode is. Sabucedo & Furton (2004) daarentegen ontwikkelden een extractieloze GC-MS analyse van GHB en GBL in waterige stalen na derivatisatie met trifluoro-azijnzuuranhydride (TFAA) en heptafluoro-1-butanol (HFB-OH) in de verhouding 2:1 (v/v).
1.3.2. Derivatisatie Derivatisatie is een vaak voorkomende staalvoorbereidingstechniek voorafgaand aan GC analyse. De chemische functionaliteit van een verbinding verandert hierdoor, met een hogere vluchtigheid en stabiliteit als gevolg (Wille, 2008). De keuze van derivatisatiereagentia is afhankelijk van de aanwezige functionele groepen op de te bepalen componenten, zoals hydroxyl-, carboxyl- en aminogroepen. De 3 meest gebruikte derivatisatiereacties voorafgaand aan GC zijn silylering, acetylering en alkylering. (http://www.chromatographyonline.org/GC/Quantitative-Analysis/Derivatization/rs55.html)
8
1.3.2.1. Silylering Vervanging van de actieve H-atomen in verbindingen met COOH-, OH-, NH2-, =NH- of SH-groepen door een silylgroep is de eenvoudigste, snelste en meest veelzijdige derivatisatiemethode voor de analyse via GC-MS. De gevormde derivaten zijn veel vluchtiger, minder polair en thermisch stabieler. De silyleringsreactie wordt als volgt weergegeven (Halket & Zaikin, 2003): -XH + ASiR1R2R3 -XSi R1R2R3 + AH De overmaat aan derivatisatieproduct wordt samen met het staal geïnjecteerd en komt op de kolom terecht. Dit kan leiden tot contaminatie en in-situ derivatisatie van alle geïnjecteerde verbindingen. Daarom zou een GC systeem enkel gebruikt kunnen worden voor gesilyleerde stalen en dit was geen optie in het laboratorium.
1.3.2.2. Acylering Acylering is ook een vaak gebruikte derivatisatiemethode voor polaire verbindingen. Het kan een alternatief zijn voor silylering en krijgt soms zelfs de voorkeur, bvb. bij primaire en secundaire amines en amides. Verbindingen met een COOH-groep kunnen echter niet omgezet worden tot acylderivaten. Bij acylering worden de actieve H-atomen van de polaire OH-, NH2-, =NH of SH-groepen vervangen door een acylgroep, waardoor de polariteit verlaagt en de vluchtigheid en moleculaire massa toenemen. Die verhoging van de moleculaire massa zorgt ervoor dat de MS-analyse eenvoudiger en preciezer wordt. De acyleringsreactie kan voorgesteld worden als volgt:
R-XH+ R’COY R-XCOR’ + YH Acylering gebeurt o.a. via anhydrides zoals bvb. trifluoroacetyl-anhydride (TFAA), pentafluoropropionyl-anhydride (PFPA) en heptafluorobutyryl-anhydride (HFBA) (Tabel 1.1) (Halket & Zaikin, 2003).
9
TABEL 1.1.: STRUCTUUR VAN DE ACYLERINGSGROEPEN Trifluoroacetyl (TFA)
-COCF3
Pentafluoropropionyl (PFP)
-COC2F5
Heptafluorobutyryl (HFB)
-COC3F7
1.3.2.3. Alkylering Een derde derivatisatietechniek is alkylering. Hierbij wordt een H-atoom van een COOH-, SH-, OH- of NH-groep vervangen door een alkylgroep. Indien de verbinding die gederivatiseerd wordt een zuur is, spreekt men van esterificatie. De gevormde derivaten zijn, net zoals na silylering of acylering, vluchtiger en dus beter geschikt voor analyse via GC-MS. Alkylering wordt vaak gebruikt voor de verestering van carboxylgroepen, en kan gebeuren via bvb. pentafluoropropanol (PFP-OH), heptafluorobutanol (HFB-OH) of BF3-butanol (Tabel 1.2) (Halket & Zaikin, 2004).
TABEL 1.2: STRUCTUUR VAN DE ALKYLERINGSREAGENTIA Pentafluoropropanol (PFP-OH) Heptafluorobutanol (HFB-OH) BF3-butanol
C2F5-CH2-OH C3F7-CH2-OH BF3-CH2-CH2-CH2-CH2-OH
1.3.3. Principe van gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) GC kan gebruikt worden om kwantitatieve en kwalitatieve informatie te bekomen over individuele componenten in stalen. Verbindingen moeten wel geschikt zijn voor GC. Zo moeten ze een goede vluchtigheid hebben bij temperaturen onder 350°C - 400°C. Het is ook belangrijk dat ze niet degraderen bij hoge temperaturen of reageren met andere verbindingen. Een algemeen aanvaarde regel is: hoe groter het moleculair gewicht of de polariteit van de verbinding, hoe lager de vluchtigheid. De aanwezigheid van polaire functionele groepen zoals OH- of NH2-groepen vermindert sterk de vluchtigheid (Rood,1999).
10
Een GC systeem bestaat hoofdzakelijk uit 6 belangrijke delen: de gastoevoer en flowcontrollers, de injector, de oven met kolom, een detector en een opnametoestel. Via de splitless injector5 kan het staal, opgelost in een solvent, ingebracht worden in de GC. De injector wordt verwarmd waardoor de verschillende vluchtige componenten snel omgezet worden tot een gas. Het carriergas (vaak Helium) vermengt zich dan met de vervluchtigde componenten en draagt deze over de kolom. Die kolom zit in een oven waarvan de temperatuur zeer nauwkeurig gecontroleerd wordt (Rood,1999).
De binnenzijde van de kolom is gecoat met een stationaire fase die de beweging van elke component vertraagt, wat retentie wordt genoemd. Eens op de kolom zullen de moleculen van elke verbinding zich tussen de mobiele fase en stationaire fase verdelen. Bij GC is de mobiele fase een gas. Dit proces van uitwisseling tussen de 2 fasen wordt duizenden keren herhaald voor elke molecule. Het netto-effect hiervan is dat elke component op een ander tijdstip de kolom verlaat. De scheiding is vnl. afhankelijk van de kolomtemperatuur en de affiniteit van de verbinding voor de stationaire fase (Rood,1999).
FIGUUR 1.2 SCHEMATISCHE VOORSTELLING VAN EEN MASSASPECTROMETER (Rood,1999)
5
Bij een splitless injectie wordt het vervluchtigde staal bijna volledig op de kolom gebracht, wat ideaal is voor het meten van componenten die in lage concentraties aanwezig zijn. Dit in tegenstelling tot een split injectie, waarbij een deel van het verdampte staal niet op de kolom terecht komt.
11
De componenten die de kolom verlaten, komen terecht in de MS die bestaat uit een ionenbron, een massafilter en een detector (Figuur 1.2). Bij het binnenkomen in de ionenbron worden ze geïoniseerd en gefragmenteerd via electron impact (EI) of chemical ionisation (CI).
Bij EI worden de moleculen die elueren van de kolom en zich in de dampfase bevinden onder hoogvacuüm beschoten met versnelde electronen (70eV). Deze botsing zorgt ervoor dat de molecule gefragmenteerd wordt in kleinere positieve fragmentionen. Welke ionen gevormd worden, is afhankelijk van de moedermolecule en de energie van de electronen.
Ionisatie via CI is een veel zachtere vorm van ionisatie en gaat gepaard met een lagere energietransfer, waardoor de molecule minder fragmenteert. De kans dat een CI massaspectrum het moleculair ion vertoont is bijgevolg veel groter dan bij EI.
De gevormde ionen worden dan van de bron naar de massafilter gestuurd, die de ionen zal scheiden volgens hun massa-over-lading verhouding (m/z). De massafilter die hier gebruikt wordt, is de quadrupool. Deze bestaat uit 4 parallelle hyperbolische staven die twee aan twee aan een gelijkspanningsbron gekoppeld zijn. Hierdoor is het ene paar positief en het andere paar negatief geladen. Tevens is er een regelbare wisselspanning aangesloten op beide paren, wat leidt tot een elektromagnetisch veld. Wanneer een geladen ion de quadrupool binnenkomt, zal deze in het elektromagnetisch veld gedwongen worden een golfbeweging te maken. De ionen zullen, afhankelijk van hun m/z waarde en de frequentie van de wisselspanning al dan niet door de quadrupool kunnen. De meeste GC-MS systemen gebruiken een electron multiplier, die een elektrisch signaal geeft dat evenredig is met het aantal ionen dat de detector binnenkomt (Rood,1999).
12
Bijlage 1: Overzichtsschema
13
Bijlage 2: Overzichtstabel
Component
Plasmaconcentratie Endogeen: 2,1-28,35 µg/ml 1
BHB
Alcoholische ketoacidose: Letaal bij > 315 µg/ml 2 Endogeen: 0,17-1,5 µg/ml 3
GHB
Exogeen: > 5 µg/ml 3 Endogeen:
GABA
46 ng/ml – 70 ng/ml 4 Therapeutische range:
Vigabatrine
1- 25 µg/ml 5 Therapeutische range: 2-20 µg/ml 5
Gabapentine
Overdosis: vanaf > 24 µg/ml 6
1
: Tietz, 1995 : Kadiš et al., 1999 3 : Elian, 2002 4 : Loscher, 1979 5: The International Association of Forensic Toxicologists (www.tiaft.org) 6 : Johannessen et al., 2003 2
14
2. OBJECTIEVEN Het onderzoek zal zich voornamelijk richten op het ontwikkelen van een methode om GBL, BHB, GHB, GABA, vigabatrine, L-glutaminezuur, gabapentine, SSA en 1,4-butaandiol te analyseren in biologische matrices via GC-MS.
GBL en 1,4-butaandiol zijn precursoren van GHB die de laatste jaren veel aan populariteit gewonnen hebben in het misbruikmilieu. Naast het opsporen van deze drugs is het ook de bedoeling dat de ontwikkelde methode gebruikt kan worden voor Therapeutic Drug Monitoring (TDM) van o.a. vigabatrine, gabapentine en GABA-analogen.
De ontwikkelde methode zal ook dienen voor de bepaling van de endogene componenten GABA en L-glutaminezuur. De endogene hoeveelheden van deze componenten variëren van mens tot mens en het is de bedoeling om na te gaan of er een verband bestaat met de endogene GHB-concentratie. Er kan dan met behulp van de bekomen methode een ratio opgesteld worden tussen de endogene concentraties van deze componenten en GHB.
BHB is een structuurisomeer van GHB dat eveneens endogeen aanwezig is. De bekomen methode zal gebruikt worden om te bepalen of dit isomeer kan interfereren bij de bepaling van GHB.
De eerste stap is de ontwikkeling van een Selected Ion Monitoring methode (SIM) voor de analyse via GC-MS, waarbij per component 1 quantifier en 2 qualifier ionen zullen bepaald worden. Het verdere onderzoek zal zich dan toespitsen op de optimalisatie van deze SIMmethode op vlak van staalintroductie en scheiding op de kolom.
Door de variatie van verschillende parameters kunnen de ideale injectietemperatuur, solvent en purge activation time bepaald worden voor een goede staalintroductie. Verder zal ook onderzocht worden of het toepassen van een pulsed splitless injectie voor betere resultaten zorgt. Voor een optimale scheiding op de kolom zullen verschillende temperatuursprogramma’s en flow rates uitgetest worden. De finaal bekomen methode zal dan uiteindelijk getest worden op vlak van precisie.
15
3. MATERIALEN EN METHODEN 3.1. REAGENTIA EN SOLVENTEN Voor het bereiden van de werkoplossingen werden volgende reagentia gebruikt: GHB (natriumzout), GBL, 1,4-butaandiol (99 % zuiverheid, dichtheid: 1,017 g/ml), GABA (≥ 99%), L-glutaminezuur (99%), gabapentine, vigabatrine, SSA (15% oplossing in H2O) en BHB. Deze werden allemaal bekomen via Sigma-Aldrich (Steinheim, Duitsland). De derivatisatiereagentia TFAA en HFB-OH en de solventen ethylacetaat (> 99.8%) en hexaan (≥ 99%) werden geleverd door Fluka (Bornem, België). Methanol en tolueen werden geleverd door Merck, net als acetonitrile (Darmstadt, Duitsland). Zowel hexaan als ethylacetaat, methanol en tolueen hebben een suprasolve kwaliteit, ideaal voor gaschromatografische analyses.
3.1.1. Bereiding van de standaarden Van elke geleverde component werden stockoplossingen bereid met een concentratie van 1 en 10 mg/ml in methanol. Deze oplossingen werden bewaard bij -20 °C. Vanuit deze stockoplossingen werden werkoplossingen van 0,1 mg/ml gemaakt via verdunningen in methanol en deze werden bewaard bij 4°C. Aangezien GBL in alcoholisch midden aanleiding geeft tot ethyl- en methylesters van GHB werd het opgelost in acetonitrile (Hennessy et al., 2004). De standaardoplossingen van L-glutaminezuur en gabapentine werden bereid in water omdat deze componenten onoplosbaar zijn in methanol (Windholz et al., 1976).
3.1.2. Bereiding van de mix Om alle componenten gelijktijdig in plasma te kunnen spiken, werd een methanolische mix gemaakt waarbij elke component aanwezig was in een concentratie van 40 ng/µl (uitgezonderd gabapentine). De mix bestond uit volgende componenten: BHB, GHB, GABA, vigabatrine, gabapentine, L-glutaminezuur en SSA. Omwille van de onstabiliteit van GBL in methanol kon deze component niet in de mix verwerkt worden. Om deze mix te bekomen, werd van elke component 400 µl genomen van de 1 mg/ml stockoplossing, waarna aangelengd werd met methanol tot 10 ml. Voor gabapentine werd 400 µl van de 0,1 mg/ml oplossing genomen, waardoor gabapentine in de mix aanwezig was met een concentratie van 4 ng/µl. Deze mix werd bewaard bij 4°C en afgeschermd van licht.
16
3.2. STAALVOORBEREIDING 3.2.1. Belasting van plasma Voor de meeste analyses werd 50 µl plasma belast met 100 µl mix. Deze stalen werden gedurende de nacht bij 4°C bewaard om de eventuele binding van de componenten aan proteïnen te laten doorgaan. Dit was nodig om de werkelijkheid zo goed mogelijk na te bootsen. Vervolgens werd acetonitrile aan het plasma toegevoegd met een verhouding acetonitrile:plasma van 2:1 om de eiwitten te laten neerslaan. Het plasma werd dan 10 min gecentrifugeerd aan een toerental van 3000 rpm met een Mistral MSE 200 BRS (Drogenbos, België). Het supernatans werd dan overgebracht en drooggedampt onder stikstofgas.
3.2.2. Derivatisatie Het derivatisatiemengsel TFAA en HFB-OH (2:1) werd steeds vers bereid, waarna aan elk drooggedampt staal 75 µl van dit mengsel werd toegevoegd. Dit werd na grondig vortexen verwarmd gedurende 30’ bij 85°C in een multiblock verwarmingstoestel (Lab-line, Tier, Nederland) om de derivatisatie optimaal te laten doorgaan. Vervolgens werden de stalen na 10 min afkoelen opnieuw drooggedampt onder stikstofgas. Het residu werd daarna heropgelost in 100 µl solvent.
3.3. GC-MS CONDITIES Voor de analyses werd gebruik gemaakt van een HP 6890 gaschromatograaf en een HP 5973 massaselectieve detector (Agilent Technologies, Avondale, PA, USA). Als dataverwerkingssysteem werd G1701DA Agilent Chem Station, versie D.02.00 gebruikt. De HP7683 split/splitless auto injector bevatte een splitless gedeactiveerde inlet liner met glaswol. De splitless injectietemperatuur was 250°C en de purge tijd 2 min. Het injectievolume bedroeg 1 µl. De scheiding gebeurde op een Agilent J&W HP-5MS capillaire kolom met een lengte van 30 m, een interne diameter van 0,25 mm en een filmdikte van 0,25 µm (Agilent Technologies, Avondale, PA, USA). Door de kolom werd een constante heliumflow van 1 ml/min gestuurd.
17
Het temperatuursprogramma bij het gebruik van hexaan als solvent was het volgende: de initiële temperatuur was 45°C en deze werd 2 min aangehouden. Daarna steeg de temperatuur tot 110° C met een stijging van 5°C/min om vervolgens verder te stijgen tot 300°C aan 30°C/ min. Deze temperatuur werd dan nog 2 min aangehouden. De totale run bedroeg dan 23,3 min.
De massaselectieve detector werd
gebruikt in de EI mode bij volgende
temperatuurscondities: 280°C voor de transferlijn, 230°C voor de EI bron en 150°C voor de quadrupool. De elektronspanning bedroeg 70 eV.
3.4. ONTWIKKELING VAN EEN SIM-METHODE 3.4.1. Full-scan monitoring Gebaseerd op een artikel van Sabucedo & Furton (2004) werd de derivatisatie van elke component eerst gevolgd in een full-scan modus, waarbij alle ionen worden geregistreerd. Van elke component werd 100 ng op de kolom gebracht en na scheiding gedetecteerd in de full-scan modus. Zo werd een Total Ion Chromatogram (TIC) bekomen, waarbij per piek de reconstructie van het massaspectrum bekeken werd. Van elk massaspectrum werden de m/z waarden vergeleken met de fragmentionen van elke component, bekomen na EI. Bij overeenkomst werd deze piek beschouwd als die van de geïnjecteerde component.
3.4.2. SIM-monitoring Uit de reconstructie van de massaspectra via de full-scan methode konden per component 1 quantifier en 2 qualifier ionen geselecteerd worden. De keuze van het quantifier ion viel op het meest abundante ion uit het massaspectrum. Als qualifier ionen werden deze gekozen die met absolute zekerheid enkel afkomstig waren van de fragmentatie van de component zelf en niet van interfererende stoffen (Van hee et al., 2004). Met deze m/z waarden en de retentietijden van elke component werd een SIM-methode ontwikkeld. Deze SIM-methode werd gebruikt om 100 µl mix (40 ng/µl) toegevoegd aan 100 µl plasma te detecteren.
18
3.5. OPTIMALISATIE VAN DE GC-MS METHODE 3.5.1. Staalintroductie Als introductiemethode voor de stalen werd voor een splitless injectie geopteerd. Het principe van een splitless injectie bestaat volgens Grob (1993) uit 3 stappen (Figuur 3.1). Bij de eerste stap is de split uitgang (split line) gesloten en wordt het staal geïnjecteerd. Tijdens de tweede stap komt het staal terecht in de verwarmde liner van waaruit het getransfereerd wordt met het draaggas naar de kolom. Deze periode wordt de splitless periode genoemd, aangezien de split uitgang nog steeds gesloten is. In de derde stap wordt de split uitgang geopend om de hoeveelheid overgebleven staal te verwijderen.
FIGUUR 3.1: PRINCIPE VAN SPLITLESS INJECTIE MET OPENING VAN DE SPLIT LINE (Grob, 1993)
3.5.1.1. Solvent In het begin van het onderzoek werd hexaan als solvent gebruikt voor de bepaling van GHB en analogen. Om de methode te optimaliseren, werden naast hexaan ook ethylacetaat en tolueen uitgetest als solvent. Een ander solvent kan er immers voor zorgen dat de starttemperatuur van het temperatuursprogramma hoger ligt, waardoor de run korter wordt. Er werd 100 µl mix toegevoegd aan 50 µl plasma en na derivatisatie heropgelost in 100 µl hexaan, ethylacetaat of tolueen.
19
3.5.1.2. Injectietemperatuur De invloed van verschillende injectietemperaturen werd onderzocht door telkens 1 µl staal (40 ng op kolom) te injecteren na staalvoorbereiding. De injectietemperatuur moet voldoende hoog zijn om alle componenten snel te verdampen zonder degradatie. Daarom werden de injectietemperaturen gevarieerd tussen 200, 250 en 300°C (Wang et al., 1983).
De gekozen injectietemperatuur werd daarna gecontroleerd d.m.v. een lineair temperatuursprogramma: een starttemperatuur van 50°C werd 2 min aangehouden en daarna via 12,5°C/min opgedreven tot 300°C. Deze temperatuur werd vervolgens nog 2 min behouden. De ideale injectietemperatuur moet dan 50°C hoger zijn dan de elutietemperatuur van de hoogstkokende component in de mix (Grob, 1993).
3.5.1.3. Purge activation time De purge activation time is het tijdstip waarop de split line wordt geopend bij splitless injectie. De beste purge activation time is afhankelijk van de flow rate van het draaggas en de vluchtigheid van de componenten in het staal. De split line mag pas geopend worden wanneer ongeveer 1 tot 1,5 linervolumes van het draaggas de injector verlaten hebben om te voorkomen dat er componenten verloren gaan via de split line (Rood, 1999).
Om de theoretische purge activation time te berekenen, moet eerst de sweep rate bepaald worden. De sweep rate is het tijdstip waarop 1 volume van het draaggas de injector verlaten heeft. Deze kan berekend worden via volgende vergelijking (3.1):
Sweep rate =
Linervolume F
(3.1)
Waarin: Linervolume (cm3) : π r² L F (ml/min): flow rate van de kolom (Rood, 1999)
20
De lengte van de liner was 8 cm, de ID 0,4 cm en de flow rate 1,3 ml/min. Het invullen van de vergelijking leverde een sweep rate op van 46 sec. De purge activation time was dan deze waarde vermenigvuldigd met 1 of 1,5. Op die manier werd een range van respectievelijk 46 tot 70 sec bekomen waartussen de purge activation time normaal gezien het best zou moeten zijn.
Voor het testen van de purge activation times werd 100 µl mix toegevoegd aan 50 µl plasma samen met 40 µl GBL (0,1 mg/ml) en na derivatisatie heropgelost in 100 µl ethylacetaat. Er werden 5 purge activation times uitgetest: opening van de split line na 45, 60, 75, 90 en 120 sec.
3.5.1.4. Pulsed splitless injectie en pulse tijd Bij een pulsed splitless injectie werd de druk van het heliumgas tijdelijk verhoogd tot 20, 25 of 30 pounds per square inch (psi) voor een complete en snelle transfer van de componenten. Wanneer gewerkt wordt met een pulsed splitless injectie is de pulse tijd van belang. Dit is het tijdstip waarop de tijdelijk verhoogde druk terug gereduceerd wordt tot de normale gasdruk van 11,81 psi. De pulse tijd moet 0,1 tot 0,5 min langer zijn dan de purge activation time. Bij een purge activation time van 90 sec en een flow rate van 1,3 ml/min werd een pulse tijd getest van 1,6 en 2,0 min. Voor een purge activation time van 120 sec en een flow rate van 1,3 ml/min werden volgende pulse tijden getest: 2,1 en 2,5 min. Daarvoor werd 50 µl plasma belast met 100 µl mix (40 ng/µl) en 40 µl GBL (0,1 mg/ml) en na staalvoorbereiding opgelost in 100 µl ethylacetaat. Bijkomend werd de vergelijking gemaakt tussen een pulsed splitless injectie en een niet-pulsed splitless injectie. 3.5.2. Scheiding op de kolom 3.5.2.1. Kolomkeuze Er werd gekozen voor een 5% phenylmethylpolysiloxaan kolom van 30 m x 0,25 mm I.D. x 0,25 µm filmdikte omdat deze een courant gebruikte kolom is bij klinische en forensische analyses. Deze kolom leverde een acceptabele scheiding van de componenten met aanvaardbare retentietijden en piekvormen.
21
3.5.2.2. Draaggas en flow rate Helium werd als draaggas gebruikt aangezien het geschikt is voor componenten die over een breed temperatuursgebied elueren. Om de optimale flow rate te vinden, moet eerst de ideale lineaire gassnelheid (ū) bepaald worden. De lineaire gassnelheid is de snelheid waarmee het draaggas door de kolom gaat. Deze ligt voor een kolom van 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm best tussen 30 en 40 cm/sec. De lineaire snelheid kan omgezet worden in een flow rate welke ingesteld wordt in het programma voor de GC-MS analyse (vergelijking 3.2.). De flow rate is het volume heliumgas dat per tijdseenheid door de kolom stroomt (ml/min) (Rood, 1999). In Tabel 3.1 staan de flow rates en de overeenkomstige lineaire gassnelheden vermeld
die werden uitgetest. Hiervoor werd 100 µl mix (40 ng/µl) en 40 µl GBL (0.1 mg/ml) toegevoegd aan 50 µl plasma en aan staalvoorbereiding onderworpen.
F = 189 r² u
(3.2)
Waarin: F = gemiddelde flow rate (ml/min) r = straal van de kolom (cm)
u = gemiddelde lineaire snelheid (cm/sec) (Rood, 1999)
TABEL 3.1 : UITGETESTE FLOW RATES MET OVEREENKOMSTIGE LINEAIRE GASSNELHEDEN
Lineaire gassnelheid
Flow rate
25 cm/sec
0,7 ml/min
31 cm/sec
0,9 ml/min
35 cm/sec
1,0 ml/min
37 cm/sec
1,1 ml/min
44 cm/sec
1,3 ml/min
49 cm/sec
1,5 ml/min
22
3.5.2.3. Optimalisatie van het temperatuursprogramma Na het spiken van 100 µl mix in 50 µl plasma werd er gederivatiseerd met 75 µl TFAA: HFB-OH en het residu werd na droogdampen opnieuw opgelost in 100 µl ethylacetaat. Er werd telkens 1 µl staal op de kolom geïntroduceerd. Een isotherme run is voor GHB en de verwante moleculen onmogelijk. Daarom werden verschillende temperatuursprogramma’s uitgetest die in Tabel 3.2 terug te vinden zijn.
TABEL 3.2: OVERZICHT VAN DE GETESTE TEMPERATUURSPROGRAMMA’S Naam
Solvent delay
Temperatuursprogramma
Duur van de run
Start: 60°C 2’ 603001050
3 minuten
°C / min 60°C 10 → 110°C / min °C → 300°C 110°C 50
12,8 minuten
300°C 2’ Start: 65°C 2’ 65595
3 minuten
°C / min → 95°C 65°C 5 / min 95°C 30 °C → 300°C
16,8 minuten
300°C 2’ Start: 65°C 2’ °C / min 65°C 8 → 155°C
65155
3 minuten
° c / min 155°C 15 → 230°C
21,7 minuten
/ min 230°C 30 °C → 300°C
300°C 2’ Start: 65°C 2’ °C / min 65°C 8 → 95°C
65300810
3 minuten
°C / min 95°C 10 → 230°C
22,7 minuten
/ min 230°C 50 °C → 300°C
300°C 2’ Start: 65°C 2’ °C / min 65°C 8 → 110°C
651108
3 minuten
°C / min 110°C 10 → 230°C
23 minuten
/ min 230°C 50 °C → 300°C
300°C 2’
23
3.6. METHODEVALIDATIE 3.6.1.Precisie De precisie van een analytische methode omschrijft de variatie op de metingen van een bepaald staal wanneer dit onder herhaalbaarheidsvoorwaarden wordt geanalyseerd. Dit betekent dat een meervoudige analyse wordt uitgevoerd onder identieke meetvoorwaarden van één bepaald staal via de bekomen methode door eenzelfde persoon. Om een betrouwbaar resultaat te bekomen moet de precisie bepaald worden op een minimum van 5 metingen van hetzelfde staal.
De precisie werd getest door 50 µl plasma te belasten met 12,5 of 100 µl mix en dit op de kolom te brengen na staalvoorbereiding. Daarvan werd een vijfvoudige analyse uitgevoerd onder herhaalbaarheidsvoorwaarden. Van elke component werd het gemiddelde van de 5 metingen, de standaarddeviatie en de variatiecoëfficiënt (VC) bepaald (vergelijking 3.3). Een goede precisie vereist een VC die lager is dan 15% (FDA Guidance for industry: bioanalytical method validation, 2001).
VC (%) =
STDEV x 100 GEM
(3.3)
Waarin: STDEV : standaarddeviatie GEM: gemiddelde
24
4. RESULTATEN EN DISCUSSIE 4.1. ONTWIKKELING VAN EEN SIM-METHODE 4.1.1.Algemeen De registratie van een massaspectrum kan zowel in de scan- als in de SIM-modus gebeuren. De massafilter die gebruikt werd, was een quadrupool (Figuur 4.1). Deze heeft 4 parallelle hyperbolische staven waarvan op het ene paar een positieve gelijkspanning wordt gebracht en op het andere paar een negatieve gelijkspanning. Er wordt ook een regelbare wisselspanning aangesloten op beide paren waardoor een elektromagnetisch veld ontstaat. Deze wisselspanning kan zo geregeld worden dat enkel ionen met een bepaalde m/z waarde de detector kunnen bereiken (Rood, 1999).
Een eerste stap in de ontwikkeling van een SIM-methode voor de bepaling van de componenten in een plasmastaal, is de bepaling van elke component afzonderlijk in een scanmodus. Daarbij wordt de wisselspanning op de quadrupool continu gevarieerd en zullen ionen met toenemende m/z waarde doorgelaten worden naar de detector. Bij een opname in scanmodus worden alle m/z waarden geregistreerd alsook hun intensiteit in functie van de wisselspanning. De detector zal dan de ionen omzetten in een elektrisch signaal dat evenredig is met de intensiteit van de ionenstroom. Daaruit wordt een massaspectrum bekomen dat de intensiteit van de ionenstroom uitzet t.o.v. de m/z waarde.
FIGUUR 4.1.: SCHEMATISCHE VOORSTELLING VAN DE WERKING VAN EEN QUADRUPOOL (http://elchem.kaist.ac.kr/vt/chem-ed/ms/quadrupo.htm)
25
4.1.2. Full-scan monitoring De analyse van de standaarden van elke component in de full-scan modus leverde voor elke molecule een chromatogram op waaruit het massaspectrum van elke piek kon gereconstrueerd worden. Een overeenkomst van de m/z waarden in de gereconstrueerde massaspectra met de fragmentionen van een bepaalde component leverde het bewijs van detectie van volgende moleculen: GBL en gederivatiseerd GHB, BHB, GABA, vigabatrine, L-glutaminezuur en gabapentine. Bij injectie van gederivatiseerd SSA en 1,4-butaandiol werden geen pieken teruggevonden die van deze moleculen afkomstig konden zijn. Deze componenten werden dan ook weggelaten voor verdere bepalingen.
Nadat elke standaard afzonderlijk werd bepaald via GC-MS in de scan-modus, werd een mix gemaakt waarin elke component in een concentratie van 40 ng/µl aanwezig was (uitgezonderd gabapentine, dat aanwezig was in een concentratie van 4 ng/µl) om een simultane detectie van elke component te bekomen. Op het Total Ion Chromatogram (TIC) (Figuur 4.2) is duidelijk te zien dat de laagkokende componenten BHB en GHB het hoogste signaal geven. Verder zijn er ook pieken te zien die niet afkomstig zijn van de geanalyseerde componenten. Sommige van deze pieken zorgen zelfs voor interferenties, zoals bijvoorbeeld bij BHB. In Figuur 4.3 zijn de massaspectra van de gederivatiseerde componenten te zien met hun onderlijnde quantifier en qualifier ionen.
FIGUUR 4.2. TIC VAN DE MIX IN PLASMA, BEPAALD IN DE SCAN MODUS
26
(A) Abundance 42 44000 42000 40000 38000 36000 34000 32000 30000 28000 26000 24000 22000 20000 18000 16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 m/z-->
GBL 86 56
40
50
60
70
207 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210
80
(B) Abundance 69 130000 120000 110000 100000 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000
227
BHB
43
113 127
56
141 183
82 95 0
40
60
80
154 169
100
120
140
160
180
240 253 269 207 200
220
297 240
260
280
300
321 338 320
340
m/z--> (C) Abundance 69 400000
183 227
350000 242
GHB
300000 250000 40 200000 113
155
150000 269 100000
55 99
50000
85 0
m/z-->
40
60
80
207 127 141
169
283
321
363
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360
FIGUUR 4.3. MASSASPECTRA VAN DE GEDERIVATISEERDE STANDAARDEN (UITZ. GBL) VAN ELKE COMPONENT, BEPAALD IN DE SCANMODUS (QUANTIFIER EN QUALIFIER IONEN VET EN ONDERLIJND)
27
(D) Abundance 126 950000 900000 850000 800000 750000 700000 650000 600000 550000 500000 450000 400000 350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000
69
182
GABA
140 154 41 227 268 24 207 284 312 342 362 381 411 9 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 95
0 m/z--> (E) Abundance
152 1800000 1700000 1600000 1500000 1400000 1300000 1200000 1100000 Vigabatrine 1000000 900000 800000 700000 600000 67 500000 165 95 208 400000 300000 113 200000 41 132 179 253 294 100000 233 275 310 338 368 389 407 0 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 m/z--> (F) Abundance 152 900000 800000 700000 600000
L-glutaminezuur
500000 400000 180 300000 200000
69
100000
41 0
50
380 207
113 100
150
200
239 266 250
310 346 300
350
408 400
470
450
510
500
560 588
550
m/z-->
FIGUUR 4.3. VERVOLG: MASSASPECTRA VAN DE GEDERIVATISEERDE STANDAARDEN VAN ELKE COMPONENT, BEPAALD IN DE SCANMODUS (QUANTIFIER EN QUALIFIER IONEN VET EN ONDERLIJND)
28
(G) Abundance 81 5000000 4500000 4000000 3500000 3000000 2500000
208
2000000
123 323
1000000 500000 0 m/z-->
Gabapentine
250
1500000
54 153 60
380
449
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
FIGUUR 4.3. VERVOLG: MASSASPECTRA VAN DE GEDERIVATISEERDE STANDAARDEN VAN ELKE COMPONENT, BEPAALD VIA DE SCANMODUS (QUANTIFIER EN QUALIFIER IONEN VET EN ONDERLIJND)
4.1.3. SIM-monitoring SIM is een methode waarbij de intensiteit van één of een beperkt aantal m/z waarden wordt geregistreerd door de wisselspanning op de quadrupool constant te houden of die over een beperkt aantal waarden te laten variëren. Op die manier worden slechts één of een beperkt aantal ionen doorgelaten naar de detector. De detectiegevoeligheid in de SIM-modus is veel groter dan die in de scan-modus omdat de massaspectrometer meer tijd per m/z waarde spendeert en zo op een gevoeliger manier bepaalde ionen kan registreren. Hierdoor is er minder staal nodig om een signaal te verkrijgen.
Een optimale SIM-methode registreert zo weinig mogelijk m/z waarden om een zo hoog mogelijke selectiviteit en gevoeligheid te bekomen. De m/z waarden die hiervoor in aanmerking komen, moeten voldoen aan volgende voorwaarden: een voldoende intensiteit en zo hoog mogelijke m/z waarden. Het is van belang dat de intensiteit hoog genoeg is met het oog op maximale gevoeligheid. Hoge m/z waarden zorgen op hun beurt voor een maximale selectiviteit, aangezien de kans op het voorkomen van deze m/z waarde in co-eluerende componenten omgekeerd evenredig is met de grootte van de m/z waarden (Wille, 2008).
29
Uit de reconstructie van de massaspectra van de componenten, bepaald in de scanmodus, werden de 3 meest geschikte ionen gehaald, nl. 1 quantifier en 2 qualifier ionen. Het quantifier ion is het ion dat voor kwantitatieve bepalingen zal gebruikt worden. Het is dat ion dat met de hoogste intensiteit aanwezig is, maar dat niet uitsluitend afkomstig hoeft te zijn van de component in kwestie. De 2 qualifier ionen daarentegen hebben niet de hoogste intensiteit maar zijn wel met absolute zekerheid enkel afkomstig van die molecule. Deze zullen dus gebruikt worden ter bevestiging van de aanwezigheid van de component in het plasmastaal (Van hee et al., 2004).
Het resultaat van de bepaling van alle componenten uit de mix in de SIM-modus is te zien op Figuur 4.4. Hierop is te zien dat de interfererende pieken volledig verdwenen zijn.
FIGUUR 4.4. TIC VAN DE MIX, BEPAALD VIA DE SIM-METHODE
30
4.2. OPTIMALISATIE VAN DE GC-MS METHODE De eerste analyses gebeurden allen via een vaste GC-MS methode, met een welbepaald temperatuursprogramma, injectietemperatuur, enz... De optimalisatie van deze GC-MS methode heeft als doel een optimale resolutie te bekomen in een zo kort mogelijke run. Om hiertoe te komen, kunnen verschillende GC-MS parameters aangepast worden die opgedeeld kunnen worden in 2 grote groepen: staalintroductie en scheiding op de kolom.
4.2.1. Staalintroductie Als introductiemethode voor de stalen werd voor een splitless injectie gekozen, waarbij het grootste deel van het verdampte staal op de kolom terecht komt. Splitless injectie is geschikt voor analyses van kleine hoeveelheden (ng) per injectievolume van 1 µl. De keuze voor een splitless injectie ligt ook deels aan het feit dat er ‘vuile’ stalen zoals plasmaextracten worden geïnjecteerd. Bij een splitless injectie blijft het onverdampte materiaal in de injector, terwijl het bij een cold on-column injectie rechtstreeks op de kolom terecht komt. Deze raakt hierdoor sneller vervuild en kan bijgevolg minder lang gebruikt worden (Grob, 1993). De splitless injectietechniek werd verder geoptimaliseerd door het veranderen van een aantal parameters om zo resultaten te bekomen met een optimale resolutie en de hoogste piekoppervlakte.
4.2.1.1. Solvent Bij de eerste analyses werd hexaan als solvent gebruikt. Een temperatuursprogramma moet steeds gestart worden bij een temperatuur die ongeveer 20°C lager ligt dan het kookpunt van het solvent (Schomburg, 1990). Gezien hexaan een kookpunt heeft van 69°C, bedroeg de starttemperatuur 45°C. Aangezien deze lage starttemperatuur aanleiding gaf tot een lange run werden ethylacetaat en tolueen als solvent uitgeprobeerd. Omdat ethylacetaat een kookpunt heeft van 77,1°C en tolueen een kookpunt van 111 °C kon het temperatuursprogramma gestart worden bij respectievelijk 60 en 90°C.
Voor de laagkokende componenten BHB en GHB bleek hexaan het beste solvent, voor de hoogkokende was ethylacetaat beduidend beter. De optie om tolueen als solvent te gebruiken werd onmiddellijk verworpen aangezien de laagkokende componenten GBL en BHB ondetecteerbaar waren.
31
Aangezien het verschil tussen ethylacetaat en hexaan bij de hoogkokende componenten het grootst was en de respons van BHB en GHB bij beide solventen voldoende hoog was, werd ethylacetaat als solvent gekozen. Een bijkomend voordeel van het gebruik van ethylacetaat is de kortere duur van de run waardoor meerdere stalen binnen een bepaalde tijdsspanne bepaald kunnen worden.
4.2.1.2. Injectietemperatuur Om de componenten volledig en zo snel mogelijk te verdampen zonder degradatie moet de injectietemperatuur hoog genoeg zijn. Een te lage injectietemperatuur zal immers voor een onvolledige verdamping zorgen. Vooral de hoogkokende verbindingen zullen dan gediscrimineerd worden of tailende pieken vertonen (Rood, 1999). Een injectietemperatuur rond 250°C wordt vaak gebruikt bij een methodeontwikkeling voor nieuwe componenten. De componenten werden zowel in hexaan als ethylacetaat bepaald bij de volgende injectietemperaturen: 200, 250 en 300 °C .
Op Figuur 4.5 zien we dat er weinig verschil is in piekoppervlakte bij het gebruik van verschillende injectietemperaturen wanneer de componenten opgelost zijn in hexaan. Vooral BHB en GHB geven hoge signalen. De hoogkokende componenten daarentegen geven een zwakkere respons. Als dan naar Figuur 4.6 gekeken wordt, valt het onmiddellijk op dat de hoogkokende componenten een hogere respons geven bij het gebruik van ethylacetaat als solvent.
Een vergelijking maken tussen de piekoppervlakten bij beide solventen is echter niet betrouwbaar. De resultaten zijn immers afkomstig van 2 verschillende stalen zonder het gebruik van een interne standaard, aangezien deze nog niet beschikbaar was. Een conclusie op vlak van het verschil in piekoppervlakte bij beide solventen is dus niet gegrond. Daarom werd besloten verder te werken met ethylacetaat als solvent op basis van de chromatografie. Deze was bij het gebruik van ethylacetaat efficiënter door de scherpere en minder tailende pieken.
32
Injectietemperatuur (hexaan) 25000000
piekoppervlakte
20000000
15000000 200°C 250°C 300°C 10000000
5000000
0 BHB
GHB
GABA
viga
L-glut
gabap
FIGUUR 4.5.: VERGELIJKING VAN DE PIEKOPPERVLAKTE BIJ VERSCHILLENDE INJECTIETEMPERATUREN, WAARBIJ DE COMPONENTEN HEROPGELOST ZIJN IN HEXAAN (n=3, gemiddelde +/- standaarddeviatie)
Injectietemperatuur (ethylacetaat) 16000000
14000000
12000000
piekoppervlakte
10000000 200°C 250°C 300°C
8000000
6000000
4000000
2000000
0 BHB
GHB
GABA
vigabatrine
L-glutaminezuur
gabapentine
FIGUUR 4.6.: VERGELIJKING VAN DE PIEKOPPERVLAKTE BIJ VERSCHILLENDE INJECTIETEMPERATUREN, WAARBIJ DE COMPONENTEN HEROPGELOST ZIJN IN ETHYLACETAAT (n=3, gemiddelde +/- standaarddeviatie) 33
Een injectietemperatuur van 200°C werd uitgesloten omdat deze temperatuur te laag was voor de verdamping van gabapentine en deze bijgevolg niet gedetecteerd kon worden (Figuur 4.6). Verder was er geen groot verschil op te merken tussen een injectietemperatuur van 250 of 300 °C. Aangezien de signalen van BHB en GHB bij 300°C het laagst waren, werd geopteerd om verder te werken met een injectietemperatuur van 250°C.
Ter
controle
werd
een
bijkomende
analyse
uitgevoerd
met
het
volgende
temperatuursprogramma: gedurende 1 minuut een starttemperatuur van 50°C gevolgd door een stijging van 12,5°C/min tot 300°C. Deze temperatuur werd nog 10 min aangehouden. Vervolgens werd naar de retentietijd van de hoogstkokende component, in dit geval gabapentine, gekeken en uitgerekend bij welke temperatuur die elueerde. De ideale injectietemperatuur moet dan minstens 50°C hoger liggen dan de elutietemperatuur van die hoogstkokende component (Grob, 1993). Volgens de berekeningen zou de ideale injectietemperatuur minimum 233°C moeten zijn, aangezien de elutietemperatuur van gabapentine 183°C bedroeg. De gekozen temperatuur van 250°C is dus ideaal om mee verder te werken.
4.2.1.3. Purge activation time De purge activation time is het tijdstip waarop de split line geopend wordt bij splitless injectie. Een te vroege opening van de klep leidt tot staalverlies en een te late opening heeft als gevolg dat de solventpiek breder is en de componenten meer tijd hebben om te degraderen en te adsorberen aan de liner (Wille, 2008). Het is dus van belang dat de purge activation time zorgvuldig gekozen wordt.
De beste purge activation time is afhankelijk van de flow rate van het draaggas. De split line mag pas geopend worden wanneer ongeveer 1 tot 1,5 linervolumes van het draaggas de injector verlaten hebben. Uit het experiment waarin de verschillende flow rates werden getest, bleek een flow rate van 1,3 ml/min het beste te zijn (cf. 4.2.2.2.). Het invullen van deze waarde in vergelijking 3.1 en vermenigvuldiging van die uitkomst met 1 en 1,5 resulteerde in een purge activation time van respectievelijk 45 en 70 sec. De optimale purge activation time bevindt zich dus in principe binnen deze range. De stalen werden na staalvoorbereiding geïnjecteerd bij volgende purge activation times: 45, 60, 75, 90 en 120 sec.
34
Op Figuur 4.7 is te zien dat de piekoppervlakten van elke component bij de verschillende purge activation times zeer gelijkaardig zijn. In dit geval wordt er vnl. gekeken naar de chromatografie. De pieken van GBL bij de purge activation times van 45, 60 en 75 sec vertoonden zeer veel tailing. Een purge activation time van 90 sec werd geselecteerd aangezien deze aanleiding gaf tot de minste tailing voor elke component en een voldoende hoog signaal.
Purge activation time 3000000
2500000
piekoppervlakte
2000000 45 sec 60 sec 75 sec 90 sec 120 sec
1500000
1000000
500000
0 GBL
BHB
GHB
GABA
Vigabatrine
L-glutaminezuur
gabapentine
FIGUUR 4.7: GRAFIEK VAN DE PIEKOPPERVLAKTE VAN ELKE COMPONENT I.F.V. DE PURGE ACTIVATION TIME (n=3, gemiddelde +/- standaarddeviatie)
4.2.1.4. Pulsed splitless injectie en pulse tijd Volgens Grob (1993) is de druk tijdens de injectie van groot belang om de verdampte stalen snel op de kolom te brengen. Een snelle transfer resulteert immers in een hoge efficiëntie en minder staal dat vertraagd op de kolom terecht komt. Hoe langer een staal in de liner blijft, hoe breder de ‘wolk’ van verdampte moleculen als resultaat van diffusie. Een te lage druk bij injectie kan op die manier leiden tot onvolledige staaloverdracht op de kolom en brede pieken. Door de injectiedruk te verhogen, wordt de initiële band die op de kolom terecht komt smaller, wat op zijn beurt leidt tot smallere pieken. Een constante hoge gasflow resulteert echter in een slechtere resolutie. 35
Een manier om een zo snel mogelijke staaltransfer én een goede resolutie te krijgen, is de druk tijdens injectie tijdelijk te verhogen en nadien tot een ideale gasflow te reduceren. Deze techniek wordt pulsed splitless injectie genoemd (Rood, 1999).
Bij een pulsed splitless injectie wordt een tijdelijke drukverhoging toegepast tot 25 psi voor een flow rate van 1,3 ml/min, die op een bepaald moment terug zakt naar een druk van 11,8 psi. Het tijdstip waarop de druk terug gereduceerd wordt, is de pulse tijd. Een blijvende verhoogde druk zou immers zorgen voor een te hoge gassnelheid waardoor de componenten niet optimaal gescheiden worden. De pulse tijd moet ongeveer 0,1 tot 0,5 min langer zijn dan de purge activation time om te voorkomen dat de druk zakt terwijl de split line geopend wordt.
Aangezien er weinig verschil te zien was in de chromatografie en de piekoppervlakte tussen een purge activation time van 90 en 120 sec, werd geopteerd 4 pulse tijden te testen i.p.v. 2, om absoluut zeker te zijn dat de gekozen purge activation time van 90 sec de beste was. Bij een purge activation time van 90 sec (1,5 min) werden volgende pulse tijden getest: 1,6 min en 2 min. Voor een purge activation time van 120 sec (2 min) testten we pulse tijden van 2,1 en 2,5 min.
Pulse time 2500000
piekoppervlakte
2000000
1500000 1,6 min 2 min 2,1 min 2,5 min 1000000
500000
0 GBL
BHB
GHB
GABA
Vigabatrine
L-glutaminezuur
gabapentine
FIGUUR 4.8: GRAFIEK VAN DE PIEKOPPERVLAKTE VAN ELKE COMPONENT I.F.V. VERSCHILLENDE PULSE TIJDEN (n=3, gemiddelde +/- standaarddeviatie) 36
Op Figuur 4.8 is te zien dat GBL niet gedetecteerd werd bij een purge activation time van 2 min en de bijhorende pulse tijden van 2,1 en 2,5 min. Hieruit besloten we om definitief verder te werken met een purge activation time van 90 sec.
Figuur 4.8 toont ook weinig verschil aan in piekoppervlakte tussen de pulse tijden van 1,6 en 2 min. Ook de chromatografie leverde geen duidelijk onderscheid op tussen deze pulse tijden. De keuze is uiteindelijk gevallen op een pulse tijd van 2 min.
Vertrekkend van de gekozen pulse tijd van 2 min werden verschillende drukverhogingen uitgetest, nl. een drukstijging van 11,8 psi tot 20, 25 en 30 psi. Deze werden vergeleken met een analyse zonder pulsed splitless injectie. Figuur 4.9 toont aan dat er opnieuw weinig verschil is in piekoppervlakte. Aangezien er uit deze grafiek geen duidelijk besluit kan getrokken worden omtrent de keuze van een pulsed splitless injectie of niet, brengt een overlap van de chromatogrammen een duidelijker beeld (Figuur 4.10). Hierop is te zien dat de componenten een hoger signaal geven indien geen pulsed splitless injectie wordt gebruikt.
Pulsed splitless: drukverhogingen 3000000
2500000
piekoppervlakte
2000000
20 psi 25 psi 30 psi 11,8 psi
1500000
1000000
500000
0 GBL
BHB
GHB
GABA
Vigabatrine
L-glutaminezuur
gabapentine
FIGUUR 4.9.: VERGELIJKING VAN DE VERSCHILLENDE DRUKVERHOGINGEN BIJ EEN PULSED SPLITLESS INJECTIE MET EEN INJECTIE ZONDER PULSED SPLITLESS (n=3, gemiddelde +/- standaarddeviatie)
37
(A)
(B)
FIGUUR 4.10 ANALYSE VAN (A): GBL, BHB EN GHB EN (B): GABA, VIGABATRINE, L-GLUTAMINEZUUR EN GABAPENTINE MET EEN PULSED SPLITLESS INJECTIE EN EEN NIET-PULSED SPLITLESS INJECTIE (BLAUW= DRUKVERHOGING TOT 30 PSI, ZWART= DRUKVERHOGING TOT 25 PSI, GROEN= DRUKVERHOGING TOT 20 PSI, ROOD= NIET-PULSED SPLITLESS INJECTIE).
38
Het verschil tussen een pulsed en een niet-pulsed splitless injectie valt het meest op bij de laagkokende componenten. Deze elueren sneller wanneer ze geïnjecteerd worden via een pulsed splitless injectie met een drukverhoging tot 30 psi maar geven een hoger signaal bij een niet-pulsed splitless injectie. Het gebruik van een pulsed splitless injectie biedt dus in feite geen voordeel ten opzichte van een niet pulsed splitless injectie. Het verschil in elutietijd bedraagt maximaal een halve minuut en dit verschil weegt niet op tegen het feit dat een pulsed splitless injectie gepaard gaat met een verlies in gevoeligheid.
4.2.2. Scheiding op de kolom 4.2.2.1. Kolomkeuze De kolom
die gebruikt
werd
voor de analyses
was
een
HP-5MS
(5%
phenylmethylpolysiloxaan) capillaire kolom. Een capillaire kolom is opgebouwd uit een polyimide coating langs de buitenzijde en fused silica gecoat met de stationaire fase langs de binnenzijde. Aangezien de stationaire fase dus eigenlijk een geïmmobiliseerde vloeistof is, wordt er gesproken van gas-vloeistofchromatografie (GLC). Het gebruik van een capillaire kolom kent een aantal belangrijke voordelen boven een gepakte kolom (Held, 2008).
Het belangrijkste kenmerk van een capillaire kolom is zijn zeer grote scheidingskracht ten gevolge van zijn hoge efficiëntie waardoor de pieken veel smaller zijn dan die bij gebruik van een gepakte kolom (Held, 2008). Er werd specifiek gekozen voor een HP-5MS kolom omdat deze kolom zeer vaak gebruikt wordt in klinisch en forensisch onderzoek.
Deze kolom is zeer geschikt voor het gebruik van MS als detectiemethode omdat ze zeer weinig bleeding6 vertoont. Met een lengte van 30 m, een interne diameter van 0,25 mm en een filmdikte van 0,25 µm leverde deze kolom analyses met een goede resolutie en accepteerbare retentietijden en piekvormen.
6
Stijgende basislijn door elutie van degradatieproducten van de stationaire fase bij te hoge temperaturen
39
4.2.2.2. Draaggas en flow rate Het type draaggas en de snelheid waarmee het door de kolom gaat, heeft een grote invloed op de resolutie en de retentietijden. Heliumgas wordt beschouwd als één van de beste keuzes als draaggas voor een capillaire kolom. Het doel van de optimalisatie van de flow rate is die waarde te vinden die zorgt voor een snelle analysetijd en een goede resolutie (Schomburg, 1990).
De flow rate is het volume gas dat per tijdseenheid door de kolom stroomt en bepaald wordt uit de lineaire gassnelheid (ū). Dit is de snelheid waarmee het draaggas door de kolom gaat en deze ligt voor een kolom van 30 m x 0,25 mm I.D. x 0,25 µm filmdikte het best tussen 30 en 40 cm/sec (Rood,1999). De omzetting van deze lineaire gassnelheden naar flow rates levert een range op waartussen de ideale flow rate verondersteld wordt te liggen, nl. tussen 0,7 en 1,5 ml/min. Binnen deze range werden de flow rates gevarieerd tussen 0,9; 1; 1,1 en 1,3 ml/min.
De flow rate van 1,3 ml/min werd geselecteerd als beste keuze omwille van de performante chromatografie (smalle pieken zonder tailing). Een flow rate van 0,7 ml/min viel direct af omdat GBL niet meer gedetecteerd werd (Figuur 4.11).
Flow rate 3000000
2500000
piekoppervlakte
2000000 0,7 ml/min 0,9ml/min 1 ml/min 1,1 ml/min 1,3ml/min 1,5 ml/min
1500000
1000000
500000
0 GBL
BHB
GHB
GABA
Vigabatrine
L-glutaminezuur
gabapentine
FIGUUR 4.11.: GRAFIEK VAN DE PIEKOPPERVLAKTE I.F.V. DE FLOW RATE (n=3, gemiddelde +/- standaarddevatie) 40
4.2.2.3. Optimalisatie van het temperatuursprogramma Om het staal in een korte band te focussen aan het begin van de kolom doet men beroep op het solvent effect. Een goed solvent effect wordt bekomen door de initiële starttemperatuur van het temperatuursprogramma 20°C onder het kookpunt van het solvent te houden (Schomburg, 1990). Op die manier zal het solvent condenseren in een dunne film aan het
begin van de kolom. De componenten die dan op de kolom terecht komen, zullen ‘gevangen’ worden in de solventfilm. Zo wordt het geïnjecteerde staal over een korte lengte op de kolom gebracht, waardoor de efficiëntie verhoogt.
Daarna wordt de temperatuur opgedreven en zal het solvent eerst verdampen (Schomburg, 1990). De overblijvende componenten blijven dan achter in een smalle band.
Wanneer de kolomtemperatuur nog verder opgedreven wordt, zullen de componenten gescheiden worden door vervluchtiging op verschillende tijdstippen, afhankelijk van hun kookpunt.
Aangezien ethylacetaat als solvent gebruikt wordt, zal het temperatuursprogramma moeten starten bij 60 à 65°C. De componenten verdampen echter bij wijd uiteenlopende temperaturen waardoor het onmogelijk is een isotherme run te doen. De hoogkokende componenten zouden immers zeer lange retentietijden en brede pieken hebben (Schomburg, 1990). Werken met een temperatuursgradiënt biedt hier de oplossing.
Er werden verschillende temperatuursprogramma’s uitgetest (cf. Tabel 3.2) en het volgende bleek het beste te zijn: de starttemperatuur werd vastgelegd op 65°C gedurende 1,5 minuut, waarna de temperatuur werd opgedreven aan 5°C/min tot 95°C. Daarna werd verder verhoogd aan 30°C/min tot een temperatuur van 300°C die 2 min werd aangehouden.
Zoals te zien op Figuur 4.12 leverde dit temperatuursprogramma niet altijd de grootste piekoppervlakten op. Het waren de beduidend smallere pieken en de basisresolutie die de doorslag gaven dit temperatuursprogramma te verkiezen boven de andere. Ook de tijdsbesparing door de korte duur van de run is een belangrijk voordeel.
41
Piekoppervlakte i.f.v. temperatuursprogramma 3500000
3000000
piekoppervlakte
2500000
65300810 651108 65155 603001050 65595
2000000
1500000
1000000
500000
0 BHB
GHB
GABA
Vigabatrine
L-glutaminezuur
gabapentine
FIGUUR 4.12: GRAFIEK DIE DE PIEKOPPERVLAKTEN VERGELIJKT BIJ VERSCHILLENDE TEMPERATUURSPROGRAMMA’S (n=3, gemiddelde +/standaarddevatie)
De SIM-methode die geoptimaliseerd werd op vlak van alle voorgaande parameters is deze die definitief verder gebruikt zal worden. In Tabel 4.1 zijn de eigenschappen terug te vinden van elke component wanneer deze bepaald worden via deze methode.
TABEL 4.1.: EIGENSCHAPPEN VAN ELKE COMPONENT BIJ BEPALING MET DE FINALE SIM-METHODE
Component
GBL BHB GHB GABA Vigabatrine L-glutaminezuur Gabapentine
Moleculair gewicht (g/mol) niet gederivatiseerd
gederivatiseerd
86 104 104 103 129 147 171
n.v.t. 382 382 381 407 607 449
Quantifier ion
42 227 227 126 152 152 208
Qualifier ionen ion 1
ion 2
56 141 183 140 165 180 250
86 240 242 154 338 380 323
Retentietijd (min)
3,86 4,71 6,32 9,45 9,75 10,36 11,26
42
4.3. METHODEVALIDATIE Wanneer een methode ontwikkeld wordt voor de bepaling van componenten in een bepaalde biologische matrix, dient een bioanalytische methodevalidatie uitgevoerd te worden. Deze toont aan of de methode betrouwbaar en reproduceerbaar is voor het vooropgestelde doel. De belangrijkste parameters voor de methodevalidatie zijn: accuraatheid, selectiviteit, gevoeligheid, reproduceerbaarheid, stabiliteit en precisie (FDA Guidance for industry: bioanalytical method validation, 2001).
4.3.1. Precisie Bij het testen van de precisie onder herhaalbaarheidsvoorwaarden wordt een maat voor de spreiding van de meetwaarden bekomen. Hiervoor worden een aantal metingen uitgevoerd van hetzelfde staal door eenzelfde persoon met dezelfde methode en apparatuur en binnen een korte tijdsspanne.
Deze test werd uitgevoerd om te bepalen of de geoptimaliseerde SIM-methode herhaalbaar is. In principe zou een vijfvoudige analyse van eenzelfde staal moeten resulteren in identieke chromatogrammen. Figuur 4.13 levert inderdaad het bewijs dat de chromatogrammen van de 5 metingen nagenoeg overeenstemmen met elkaar.
Ter controle werd de variatiecoëfficiënt van de 5 analyses voor elke component bepaald en deze bleek maximaal 4,36 % te zijn (voor L-glutaminezuur). Deze waarde ligt ver onder de grens van 15%, wat wil zeggen dat de methode een goede precisie heeft (FDA Guidance for industry: bioanalytical method validation, 2001).
Er werd exact dezelfde procedure toegepast wanneer 5 ng op de kolom werd gebracht i.p.v. 40 ng en ook hier bleek de geoptimaliseerde SIM-methode een goede precisie onder herhaalbaarheidsvoorwaarden te hebben.
43
(A)
(B)
FIGUUR 4.13: OVERLAP VAN DE CHROMATOGRAMMEN NA VIJFVOUDIGE ANALYSE VAN (A): 40 NG GBL, BHB EN GHB en (B): 40 NG GABA, VIGABATRINE, L-GLUTAMINEZUUR EN GABAPENTINE ONDER HERHAALBAARHEIDSVOORWAARDEN
44
5. CONCLUSIE Er werd een GC-MS SIM-methode ontwikkeld voor de simultane bepaling van GBL en gederivatiseerd BHB, GHB, GABA, vigabatrine, L-glutaminezuur en gabapentine. De detectie van SSA en 1,4-butaandiol was niet mogelijk via deze methode.
Eerst werden de qualifier ionen en het quantifier ion per component bepaald. Daarna werd de methode verder geoptimaliseerd. Ethylacetaat bleek efficiënter te zijn als solvent dan hexaan, waardoor het temperatuursprogramma kon gestart worden bij 65°C. Volgend temperatuursprogramma werd gebruikt: de initiële kolomtemperatuur was 65°C gedurende 1,5 min, waarna de temperatuur werd opgedreven aan 5°C/min tot 95°C. Daarna steeg de temperatuur aan 30°C/min tot 300°C, en deze werd nog 2 min aangehouden.
Er werd gekozen voor een splitless injectie met een injectietemperatuur van 250°C. Als carriergas werd helium gebruikt met een flow rate van 1,3 ml/min. Op basis van deze flow rate werd een purge activation time gekozen van 1,5 min.
De retentietijden van GBL, BHB, GHB, GABA, vigabatrine, L-glutaminezuur en gabapentine zijn na analyse met de geoptimaliseerde methode respectievelijk 3,86; 4,71; 6,32; 9,45; 9,75; 10,36 en 11,26 min. Een belangrijk voordeel van de geoptimaliseerde SIMmethode is dat de duur van een run gedaald is van 23,3 naar 16,8 min, wat een aanzienlijke besparing in tijd betekent.
De variatiecoëfficiënt die per component berekend werd op 5 metingen onder herhaalbaarheidsvoorwaarden bedroeg maximaal 4,36 %. Deze waarde ligt ver onder de grens van 15%, waardoor we kunnen besluiten dat de methode een goede precisie heeft.
In de toekomst moet er vooral aandacht besteed worden aan de componenten die tot op heden nog niet gedetecteerd werden via deze methode, bvb. 1,4-butaandiol. Deze precursor van GHB wordt immers ook vaak gebruikt in het drugsmilieu en het is dus van belang ook hiervoor een geschikte detectiemethode te vinden.
45
Voor de optimalisatie van de derivatisatieprocedure is er een geschikte interne standaard nodig die toelaat de verschillende stalen met elkaar te vergelijken. Met behulp van deze interne standaard en de stockoplossingen van elke component kunnen calibratiecurves opgesteld worden. Deze kunnen dan verder gebruikt worden voor de kwantificatie van de componenten in forensische stalen.
Ook de methodevalidatie kan nog verder uitgewerkt worden, o.a. op vlak van accuraatheid, reproduceerbaarheid, selectiviteit en gevoeligheid. Ook hiervoor is het gebruik van een interne standaard vereist. Verder is het ook belangrijk de stabiliteit van een gederivatiseerd staal te kennen wanneer het gedurende een bepaalde tijd bij kamertemperatuur blijft staan. Het kan namelijk een aantal uur duren alvorens een staal geanalyseerd kan worden en dan is het noodzakelijk te weten in welke mate een staal stabiel blijft.
46
6. LITERATUURLIJST
Bak, L. K.; Schousboe, A.; Waagepetersen, H. S. (2006). The glutamate/GABA-glutamine cycle: aspects of transport, neurotransmitter homeostasis and ammonia transfer. Journal of Neurochemistry, Vol. 98 (3), 641-653.
Barker, S. A.; Snead, O. C.; Poldrugo, F.; Liu, C. C.; Fish, F. P.; Settine, R. L. (1985). Identification and quantitation of 1,4-butanediol in mammalian tissues: an alternative biosynthetic pathway for gamma-hydroxybutyric acid. Biochemical Pharmacology, Vol. 34 (10), 1849-1852. Bechtel, L. K.; Holstege, C. P. (2007). Criminal poisoning: drug-facilitated sexual assault. Emergency medicine clinics of North America, Vol. 25 (2), 499-525.
Bessman, S. P.; Fishbein, W. N. (1963). Gamma-hydroxybutyrate, a normal brain metabolite. Nature, Vol. 200, 1207-&.
Blumenfeld, M.; Harmel, M. H.; Suntay, R. G. (1962). Sodium gamma-hydroxybutyric acid: a new anesthetic adjuvant. Anesthesia and Analgesia, Vol. 41 (6), 721-726.
Carai, M. A. M.; Colombo, G.; Reali, R.; Serra, S.; Mocci, I.; Castelli, M. P.; Cignarella, G.; Gessa, G. L. (2002). Central effects of 1,4-butanediol are mediated by GABA(B) receptors via its conversion into gamma-hydroxybutyric acid. European Journal of Pharmacology, Vol. 441 (3), 157-163.
Carai, M. A. M.; Lobina, C.; Maccioni, P.; Cabras, C.; Colombo, G.; Gessa, G. L. (2008). Gamma-aminobutyric acid (B) (GABA(B))-receptor mediation of different in vivo effects of gamma-butyrolactone. Journal of Pharmacologycal Sciences, Vol. 106 (2), 199-207.
De Paoli, G.; Bell, S. (2008). A rapid GC-MS determination of gamma-hydroxybutyrate in saliva. Journal of Analytical Toxicology, Vol. 32 (4), 298-302.
47
De Vriendt, C. A.; Van Sassenbroeck, D. K.; Rosseel, M. T.; Van De Velde, E. J.; Verstraete, A. G.; Vander Heyden, Y.; Belpaire, F. M. (2001). Development and validation of a highperformance liquid chromatographic method for the determination of γ-hydroxybutyric acid in rat plasma. Journal of Chromatography B, Vol. 752 (1), 85-90.
Doherty, J. D.; Snead, O. C.; Roth, R. H. (1975). A sensitive method for quantitation of γhydroxybutyric acid and γ-butyrolactone in brain by electron capture gas chromatography. Analytical Biochemistry, Vol. 69 (1), 268-277.
Drasbek, K. R.; Christensen, J.; Jensen, K. (2006). Gamma-hydroxybutyrate – a drug of abuse. Acta Neurologica Scandinavia, Vol. 114, 145-156.
Drasbek, K. R.; Vardya, L.; Delenclos, M.; Gibson, K. M.; Jensen, K. (2008). SSADH deficiency leads to elevated extracellular GABA levels and increased GABAergic neurotransmission in the mouse cerebral cortex. Journal of Inherited Metabolic Disease, Vol. 31 (6), 662-668.
Dyer, J. E.; Roth, B.; Hyma, B. A. (2001). Gamma-hydroxybutyrate withdrawal syndrome. Annals of Eemergency Medicine, Vol. 37 (2), 147-153.
Elian, A. A. (2000). A novel method for GHB detection in urine and its application in drugfacilitated sexual assaults. Forensic Science International, Vol. 109 (3), 183-187.
Elian, A. A. (2002). Determination of endogenous gamma-hydroxybutyric acid (GHB) levels in antemortem urine and blood. Forensic Science International, Vol. 128, 120-122.
Ferrara, S. D.; Zotti, S.; Tedeshi, L.; Frison, G.; Castagna, F.; Gallimberti, L.; Gessa, G. L.; Palatini, P. (1992). Pharmacokinetics of gamma-hydroxybutyric acid in alcohol dependent patients after single and repeated oral doses. British Journal of Clinical Pharmacology, Vol. 34 (3), 231-235.
48
Ferrara, S. D.; Tedeshi, L.; Frison, G.; Castagna, F.; Gallimberti, L.; Giorgetti, R.; Gessa, G. L.; Palatini, P. (1993). Therapeutic gamma-hydroxybutyric acid monitoring in plasma and urine by gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol. 11 (6), 483-487.
Food and drug administration (2001). Draft Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation.
Fraser, A. D. (2002). Clinical toxicologic implications of ethylene glycol and glycolic acid poisoning. Therapeutic Drug Monitoring, Vol. 24 (2), 232-238.
Grob, K. (1993, third edition). Split and splitless injection in capillary GC. Hüthig Buch Verlag, Heidelberg, Germany.
Halket, J. M. ; Zaikin, V. G. (2003). Derivatization in mass spectrometry – 1. Silylation. European Journal of Mass Spectrometry, Vol. 9 (1), 1-21.
Halket, J. M. ; Zaikin, V. G. (2003). Derivatization in mass spectrometry – 2. Acylation. European Journal of Mass Spectrometry, Vol. 9 (5), 421-434.
Halket, J. M. ; Zaikin, V. G. (2004). Derivatization in mass spectrometry- 3. Alkylation (arylation). European Journal of Medicine, Vol. 10 (1), 1-19.
Held, E. (2008). Interscience basiscursus chromatografie.
http://elchem.kaist.ac.kr/vt/chem-ed/ms/quadrupo.htm, geraadpleegd op 14 maart 2009.
http://www.drugs.com/pro/gabapentin.html, geraadpleegd op 23 februari 2009.
http://www.tiaft.org, geraadpleegd op 7 april 2009
http://www.usdoj.gov/dea/pubs/scheduling.html, geraadpleegd op 9 maart 2009.
49
Hennessy, S. A.; Moane, S. M.; McDermott, S. D. (2004). The reactivity of gammahydroxybutyric acid (GHB) and gamma-butyrolactone (GBL) in alcoholic solutions. Journal of Forensic Science, Vol. 49 (6), 1220-1229.
Johannessen, S.; Battino, D.; Berry, D. J.; Bialer, M.; Krämer, G.; Tomson, T.; Patsalos, P. N. (2003). Therapeutic drug monitoring of the newer antiepileptic drugs. Therapeutic Drug Monitoring, Vol. 25 (3), 347-363.
Kadiš, P.; Balažic, J.; Ferlan-Marolt, V. (1999). Alcoholic ketoacidosis: a cause of sudden death of chronic alcoholics. Forensic Science International, Vol. 103, S53-S59.
Kimura, M.; Hasegawa, Y.; Nakagawa, K.; Kajita, M.; Watanabe, K.; Yamaguchi, S. (2003). A sensitive method for 4-hydroxybutyric acid in urine using gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography B – Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, Vol. 792 (1), 141-144.
Laborit, H. (1964). Sodium 4-hydroxybutyrate. International Journal of Neuropharmacology, Vol. 3, 433-451.
Liechti, M. E.; Kunz, L.; Greminger, P.; Speich, R.; Kupferschmidt, H. (2006). Clinical features of gamma-hydroxybutyrate and gamma-butyrolactone toxicity and concomitant drug and alcohol use. Drug and Alcohol Dependence, Vol. 81 (3), 323-326.
Loscher, W. (1979). GABA in plasma and cerebrospinal-fluid of different species, effects of gamma-acetylenic GABA, gamma-vinyl GABA and sodium valproate. Journal of Neurochemistry, Vol. 32 (5), 1587-1591.
Mahmood, M.; Black, J. (2005). Narcolepsy-cataplexy: how does recent understanding help in evaluation and treatment. Current Treatment Options in Neurology, Vol. 7, 363-371.
Mesmer, M. Z.; Satzger, R. D. (1998). Determination of gamma-hydroxybutyrate (GHB) and gamma-butyrolactone (GBL) by HPLC/UV-VIS spectrophotometry and HPLC/thermospray mass spectrometry. Journal of Forensic Sciences, Vol. 43 (3), 489-492.
50
Pardi, D.; Black, J. (2006). γ-Hydroxybutyrate/Sodium oxybate: Neurobiology, and impact on sleep and wakefulness. CNS Drugs, Vol. 20 (12), 993-1018.
Paul, R.; Tsanaclis, L.; Kingston, R.; Berry, A.; Guwy, A. (2006). GC-MS-MS determination of gamma-hydroxybutyrate in blood and urine. Journal of Analytical Toxicology, Vol. 30 (6), 375-379.
Rodgers, J.; Ahston, C. H. (2004). Liquid ecstasy: a new kid on the dancefloor. The British Journal of Psychiatry, Vol. 184, 104-106.
Rood, D. (1999). A practical guide to the care, maintenance, and troubleshooting of capillary gas chromatographic systems. Wiley-VCH, Weinheim, Germany, Chapter 1 & Chapter 8.
Rose, M. A.; Kam, P. C. A. (2002). Gabapentin: pharmacology and its use in pain management. Anaesthesia, Vol. 57 (5), 451-462.
Sabucedo, A. J.; Furton, K. G. (2004). Extractionless GC/MS analysis of γ-hydroxybutyrate and γ-butyrolactone with trifluoroacetic anhydride and heptafluoro-1-butanol from aqueous samples. Journal of Separation Science, Vol. 27 (9), 703-709.
Schomburg, G. (1990). Gas chromatography, a practical course. VVH, Weinheim, Germany.
Schwartz, R. H.; Milteer, R. (2000). Drug-facilitated sexual assault (‘date rape’). Southern Medical Journal, Vol. 93 (6), 558-561.
Smith, Q. R. (2000). Transport of glutamate and other amino acids at the blood-brain barrier. Journal of Nutrition, Vol. 130 (4), 1016-1022.
Sumnall, H. R.; Woolfall, K.; Edwards, S.; Cole, C.; Beynon, C. M. (2008). Use, function and subjective experiences of gamma-hydroxybutyrate (GHB). Drug and alcohol dependence, Vol. 95, 286-290.
Tietz, N. W. (1995). Clinical guide to laboratory tests. W.B. Saunders, Philadelphia, PA.
51
Van hee, P.; Neels, H., De Doncker, M.; Vrijdags, N.; Schatteman, K.; Uyttenbroeck, W.; Hamers, N.; Himpe, D.; Lambert, W. (2004). Analysis of γ-hydroxybutyric acid, DL-lactic acid, glycolic acid, ethylene glycol and other glycols in body fluids by a direct injection gas chromatography-mass spectrometry assay for wide use. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, Vol. 45 (11), 1341-1345.
Wang, F. S.; Shanfield, H.; Zlatkis, A. (1983). Injection temperature effects using column and split sampling in capillary gas chromatography. Journal of High Resolution Chromatography & Chromatography Communications, Vol. 6 (9), 471-479.
Wille, S. (2008). Quantitative analysis of new generation antidepressants using gas chromatography-mass spectrometry. Applications in clinical and forensic toxicology. Chapter
5.
Willmore, L. J.; Abelson, M. B.; Ben-Menachem, E.; Pellock, J. M.; Shields, D. (2009). Vigabatrin: 2008 update. Epilepsia, Vol. 50 (2), 163-173.
Windholz, M.; Budavari S.; Stroumtos, L. Y.; Fertig, M. N. (1976). The Merck index, ninth edition. Merck & co., inc., Rathway, NY, USA.
Wood, M.; Laloup, M.; Samyn, N.; Morris, M. R.; de Bruijn, E. A.; Maes, R. A.; Young, M. S.; Maes, V.; De Boeck, G. (2004). Simultaneous analysis of gamma-hydroxybutyric acid and its precursors in urine using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, Vol. 1056 (1-2), 83-90.
Zvosec, D. L.; Smith, S. W. (2005). Agitation is common in gamma-hydroxybutyrate toxicity. American Journal of Emergency Medicine, Vol. 23 (3), 316-320.
Zvosec, D. L.; Smith, S. W.; McCutcheon, J. R.; Spillane, J.; Hall, B. J.; Peacock, E. A. (2001). Adverse effects, including death, associated with the use of 1,4-butanediol. New England Journal of Medicine, Vol. 344 (2), 87-94.
52
