FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2008 - 2009
BEÏNVLOEDT HET HER-2 ONCOGEN DE HORMOONGEVOELIGHEID VAN BORSTKANKER?
Evelyne UYTTERSPROT
Promotor: Prof. Dr. Veronique Cocquyt
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot
ARTS
FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2008 - 2009
BEÏNVLOEDT HET HER-2 ONCOGEN DE HORMOONGEVOELIGHEID VAN BORSTKANKER?
Evelyne UYTTERSPROT
Promotor: Prof. Dr. Veronique Cocquyt
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot
ARTS
“De auteur(s) en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.”
28 april 2009
Uyttersprot Evelyne
Prof. Dr. Veronique Cocquyt
Voorwoord Graag zou ik mijn promotor Prof. Dr. Veronique Cocquyt hartelijk willen bedanken voor haar tijd, luisterbereidheid, nuttige feedback en tips en haar aanmoedigingen bij het schrijven en realiseren van deze thesis. Eveneens bedank ik ook mijn ouders en vriend voor hun luisterend oor en bemoedigende woorden.
Inhoudsopgave
Abstract ...................................................................................................................................... 1 Inleiding ..................................................................................................................................... 2 Methodologie ............................................................................................................................. 4 Resultaten ................................................................................................................................... 5 1.
Biologie en rol van HER-2/neu. ..................................................................................... 5
2.
Biologie en rol van de oestrogeenreceptor. .................................................................... 7 2.1. De nucleaire genomische ER activiteit (NISS). .......................................................... 7 2.2. De niet-genomische membraan ER activiteit. ............................................................. 9
3.
Crosstalk tussen ER en groeifactorreceptor signaalwegen. ......................................... 10
4.
Laboratoriumstudies. .................................................................................................... 14 4.1 Mechanismen van resistentie aan Tamoxifen, een selectieve oestrogeenreceptor modulator . ....................................................................................................................... 14 4.2 Mechanismen van resistentie aan Aromatase Inhibitoren. ......................................... 20 4.3 Combinatie van Aromatase Inhibitoren en Anti-oestrogenen. ................................... 24 4.4. Trastuzumab en Lapatinib. ........................................................................................ 25
5. Klinische studies. ............................................................................................................. 28 5.1. Studies rond Aromatase Inhibitoren. ......................................................................... 28 5.1.1. Letrozole............................................................................................................. 28 5.1.2. Letrozole en Lapatinib. ...................................................................................... 32 5.1.3. Anastrozole......................................................................................................... 32 5.1.4. De Celecoxib anti-aromatase neoadjuvante studie............................................. 35 5.2. De Akt signaalweg. ................................................................................................... 35 Discussie................................................................................................................................... 38 Referenties ................................................................................................................................ 49
Abstract Borstcarcinomen zijn hormoonafhankelijke tumoren waarbij oestrogenen een belangrijke rol spelen in de ontwikkeling en progressie van de ziekte. Ondanks de duidelijk aantoonbare aanwezigheid van oestrogeenreceptoren in borsttumoren ontwikkelen verschillende patiënten resistentie tegenover antihormoonbehandelingen gebruikt als therapie voor deze tumoren. Verschillende mechanismen, waaronder HER-2, kunnen bijdragen tot het ontwikkelen van resistente borstcarcinomen. De relatie tussen ER en HER-2 en de mogelijke rol in het ontstaan van resistentie aan endocriene therapie werd in deze thesis onderzocht via cellijn en klinische studies. HER-2/neu, een receptor tyrosine kinase betrokken bij celgroei en -proliferatie, wordt in ongeveer 30% van de borsttumoren tot overexpressie wat gepaard gaat met agressievere tumoren, met een kortere overlevingstijd en met een kortere tijd tot herval. Er is een bidirectionele crosstalk tussen de oestrogeenreceptor- en de groeifactorsignaalwegen wat leidt tot verhoogde signaalactiviteit van beiden. Hierdoor verhoogt de overleving van borstkankercellen en kunnen deze potentieel meer resistent worden aan unieke vormen van endocriene therapie. Er kan nog geen eenduidig antwoord geformuleerd worden op de vraag of HER-2 de gevoeligheid voor endocriene therapieën in borstkanker beïnvloedt en via welke mechanismen precies de resistentie aan antihormoonbehandelingen plaatsvindt. Bijkomend onderzoek, zowel laboratoriumstudies als klinische trials, naar deze signaalwegen en resistentiemechanismen is nodig opdat nieuwere therapieën, therapieschema’s en combinaties van therapieën kunnen opgesteld worden waardoor de overleving en genezing van borstkankerpatiënten verbeterd kan worden.
1
Inleiding Borstcarcinomen zijn hormoonafhankelijke tumoren waarbij oestrogenen een belangrijke rol spelen in de ontwikkeling en progressie van de ziekte. Aangezien ongeveer 70% van de borsttumoren oestrogeen- (ER) en/of progesteronreceptoren (PgR) tot expressie brengen, zijn antihormoonbehandelingen een goede therapeutische aanpak in hormoonreceptor positieve borsttumoren. Deze endocriene therapieën, waaronder de selectieve oestrogeen receptor modulatoren, type Tamoxifen, de aromatase-inhibitoren (AI) en de pure ER antagonisten, hebben de genezingsratio’s, de levenskwaliteit en de ziektepreventie van borstkanker sterk verbeterd. (Massarweh and Shiff, 2006) Ondanks de duidelijk aantoonbare aanwezigheid van oestrogeenreceptoren in borsttumoren, zullen verschillende patiënten resistentie ontwikkelen tegenover deze therapieën. Deze resistentie kan de novo optreden, namelijk bij het begin van de behandeling of ze kan verworven zijn waarbij patiënten die initieel wel reageerden op therapie ziekteprogressie of herval kennen tijdens de behandeling. (Milano et al., 2006 en Massarweh and Shiff, 2006) Verschillende mechanismen zouden kunnen bijdragen tot het ontwikkelen van borsttumoren resistent aan endocriene therapie. De ER-pathway is complex en er zou bij therapieresistente borsttumoren mogelijks een relatie zijn tussen de ER-pathway en de groeifactorreceptorpathway, zoals de tyrosine kinase receptor HER-2 (Human Epidermal Growth factor receptor2; HER2/neu; ErbB2) . (Milano et al., 2006) HER-2/neu maakt deel uit van een familie van vier transmembraan receptor tyrosine kinases. Deze receptor is betrokken in de pathways van signaaltransductie die celgroei en –proliferatie reguleren. In ongeveer 30% van de borstkankers is HER-2/neu geamplificeerd of tot overexpressie gebracht. Dit zou gepaard gaan met een slechtere outcome, waaronder een kortere overlevingstijd en een kortere tijd tot herval. (Zhou and Hung, 2003) De Letrozole studie was één van de eerste neo-adjuvante dubbelblinde gerandomiseerde klinische studies die het verschil in respons wou aantonen tussen twee endocriene therapieën, namelijk Letrozole, een AI, en Tamoxifen bij post-menopauzale vrouwen met ER+ en/of PgR+ , ErbB1+ en/of ErbB2+ (of HER-2+) borsttumoren. Deze studie concludeerde dat deze tumoren beter antwoordden op een behandeling met Letrozole dan met Tamoxifen. Daarnaast 2
werd de mogelijke rol van HER-2/neu in de resistentie van hormoonreceptor positieve borsttumoren voor zowel Tamoxifen als voor Letrozole bestudeerd. Er werd een lagere respons gevonden in ErbB1+ en/of ErbB2+ tumoren voor Tamoxifen in vergelijking met ErbB1- en/of ErbB2- tumoren. In contrast bleek dat Letrozole voor zowel ErbB2+ als voor ErbB2- borsttumoren effectief was. Met andere woorden, de respons op Letrozole werd niet beïnvloed door de ErbB2 status. Bij de interpretatie van deze resultaten moet men in het achterhoofd houden dat er in deze studie maar een kleine populatie ErbB2+ tumoren was en dat dit de statistische kracht van het onderzoek kan ondermijnen. Wel kon geconcludeerd worden dat Letrozole effectiever was dan Tamoxifen in deze tumoren, dit bleek statistisch significant te zijn. Er zijn andere studies die de associatie tussen HER-2 en Tamoxifen niet hebben kunnen bewijzen, waardoor er dus geen eenduidig antwoord is over het effect van dit oncogen op de hormoongevoeligheid in borstkanker. (Ellis et al., 2001) Met deze studie als basis kunnen nog enkele vragen en doelstellingen voorop gesteld worden omtrent de mogelijke rol van het HER-2/neu oncogen in de resistentie aan Tamoxifen en andere beschikbare anti-hormoonbehandelingen in borstkanker. Via welke mechanismen beïnvloeden de HER2- en hormoonpathway elkaar? Wat zijn de bevindingen omtrent de mogelijke invloed van dit oncogen op de verschillende behandelingen bij hormoonreceptor positieve borsttumoren van zowel laboratoriumstudies, als van klinische trials? Kan HER-2 in de toekomst toegevoegd worden aan de aanwezigheid en het niveau van ER en PgR als predictieve marker voor endocriene therapieën? Tot slot kan men zich afvragen of er baat is bij het combineren van antihormonale behandelingen met therapieën specifiek gericht tegen HER-2.
3
Methodologie De bronnen en artikels voor deze thesis werden gezocht via de databanken PubMed en Web of Science beschikbaar via de site van de Universiteit Gent. Als zoektermen werden onder andere ‘estrogen receptor pathway in breast cancer’, ‘HER-2 overexpression in breast cancer’, ‘HER-2 biology’ en ‘HER-2 oncogene and resistance to endocrine therapy’ gebruikt. Uit de referentielijsten van gevonden artikels werden eveneens nieuwe bronnen gevonden. De ATAC en IMPACT trial werden via Web of Science opgezocht, de Letrozolestudie via PubMed. De zoeklimieten waren de taal, het Engels en het publicatiejaar. Artikels gepubliceerd in de afgelopen 5 jaar, van bij het begin van de thesis, werden weerhouden. Verdere selectie gebeurde bij het doornemen en lezen van de artikels. De methodologie en werkwijze van klinische trials en laboratoriumstudies werden als selectiecriterium gebruikt.
4
Resultaten
1. Biologie en rol van HER-2/neu.
HER-2 is een proto-oncogen, gelegen op chromosoom 17, dat codeert voor het HER-2 proteïne of de HER-2 receptor. Het maakt deel uit van een familie van vier transmembraan receptor tyrosine kinasen die allemaal aanwezig zijn op de celmembraan in verschillende weefsels. Activatie van deze receptoren via hun tyrosine kinase activiteit leidt tot signaaltransductie naar de nucleus. Hier worden dan genen geactiveerd waarop celdeling volgt. (Yarden, 2001 en Zhou and Hung, 2003) De activatie van HER is afhankelijk van de binding van liganden aan deze receptoren waarna de vier verschillende HER-receptoren met elkaar kunnen associëren om zowel homo- als heterodimeren te vormen. Voor HER-2 is er nog geen direct ligand gevonden, maar het kan wel als coreceptor optreden voor het vormen van heterodimeren met de andere leden van de HER-familie. Zo kan HER-2 toch deelnemen aan de signaaltransductie. Dit laatste is een interactief systeem waarbij verschillende signaalwegen geactiveerd kunnen worden. (Yarden, 2001) HER-2/neu fosforyleert verschillende downstream molecules en deze activeren op hun beurt verschillende signaalcascades. Deze zijn onder andere phosphatidylinositol-3-OH kinase (PI-3K)/Akt, mitogeen geactiveerd proteïne kinase (MAPK) en cAMP proteïne kinase A cascade. Deze signaalwegen dragen bij tot celproliferatie en celoverleving. (Zhou and Hung, 2003) HER-2 wordt voor afbraak ofwel opgenomen door vesikels die de receptor transporteren naar de lysosomen voor verdere degradatie ofwel gerecycleerd en teruggebracht naar de celmembraan. (Yarden, 2001) De HER-familie speelt een belangrijke rol tijdens de foetale ontwikkeling van het zenuwstelsel, het bot, de spieren, de huid, het hart, de longen en het intestinaal epitheel. Na de geboorte blijkt HER-2 een regulerende rol te spelen tijdens de normale borstgroei en – ontwikkeling. Overexpressie van HER-2 is geassocieerd met borstkanker. Amplificatie van het HER-2 gen leidt tot de overexpressie van de receptor waardoor de cel aan de normale controlemechanismen
ontsnapt.
Hierdoor
onstaat
de
vorming
van
agressieve
tumorcellen.(Yarden, 2001) 5
In ongeveer 20 à 30% van de borsttumoren is HER-2/neu geamplificeerd of tot overexpressie gebracht. Dit zou gepaard gaan met een slechtere outcome, waaronder een kortere overlevingstijd en een kortere tijd tot herval. (Yarden, 2001 en Zhou and Hung, 2003) De celcyclus wordt geregeld door verschillende cycline-dependente kinase (CDK) complexen. Een kenmerk van kankercellen is het falen van de controlepunten in de celcyclus. Er bestaat een verband tussen de gestegen expressie van de groei-inhibitor p21Cip1/Waf1 en de overexpressie van HER-2/neu in kankercellen. Akt, een downstream kinase dat constitutief actief is in HER-2/neu positieve borstkankercellen, fosforyleert p21Cip1/Waf1 wat leidt tot een vermindering van zijn inhiberende rol op de celgroei. Eveneens zal er via de Akt-signaalweg in HER2+ kankercellen een onderdrukking zijn van de p53 activiteit. Deze laatste is betrokken bij de activatie van genen die zorgen voor controle van de celcyclus en bij de apoptose van cellen wanneer er celschade optreedt. Er zal dus via Akt een vertraging zijn van de p53 gemediëerde apoptose. (Zhou and Hung, 2003) NF-κB speelt een rol in onder andere celproliferatie en anti-apoptose en wordt geactiveerd door verschillende stimuli waaronder cytokines en oncoproteïnen. HER-2/neu activeert deze signaalweg via Akt en dit zorgt voor de expressie van NF-κB gecontroleerde anti-apoptose genproducten. (Zhou and Hung, 2003) MAPK, betrokken in celproliferatie en –transformatie, zal ook geactiveerd worden in HER2/neu+ borstkankercellen. Het zorgt voor de associatie tussen p27Kip1, een CDK inhibitor, en zijn exporter waardoor de degradatie van deze inhibitor in het cytoplasma van de cel gefaciliteerd wordt en er dus een verlies is aan groei-inhibitie van de cel. (Zhou and Hung, 2003) Het onderdrukken van HER-2 expressie, om zo de volledige signaalcascade te blokkeren, kan gebruikt worden om de maligne groei van cellen tegen te gaan. Het gebruiken van andere moleculen in de cascade als therapiedoelwit kan onvoldoende zijn om het oncogene effect van HER-2 tegen te gaan aangezien andere moleculen de blokkade via een alternatieve weg kunnen kortsluiten. (Yarden, 2001)
6
2. Biologie en rol van de oestrogeenreceptor.
ER spelen een belangrijke sleutelrol in de ontwikkeling van het normale borstweefsel alsook in de ontwikkeling en de progressie van borstkanker. Er bestaan 2 isovormen van ER, namelijk α en β, die gecodeerd worden door 2 verschillende genen. Deze receptoren vertonen een gelijkaardige structuur, maar blijken toch verschillende functies te hebben. Zowel de α- als de β-receptoren zijn aanwezig in normaal borstweefsel, toch blijkt enkel de α-vorm belangrijk te zijn voor de normale ontwikkeling van de klieren. Een zeer sterke stijging van de ER-α vorm is aangetoond in premaligne hyperproliferatieve borstlaesies en borstkankers in vergelijking met normaal borstweefsel. Hieruit blijkt dat deze isovorm van ER een belangrijke rol speelt in de etiologie van borstkanker en de progressie ervan. (Schiff and Osborne, 2005)
2.1. De nucleaire genomische ER activiteit (NISS). De ER is voornamelijk een nucleair eiwit dat functioneert als een ligand gebonden transcriptiefactor dat zo de expressie van verschillende genen reguleert. Verschillende van deze genen hebben een direct effect op de proliferatie en overleving van borstkankercellen. Deze oestrogeenreceptor is opgebouwd uit verschillende domeinen waaronder het DNAbindend domein (DBD) en 2 domeinen verantwoordelijk voor de transcriptieactiviteit-functie (AF), namelijk AF-1 en AF-2. (zie Figuur 1, Schiff et al., 2005) Deze laatste is afhankelijk van ligandbinding, terwijl AF-1 constitutief actief is, ligand onafhankelijk en versterkt wordt door groeifactorsignalen. Het DNA-bindend domein geeft ER de mogelijkheid om te binden met specifieke sequenties van de promotors in oestrogeen regulerende genen. (Schiff et al., 2005 en Schiff and Osborne, 2005)
Figuur 1 - Structuur van ER-alfa (Schiff et al., 2005)
7
Wanneer een ligand op de receptor bindt dan zullen er specifieke conformationele veranderingen in de receptor plaatsvinden waardoor de receptor vrijgelaten wordt van zijn inhiberend complex. Eveneens zal er dimerizatie van ER plaatsvinden waardoor de binding van coregulatoire proteïnen op ER vergemakkelijkt wordt. Deze proteïnen beïnvloeden de transcritptionele activiteit van ER door het proces te onderdrukken, de co-repressoren, of door het te activeren, de co-activatoren zoals AIB1 (amplified in breast cancer 1). Ze veranderen dus de transcriptionele activiteit van ER op specifieke DNA elementen, namelijk de oestrogeen respons elementen (ERE). Dit wordt de klassieke actie van ER genoemd. (zie Figuur 2, Schiff et al., 2005) (Prat and Baselga, 2008, Schiff et al., 2005 en Schiff and Osborne, 2005) Er bestaat ook een niet-klassieke ER weg waarbij de receptor, op een indirecte manier via proteïn-proteïn interactie, ook de gentranscriptie van DNA-gebieden responsief aan andere transcriptiefactoren reguleert. (Schiff et al., 2005) Er zal co-activatie van andere transcriptiefactoren zoals c-fos/c-jun plaatsvinden die dan zullen binden op specifieke, niet oestrogeen respons elementen van genen. (Prat and Baselga, 2008) (zie Figuur 2, Schiff et al., 2005)
Figuur 2 - De nucleaire genomische ER activiteit (NISS). (Schiff et al., 2005) A en B tonen de klassieke actie van ER waarbij er een onmiddellijke binding is op ERE’s. In A worden co-activatoren aangetrokken waardoor de transcriptie geïnduceerd wordt. In B zorgen de aangeworven co-repressoren voor het inhiberen van de gentranscriptie. C toont de niet-klassieke actie van ER met de gentranscriptie verlopend via proteïn-proteïn interactie.
8
Deze genomische effecten van oestrogeen induceren de expressie van genen coderend voor proteïnen met een belangrijke rol in tumorgroei, zoals onder andere de vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), collagenase,...
2.2. De niet-genomische membraan ER activiteit. (zie Figuur 3, Schiff and Osborne, 2005) Naast zijn rol als directe modulator van de gentranscriptie via receptoren in de kern, kan ER ook snelle stimulerende effecten op verschillende transductiewegen en moleculen uitoefenen. Dit wordt ook membraan geïnitieerde steroïde signalering (MISS) genoemd en is onafhankelijk van gentranscriptie. MISS wordt waarschijnlijk geïnitieerd buiten de cel. (Schiff et al., 2005) Een klein deel van de ER bevindt zich in het cytoplasma van de cel alsook in de mitochondria en op het plasmacelmembraan. Via deze plasmamembraan geassocieerde ER-functie stijgt het niveau van secundaire signaalmoleculen zoals cAMP en worden verschillende tyrosine kinase receptoren , waaronder HER-2 en EGFR, geactiveerd. (Prat and Baselga, 2008)
Figuur 3 - MISS activiteit van ER. (Schiff and Osborne, 2005) Oestrogeen bindt de membraan of cytoplasmatisch gelokaliseerde ER. Hierdoor worden groeifactorsignaalmoleculen (o.a. PI3K) geactiveerd. Dit activeert op zijn beurt MAPK of Akt. Via G-proteïnen kan ER ook EGFR activeren. Deze activeert op zijn beurt MAPK en Akt waardoor nucleair ER gefosforyleerd en geactiveerd wordt alsook AIB1. EGFR en HER-2 kunnen ook onmiddellijk bijdragen tot tumorgroei en overleving.
9
3. Crosstalk tussen ER en groeifactorreceptor signaalwegen.
De ER- en groeifactor signaalwegen blijken niet naast elkaar te verlopen, maar er zou sprake zijn van een bidirectionele crosstalk tussen deze beide signaalwegen. Hierdoor kunnen zij elkaar op verschillende manieren beïnvloeden en zo dus uiteindelijk ook de celgroei. Het binden van oestrogeen aan de membraangebonden ER kan de groeifactorreceptoren activeren via onder andere G-proteïnen en PI3K. Dit zal verder leiden tot de activatie van secundaire signaal messengers en kinase signaalwegen zoals p21Ras/p42/44 MAPK en Akt waardoor er verschillende celprocessen van proliferatie, groei en overleving geactiveerd kunnen worden. Het is dus mogelijk dat het blootstellen van cellen, die zowel HER-2 als ER tot expressie brengen, aan oestrogeen leidt tot de activatie van deze alternatieve signaalwegen. Dit zou dan proliferatie en overleving van deze cellen voor gevolg hebben. Eveneens kunnen groeifactorreceptor kinasen ER en zijn coregulerende proteïnen functioneel activeren waardoor ER-afhankelijke transcriptie plaatsvindt. (Massarweh and Schiff, 2006, Milano et al., 2006 en Prat and Baselga, 2008) Zoals eerder vermeld (zie 2. Biologie en rol van de oestrogeenreceptor.) kan de ligand gebonden ER interageren met ofwel een co-activator die de transcriptie bevordert, ofwel met een co-repressor die de transcriptie onderdrukt. Ze moduleren dus zo de ER transcriptieactiviteit. ER zelf kan gefosforyleerd en dus geactiveerd worden door verschillende kinasen. Het fosforyleren van de ER coregulatoren door onder andere MAPK, Akt, die zelf geactiveerd kunnen worden door HER2, is eveneens belangrijk voor de groeifactoren om hun effecten uit te oefenen op de ER signaalweg. Deze coregulatoren zouden een belangrijke rol kunnen spelen in de oestrogeengemediëerde tumorgroei alsook in de sensitiviteit of resistentie voor endocriene therapie. De co-activator AIB1 blijkt in meer dan 50% van de borsttumoren tot overexpressie gebracht en het gen is in ongeveer 5 à 10% van de borsttumoren geamplifieerd. (Milano et al., 2006 en Schiff et al., 2003) Deze crosstalk tussen beide signaalwegen leidt tot een verhoogde signaalactiviteit van zowel de ER- als de groeifactorreceptorsignaalweg waardoor de overleving van borstkankercellen verhoogd wordt. Borstkankercellen kunnen dus potentieel meer resistent worden aan unieke vormen van moleculaire therapie. (Massarweh and Schiff, 2006 en Milano et al., 2006) 10
Door het overschakelen naar een alternatieve groeifactor signaalweg kunnen cellen de farmacologische blokkade van de klassieke oestrogeenweg omzeilen. Uit in vitro studies blijkt dat er mogelijks een hypersensitiviteit aan oestrogeen ontstaat na langdurige oestrogeendeprivatie. Dit blijkt geassocieerd te zijn met de overexpressie van groeifactorsignaalwegen waardoor tumorcellen gestimuleerd worden door veel kleinere hoeveelheden oestrogeen. Eveneens blijkt dat er een omgekeerde relatie bestaat tussen het niveau van ER-α en het niveau van groeifactorreceptoren in borstkankercellen. Door antioestrogeen therapie treedt er in de borstkankercellen een verlies op van ER-α wat kan resulteren in het gevoeliger worden van deze cellen voor groeifactoren. (Pietras, 2006) Hierdoor kan het nodig zijn om op verschillende niveaus de ER en andere pathways te inhiberen om zo de groei van kankercellen tegen te gaan. (Massarweh and Schiff, 2006 en Milano et al., 2006)
Figuur 4 - Crosstalk tussen ER- en groeifactorsignaalwegen (Pietras, 2006) Interactie tussen celoppervlakte groeifactorreceptoren en nucleaire ER.
11
Uit Figuur 4 (Pietras, 2006) kan men opmaken dat de binding van een ligand aan de groeifactor receptor tyrosine kinases gelegen ter hoogte van de celmembraan leidt tot de activatie van downstream signaalwegen zoals PI3K, p38-MAPK, Akt, betrokken bij de celoverleving en proliferatie. Deze activatie geeft aanleiding tot fosforylatie van de ER of van de receptor co-activatoren die de transcriptie van ERE’s zullen bevorderen. Enkele mogelijke liganden betrokken bij de fosforylatie van ER zijn EGF, bindend op EGFR en HER-2/neu en VEGF (vascular endothelial growth factor), bindend op VEGFR.
Figuur 5 - Crosstalk tussen ER- en groeifactorsignaalwegen 2 (Pietras, 2006)
Figuur 5 (Pietras, 2006) toont de werking van oestrogeen zowel op nucleair als op extranucleair niveau. In Figuur 5 a ziet men dat oestrogeen vrij in de cel diffundeert en op zijn receptor bindt die zich in de celkern bevindt. Door deze binding zal de receptor veranderingen ondergaan en zich associëren met co-activatoren en ERE’s. Dit leidt uiteindelijk tot selectieve gentranscriptie. Er bestaat ook een genomische activatie die onafhankelijk is van ERE’s, zoals getoond in Figuur 5 b. Hierbij zal oestrogeen interageren met proteïnen waardoor de transcriptie verloopt via een weg zonder de tussenkomst van ERE’s.
12
Oestrogeen kan ook een extranucleaire ER in het plasmamembraan binden (zie Figuur 5 c). Door deze binding kunnen verschillende signaalwegen waaronder MAPK, G-proteïnen en ionkanalen, geactiveerd worden. Uiteindelijk wordt de ER gefosforyleerd en geactiveerd. In Figuur 5 d ziet men dat de activatie van ER via een oestrogeen onafhankelijke weg verloopt. Groeifactorreceptoren zorgen hier voor de activatie van de ER eveneens via een cascade van verschillende signaalwegen zoals onder andere MAPK. Ook hier wordt de ER gefosforyleerd en geactiveerd. Door deze verschillende signaalwegen, die met elkaar in verbinding staan, kan de cel via nucleaire en extranucleaire wegen op gepaste en gecoördineerde manier reageren op het extracellulaire niveau van oestrogeen. (Pietras, 2006)
13
4. Laboratoriumstudies.
4.1
Mechanismen
van
resistentie
aan
Tamoxifen,
een
selectieve
oestrogeenreceptor modulator . Tamoxifen is een van de meest gebruikte therapieën in de behandeling van borstkanker. Het is gebleken dat Tamoxifen het risico op herval en overlijden van vrouwen met hormoonreceptor positieve borsttumoren significant reduceert. Deze therapie is werkzaam, onafhankelijk van de leeftijd, de nodale en menopauzale status van de patiënte. Het is wel ineffectief in ERnegatieve tumoren. (Milano et al., 2006) Het effect van Tamoxifen, een selectieve oestrogeen receptor modulator (SERM), blijkt weefselspecifiek te zijn. In het endometrium en het bot bijvoorbeeld treedt Tamoxifen op als een agonist van oestrogeen. In borstweefsel blokkeert deze therapie de activiteit van oestrogeen door de binding van AF-2 aan het co-activator complex te verhinderen. Het bemoeilijkt zo de transcriptie. (Pietras, 2006 en Schiff et al., 2003) Tamoxifen inhibeert dus de borstkankergroei door een competitieve blokkade van de ER waardoor de oestrogeen geïnduceerde groei geïnhibeerd wordt. (Schiff et al., 2003) Ondanks de aanwezigheid van ER, zal ongeveer 50% van de borsttumoren niet reageren op een behandeling met Tamoxifen. Deze resistentie, zowel de novo als verworven, is een belangrijk obstakel in de behandeling van deze tumoren. (Schiff et al., 2003) De studie van Shou et al. (2004) onderzocht de mechanismen van resistentie aan Tamoxifen in ER-positieve tumoren die hoge niveaus van AIB1 en HER-2 tot expressie brengen. Dit onderzoek werd uitgevoerd op MCF-7 borstkankercellen met veel AIB1 en een afgeleide cellijn met een hoog niveau van zowel AIB1 als van HER-2, namelijk MCF-7/HER2-18. De agonistische activiteit van oestrogeen of Tamoxifen gebonden aan ER op de in vivo tumorgroei werd in de 2 cellijnen vergeleken. De crosstalk tussen de HER-2 en ER signaalwegen werd eveneens onderzocht. Het effect van de groeifactor receptor tyrosine kinase inhibitor, Gefitinib werd ook in deze studie bestudeerd.
14
De MCF-7/HER2-18 xenogreffen werden bij 5 tot 6 weken oude athymische muizen zonder ovaria ingeplant. De muizen kregen oestrogeen supplementen toegediend. Wanneer de tumoren een bepaalde grootte bereikt hadden, werden de muizen gerandomiseerd over verschillende groepen met telkens een andere behandeling waaronder verdere toediening met oestrogeen, oestrogeendeprivatie alleen, oestrogeendeprivatie met Tamoxifen al dan niet met Gefitinib. Vorig onderzoek toonde aan dat de groei van MCF-7 xenogreffen met een matig niveau aan ER, lage niveaus EGFR en HER-2 en hoge niveaus van AIB1 gestimuleerd werd door oestrogeen en geïnhibeerd door de wegname van oestrogeen al dan niet in combinatie met Tamoxifen. Uit dit onderzoek bleek dat de groei van de MCF-7/Her2-18 tumoren gestimuleerd werd door oestrogeen en volledig geblokkeerd werd door oestrogeendeprivatie. Eveneens bleek de groei van de tumoren gestimuleerd door het toevoegen van Tamoxifen aan de oestrogeendeprivatie. Hieruit blijkt dus dat Tamoxifen als een agonist van oestrogeen functioneert wanneer HER-2 tot overexpressie is gebracht. Eveneens bleken de downstream signaalmoleculen, zoals MAPK verhoogd te zijn door de aanwezigheid van Tamoxifen alsook door oestrogeen in vergelijking met de oestrogeendeprivatie. Voor het onderzoek van de crosstalk tussen groeifactorreceptor en ER signaalwegen werd de tyrosine kinase inhibitor Gefitinib aan de behandeling van de tumoren toegevoegd. De maternele MCF-7 cellen behandeld met oestrogeen of Tamoxifen leidde tot de fosforylatie van ER onafhankelijk van HER-2 of EGFR omdat dit proces niet geïnhibeerd werd door Gefitinib. Er bleek ook geen fosforylatie te zijn van EGFR, HER-2, MAPK, ERK1,2 MAPK of Akt in deze MCF-7 cellen behandeld met oestrogeen of Tamoxifen. De MCF-7/HER2-18 cellen vertonen daarentegen wel belangrijke crosstalk tussen beide signaalwegen en dit dus in tegenstelling tot hun moedercellen. De fosforylatie van ER door Tamoxifen werd gedeeltelijk geïnhibeerd door Gefitinib, maar de fosforylatie door oestrogeen werd net als in de MCF-7 cellen niet verhinderd. Nochtans bleek er bij de behandeling met zowel Tamoxifen als met oestrogeen een gestegen fosforylatie van EGFR, HER-2, MAPK, ERK1,2 MAPK en Akt te zijn. Dit werd tegengegaan door Gefitinib. Men kan dus concluderen dat er in de tumoren met HER-2 overexpressie sprake is van bidirectionele crosstalk tussen Tamoxifen en groeifactoren en dat Gefitinib de crosstalk in beide richtingen tegenhoudt. 15
In de maternele cellen bleek noch oestrogeen, noch Tamoxifen een effect te hebben op de fosforylatie van AIB1. Dit was wel het geval in de MCF-7/HER-2-18 cellen. De fosforylatie werd hier wel geblokkeerd door Gefitinib wat suggereert dat deze fosforylatie door oestrogeen en Tamoxifen het gevolg was van ER-gemediëerde activatie van de EGFR/HER-2 signaalweg.
Figuur 6 – Crosstalk tussen groeifactor- (GF) en ER-signaalwegen: Rol van co-activatoren (CoA) en Corepressoren (CoR) in de activiteit van Tamoxifen. (Schiff et al, 2003) Hoge niveaus van CoA, zoals AIB1, in tumorcellen resulteren in gestegen agonistische activiteit van Tamoxifen (Tam) en tumorgroei.
Verder werd er in het onderzoek van Shou et al. (2004) nagegaan of de activatie van groeifactorsignalen, ER fosforylatie en AIB1 fosforylatie door Tamoxifen een functionele betekenis had door het bestuderen van de effecten van deze behandeling op ER-afhankelijke gentranscriptie. Het bleek dat Tamoxifen geen oestrogeen agonistische effecten had op de genen in MCF-7 cellen, maar dat het wel als agonist van oestrogeen optrad in cellen die HER2 tot overexpressie brachten. Deze agonistische activiteit bleek volledig afhankelijk te zijn van de cross-talk met groeifactor receptoractiviteit aangezien het effect tegengegaan werd door toevoeging van Gefitinib. De aanwezigheid van co-activator complexen op de promotor van oestrogeen gerelateerde genen wanneer Tamoxifen gebonden is op de receptor kan de agonistische activiteit op genexpressie in MCF-7/HER2-18 cellen verklaren. Ook blijkt dat Tamoxifen zich als een sterke oestrogeen agonist gedraagt op de celproliferatie in de cellen met HER-2 overexpressie. Gefitinib bleek in deze cellen het stimulerend effect van Tamoxifen met meer dan 50% te inhiberen. Dit duidt eveneens op een groeifactorreceptor afhankelijkheid van de agonistische activiteit van Tamoxifen. Deze bevindingen worden ook teruggevonden wanneer men de groei van deze cellen onder Tamoxifen behandeling 16
bestudeert. Gefitinib blokkeert aan de ene kant de Tamoxifen-gestimuleerde groei anderzijds verlaagt het ook de niveaus van ERK1,2 MAPK. Uit deze studie kan men concluderen dat het groeistimulerende effect van Tamoxifen volledig afhankelijk is van groeifactoren. Enerzijds blijkt dat monotherapie met een groeifactor inhibitor zoals Gefitinib slechts een klein gunstig effect heeft op ER-positieve, HER-2 positieve borsttumoren, anderzijds geeft deze studie aan dat de combinatie van Tamoxifen met Gefitinib of een andere HER-2 signaalweg inhibitor belangrijk kan zijn in het verhinderen van resistentie in type tumoren. Humane BT-474 borstcarcinoomcellen die ER positief zijn en HER-2 tot overexpressie brengen, werden in cultuur gebracht in de aanwezigheid van ofwel Tamoxifen, ofwel Trastuzumab ofwel beide samen. De rationale achter deze combinatietherapie is de interactie die bestaat tussen de groeifactor- en de ER-signaalwegen in borstcarcinomen. Men bestudeerde de effecten op celgroei, celcyclus en celoverleving en het niveau van HER-2 activiteit. Beide monotherapieën veroorzaakten een partiële groei-inhibitie daar waar de combinatietherapie voor een bijna volledige groei-inhibitie in deze cellijn zorgde. Na reeds 48 uur blootstelling aan de monotherapieën was er een statisch significante stijging van het percentage cellen in de G0-G1 fase van de celcyclus. Onder de combinatiebehandeling werd dit effect ook waargenomen. Het effect was groter dan onder de monotherapieën. Het percentage van cellen dat zich in de S-fase bevond, daalde in vergelijking met onbehandelde cellen en cellen behandeld met een Trastuzumab monotherapie. Noch Tamoxifen, noch Trastuzumab noch de combinatietherapie resulteerde in apoptose van de BT-474 cellen. Wat het niveau van HER-2 activiteit betreft, werd in deze studie gevonden dat Tamoxifen geen effect heeft op het niveau van gefosforyleerd en dus geactiveerd HER-2. Trastuzumab in tegenstelling verminderde wel het niveau van geactiveerd HER-2 en dit al na enkele uren en gedurende de gehele tijd van het experiment. Het HER-2 antilichaam had dus geen effect op het expressieniveau van HER-2, maar inhibeerde de signaalactiviteit van HER-2 door de hoeveelheid gefosforyleerd HER-2 te verlagen. Het toevoegen van Tamoxifen aan Trastuzumab bracht geen additief effect op het niveau van gefosforyleerd HER-2. (Argiris et al., 2004) Twee Tamoxifen resistente ER-positieve/HER-2 positieve borstkankercellijnen, MCF7/HER2 en BT474 werden in de studie van Zhou et al. (2007) vergeleken op de effecten van NFкB en 17
AP-1 genexpressie met een Tamoxifen gevoelige ER-positieve/HER-2 negatieve MCF7 borstkankercellijn. In beide Tamoxifen resistente HER-2 positieve cellijnen werden significant verhoogde niveaus van NFкB
en AP-1 gevonden in vergelijking met de
Tamoxifen gevoelige ER-positieve/HER-2 negatieve MCF7. Zoals eerder vermeld (zie Biologie en rol van HER-2/neu.) speelt NF-κB een rol in onder andere celproliferatie en antiapoptose. HER-2/neu activeert deze signaalweg via Akt en dit zorgt voor de expressie van NF-κB gecontroleerde anti-apoptose genproducten. (Zhou and Hung, 2003) Het toevoegen van een IKK inhibitor, parthenolide (PA) of van de proteasoom inhibitor bortezomib (PS341) aan de Tamoxifen resistente cellijnen vermindert de genexpressie van NFкB en AP-1 en de tumorgroei wordt zo geïnhibeerd. De combinatie van PA of PS341 aan een behandeling met Tamoxifen had geen bijkomend effect op de reductie van de activiteit van NFкB en AP-1 in de resistente cellijnen. Het niveau van de ER co-repressor NCoR werd niet beïnvloed door monotherapie met PA of PS341 in de MCF7, MCF7/HER2 en BT474 cellijnen. Uiteraard verhoogde de Tamoxifenbehandeling het niveau van NCoR in Tamoxifen gevoelige kankercellen, daar waar dit in de MCF7/HER2 en BT474 cellijnen niet het geval was. Er werd wel een verhoging van het niveau van NCoR, gelijkaardig aan dat van MCF-7 cellen, opgemerkt in de Tamoxifen resistente cellijnen bij een combinatietherapie van PA of PS341 met Tamoxifen. Dus de directe inhibitie van de constitutief verhoogde transcriptieactiviteit van NFкB en AP-1 kan de endocriene respons verbeteren in Tamoxifen resistente ER positeve borstcarcinomen. Dit is mogelijk door het recruteren van NCoR aan ER dat Tamoxifen als gebonden ligand heeft. Hierdoor wordt de expressie van genen, opgereguleerd door NFкB en AP-1, die instaan voor de groei en metastasering onderdrukt. (Zhou et al. 2007) In het ontstaan van borsttumoren resistent aan Tamoxifen blijkt men 3 verschillende fasen van resistentie te kunnen onderscheiden. (zie Figuur 7, Osipo et al 2005)
Figuur 7 - 3 fasen van Tamoxifen resistentie (Osipo et al., 2005)
18
Het model voor de behandelfase van borstkankercellen werd ontwikkeld door het injecteren van ER-α positieve MCF-7 cellen in athymische muizen gesupplementeerd met een postmenopauzale dosis oestrogeen. Deze MCF-7E2 werden in hun groei gestimuleerd door oestrogeen en geïnhibeerd door Tamoxifen alsook door een AI. De eerste fase van Tamoxifen resistente borsttumoren ontstond na een behandeling met Tamoxifen van minder dan 2 jaar (MCF-7 TAMST) waarbij de groei van de tumoren gestimuleerd werd door zowel oestrogeen als Tamoxifen. Een AI alleen, Fulvestrant alleen of Fulvestrant en oestrogeen inhibeerden de tumorgroei wel. Na een langdurige behandeling van borsttumoren met Tamoxifen (gedurende meer dan 5 jaar) ontstond de tweede fase van resistentie, namelijk MCF-7TAMLT. Deze tumoren werden door Tamoxifen gestimuleerd tot groei en paradoxaal door oestrogeen geïnhibeerd. De groei werd ook gestopt door een AI en Fulvestrant. Een afzonderlijk experiment op deze tumoren toonde aan
dat
MCF-7TAMLT
kleiner
dan
0.25
cm2
volledig
regresseerden
onder
oestrogeenbehandeling en dat tumoren groter dan 0.50 cm2 slechts een gedeeltelijke regressie vertoonden bij deze behandeling. De regressie bij grotere tumoren werd gevolgd door een snelle herstimulatie van groei bij behandeling met oestrogeen. Deze tumoren, MCF-7TAME genaamd, groeiden aan een tempo dat twee maal zo snel bleek als de ouderlijke MCF-7 E2 cellijn. MCF-7TAME tumoren bleken opnieuw gevoelig te zijn voor het inhiberende effect van Tamoxifen net zoals de maternele MCF-7 E2 tumoren. Deze data tonen aan dat resistentie aan Tamoxifen volledig reversiebel kan zijn door het gebruik van lage dosissen oestrogeen. De fase drie resistente borsttumoren ontwikkelen zich wanneer alle behandelingen falen en wanneer enkel oestrogeen de groei nog stopt. (Osipo et al., 2005) De expressie van HER-2/neu mRNA (zie Figuur 8, Osipo et al., 2005) werd in de verschillende tumoren bestudeerd en het bleek dat deze expressie verlaagd werd door oestrogeen in MCF-7 E2, MCF-7 TAMST, MCF-7TAMLT en MCF-7TAME tumoren. Het niveau van HER-2 werd in alle tumoren bijna volledig hersteld door behandeling met Tamoxifen. Er bleek een 10-voudige stijging van HER-2/neu te zijn in MCF-7TAMLT in vergelijking met MCF-7 E2 tumoren. Ondanks het feit dat oestrogeen het niveau van HER-2 mRNA met ongeveer 40% verlaagt in MCF-7TAME tumoren, zal dit nooit leiden tot een volledig herstel van het HER-2 niveau zoals in de ouderlijke MCF-7 E2 tumoren.
19
Figuur 8 - Niveau HER-2/neu. (Osipo et al., 2005)
Uit deze resultaten blijkt dat de overexpressie van HER-2/neu mRNA een belangrijke rol kan spelen in de fase II resistentie, de Tamoxifen gestimuleerde en de oestrogeen geïnhibeerde MCF-7TAMLT tumoren. Ook blijkt dat enkel deze HER-2 overexpressie onvoldoende is om de resistentie van borsttumoren aan Tamoxifen te verklaren aangezien het niveau van HER-2 hoog blijft in MCF-7TAME tumoren die opnieuw gevoelig zijn aan de groei-inhiberende effecten van Tamoxifen. (Osipo et al., 2005) Dit onderzoek toont aan dat Tamoxifen resistente borstkankercellen terug gevoelig kunnen worden aan de inhiberende effecten van deze endocriene behandeling door het gebruik van lage dosissen oestrogeen. De effectiviteit van de oestrogeentherapie blijkt wel afhankelijk te zijn van de grootte van de tumor waarbij de beste resultaten bekomen worden in kleine tumoren. Hiernaast is de identificatie van biologische markers in de verschillende fasen van resistentie belangrijk aangezien er naast HER-2 nog andere signaalmoleculen mogelijk een rol spelen in de progressie naar resistentie. (Osipo et al., 2005)
4.2 Mechanismen van resistentie aan Aromatase Inhibitoren. De meerderheid van de borstkankerpatiënten zijn post-menopauzale vrouwen met ER+ tumoren die zoals al aangegeven gevoelig zijn voor oestrogeen. Bij deze vrouwen wordt oestrogeen niet meer in de ovaria gesynthetiseerd, maar in het vet- en borstweefsel. De oestrogeenconcentratie in de borst van post-menopauzale vrouwen is verschillende malen
20
hoger of gelijk aan die van pre-menopauzale vrouwen, ondanks het feit dat de circulerende concentratie oestrogeen bij post-menopauzale vrouwen laag is. Naast Tamoxifen bestaan er voor de behandeling van borsttumoren nog andere effectieve vormen van endocriene therapie, zoals onder andere de aromatase inhibitoren (AI). De AI, waaronder Letrozole, Anastrozole en Exemestane hebben een duidelijk verschillende werking dan de SERMs. Ze gaan namelijk de conversie van androgene precursoren naar oestrogeen verhinderen. De AI hebben, in tegenstelling tot Tamoxifen, geen oestrogeen agonistische acitviteit waardoor ze mogelijk klinisch voordeliger zijn in de behandeling van borsttumoren. Eveneens kan er tegen deze vorm van therapie resistentie ontstaan. (Brodie et al., 2006, Macedo et al., 2007 en Massarweh et al., 2006) In de studie van Brodie et al. (2006) werd gebruik gemaakt van ER positieve borstkankercellen getransfecteerd met het humane aromatase gen. Deze cellijn werd MCF7Ca genoemd en werd in muizen ingeplant (xenograft model). Deze tumoren werden gedurende 56 weken met Letrozole behandeld. De LTLT-Ca cellijn werd ontwikkeld van de Letrozole resistente tumoren na een 56-weken durende behandeling. Letrozole bleek in het xenograft model een belangrijk anti-tumoraal effect te hebben, maar desondanks verdere AI therapie begonnen tumoren toch te groeien. Om het adaptieve vermogen van tumorcellen te onderzoeken, werden de tumoren op verschillende tijdstippen onderzocht. Tijdens week 4 bleken de tumoren te verkleinen als respons op de therapie, daar waar op week 28 de tumoren teruggegroeid waren tot hun startvolume. Op week 56 waren de tumorvolumes al verdubbeld ondanks de behandeling met Letrozole. Als mogelijk verklarend mechanisme voor dit fenomeen werd gedacht dat de concentratie aan ER in deze tumoren gestegen was waardoor tumorproliferatie mogelijk werd bij lage concentraties aan ligand. Dit bleek uiteindelijk niet zo te zijn aangezien de ER niveaus op week 28 en 56 gedaald waren onder het controleniveau. Wel bleek p-ER gestegen te zijn wat suggereert dat tumorproliferatie, ondanks Letrozolebehandeling, op een ligandonafhankelijke manier verliep. De studie van Macedo et al. (2007), die voortgaat op de studie van Brodie et al.(2006), toont dat de activatie van groeifactorreceptor signaalwegen, vooral de HER-2/Raf/mitogenactivated protein kinase (MAPK) signaalweg verantwoordelijk is voor de verandering van responsieve tumoren naar niet-responsieve tumoren. Hiernaast vond men dat de HER-2 expressie alsook deze van downstream molecules van HER-2 zoals MAPK op de drie de tijdstippen gestegen was, zelfs wanneer het tumorvolume 21
regresseerde. (Brodie et al., 2006 en Macedo et al., 2007) De gestegen HER-2 expressie werd gevolgd door een stijging van gefosforyleerd, dus geactiveerd SHC-adaptor proteïne alsook van p-MAPK. (Macedo et al., 2007) De LTLT-Ca cellen bleken onafhankelijk van oestrogeen te groeien en werden niet geïnhibeerd door Letrozole. De ER expressie bleek eveneens sterk gedaald te zijn en HER-2, p-Raf en pMER1/2 en p-MAPK alsook zijn down-stream signaalmolecules bleken allemaal 2 tot 6 maal gestegen te zijn in vergelijking met MCF-7Ca cellen. (Brodie et al., 2006 en Macedo et al., 2007) MAPK kan de ER direct of indirect fosforyleren en zo dus de transcriptie van genen belangrijk in de groeiregulatie en tumorprogressie stimuleren. Ondanks het feit dat bij Letrozole resistentie de ER-expressie enorm gedaald was, bleken de resterende ER in belangrijke mate gefosforyleerd. Deze resultaten suggereren dat de groei van resistente tumoren onafhankelijk wordt van oestrogeenstimulatie door een verminderde ER expressie en door de crosstalk tussen HER-2/Raf/MAPK en ER die deze laatste constitutief activeert via fosforylatie. Door deze constitutieve activatie van de ER werden de LTLT-Ca cellen dus ongevoelig voor het proliferatieve effect van oestrogeen en bijgevolg ook voor de reductie van de oestrogeenconcentratie door AI. Er is dan sprake van verworven resistentie. (Macedo et al., 2007) De PI3K/Akt signaalweg bleek niet gestegen te zijn in LTLT-Ca cellen. (Brodie et al., 2006) Aangezien HER-2 positieve tumoren vaker ER negatief zijn, werd het effect op uitstel van resistentie en herstel van de ER positiviteit bekeken door een behandeling van deze tumoren met onder andere een MAPK-inhibitor en Trastuzumab, een HER-2 blokker. (Brodie et al., 2006 en Macedo et al., 2007) De incubatie van MCF-7Ca en LTLT-Ca cellen met MAPK en MEK1/2 inhibitoren had op de proliferatie van MCF-7Ca geen effect, maar er was wel sprake van een dosisdependente groei-inhibitie van de LTLT-Ca cellen. (Brodie et al., 2006) De expressie van ER steeg terug tot niveaus vergelijkbaar met deze in MCF-7Ca cellen en was vele malen hoger dan het niveau in onbehandelde LTLT-Ca cellen. (Macedo et al., 2007) Het HER-2 antilichaam Trastuzumab blokkeerde de groei van LTLT-Ca cellen en herstelde het niveau van ER en de gevoeligheid voor oestradiol volledig. Daarnaast inhibeerde Trastuzumab ook de werking van p-HER-2 en p-MAPK. Door de combinatie met Letrozole werd ook een synergistisch effect waargenomen op de inhibitie van celgroei. De LTLT-Ca cellen werden opnieuw even gevoelig als de MCF-7Ca cellen. Dit suggereert dat de 22
gevoeligheid voor hormonen en AI in resistente tumoren hersteld kan worden door blokkade van groeifactorreceptor signalen. (Brodie et al., 2006 en Macedo et al., 2007) Door het toevoegen van Trastuzumab aan het behandelschema van Letrozole resistente tumoren kan resistentie dus ‘overwonnen’ worden. De respons van borsttumoren refractair aan endocriene therapieën kan verlengd worden door de inhibitie van de HER-2 signaalweg in combinatie met de inhibitie van de oestrogeensynthese. Er wordt gesuggereerd dat de voordelen van de combinatie van Trastuzumab en Letrozole slechts groter zijn dan die van monotherapie met Letrozole wanneer tumoren hieraan refractair geworden zijn. Met andere woorden het is beter om Trastuzumab pas na een bepaalde tijd aan de behandeling met Letrozole toe te voegen eerder dan bij de start van Letrozoletherapie. (Macedo et al., 2007) Er werd in de LTLT-Ca tumoren ook een synergistisch effect op groei-inhibitie waargenomen wanneer Gefitinib gecombineerd werd met anastrozole. (Brodie et al., 2006) Een andere studie (Massarweh et al., 2006) die ook het effect en de mechanismen van resistentie aan AI wou bestuderen, gebruikte daarvoor MCF7/HER-2/neu-18 cellen, namelijk xenogreffen van ER-positieve borstkankercellen die HER-2 tot overexpressie brengen, vond gelijkaardige resultaten. Ook deze studie vond, net zoals de studie van Brodie et al., dat de tumorgroei zeer sterk verhinderd werd door oestrogeendeprivatie (dit komt overeen met het werkingsmechanisme van de AI). Deze tumoren bleken ook met deze behandeling een verlaagde hoeveelheid p-HER-2/neu en p-MAPK te hebben. Na ongeveer 2 à 3 maand ontstond er resistentie aan AI en de tumoren begonnen opnieuw te groeien. In de resistente tumoren bleek het niveau van p-HER-2/neu en zijn downstream kinase p-MAPK verhoogd te zijn. Ook bleek het niveau van ER zeer sterk gedaald te zijn in resistente tumoren. In de nog AI gevoelige tumoren was de cycline dependente celcyclus regulator p27 verhoogd. Dit is in overeenstemming met zijn rol als inhiberende mediator van de celcyclus. Het is mogelijk dat het verlagen van het niveau van p27 leidt tot tumorgroei, aangezien er een omgekeerde relatie bestaat tussen de hoeveelheid HER-2 en p27 in de cel. Ook in deze studie werd de tyrosine kinase inhibitor (TKI) Gefitinib toegevoegd aan de behandeling met AI. Deze combinatie vertraagde het ontstaan van resistentie opmerkelijk. De moleculaire analyse toonde aan dat deze TKI in combinatie met oestrogeendeprivatie het niveau van p-MAPK en p-HER-2/neu verlaagde alsook dat van p-AKT. De hoeveelheid ER steeg dan weer. De tumoren bleken ook resistentie te ontwikkelen tegenover deze combinatie. 23
Hierbij zag men dat er opnieuw een belangrijke stijging was van p-MAPK, p-HER-2/neu en p-AKT. Dit was gerelateerd aan tumorgroei. Eveneens bleek deze resistentie gepaard te gaan met het verlies van ER, gelijkaardig aan het verlies in tumoren enkel resistent aan endocriene therapie. (Massarweh et al., 2006)
4.3 Combinatie van Aromatase Inhibitoren en Anti-oestrogenen. In de studie van Brodie et al. (2006) werden de effecten van de combinatietherapie van Letrozole en Tamoxifen getest op de MCF-7Ca cellijn. De tumorsuppressie hierdoor bekomen was even groot als deze van Tamoxifen alleen, maar kleiner dan het effect van Letrozole in monotherapie. Gelijkaardige bevindingen werden gemaakt bij de combinatie van Anastrozole en Tamoxifen. Deze studie onderzocht ook of er baat was bij een sequentiële therapie, waarbij tumoren eerst met Tamoxifen behandeld werden en daarna in tweede lijn met Letrozole. De reductie van de tumorgroei bewees dat de overschakeling naar een AI significant effectiever was dan het voortzetten van de behandeling met Tamoxifen. Ondanks deze resultaten was deze sequentiële strategie toch inferieur aan een initiële behandeling met Letrozole. Andersom blijkt het switchen van Letrozole in Letrozole resistente tumoren naar Tamoxifen of Fulvestrant ineffectief. (Brodie et al., 2006) In tumoren resistent aan deze AI zouden antioestrogenen ineffectief zijn door de down-regulatie en het constitutief activeren van de ER. Een verklaring hiervoor is te vinden in de crosstalk tussen ER en HER-2 aangezien de resistentie voor hormonale behandelingen hersteld kan worden door het gebruik van een ERdown-regulator zoals Fulvestrant die de crosstalk tussen beide signaalwegen op die manier onderbreekt. Er bleek een grotere onderdrukking te zijn van de expressie van HER-2 en pMAPK in tumoren behandeld met de combinatie Letrozole en Fulvestrant dan enkel met Letrozole. Eveneens is de combinatie van Anastrozole en Fulvestrant effectiever in de suppressie van tumorgroei dan Anastrozole alleen. Deze bevindingen suggereren dus dat de complete oestrogeenblokkade via de down-regulatie van de ER en inhibitie van de oestrogeensynthese door de combinatie van Fulvestrant en een AI een groter effect heeft op de onderdrukking van tumorgroei dan elke behandeling apart. Deze combinatie zou de resistentie aan hormonale therapieën kunnen uitstellen en tegengaan. (Brodie et al., 2006 en Macedo et al., 2007) 24
Ook de studie van Massarweh et al. (2006) vond dat de combinatie van een AI en Fulvestrant zeer effectief was om de groei van MCF7/HER-2/neu-18 tumoren te onderdrukken. Dit bevestigt dat in de HER-2 positieve borsttumoren oestrogeen, via de non-genomische activiteit van de ER, een belangrijke activator is van het oncogen. Eveneens vond men dat de combinatietherapie in deze tumoren de niveaus van HER-2 en p-MAPK verlaagden.
4.4. Trastuzumab en Lapatinib. Trastuzumab is een gehumaniseerd monoclonaal antilichaam waarvan de werking gericht is tegen het extracellulaire domein van HER-2. Het is actief in patiënten met gemetastaseerde borstkankercellen die HER-2 tot overexpressie brengen, alsook in de adjuvante setting. De werkingsmechanismen van Trastuzumab zijn complex en nog niet volledig opgehelderd. Onder deze mechanismen rekent men receptor downregulatie, celcyclus arrest, inhibitie van de angiogensese en inductie van antilichaamafhankelijke celgemedieerde cytotoxiciteit (ADCC). Lapatinib is een dubbele tyrosine kinase inhibitor (TKI) die zowel EGFR als HER-2 inhibeert en is ook effectief in HER-2 positieve borstkankercellen. Het inhibeert deze 2 receptoren door in competitie te gaan met ATP voor de binding van het kinase domein. De binding van Lapatinib ter hoogte van de ATP-plaats van de receptor verstoort de drie dimensionele structuur ervan waardoor de interacties ter hoogte van de receptor gestabiliseerd worden en er accumulatie is van inactieve dimeren. De aanwezigheid van zulke inactieve dimeren aan het celoppervlak functioneert als een soort val voor de liganden. Deze worden dan gebonden zonder receptor fosforylatie voor gevolg te hebben. Wel blijkt Lapatinib een hogere affiniteit te hebben voor de HER-2 monomeren dan voor deze van EGFR. Ook heeft deze molecule een hogere affiniteit voor de HER-2 monomeren dan ATP. (Scaltriti et al., 2009) Ondanks de effectiviteit van Trastuzumab en Lapatinib in HER-2 positieve borsttumoren, zal een grote fractie ervan primaire alsook verworven resistentie vertonen aan deze therapieën. Om deze resistentie proberen te voorkomen, werden verschillende studies uitgevoerd die de combinatie van Trastuzumab en Lapatinib onderzochten. Hierbij werd ondervonden dat er een verbeterde uitkomst was met de combinatietherapie in vergelijking met de monotherapieën. (Scaltriti et al., 2009) 25
De studie van Scaltriti et al. (2009) exploreerde de verschillen in werkingsmechanismen tussen Trastuzumab en Lapatinib om zo te komen tot een eventuele verklaring voor de betere activiteit van de combinatietherapie. Hiervoor werden cellijnen gebruikt die HER-2 tot overexpressie (MCF-7 HER2) brengen alsook cellijnen met amplificatie van HER-2 (SKBR3). Een behandeling met Lapatinib in SKBR-3 en MCF-7 HER2 resulteerde in de inhibitie van HER-2 fosforylatie en in de inhibitie van MAPK fosforylatie. Eveneens werd er een accumulatie gevonden van HER-2 ter hoogte van de plasmamembraan. Trastuzumab in monotherapie leidde tot een down-regulatie van HER-2. Bij de combinatietherapie bleek er net zoals bij een monotherapie met Lapatinib een accumulatie te zijn van de HER-2 receptor ter hoogte van de celmembraan. De endocytose en de degradatie van de tyrosinereceptor wordt gereguleerd door posttranslationele modificaties zoals receptorfosforylatie en ubiquitinatie. (Scaltriti, 2009 en Yarden, 2001) In de cellijnen SKBR-3 en MCF-7 HER2 behandeld met Lapatinib of met de combinatie was het niveau van geubiquitineerde HER-2 receptor bijna ondetecteerbaar. Bij deze behandelingen was er een verminderde receptordegradatie (stabiele HER-2 receptor) in vergelijking met onbehandelde cellen en met cellen behandeld met Trastuzumab. Deze laatste bleek de ubiquitinatie en de degradatie van HER-2 te doen stijgen. Lapatinib zorgde ook voor de vorming van inactieve HER-2 bevattende homo- en heterodimeren in beide cellijnen. In tegenstelling tot Trastuzumab, accumuleerde de HER-2 receptor met een gedaalde fosforylatie van tyrosine onder een behandeling met Lapatinib alsook onder de combinatietherapie. In de xenogreffen bleek het effect van Lapatinib bij combinatietherapie te overheersen boven dat van Trastuzumab op vlak van HER-2 accumulatie. De cytotoxiciteit afhankelijk van Trastuzumab bleek eveneens hoger te zijn in cellen behandeld met Lapatinib. Door deze laatste accumuleren de inactieve HER-2 receptoren ter hoogte van de celmembraan waardoor het aantal bindingsplaatsen voor Trastuzumab ter hoogte van het celoppervlak verhoogt. De Trastuzumab-afhankelijke celcytotoxiciteit of de ADCC stijgt hierdoor. (Scaltriti et al., 2009)
26
Figuur 9 - Werkingsmechanismen van Trastuzumab en Lapatinib. (Scaltriti, 2009) Lapatinib gaat de receptorfosforylatie, ubiquitinatie en degradatie tegen met als resultaat HER-2 dimeer accumulatie ter hoogte van het plasmamembraan. Hierdoor wordt de cel gevoeliger voor de imuungemedieerde werking van anti-HER antilichamen (mAbs) zoals Trastuzumab.
27
5. Klinische studies.
5.1. Studies rond Aromatase Inhibitoren. 5.1.1. Letrozole.
Zoals eerder al vermeld (zie Inleiding) was de Letrozole studie (Ellis et al., 2001) één van de eerste neo-adjuvante dubbelblinde gerandomiseerde klinische studies die het verschil in respons wou aantonen tussen twee endocriene therapieën, namelijk Letrozole, een AI, en Tamoxifen bij post-menopauzale vrouwen met ER+ en/of PgR+ , ErbB1+ en/of ErbB2+ (of HER-2+) borsttumoren. Het voordeel van een neo-adjuvante endocriene therapie is dat er een betere patiëntenselectie gebeurt om niet-reagerende tumoren uit te sluiten en dat er alternatieve therapieën kunnen voorgesteld worden die de tumorgroei beter tegengaan. Een neo-adjuvante behandeling kan de chirurgische resultaten verbeteren door de tumor vóór chirurgie al in grootte te laten nemen. Hierdoor kunnen grote tumoren die een mastectomie noodzaken, verkleinen wat borstsparende heelkunde mogelijk maakt. (Ellis et al., 2001 en Zhu et al., 2004) Daarnaast is het door neo-adjuvante studies mogelijk om de mechanismen van respons op endocriene therapie beter te bestuderen en te begrijpen. (Dowsett et al., 2005) Driehonderd vierentwintig post-menopauzale vrouwen met ER+ en/of PgR+ , ErbB1+ en/of ErbB2+ tumoren namen deel aan deze studie en werden in 2 groepen verdeeld. De ene groep kreeg dagelijks Letrozole en de andere dagelijks Tamoxifen gedurende 4 maanden indien geen progressieve ziekte, bijwerking of vraag van de patiënt was om uit de studie te stappen. Na deze 4 maanden durende behandeling werd chirurgie gepland. Eén van de exclusiecriteria was uiteraard voorafgaandelijke blootstelling aan een AI of Tamoxifen. Hormonale substitutietherapie moest eveneens gestopt worden. Deze studie had 3 objectieven vooropgesteld, namelijk het bevestigen van de expressie van ER en PgR in deze tumoren, ten tweede de relatie tussen ER en PgR expressie niveaus en de therapierespons om zo de expressiewaarden te correleren met de optimale klinische respons. Als laatste objectief werd gekeken naar de relatie tussen de HER2/neu expressie en de
28
tumorregressie omdat deze tyrosine receptor kinase mogelijks een merker is van Tamoxifenresistentie. Er werd geen verschil gevonden tussen de twee armen van de studie wat betreft de frequentie van ER en PgR expressie zodat het verschil in studieresultaten niet beïnvloed is door een onevenwicht in aantal hormoonreceptor positieve tumoren. Het grootste deel van de tumoren was ER positief en er bleek een sterke relatie te zijn tussen de aanwezigheid van de hormoonreceptor en de therapierespons aangezien ER negatieve/PgR negatieve tumoren bijna nooit antwoordden op therapie. De respons ratio op neo-adjuvante Letrozole toediening in ER+PgR+ tumoren was groter dan die voor neo-adjuvante Tamoxifen behandeling. Dit geldt ook voor de ratios van borstsparende chirurgie in deze tumoren. Dit duidt dus het belang aan van een accurate analyse van de ER en PgR status in borsttumoren voor de endocriene behandeling. Veertien percent van de tumoren in deze studie was ErbB-2 positief en een groot deel van deze tumoren bleek ER negatief te zijn zodat ongeveer 15% van de tumoren zowel HER-2 als ER positief waren. Tumoren die ER+ ErbB-1/ErbB-2 positief zijn hebben een significant hogere respons op Letrozole dan tumoren die ER+, maar ErbB-1/ErbB-2 negatief zijn. Dit suggereert dat via de HER-1/HER-2 signaalweg, door fosforylatie van de ER, een oestrogeenafhankelijke groei plaatsvindt. Omgekeerd blijken de ErbB-1/ErbB-2 negatieve tumoren beter te reageren op een behandeling met Tamoxifen dan de ErbB-1/ErbB-2 positieve. Door het kleine aantal ER+ ErbB-1/ErbB-2 positieve tumoren is er onvoldoende statistische kracht om te concluderen dat deze tumoren resistent zijn aan Tamoxifen. Wel kon geconcludeerd worden dat Letrozole in deze tumoren effectiever was dan Tamoxifen. Dus bij de interpretatie van deze resultaten moet men in het achterhoofd houden dat er in de studie maar een kleine subset aan ErbB2+ tumoren was en dat dit de statistische kracht van het onderzoek kan ondermijnen. Wel kon, zoals al vermeld, geconcludeerd worden dat Letrozole effectiever was dan Tamoxifen in deze tumoren, wat statistisch significant bleek te zijn. Er zijn andere studies die de associatie tussen HER-2 en Tamoxifen niet hebben kunnen bewijzen, waardoor er dus geen eenduidig antwoord is over het effect van dit oncogen op de hormoongevoeligheid in borstkanker. (Ellis et al., 2001) Op deze studie werd voortgebouwd, waarbij de HER-2 status via de FISH test, de nieuwe standaard, in plaats van met immunohistochemie (IHC), zoals in voorgaande studie, bepaald werd. De studiepopulatie werd ook uitgebreid door het toevoegen van klinische informatie en 29
tumoren uit 2 andere onafhankelijke studies van preoperatieve endocriene therapie. Er werd nu gewerkt met 305 tumoren waarvan er 28 HER-2 positief bleken te zijn. Wanneer de biomerkers en de klinische karakteristieken van de HER-2 positieve en negatieve tumoren vergeleken werden, dan bleek dat de HER-2 positieve tumoren hogere niveaus van Ki67, een merker van proliferatie, vóór de behandeling hadden alsook een hogere histologische graad vertoonden dan de HER-2 negatieve tumoren. Er kon geen statistisch significant verschil gevonden worden tussen patiënten behandeld met Tamoxifen en deze behandeld met Letrozole op het vlak van biomerkers en klinische karakteristieken. In HER-2 FISH positieve tumoren blijkt zoals in de studie van Ellis et al. (2001) dat Letrozole effectiever is dan Tamoxifen. De anti-proliferatieve effecten van zowel Tamoxifen als van Letrozole bleken statistisch significant te zijn in HER-2 negatieve tumoren. Dit bleek niet het geval te zijn in HER-2 positieve tumoren, waar de daling van de proliferatie dus niet significant bleek te zijn. Dit kan te wijten zijn aan het te kleine aantal tumoren positief voor HER-2. Toch blijkt ook uit andere resultaten dat de HER-2 genamplificatie het antiproliferatieve effect van Tamoxifen alsook van Letrozole vermindert. HER-2 positieve tumoren bleken onder Letrozole behandeling een onvolledig celcyclus arrest te vertonen daar waar het overgrote deel van de HER-2 negatieve tumoren wel tot een volledig celcyclus arrest kwamen. De relatie tussen het celcyclus arrest en de HER-2 status was gelijkaardig in tumoren behandeld met Tamoxifen. (Ellis et al., 2006) De BIG 1-98 studie (Breast International Group) is een internationale, dubbelblinde gerandomiseerde studie die Letrozole vergeleek met Tamoxifen in de adjuvante setting bij 8010 postmenopausale vrouwen met invasieve borsttumoren die gevoelig waren aan endocriene therapie. De studie onderzocht 4 therapiegroepen, namelijk 5 jaar monotherapie met Letrozole, 5 jaar monotherapie met Tamoxifen, Letrozole gedurende 2 jaar gevolgd door 3 jaar Tamoxifen en Tamoxifen gedurende 2 jaar gevolgd door 3 jaar Letrozole. Letrozole bleek volgens deze studie in vergelijking met Tamoxifen het risico op het heroptreden van de ziekte op afstand te verlagen. Na een gemiddelde opvolging van 2 jaar wezen de resultaten van deze studie erop dat Letrozole een effectieve optie is als standaard adjuvante therapie. (Thürlimann et al., 2005) Verdere analyse van deze studie vond dat een initiële behandeling met Letrozole beter is dan een behandeling met Tamoxifen op vlak van ziektevrije overleving. Er werd in een substudie van BIG 1-98 ook onderzocht of HER-2 positieve tumoren een gunstig effect ondervonden bij een behandeling met Letrozole. Van de patiënten uit de 30
monotherapiegroepen was 7% (257 van de 3650 patiënten) HER-2 positief. Deze patiënten waren jonger, ondergingen vaker een mastectomie en chemotherapie in vergelijking met de HER-2 negatieve patiënten. Deze tumoren waren ook groter, vertoonden een hogere histologische graad en een lagere ER en PgR expressie. HER-2 positieve tumoren bleken een slechtere ziektevrije overleving te hebben dan deze zonder de tyrosine kinase receptor. Letrozole verbeterde de ziektevrije overleving in vergelijking met Tamoxifen onafhankelijk van de HER-2 status. Een positieve HER-2 status blijkt dus van prognostisch belang te zijn aangezien tumoren die HER-2 tot expressie brengen een significant slechtere ziektevrije overleving hebben vergeleken met HER-2 negatieve. Eveneens was HER-2 geassocieerd aan andere negatieve prognostische factoren zoals onder andere tumorgrootte en een hoge tumorgraad. Wel bleek de associatie tussen de slechtere ziektevrije overleving en HER-2 positiviteit onafhankelijk van deze andere ongunstige prognostische factoren. Het gunstige effect van Letrozole boven Tamoxifen in ER positieve tumoren bleek consistent te zijn onafhankelijk van de PgR en HER-2 status. Zowel PgR als HER-2 zouden volgens deze studie niet als factoren gebruikt mogen worden in het selecteren van initiële adjuvante endocriene therapie in postmenopausale vrouwen met borsttumoren gevoelig voor endocriene therapie. (Rasmussen et al., 2008) De combinatie van Letrozole en Trastuzumab, een monoclonaal antilichaam gericht tegen HER-2, werd onderzocht in een klinische trial van Marcom et al. (2007) waaraan 33 postmenopauzale patiënten met ER+ en/of PgR+ HER2+ metastatische borstcarcinomen, die nog geen behandeling hadden gehad of resistent waren aan Tamoxifen, deelnamen. De objectieven van deze studie waren het bepalen van de mate van respons van de tumoren op deze combinatietherapie, alsook het bepalen van de tijd tot progressie, de tijd tot het falen van de therapie en de duur van de respons. Ongeveer een kwart van de patiënten had een duurzame respons die ten minste één jaar aanhield en verschillende patiënten hadden gedurende 3 à 4 jaar geen ziekteprogressie onder deze combinatietherapie. In het algemeen heeft ongeveer een derde van de patiënten klinisch voordeel gedurende minstens één jaar. Toch bleek de helft van de patiënten met ER+HER-2+ tumoren, ondanks de dubbele therapie, geen klinisch voordeel te hebben. Dit kan wijzen op gemeenschappelijke mechanismen van resistentie die een impact hebben op de efficaciteit van behandelingen die inwerken op de ER of op HER-2. Uiteraard is de onderzoekspopulatie van deze studie te klein om deze hypothese op moleculair vlak te onderzoeken, te ondersteunen of te verwerpen. Wel blijkt de combinatie van Letrozole en 31
Trastuzumab een aanvaardbare, effectieve en goed getolereerde behandeling voor metastatische ER+ HER-2+ borsttumoren. Uiteraard zou dit verder onderzocht moeten worden in klinische studies die eveneens de mogelijkheid bieden om de moleculaire mechanismen van respons en resistentie te onderzoeken. (Marcom et al., 2007)
5.1.2. Letrozole en Lapatinib.
Tijdens het San Antonio Breast Cancer Symposium in december 2008 werden de eerste resultaten voorgesteld van een dubbelblinde, placebogecontroleerde klinische studie die het voordeel van Letrozole met of zonder Lapatinib bij onbehandelde hormoonreceptor positieve (HR+) gemetastaseerde post-menopauzale borstkankerpatiënten wou aantonen. Tweehonderd negentien van de 1286 patiënten waren positief voor HER-2, bepaald via IHC en/of via FISH. De gemiddelde progressievrije overleving, het primaire eindepunt van de studie, steeg significant van 3 maanden in de Letrozole monotherapiegroep naar 8.2 maanden in de combinatiegroep Letrozole en Lapatinib. De globale response ratio in de HER-2+ populatie nam ook toe van 14.8% naar 27.9% in de combinatiegroep. Ook was er een verbetering van het klinisch voordeel van 28.7% naar 47.7%. Er wordt in deze subset van patiënten een mogelijke algemene overlevingstrend waargenomen. De combinatie met Lapatinib verbetert significant de klinische efficaciteit van Letrozole bij HR+, HER-2+ gemetastaseerde borsttumoren. (Johnston et al., 2008)
5.1.3. Anastrozole.
De IMPACT studie (Smith et al., 2005), een multicenter dubbel blinde gerandomiseerde studie, vergeleek de klinische en biologische effecten tussen neo-adjuvant toegediend Tamoxifen, Anastrozole en de combinatie van beide bij postmenopausale vrouwen met ER positieve, invasieve, niet gemetastaseerde borstcarcinomen. Driehonderddertig vrouwen namen deel aan deze drie-armige studie. De globale respons bleek het hoogst te zijn bij de vrouwen behandeld met de combinatie van Anastrozole en Tamoxifen, gevolgd door de monotherapie met Anastrozole. De laagste respons werd opgemerkt bij een enkelvoudige therapie met Tamoxifen. De bekomen resultaten bleken niet significant te verschillen. Het aantal patiënten dat nood had aan een mastectomie bij het begin van de studie werd het meest 32
verlaagd door Anastrozole, dan door Tamoxifen en ten slotte door de combinatie van beide. Deze vrouwen bleken na deze behandeling kandidaat te zijn voor borstsparende chirurgie. Patiënten met tumoren die hoge niveaus van ER vertoonden, bleken het best te antwoordden op de therapie. Dit effect werd bemerkt in de 3 studiegroepen en was statistisch significant. (Smith et al., 2005) Een substudie van deze IMPACT trial bekeek het effect, aan de hand van biomarker Ki67 veranderingen, van HER-2 amplificatie of overexpressie op de therapierespons. Na 2 weken behandeling was de onderdrukking van Ki67 groter bij HER-2 negativiteit dan bij HER-2 positiviteit in de algemene patiëntenpopulatie. Er werd enkel een statistisch significant verschil gevonden in tumoren behandeld met Tamoxifen. Op het tijdstip van 12 weken bleek er ook een significant grotere reductie te zijn van Ki67 in HER-2 negatieve tumoren dan in de HER-2 positieve. Dit was zowel in de algemene populatie als in de Anastrozole groep statistisch significant. Kanttekening bij dit laatste resultaat is dat er bij het begin van de studie in de Anastrozole groep geen HER-2 positieve tumoren waren met een hoog niveau van Ki67, wat de waarde van het resultaat wel onzekerder maakt. (Dowsett et al., 2005) In de adjuvante setting bestudeerde de ATAC studie de Tamoxifen-, Anastrozole- en de combinatiebehandeling gedurende 5 jaar bij post-menopausale vrouwen met vroege nog opereerbare borsttumoren. Deze patiënten hadden vóór de studie al chirurgie ondergaan en chemotherapie gekregen. Vrouwen waarvan de hormoonreceptorstatus van de borsttumor ongekend was, werden ook opgenomen in de studie. Een initieel doel van de studie was het aantonen dat Anastrozole minstens even effectief is als Tamoxifen. In totaal namen 9366 vrouwen deel aan deze studie gerandomiseerd in 3 studie armen, namelijk Tamoxifen, Anastrozole en de combinatie. (Baum et al., 2002) Uit deze studie bleek dat vrouwen behandeld met Anastrozole een significant langere ziektevrij overleving en een verlengde tijd tot herval te hebben in vergelijking met Tamoxifen. Dit effect was groter in hormoonreceptor positieve patiënten. De incidentie van contralaterale borstkanker werd gereduceerd door Anastrozole alsook de metastasen op afstand. Opnieuw bleken deze effecten het grootst in tumoren positief voor hormoonreceptoren. Na deze initiële analyse werd de combinatiearm van de studie gesloten wegens lage efficaciteit. (Howell et al., 2005) Voor de identificatie van moleculaire kenmerken van tumoren die het verschil in respons tussen Anastrozole- en Tamoxifentherapie kunnen verklaren, werd de TransATAC studie 33
opgezet. Dit is een retrospectieve studie die gebruik maakt van gefixeerde tumorcoupes van 1918 patiënten uit de monotherapiearmen van de oorspronkelijke ATAC studie. Het effect van de expressie van ER, PgR en HER-2 in deze tumoren werd nagegaan. De relatie tussen het niveau van ER-posititviteit en de tijd tot herval was significant, met andere woorden, lagere niveaus van ER zijn geassocieerd met een kortere tijd tot herval. Dit effect was minder sterk voor Tamoxifen behandelde patiënten dan voor de Anastrozolebehandeling. Wat het PgR niveau betreft, was er een sterke correlatie met de tijd tot herval voor de Tamoxifenarm, maar nog sterker voor de Anastrozolearm. In HER-2 positieve patiënten was er geen beter effect van Anastrozole in vergelijking met Tamoxifen wat betreft de tijd tot herval. Deze patiënten vertonen een kortere tijd tot herval. PgR, HER-2 en ER zijn belangrijke predictoren voor behandeling met Tamoxifen en Anastrozole aangezien een lage ER-, een lage PgR-, of een hoge HER-2 expressie geassocieerd is met een hoger risico tot herval onder beide therapieën. De kwantitatieve expressie van ER, PgR en HER-2 status slaagde er niet in de patiënten aan te duiden die een groter voordeel zouden hebben bij een behandeling met Anastrozole dan bij een behandeling met Tamoxifen. (Dowsett, 2008) INTRODUCTION
De neo-adjuvante combinatie van Anastrozole en Gefitinb werd bestudeerd bij 206 postmenopauzale vrouwen met niet gemetastaseerde ER en/of PgR positieve adenocarcinomen van de borst. De HER-2 status werd bepaald via FISH, maar positiviteit voor deze receptor was geen vereiste voor deelname aan de studie gezien de lage HER-2 positiviteit, vooral in ER positieve tumoren. De deelneemsters werden in 3 behandelgroepen gerandomiseerd. Alle patiënten kregen gedurende 16 weken een behandeling met Anastrozole, waarbij groep A tijdens die periode dagelijks ook Gefitinib kreeg. Groep B kreeg de eerste 2 weken naast Anastrozole een placebo gevolgd door Gefitinib de resterende 14 weken. Groep C kreeg tijdens de volledige studieperiode placebo naast de AI. Deze studie wou aan de hand van de veranderingen van de proliferatiemarker Ki67 een eventueel uitstel van resistentie in borsttumoren aantonen onder deze combinatietherapie. Er bleek geen significant verschil te zijn in de verandering in Ki67 voor de groep Anastrozole en Gefitinib in vergelijking met de groep die alleen Anastrozole kreeg. Tweeëntwintig patiënten bleken HER-2 positieve tumoren te hebben. Ook hier bleek er, ondanks het kleine aantal patiënten, geen verschil te zijn tussen de studiegroepen wat betreft veranderingen in Ki67, alsook voor de veranderingen in klinische respons. Deze neo-adjuvante studie 34
suggereert dat er geen bijkomend klinisch of biologisch effect is door de combinatietherapie Anastrozole en Gefitinib. (Smith, 2007)
5.1.4. De Celecoxib anti-aromatase neoadjuvante studie.
Deze studie bepaalde het niveau van de HER-2/neu expressie bij 36 post-menopauzale borstkankerpatiënten, alsook eventuele veranderingen in de expressie ervan na een behandeling ofwel met Letrozole ofwel met Exemestane. Het identificeren van een eventuele relatie tussen de HER-2/neu expressie en het antwoord op de AI behandeling was eveneens een studiedoel. Via IHC bepaling werden 16 van de 36 patiënten vóór de AI behandeling HER-2/neu positief ( een score van 2+ of 3+) bevonden ten opzichte van 5 na de behandeling. Voor FISH (bepaling van amplificatie van het gen) bedroeg het aantal HER-2/neu positieve patiënten vóór behandeling 20 en erna nog 5. De respons op de AI behandeling bleek significant beïnvloed te worden door de initiële HER-2/neu status. HER-2 positieve tumoren vertoonden een hogere respons ratio dan de HER-2 negatieve tumoren. Ook bleken de tumoren die na behandeling een gedaalde HER-2 expressie vertoonden een betere respons te hebben dan tumoren die geen verandering hadden in de expressie van HER-2. Uiteindelijk concludeerde deze studie dat zowel de expressie van HER-2 als een daling van deze expressie een predictieve waarde kan hebben voor de behandeling van borsttumoren. (Zhu et al., 2004)
5.2. De Akt signaalweg. Akt of proteïne kinase B, behoort tot de familie van de serine/threonine kinases. Na de stimulatie met groeifactoren en cytokines wordt PI3K geactiveerd. Deze zal ter hoogte van de celmembraan Akt recruteren waar deze laatste ook gefosforyleerd wordt ter hoogte van zowel het threonine- als van het serine-uiteinde. Akt wordt zo volledig geactiveerd en levert signalen die de cel beschermen tegen apoptose en die de celproliferatie, -groei, -migratie en – overleving, geïnduceerd door groeifactoren, medieëren. Wanneer Akt geactiveerd is, komt het los van de membraan waardoor het voor deze molecule mogelijk wordt om zowel de substraten in het cytosol als in de kern te fosforyleren. Deze opdeling in compartimenten kan belangrijk zijn in de uitgeoefende effecten van Akt. (Park and Sung, 2007) Uit een studie op 35
127 chirurgisch gereseceerde invasieve ductale borstcarcinomen blijkt dat er een significante associatie is tussen de overexpressie van HER-2 en hoge niveaus van cytoplasmatisch en nucleair pAkt. Deze correlatie werd ook gevonden tussen een hoog niveau van nucleaire pAkt en een hoog niveau van nucleaire ER en PgR. Dit werd niet gevonden tussen cytoplamatisch pAkt en de hormoonreceptoren. (Park and Sung, 2007) De pathway via Akt speelt een belangrijke rol in de controle van het evenwicht tussen celoverleving en apoptose. Verschillende humane kankers vertonen frequent een verandering in de normale Akt/PKB signaalweg. Dit enzym blijkt van belang te zijn bij progressie en celoverleving. (Park and Sung, 2007 en Tokunaga, 2006) In de retrospectieve studie van Tokunaga et al. (2006) werd de relatie nagegaan tussen de activatie van Akt en de efficaciteit van endocriene therapieën in metastatische borstcarcinomen. Zesendertig patiënten met gemetastaseerde borstkanker, waarvan 6 HER-2 positief, werden opgenomen in deze studie. De HER-2 positieve tumoren vertoonden een hogere graad van activiteit van Akt dan in HER-2 negatieve tumoren. Tumoren met geactiveerd Akt hadden een slechtere objectieve respons alsook een slechtere efficaciteit van de endocriene therapieën in vergelijking met Akt negatieve tumoren. Het klinische voordeel was het kleinst in tumoren die zowel HER-2 als p-Akt positief zijn. Ook bleek Akt verantwoordelijk te zijn voor het induceren van resistentie in gemetastaseerde borsttumoren onafhankelijk van de gebruikte endocriene therapie. De activatie van Akt blijkt dus geassocieerd te zijn met Tamoxifenresistentie. Experimentele studies hebben aangetoond dat oestradiol de PI3K/Akt weg snel kan activeren langs de HER-2 signaalweg. Hierdoor ontstaat een actieve vorm van Akt die het effect van oestrogeen mimeert in afwezigheid ervan. Dit suggereert dat borstkankercellen met geactiveerd Akt kunnen overleven wanneer oestrogeen onderdrukt wordt zoals bij een behandeling met een AI het geval is. (Tokunaga et al., 2006) Deze bevindingen suggereren dat pAkt activatie en HER-2 overexpressie kunnen resulteren in een hormoononafhankelijk fenotype en resistentie voor endocriene therapieën zoals Tamoxifen. pAkt kan dus, naast ER, PgR en HER-2, een nuttige predictor zijn voor resistentie aan endocriene therapie gebruikt als behandeling voor borstkanker. (Park and Sung, 2007 en Tokunaga, 2006)
36
Figuur 10 - Mechanismen voor endocriene resistentie in Akt-geactiveerde cellen. (Tokunaga et al., 2006)
Figuur 10 (Tokunaga et al., 2006) toont dat de activatie van membraan tyrosine kinasen een stimulus is die leidt tot de activatie van Akt. Eens Akt geactiveerd, promoot het de expressie van de oestrogeenreceptorgenen wat leidt tot celgroei. Dit effect wordt zelfs bekomen in de afwezigheid van oestrogeen, dus onder AI behandeling, alsook bij een therapie met Tamoxifen. Oestrogeen onafhankelijke tumorgroei in kankercellen met geactiveerd Akt kan geassocieerd zijn met resistentie.
37
Discussie Oestrogenen spelen een belangrijke rol in de ontwikkeling en progressie van borstcarcinomen, dit betekent dat deze tumoren hormoonafhankelijk zijn. Antihormoonbehandelingen blijken een goede therapeutische aanpak aangezien ongeveer 70% van de borsttumoren ER en/of PgR tot expressie brengen. De verschillende endocriene therapieën waaronder de selectieve oestrogeen receptor modulatoren (SERM) zoals Tamoxifen, de aromatase-inhibitoren (AI) en de pure ER antagonisten, hebben de genezingsratio’s, de levenskwaliteit en de ziektepreventie van borsttumoren sterk verbeterd. Ondanks de aanwezigheid van ER in deze tumoren, zullen verschillende patiënten resistentie ontwikkelen tegenover deze antihormoonbehandelingen. Deze resistentie kan van bij het begin van de behandeling, de novo, optreden ofwel kan er ziekteprogressie of herval optreden tijdens de behandeling in tumoren die initieel wel reageerden. Verschillende mechanismen zouden kunnen bijdragen tot het ontwikkelen van resistente borsttumoren. In deze thesis werd de relatie tussen de ER-signaalweg en de groeifactorreceptor HER-2/neu signaalweg bestudeerd alsook de mogelijke rol van deze laatste in het ontwikkelen van borsttumoren resistent aan endocriene therapieën. HER-2/neu is een proto-oncogen coderend voor de HER-2 receptor die deel uitmaakt van een familie van 4 transmembraan receptor tyrosine kinasen gelegen ter hoogte van de celmembraan in verschillende weefsels. Via de binding van liganden aan de verschillende HER-receptoren, uitgezonderd aan HER-2, zullen deze receptoren zowel homo- als heterodimeren vormen waardoor ze geactiveerd worden. De signaaltransductie hierop volgend is een interactief systeem waarbij verschillende signaalwegen geactiveerd worden waaronder onder andere MAPK en Akt. Deze signaalwegen dragen bij tot celproliferatie en celoverleving. Tijdens het foetale leven heeft de HER-familie een belangrijke functie in de ontwikkeling van verschillende organen en orgaansystemen. Na de geboorte blijkt HER-2 een regulerende rol te spelen tijdens de normale borstgroei en –ontwikkeling. Amplificatie en overexpressie van de HER-2 receptor komt voor in 20 à 30% van de borstcarcinomen en is geassocieerd met agressievere borsttumoren, een kortere overlevingstijd en een kortere tijd tot herval. In HER-2 positieve borstcarcinomen worden verschillende downstream signaalwegen, betrokken in de celgroei en –proliferatie, geactiveerd. De Akt-signaalweg zal in borsttumoren 38
met overexpressie van HER-2, de p53 activiteit onderdrukken waardoor er een vertraging is van de p53 gemedieërde apoptose. Deze signaalweg fosforyleert eveneens de groei-inhibitor p21Cip1/Waf1 waardoor zijn inhiberende rol op celgroei verminderd is. NF-кB wordt ook door Akt gefosforyleerd in deze borsttumoren met een verhoogde expressie van NF-кB antiapoptose genproducten tot gevolg. Via MAPK, een andere downstream signaalweg van HER2, is er een verlies aan groei-inhibitie van de cel doordat de degradatie van een cyclinedependente kinase inhibitor bevorderd wordt. Om de volledige signaalcascade te blokkeren, kan men de HER-2 expressie onderdrukken waardoor maligne celgroei tegengegaan kan worden. Het blokkeren van andere moleculen in de cascade kan onvoldoende zijn om het oncogene effect van HER-2 tegen te gaan door de mogelijkheid om via andere moleculen langs een alternatieve weg de blokkade te kunnen kortsluiten. ER spelen een belangrijke rol in de ontwikkeling van het normale borstweefsel alsook in de ontwikkeling en progressie van borstkanker. Er bestaat zowel een α- als een β-vorm van de oestrogeenreceptor. Beide zijn aanwezig in normaal borstweefsel, maar enkel de α-vorm van de ER blijkt belangrijk te zijn voor de normale ontwikkeling van borstklieren. Daarnaast speelt deze α-vorm een rol in het ontstaan en de progressie van borstkanker. De binding van een ligand op de oestrogeenreceptor, dat voornamelijk als nucleair eiwit functioneert, zal leiden tot het vrijlaten van de receptor van zijn inhiberend complex alsook tot de dimerizatie van de receptor waardoor deze makkelijker kan binden met zijn coregulatoire proteïnen. Deze laatsten kunnen de transcriptionele activiteit van de ER zowel onderdrukken, de co-repressoren, als activeren, de co-activatoren zoals AIB1. De transcriptionele activiteit van ER op specifieke DNA-elementen, namelijk de oestrogeen respons elementen, wordt hierdoor dus veranderd. Dit is de klassieke actie van de ER. Via de niet-klassieke ER weg, zal de receptor de gentranscriptie van DNA-gebieden resonsief aan andere transcriptiefactoren, zoals c-fos en c-jun, reguleren op een indirecte manier via proteïn-proteïn interactie. Zowel de klassieke als de niet-klassieke weg behoren tot de nucleaire genomische activiteit van de ER waardoor de expressie van genen coderend voor proteïnen met een belangrijke rol in tumorgroei geïnduceerd wordt. Naast de oestrogeenreceptoren in de kern, bevindt er zich een deel van deze receptoren in het cytoplasma van de cel alsook ter hoogte van de celmembraan. Hierdoor kunnen snelle stimulerende effecten op verschillende transductiewegen en moleculen uitgeoefend worden. 39
Via deze plasmamembraan geassocieerde ER functie stijgt het niveau van secundaire signaalmoleculen zoals cAMP en worden verschillende tyrosine kinase receptoren zoals HER-2 geactiveerd. Dit noemt men de niet-genomische membraan ER activiteit. De oestrogeenreceptor- en de groeifactorsignaalwegen verlopen niet naast elkaar, maar er is sprake van een bidirectionele crosstalk tussen beide pathways. Zij kunnen elkaar hierdoor op verschillende manieren beïnvloeden en dus uiteindelijk ook de celgroei. Groeifactorreceptoren kunnen geactiveerd worden via ondermeer G-proteïnen en PI3K na de binding van oestrogeen aan de membraangebonden ER. Verderop in de signaalcascade worden dan secundaire signaal messengers en kinase signaalwegen zoals p21Ras/p42/44 MAPK en Akt geactiveerd waardoor celprocessen van proliferatie, groei en overleving geactiveerd worden. Het blootstellen aan oestrogeen van cellen die zowel HER-2 als ER tot expressie brengen, leidt tot activatie van deze alternatieve signaalwegen met celproliferatie en –overleving tot gevolg. Zowel de ER als zijn co-regulerende proteïnen kunnen gefosforyleerd en dus geactiveerd worden door verschillende kinasen zoals MAPK en Akt, zelf geactiveerd door HER-2. Dit is belangrijk voor de groeifactoren om hun effecten uit te oefenen op de ER signaalweg. De co-regulatoren blijken een belangrijke rol te spelen in de oestrogeengemedieërde tumorgroei alsook in de sensitiviteit of resistentie voor endocriene therapie. De crosstalk tussen beide signaalwegen leidt tot een verhoogde signaalactiviteit van zowel de ER- als van de groeifactorreceptorsignaalweg. Hierdoor wordt de overleving van borstkankercellen verhoogd en kunnen deze potentieel meer resistent worden aan unieke vormen van moleculaire therapie. De farmacologische blokkade van de klassieke oestrogeensignaalweg kan omzeild worden door het overschakelen naar alternatieve groeifactor gemedieerde signaalwegen. Eveneens blijkt er tussen het niveau van ER-α en het niveau van HER-2 een omgekeerde relatie te bestaan. Het kan nodig zijn om op verschillende niveaus de ER- en andere pathways te inhibiren om zo de groei van kankercellen tegen te gaan. Door de verbinding tussen de verschillende signaalwegen kan de tumorcel via nucleaire en extranucleaire weg op gepaste en gecoördineerde manier reageren op het extracellulair niveau van oestrogeen.
40
Verschillende laboratoriumstudies op zowel cellijnen als op xenogreffen werden besproken om de invloed van HER-2 op de verschillende behandelingen na te gaan. Eveneens werd gezocht naar mogelijke verklarende mechanismen voor resistentie aan de verschillende endocriene therapieën. Tamoxifen, een SERM, is een zeer belangrijke therapie in de behandeling van borstkanker waardoor het risico op herval en overlijden van vrouwen met hormoonreceptor positieve borsttumoren significant gereduceerd wordt. Het effect van deze therapie is weefselspecifiek aangezien het in het bot en endometrium als een oestrogeenagonist werkt, terwijl het in het borstweefsel de oestrogeengeïnduceerde groei inhibeert via een competitieve blokkade van de ER. Ondanks de aanwezigheid van ER, zal ongeveer 50% van de borsttumoren niet reageren op een behandeling met Tamoxifen. Uit een studie op MCF-7 borstkankercellen met een matig niveau aan ER, lage niveaus EGFR en HER-2 en hoge niveaus AIB1 en hun afgeleide dochtercellen MCF-7/HER2-18, blijkt dat de MCF-7 moedercellen gestimuleerd worden door oestrogeen en geïnhibeerd door de wegname van oestrogeen al dan niet in combinatie met Tamoxifen. De dochtercellen daarentegen blijken in hun groei gestimuleerd door zowel oestrogeen als door Tamoxifen en geïnhibeerd door oestrogeendeprivatie. Tamoxifen functioneert dus als een oestrogeenagonist in cellen die HER-2 tot overexpressie brengen. MAPK bleek hierbij eveneens verhoogd te zijn. De agonistische werking van Tamoxifen in HER-2 positieve cellen kan verklaard worden door de aanwezigheid van co-activatoren op oestrogeengerelateerde genen. Het toevoegen van Gefitinib, een tyrosine kinase inhibitor, aan deze cellen bracht aan het licht dat er tussen de ER- en de HER-2 signaalwegen een belangrijke bidirectionele crosstalk plaatsvond aangezien de fosforylatie van de ER door Tamoxifen in de MCF-7/HER2-18 cellen gedeeltelijk werd tegengehouden door het TKI. Dit was in de MCF-7 cellen niet het geval waaruit geconcludeerd werd dat de fosfoylatie van de ER door Tamoxifen onafhankelijk van de EGFR of HER-2 status verliep. Gefitinib verhinderde eveneens de gestegen fosforylatie van EGFR, HER-2, MAPK, AKT en ERK1,2 MAPK. In humane ER- en HER-2 positieve BT-474 borstcarcinoomcellen werd Tamoxifen gecombineerd met Trastuzumab, een monoclonaal HER-2 antilichaam. De combinatietherapie zorgde voor een bijna volledige groei-inhibitie in deze cellijn. Het aantal cellen in de G0-G1 fase van de celcyclus steeg terwijl het aantal cellen in de S-fase daalde. Deze waargenomen effecten waren steeds belangrijker bij de combinatietherapie dan onder beide monotherapieën. 41
Geen enkele van deze 3 therapieën resulteerde in de apoptose van de BT-474 cellen. Trastuzumab verminderde het niveau van geactiveerd dus gefosforyleerd HER-2 in tegenstelling tot Tamoxifen dat hierop geen effect bleek te hebben. De combinatietherapie had geen bijkomend effect wat betreft het niveau van gefosforyleerd HER-2 op een monotherapie met Trastuzumab. Het expressieniveau van HER-2 werd niet veranderd door de verschillende therapiemogelijkheden. In Tamoxifen resistente ER- en HER-2 positieve borstkankercellijnen, MCF-7/HER2 en BT474 werden er significant verhoogde niveaus van NFкB en AP-1 gevonden, in vergelijking met Tamoxifen gevoelige ER-positieve/HER-2 negatieve MCF-7 cellen. Het toevoegen van parthenolide of van bortezomib aan de resistente cellijnen deed de genexpressie van NFкB en AP-1 dalen en de tumorgroei werd geïnhibeerd. Het combineren van deze therapieën met Tamoxifen in de resistente cellen had geen enkel bijkomend effect. De directe inhibitie van de constitutief verhoogde transcriptieactiviteit van NFкB en AP-1 kan de endocriene respons verbeteren in Tamoxifen resistente ER positieve borstcarcinomen door het recruteren van NCoR aan ER dat gebonden is met Tamoxifen als ligand. Er kunnen 3 verschillende fasen onderscheiden worden bij het ontstaan van borsttumoren resistent aan Tamoxifen. Uit een laboratoriumstudie met MCF-7 ER-α positieve cellen, gevoelig aan therapie met Tamoxifen, ontstaat de eerste fase van resistentie na een behandeling met Tamoxifen gedurende minder dan 2 jaar waarbij de cellen zullen groeien onder oestrogeen alsook onder Tamoxifen. Na 5 jaar Tamoxifen ontstaat de tweede fase van resistentie waarin Tamoxifen de groei stimuleert en oestrogeen paradoxaal de groei inhibeert. In deze tweede fase van resistentie werd gevonden dat sommige tumoren door het gebruik van lage dosissen oestrogeen opnieuw gevoelig werden aan een behandeling met Tamoxifen. De derde fase van resistentie ontstond wanneer alle behandelingen, waaronder ook AI en Fulvestrant die in de vorige 2 fasen nog actief waren, faalden en enkel nog oestrogeen de groei inhibeerde. Overexpressie van HER-2/neu blijkt een belangrijke rol te spelen in de fase II resistentie. Toch blijkt dat enkel de HER-2 overexpressie onvoldoende is om de Tamoxifenresistentie van borsttumoren te verklaren aangezien het niveau van HER-2 hoog blijft in de tumoren die opnieuw gevoelig geworden waren aan Tamoxifen. De identificatie van biologische markers in de verschillende fasen van resistentie is belangrijk aangezien er naast HER-2 nog andere signaalmoleculen mogelijk een rol spelen in de progressie naar resistentie.
42
De aromatase inhibitoren (AI) verhinderen de conversie van androgene precursoren naar oestrogeen en hebben geen agonistische activiteit zoals de SERMs. Deze AI’s vormen ook een effectieve vorm van endocriene therapie in de behandeling van borstkanker, maar waartegen er eveneens resistentie kan ontstaan. De laboratoriumstudies vonden dat Letrozole in MCF-7Ca, ER+ borstkankercellen een belangrijk anti-tumoraal effect had, maar dat ondanks verdere therapie de tumoren toch opnieuw begonnen te groeien. Het niveau van p-ER, niet dat van ER, bleek in de resistente tumoren,
LTLT-Ca,
gestegen.
Dit
suggereert
dat
de
tumorproliferatie
op
een
ligandonafhankelijke manier verloopt, zelfs onder Letrozolebehandeling. De activatie van groeifactorreceptorsignaalwegen
HER-2/Raf/MAPK
blijkt
verantwoordelijk
voor
de
omschakeling van responsieve tumoren naar niet responsieve tumoren. In de Letrozole resistente tumoren was de ER expressie sterk gedaald daar waar HER-2, p-Raf, pMER1/2 en p-MAPK gestegen waren. De groei van resistente tumoren gebeurde onafhankelijk van oestrogeenstimulatie door de crosstalk tussen HER-2/Raf/MAPK en ER waarbij deze laatste constitutief geactiveerd werd door fosforylatie via de groeisignalen. Het toevoegen MAPK en MEK1/2 inhibitoren had geen effect op de MCF-Ca cellen, maar had wel een groei-inhiberend effect op de resistente cellen. Het niveau van ER steeg opnieuw. Trastuzumab therapie in de LTLT-Ca cellijn blokkeerde de groei van de cellen en herstelde het niveau van ER en de gevoeligheid voor oestradiol volledig. Eveneens werd hierdoor pHER-2 en p-MAPK geïnhibeerd. De Letrozole resistente cellen werden opnieuw gevoelig voor hormonen en AI door de blokkade van groeifactorreceptor signalen. De combinatie van Letrozole en Trastuzumab heeft een synergistisch effect op de groei-inhibitie, maar uit onderzoek is gebleken dat Trastuzumab best pas toegevoegd wordt aan Letrozole wanneer tumoren hiervoor refractair geworden zijn. De combinatie van Gefitinib en een AI vertraagt het ontstaan van resistentie in borstkankercellen. Het niveau van p-MAPK, p-HER-2 en p-Akt wordt verlaagd en dat van ER verhoogd. Bij het ontstaan van resistentie voor deze therapie wordt het omgekeerde vastgesteld. Het overschakelen van Tamoxifen naar Letrozole in Tamoxifenresistente borstkankercellen blijkt significant effectiever dan het voortzetten van de Tamoxifenbehandeling. Andersom worden deze resultaten niet waargenomen aangezien tumoren resistent aan AI ongevoelig zijn voor SERMs door de down-regulatie van ER en door het constitutief activeren ervan.
43
Een complete oestrogeenblokkade kan bekomen worden door het combineren van een AI met Fulverstrant aangezien deze zowel ER down-reguleren als de oestrogeensynthese inhiberen. Dit blijkt een goed en groter effect te hebben op de onderdrukking van tumorgroei, HER-2 en p-MAPK, dan het effect van elke therapie apart. De resistentie aan hormonale therapieën kan uitgesteld en misschien zelfs tegengaan worden. Wanneer Trastuzumab en Lapatinib, een dubbele tyrosine kinase inhibitor, gecombineerd worden in cellijnen die HER-2 tot overexpressie of tot amplificatie brengen, dan zullen de inactieve HER-2 receptoren ter hoogte van de celmembraan accumuleren door Lapatinib. Hierdoor
verhoogt
het
aantal
bindingsplaatsen
voor
Trastuzumab
waardoor
de
celcytotoxiciteit door deze laatste toeneemt. Verder werden klinische studies besproken waarbij verschillende therapieën vergeleken werden bij specifieke patiëntenpopulaties van vrouwen met borstkanker. De relatie tussen HER-2 en de reactie van de tumoren op therapie werden in deze studies ook bestudeerd. De Letrozole studie was één van de eerste neo-adjuvante gerandomiseerde klinische studies die het verschil in respons bestudeerde tussen Letrozole en Tamoxifen bij post-menopauzale vrouwen met borsttumoren positief voor ER en/of PgR, ErbB1 en/of ErbB2. Deze studie vormde ook de basis voor het onderwerp van deze thesis. In ER+PgR+ tumoren blijkt de respons ratio voor Letrozole therapie hoger te zijn dan voor Tamoxifen. Slechts een klein percentage van de patiënten had ER positieve, ErbB-1/ErbB-2 positieve tumoren. Deze vertoonden een significant hogere respons op Letrozole dan tumoren die ER+, maar ErbB1/ErbB-2 negatief zijn. Deze laatsten reageren beter op Tamoxifen dan de ErbB-1/ErbB-2 positieve tumoren. Door het kleine aantal ER positieve, ErbB-1/ErbB-2 positieve carcinomen is er onvoldoende statistische kracht om te besluiten dat deze tumoren resistent zijn aan Tamoxifen. Wel mag men concluderen dat Letrozole effectiever is dan Tamoxifen in deze tumoren. HER-2 positieve tumoren hebben hogere niveaus van Ki67, een merker van proliferatie, vóór de behandeling alsook een hogere histologische graad dan HER-2 negatieve tumoren. Na behandeling kon er geen statisch significant verschil gevonden worden tussen patiënten behandeld met Tamoxifen en deze behandeld met Letrozole wat betreft biomerkers en klinische karakteristieken. Het anti-proliferatief effect van Tamoxifen alsook van Letrozole bleek wel statistisch significant te zijn in HER-2 negatieve tumoren, maar niet in HER-2 44
positieve tumoren. Deze bevindingen kunnen opnieuw het gevolg zijn van het kleine aantal HER-2 positieve tumoren. Deze 2 behandelingen, al dan niet in combinatie, werden eveneens in de adjuvante setting vergeleken bij post-menopauzale borstkankerpatiënten. Er werd geconcludeerd dat Letrozole een effectieve optie is als standaard adjuvante therapie. Op vlak van ziektevrije overleving blijkt een initiële behandeling met Letrozole beter dan een behandeling met Tamoxifen. Wat de HER-2 status betreft, blijkt Letrozole de ziektevrije overleving te verbeteren in vergelijking met Tamoxifen onafhankelijk van HER-2 positiviteit of negativiteit. Volgens de BIG 1-98 mag HER-2 dus niet als selectiefactor gebruikt worden voor het bepalen van de initiële adjuvante endocriene therapie. HER-2 positieve tumoren bleken wel een significant slechtere prognose te hebben dan HER-2 negatieve tumoren. Het combineren van Letrozole en Trastuzumab blijkt een aanvaardbare, effectieve en goed getolereerde behandeling voor metastatische ER+ en/of PgR+ HER2+ tumoren. Er zou mogelijks een gemeenschappelijk mechanisme van resistentie zijn aangezien in deze studie ongeveer de helft van de onderzoekspopulatie geen klinisch voordeel blijkt te hebben. Opnieuw was de studie te klein. Een studie waarin patiënten ofwel Letrozole ofwel Exemestane toegediend kregen, vond dat HER-2 positieve tumoren beter reageerden op de therapie dan HER-2 negatieve tumoren. De respons op de behandeling bleek significant beïnvloed te worden door de initiële HER-2/neu status en de expressie ervan kan een predicitieve waarde hebben voor de behandeling van borsttumoren. Studies omtrent Anastrozole, eveneens een AI, Tamoxifen of de combinatie tonen aan dat in de neo-adjuvante setting met de combinatie van Anastrozole en Tamoxifen de beste respons bekomen wordt bij post-menopauzale vrouwen met ER positieve borstcarcinomen. Anastrozole monotherapie daarentegen verlaagde het meest de nood aan mastectomieën. De onderdrukking van Ki67 was groter in HER-2 negatieve dan in HER-2 positieve tumoren. Adjuvante studies rond deze therapieën bij post-menopauzale vrouwen met borstkanker concluderen dat de Anastrozole behandeling een significante langere ziektevrije overleving, een verlengde tijd tot herval en een daling van de incidentie van contralaterale borstkanker en metastasen op afstand voor gevolg had in vergelijking met Tamoxifen. De combinatie van de 2 therapieën bleek niet effectief. Wat HER-2 positiviteit betreft, kon er geen beter effect gevonden worden voor Anastrozole in vergelijking met Tamoxifen wat betreft de tijd tot 45
herval. Deze tumoren hebben een kortere tijd tot herval. PgR, HER-2 en ER zijn belangrijke predictoren voor behandeling met Tamoxifen en Anastrozole aangezien een lage ER- of een lage PgR- of hoge HER-2 expressie geassocieerd is met een hoger risico tot herval onder beide therapieën. Het neo-adjuvant toedienen van Anastrozole en Gefitinib als monotherapie of in combinatie aan post-menopauzale borstkankerpatiënten, bleek geen significant verschil aan te kunnen tonen in Ki67 veranderingen tussen beide behandelgroepen. Ook voor patiënten met HER-2 positieve tumoren kon men geen verschil aantonen tussen beide therapieën in verband met Ki67. Er wordt gesuggereerd dat er geen bijkomend klinisch of biologisch effect is door de combinatietherapie. Uit recent onderzoek blijkt dat de combinatie van Lapatinib met Letrozole de klinische efficaciteit van deze laatste, bij HR+, HER-2+ gemetastaseerde borsttumoren, significant verbetert. De gemiddelde progressievrije overleving alsook de globale respons nam toe onder deze combinatietherapie in vergelijking met monotherapie Letrozole. De overexpressie van HER-2 blijkt geassocieerd te zijn met hoge niveaus van p-Akt. Deze tumoren hebben een slechtere respons alsook een slechtere efficaciteit van endocriene therapieën in vergelijking met Akt negatieve tumoren. Onafhankelijk van de therapie blijkt Akt hiervoor resistentie te induceren in gemetastaseerde borstcarcinomen. pAkt zou dus een nuttige predictor zijn voor resistentie aan endocriene therapieën. Het is moeilijk om de verschillende studies en hun resultaten met elkaar te vergelijken aangezien ze zowel in het ontwerp, als in de onderzoekspopulatie als in de eindpunten zeer heterogeen zijn. Op vlak van studiedesign is het onmogelijk om neo-adjuvante studies met adjuvante te vergelijken. In adjuvante studies werden de deelneemsters voorafgaand aan het onderzoek al behandeld met chirurgie, chemotherapie, radiotherapie of een combinatie ervan. Hiermee moet rekening gehouden worden bij het interpreteren van de studieresultaten aangezien vertekening kan optreden door de mogelijke invloed van behandelingen voorafgaand aan de studie. Bij neo-adjuvante studies bestaat het risico op deze bias niet aangezien de patiënten nog geen enkele therapie ondergaan hebben. Bijkomend voordeel van neo-adjuvante behandelingen is dat er een betere patiëntenselectie mogelijk is om zo niet-reagerende tumoren sneller te ontdekken. Daarnaast kunnen de mechanismen van respons op therapie 46
beter bestudeerd worden en kan de neo-adjuvante therapie de resultaten van chirurgie verbeteren. Het niveau van HER-2 wordt op verschillende manieren bepaald wat de vergelijking tussen de studies eveneens bemoeilijkt. De HER-2 status kan in het serum bepaald worden alsook via IHC en FISH. De meeste studies bepalen eerst HER-2 via IHC en dan worden de tumoren positief voor HER-2 verder onderzocht met de FISH techniek. Er is dus nood aan een gestandaardiseerde manier om HER-2 te bepalen in borsttumoren wat de vergelijking eenvoudiger en eenduidiger zal maken. In vele studies wordt het onderzoek naar HER-2 en zijn invloed op therapie niet opgenomen in het initiële studie-ontwerp, maar wordt pas erna retrospectief op vriescoupes onderzocht. Uiteraard ondermijnt dit de sterkte van de bekomen resultaten. De studies alsook de follow-up worden vaak over een korte periode uitgevoerd waardoor resultaten op lange termijn ontbreken. De studiepopulaties zijn tussen de verschillende studies eveneens moeilijk te vergelijken. De inclusie- en exclusiecriteria zijn zeer divers. Sommige studies worden opgezet voor postmenopauzale vrouwen, andere voor gemetastaseerde borstcarcinomen waardoor vergelijking onmogelijk is. Aangezien het aantal tumoren dat zowel ER- als HER-2 positief is klein is doordat deze twee receptoren omgekeerd evenredig gerelateerd zijn, zijn de studiepopulaties niet heel groot waardoor de bevindingen vaak als statistisch niet significant bestempeld worden. Een kleine studiepopulatie ondermijnt wederom de statistisch kracht van een onderzoek en zijn resultaten. De eindpunten die als doel voor de studies bepaald worden, verschillen eveneens. Sommige studies gebruiken klinische eindpunten zoals tijd tot herval, daar waar andere studies biologische eindpunten zoals veranderingen in Ki67 gebruiken. Deze bemerkingen gelden uiteraard ook voor de laboratoriumstudies. Specifiek hiervoor kan men nog opmerken dat bij de cellijnstudies ofwel humane borstkankercellen (BT-474 cellijnen) ofwel genetisch aangepaste borstkankercellen (MCF-7 cellijnen) gebruikt worden. Ook hiermee moet rekening gehouden worden bij de interpretatie van studieresultaten.
47
Uit al deze studies blijkt dat er geen eenduidig antwoord geformuleerd kan worden op de vraag of HER-2 de gevoeligheid voor endocriene therapieën in borstkanker beïnvloedt. In deze thesis wordt via verschillende invalspunten de mogelijke invloed van HER-2 op resistentie belicht. Het onderzochte onderwerp werd vrij breed gelaten omdat het onderzoek naar HER-2 en resistentie voor endocriene therapieën meerdere facetten aanhaalt en zeer gevarieerd is. HER-2 positieve tumoren zijn complexe tumoren met een agressiever verloop. Vele onderzoeken en studies bevestigen het bestaan van de bi-directionele crosstalk tussen de ERen HER-2 signaalweg, maar er bestaat nog geen eenduidigheid over de invloed ervan op therapieresistentie en over de mogelijke predictieve rol van HER-2 in borstcarcinomen. Deze signaalwegen en mechanismen van resistentie zouden in de toekomst door bijkomend onderzoek, zowel in laboratoriumstudies als in klinische trials, nog verder onderzocht moeten worden opdat nieuwere therapieën, therapieschema’s en combinaties van therapieën kunnen opgesteld worden waardoor de overleving en genezing van deze borstkankerpatiënten verbeterd kan worden.
48
Referenties 1. ARGIRIS A., WANG C.-X., WHALEN S.G., DIGIOVANNA P. : Synergistic interactions between Tamoxifen and Trastuzumab (Herceptin). Clin. Cancer Res., 2004, 10, 1409-20. 2. BAUM M., BUDZAR A.U., CUZICK J., FORBES J., HOUGHTON J., KLIJN J.G., SAHMOUD T. : Anastrozole alone or in combination with tamoxifen versus tamoxifen alone for adjuvant treatment of postmenopausal women with early breast cancer: first results of the ATAC randomised trial. The Lancet, 2002, 359, 2131-39. 3. BRODIE A., SABNIS G., JELOVAC D. : Aromatase and breast cancer. J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 2006, 102, 97-102. 4. DOWSETT
M.,
EBBS
S.,
DIXON
M.,
SKENE
A.,
GRIFFITH
C.,
BOEDDINGHAUS I., SALTER J., DETRE S., HILLS M., ASHLEY S., FRANCIS S., WALSH G., SMITH I. : Biomarker changes during neoadjuvant Anastrozole, Tamoxifen or the combination: influence of hormonal status and HER-2 in breast cancer-a study from the IMPACT trialist. J. Clin. Oncol., 2005, 23, 2477-92. 5. DOWSETT M., ALLRED C., KNOX J., QUINN E., SALTER J., WALE C., CUZICK J., HOUGHTON J., WILLIAMS N., MALLON E., BISHOP H., ELLIS I., LARSIMONT D., SASANO H., CARDER P., CUSSAC A.L., KNOX F., SPEIRS V., FORBES J., BUZDAR A. : Relationship Between Quantitative Estrogen and Progesterone Receptor Expression and Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER-2) Status With Recurrence in the Arimidex, Tamoxifen, Alone or in Combination Trial. J. Clin. Oncol., 2008, 26, 1059-65.
49
6. ELLIS M.J., COOP A., SHING B., MAURIAC L., LLOMBERT-CUSSAC A., JÄNICKE F., MILLER W.R., EVANS D.B., DUGAN M., BRADY C., QUEBE-FEHLING E., BORGS M. : Letrozole is more effective neuadjuvant endocrine therapy than tamoxifen for ErbB-1- and/or Erbb-2-positive, estrogen receptor-positive primary breast cancer: evidence from a phase III randomized trial. J. Clin. Oncol., 2001, 15, 3808-16. 7. ELLIS M.J., TAO Y., YOUNG O., WHITE S., PROIA A.D., MURRAY J., RENSHAW L., FARATIAN D., THOMAS J., DOWSETT M., KRAUSE A., EVANS D.B., MILLER W.R., DIXON J.M. : Estrogen-independent proliferation is present in estrogenreceptor HER2-positive primary breast cancer after neoadjuvant letrozole. J. Clin. Oncol., 2006, 24, 3019-25. 8. HOWELL A., CUZICK J., BAUM M., BUZDAR A., DOWSETT M., FORBES J.F., HOCTIN-BOES G., HOUGHTON J., LOCKER G.Y., TOBIAS J.S. : Results of the ATAC Arimidex, Tamoxifen, Alone or in Combination) trial after completion of 5 years’ adjuvant treatment for breast cancer. The Lancet, 2005, 365, 60-62. 9. JOHNSTON S., PEGRAM M., PRESS M., PIPPEN J., PIVOT X., GOMEZ H., FLORANCE A., O’ROURKE L., MALTZMAN J. : Lapatinib combined with letrozole vs. Alone for front line postmenopausal hormone receptor positive (HR+) metastatic breast cancer (MBC): first results from the EGF30008 Trial. Proceeding paper. Opgehaald op 2 april 2009, van http://www.abstracts2view.com/sabcs/view.php?nu=SABCS08L_1448&terms= 10. MACEDO L.F., SABNIS G., BRODIE A. : Preclinical modeling of endocrine response and resistance. Cancer., 2008, 112(3 Suppl), 679-88. 11. MARCOM P.K., ISAACS C., HARRIS L., WONG Z.W., KOMMARREDDY A., NOVIELLI N., MANN G., TAO Y., ELLIS M.J. : The combination of letrozole and trastuzumab as first or second-line biological therapy produces durable responses in a subset of HER2 positive and ER positive advanced breast cancers. Breast Cancer Res. Treat., 2007, 102(1), 43-9.
50
12. MASSARWEH S., SCHIFF R. : Resistance to endocrine therapy in breast cancer: exploiting estrogen receptor/growth factor signaling crosstalk. Endocr. Relat. Cancer., 2006, 13 Suppl 1, S15-24. 13. MASSARWEH S., OSBORNE C.K., JIANG S., WAKELING A.E., RIMAWI M., MOHSIN S.K., HILSENBECK S., SCHIFF R. : Mechanisms of tumor regression and resistance to estrogen deprivation and fulvestrant in a model of estrogen receptor-positive, HER-2/neu-positive breast cancer. Cancer Res. 2006, 66, 8266-73. 14. MILANO A., DAL LAGO L., SOTIROU C., PICCART M., CARDOSO F. : What clinicians need to know about antioestrogen resistance in breast cancer therapy. Eur. J. Cancer., 2006, 42(16), 2692-705. 15. OSIPO C., GAJDOS C., CHENG D., JORDAN V.G. : Reversal of tamoxifen resistant breast cancer by low dose estrogen therapy. J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 2005, 93, 249-56. 16. PARK S.-S., KIM S.-W. : Activated Akt singnaling pathway in invasive ductal carcinoma of the breast: Correlation with HER2 overexpression. Oncol. Rep., 2007, 18, 13943. 17. PIETRAS R.I. : Biologic basis of sequential and combination therapies for hormoneresponsive breast cancer. The Oncologist, 2006, 11, 704-17. 18. PRAT A., BASELGA J. : The role of hormonal therapy in the management of hormonal-receptor-positive breast cancer with co-expression of HER2. Nat. Clin. Pract. Oncol., 2008, 5, 531-42.
51
19. RASMUSSEN B.B., REGAN M.M., LYKKESFELDT A.E., DELL’ORTO P., DEL CURTO B., HENRIKSEN K.L., MASTROPASQUA M.G., PRICE K.N., MERY E., LACROIX-TRIKI M., BRAYE S., ALTERMATT H.J., GELBER R., CASTIGLIONEGERTSCH M., GOLDHIRSCH A., GUSTERSON B.A., THURLIMANN B., COATES A.S., VIALE G. : Adjuvant Letrozole versus Tamoxifen according to centrally-assessed ERBB2 status for postmenopausal women with endocrine-responsive early breast cancer: supplementary results from the BIG 1-98 randomised trial. Lancet Oncol., 2008, 9, 23-28. 20. SCALTRITI C., VERMA C., GUZMAN M., JIMENEZ J., PARRA J.L., PEDERSEN K., SMITH D.J., LANDOLFI S., RAMON Y CAJAL S., ARRIBAS J., BASELGA J. : Lapatinib, a HER2 tyrosine kinase inhibitor, induces stabilization and accumulation of HER2 and potentiates trastuzuma-dependent cell cytotoxicity. Oncogene, 2009, 28, 803-14. 21. SCHIFF R., OSBORNE C.K.: Endocrinology and hormone therapy in breast cancer: new insight into estrogen receptor-alpha function and its implication for endocrine therapy resistance in breast cancer. Breast Cancer Res., 2005, 7(5), 205-11. 22. SCHIFF R., MASSARWEH S., SHOU J., OSBORNE C.K. : Breast cancer endocrine resistance: How growth factor signaling and estrogen receptor coregulators modulate response. Clin. Cancer Res., 2003, 9(1 Pt 2), 447S-54S. 23. SCHIFF R., MASSARWEH S., SHOU J., BHARWANI L., ARPINO G., RIMAWI M., OSBORNE C.K.: Advanced concepts in estrogen receptor biology and breast cancer endocrine resistance: implicated role of growth factor signalling and estrogen receptor coregulators. Cancer Chemother. Pharmacol., 2005, 56 Suppl 1, 10-20. 24. SHOU J., MASSARWEH S., OSBORNE C.K., WAKELING A.E., ALI S., WEISS H., SCHIFF R. : Mechanisms of tamoxifen resistance: Increased estrogen receptor-HER-2/neu cross-talk in ER/HER-2-positive breast cancer. J. Natl. Cancer Inst., 2004, 96(12), 926-35.
52
25. SMITH I.E., DOWSETT M., EBBS S.R., DIXON J.M., SKENE A., BLOHMER J.-U., ASHLEY S.E., FRANCIS S., BOEDDINGHAUS I., WALSH G. : Neoadjuvant treatment of postmenopausal breast cancer with Anastrozole, Tamoxifen, or both in combination: the immediate preoperative Anastrozole, Tamoxifen, or combined with Tamoxifen (IMPACT) multicenter double-blind randomized trial. J. Clin. Oncol., 2005, 23, 5108-16. 26. SMITH I.E, WALSH G., SKENE A., LLOMBART A., MAYORDOMO J.I., DETRE S., SALTER J., CLARK E., MAGILL P., DOWSETT M. : A phase II placebo-controlled trial of neoadjuvant anastrozole alone or with gefitinib in early breast cancer. J. Clin. Oncol., 2007, 25(25), 3816-22. 27. THURLIMANN B., KESHAVIAH A., COATES A.S., MOURIDSEN H., MAURIAC L., FORBES J.F., PARIDAENS R.,
CASTIGLIONE-GERTSCH M., GELBER R.,
RABAGLIO M., SMITH R., WARDLY A., PRICE K.N., GOLDHIRSCH A. : A comparison of Letrozole and Tamoxifen in postmenopausal women with early breast cancer. N.Engl.J.Med, 2005, 353, 2747-57. 28. TOKUNAGA E., KATAOKA A., KIMURA Y., OKI E., MASHINO K., NISHIDA K., KOGA T., MORITA M., KAKEJI Y., BABA H., OHNO S., MAEHARA Y. : The association between Akt activation and resistance to hormone therapy in metastatic breast cancer. Eur. J. Cancer, 2006, 42, 629-35. 29. YARDEN Y.: Biology of HER2 and it’s importance in breast cancer. Oncology, 2001, 61, Suppl.2: 1-13. 30. ZHOU B.P., HUNG M-C. : Dysregulation of cellular signalling by HER2/neu in breast cancer. Semin. Oncol., 2003, 30(5 Suppl 16), 38-48. 31. ZHOU Y., YAU C., GRAY J.W., CHEW K., DAIRKEE S.H., MOORE D.H., EPPENBERGER U., EPPENBERGER-CASTORI S., BENZ C.C. : Enhanced NFкB and AP1 transcriptional activity associated with antiestrogen resistant breast cancer. BMC Cancer., 2007, 7, 59.
53
32. ZHU L., CHOW L.W.C, LOO W.T.Y., GUAN X-Y., TOI M. : Her2/neu expression predicts the response to antiaromatase neoadjuvant therapy in primary breast cancer: Subgroup analysis from celecoxib antiaromatase neoadjuvant trial. Clin. Cancer Res., 2004, 10, 4639-44.
54
