BD Mueller Hinton II Agar BD Mueller Hinton II Agar (150 mm) BD Mueller Hinton II Agar, Square

HASZNÁLATI UTASÍTÁSOK – HASZNÁLATRA KÉSZ TÁPTALAJOK PA-254032.07

Változat: April 2013

BD Mueller Hinton II Agar  BD Mueller Hinton II Agar (150 mm) BD Mueller Hinton II Agar, Square HASZNÁLATI JAVASLAT A BD Mueller Hinton Agar tápközeg különféle kiszerelésekben kapható; gyorsan szaporodó aerob mikroorganizmusok klinikai izolátumainak szabványosított korongos diffúziós antibiotikumérzékenységi vizsgálatához használják antimikrobiális hatóanyagok jelenlétében, a Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) által szabványosított módszer szerint.1

AZ ELJÁRÁS ELVE ÉS MAGYARÁZATA Mikrobiológiai módszer. Mivel a mikrobiológiai laboratóriumok a 1960-as évek elején rengeteg féle módszert használtak a baktériumoknak az antibiotikumokkal és más hatóanyagokkal szembeni érzékenységét, Bauer, Kirby és munkatársaik kidolgoztak egy standard eljárást, melyben a Mueller Hinton Agart, egy amúgy gonococcusok izolálására kifejlesztett táptalajt, választottak teszttáptalajnak.1-4 Azt követően, egy nemzetközi együttműködésben elvégzett tanulmány megerősítette ezt a választást, mert a Mueller Hinton Agar egy viszonylag jól reprodukálható táptalaj, receptúrája egyszerű, és eddigi alkalmazása során már bőséges adatbázis gyűlt össze vele kapcsolatban. Az CLSI leírja a Bauer-Kirby-féle módszer standard eljárását; a további részletek ott találhatók meg.6 A Bauer-Kirby módszerrel összhangban számos más nemzeti standardot is kidolgoztak az antibiotikum érzékenység vizsgálatára. Ezek a standardok az inokulum sűrűségében, az inokuláció módszerében, a gátlási zóna méretében és annak értelmezésében különbözhetnek az CLSI Standard-tól. Mivel az antibiotikum érzékenység vizsgálatának nem léteznek általánosan elfogadott európai standardjai, amennyiben az CLSI irányelvei nem alkalmazhatók, a helyi nemzeti standardok szerint kell eljárni. A Bauer-Kirby-féle módszer az antibiotikumoknak, melyekkel papírkorongokat itattak át, gélben való diffúzióján alapszik.7 Ellentétben a korábbi módszerekkel, melyek alacsony és magas antibiotikum-koncentrációjú korongokat alkalmaztak, s melyeket a gátlási zóna jelenlétével, ill. hiányával értelmeztek, ez a módszer egyfajta koncentrációjú antibiotikummal átitatott korongokkal dolgozik és a gátlási zónák átmérőjének függvényében állapítja meg a minimális gátlási koncentrációt (MIC, minimum inhibitory concentration). A teszt során a mikroorganizmus standardizált szuszpenzióját a táptalaj teljes felületére fel kell vinni mintavevő pálcikával. Az antibiotikum vagy más antimikrobiális szer adott adagjával átitatott korongokat a táptalaj felületére helyezik; a lemezt inkubálják, majd minden korong körül megmérik a gátlási zónák átmérőjét. Annak megállapítására, hogy az adott mikroorganizmus érzékeny, közepesen érzékeny vagy ellenálló-e, a kapott gátlási zónák méretét az CLSI Document M100 (M2) fejezetének 2A és 2D táblázataiban foglaltakkal hasonlítják össze. Kiderült, hogy a korongmódszeres antibiotikum-érzékenység vizsgálatot számos tényező befolyásolhatja. Ezek közé sorolható a táptalaj, a táptalaj felületén lévő túl nagy nedvesség, az agar vastagsága, a korongok potenciája, az inokulum koncentrációja, pH és a teszt mikroorganizmusok ß-laktamáz termelése.5-8 A BD Mueller Hinton II Agar-t úgy készítik, hogy abban a timin- és timidinszint alacsony legyen, míg a kalcium- és magnéziumszintet ellenőrzik. 11-13 A nyersanyagok timin- és timidin tartalmát trimetoprim-szulfametoxazol (SXT) tartalmú tesztkorongokkal és Enterococcus faecalis ATCC 33186-tal és/vagy 29212-vel ellenőrzik. A kalcium- és magnéziumszintet a PA-254032.07

-1-

nyersanyagok ellenőrzésével, valamint szükség szerint, kalcium- és magnéziumforrásokkal állítják be annak érdekében, hogy az aminoglikozidos antibiotikumokkal és a Pseudomonas aeruginosa ATTC 27853-mal pontos átmérőjű gátlási zónákat kapjanak.

REAGENSEK BD Mueller Hinton II Agar 1 liter szűrt vízre vonatkoztatva* Húskivonat 2,0 g Kazein savas hidrolizátuma 17.5 Keményítő 1.5 Agar 17.0 pH 7.3 +/- 0.2 *Úgy beállítva és/vagy összekeverve, hogy megfeleljen a működési követelményeknek.

FIGYELMEZTETÉS . Használata szakértelmet igényel. Ne használja a lemezeket, ha azon mikrobiális szennyeződés, kiszáradás és betöredezés, ill. a károsodás bármilyen más jelét észleli. Amennyiben ez a táptalaj kiszáradás miatt erősen zsugorodott, úgy az hamis eredményekhez vezethet. A steril munkával, a biológiai veszélyekkel és a használt termékek hulladékként való kezelésével kapcsolatban olvassa el az ÁLTALÁNOS HASZNÁLATI ÚTMUTATÓT.

TÁROLÁS ÉS ELTARTHATÓSÁG Átvétel után felhasználásig, a lemezeket sötét helyen, 2-8C-on az eredeti lezárt tasakban tárolja. Kerülni kell a lemezek megfagyását, illetve túlmelegedését. A lemezeket a lejárati időn belül kell inokulálni (lásd: csomagolás címkéje) és az előírt inkubációs időt be kell tartani. A felbontott 10-es csomagolás lemezeit, tiszta helyen, 2-8°C-on tárolva, egy héten belül fel kell használni.

FELHASZNÁLÓI MINŐSÉGI ELLENŐRZÉS

A felhasználói minőségi ellenőrzéshez amennyiben lehetséges kövesse az idevágó CLSI-t 6, vagy amennyiben az nem alkalmazható, úgy kövesse a nemzeti standardokat. Általában a következőkben az Eljárás címszó alatt felsorolt lépéseket kell követni és a Nem szállított anyagok között felsorolt teszttörzseket kell alkalmazni. A Mueller Hinton II Agar lemezek és a korongok hatékonyságát legalább hetente kétszer ellenőrizni kell. A nem inokulált táptalaj színe: színtelen vagy enyhén ámbraszínű.

ELJÁRÁS Szállított anyagok BD Mueller Hinton II Agar (különböző lemez méretekben; lásd Kiszerelések). Mikrobiológiailag ellenőrzött Nem szállított anyagok 1. Inokulum tápleves kémcsőben, pl. BD Trypticase™ Soy Broth (Kazein emésztett szója tápleves) vagy Mueller Hinton II Broth (kiegyenlített kationszinttel), a standard inokulum elkészítéséhez és steril tápleves vagy fiziológiás sóoldat az inokulum hígításához. 2. Bárium-szulfát összehasonlító standard (0,5 ml 0,048 M BaCl2 [1.175% w/v BaCl2 2H2O] 99,5 ml 0,18 M [0,36 N] H2SO4 [1% v/v]-hoz). 2H2O] to 99.5 ml of 0.18 M [0.36 N] H2SO4 [1% v/v]). 3. Fotometrikus készülék az inokulum szuszpenzió turbiditásának beállításához, hogy az ekvivalens legyen a 0,5 McFarland-os standarddal. 4. A fent felsorolt eszközök (1-3) helyett használható a BD Prompt™ Inoculation System (térfogatmérésen alapuló inokulum készítő eszköz).6,18

PA-254032.07

-2-

5. Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218 (kizárólag a ß-laktám-ß-laktamáz inhibitor kombinációkhoz), Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, és Enterococcus faecalis ATCC 33186 vagy ATCC 29212 kontroll kultúrák.6 6. Meghatározott mennyiségű antimikrobiotikummal átitatott papírkorongok, 6 pl. BD SensiDisc™ antibiotikum érzékenység mérő korongok. 7. Elosztó eszköz, mint pl. a BD Sensi-Disc 6-, 8-21-férőhelyes elosztója. A Mueller Hinton II Agar Square lemezekhez is rendelkezésre áll ilyen elosztó rendszer. 8. Milliméteres beosztású vonalzó vagy más mérőeszköz a gátlási zóna méréséhez. 9. Kiegészítő tápleves a tenyésztéshez, reagensek és szükséges laboratóriumi eszközök. Minták típusa Ez a termék klinikai mintából izolált tiszta tenyészetek antibiotikum-érzékenységének tesztelésére szolgál (lásd még: TELJESÍTMÉNYJELLEMZŐK ÉS AZ ELJÁRÁS KORLÁTAI). Az antibiotikum-érzékenység ugyan közvetlenül vér- és vizelettenyészeteken is vizsgálható, de ezeket a teszteket tiszta tenyészetekkel is meg kell ismételni és meg kell erősíteni. 14-17 A teszt kivitelezése A közvetlen telep-szuszpenzió módszere 6: 1. Győződjön meg arról, hogy rendelkezésre áll egy friss (= 24 órás), nem szelektáló táptalajról, pl. véres agar, származó kultúra. 2. A rutin érzékenységi tesztekhez az inokulumot a telepek fiziológiás sóoldatban vagy táplevesben kell szuszpenzálni.6 A szuszpenzió turbiditását azonnal, inkubáció nélkül, állítsa be a bárium-szulfát standardhoz (0,5 McFarland standard) képest. A standard és az inokulum turbitásának méréséhez tartsa mindkét kémcsövet egy fehér háttér elé, melyen vékony fekete vonalak vannak, ill. használjon egy fotometrikus mérőműszert. 3. Azokat az alternatív inokulum készítési módszereket, melyek folyamán olyan eszköz kerül alkalmazásra, mely lehetővé teszi a turbiditás beállítása nélkül az inokulum standardizálását, mint pl. a BD Prompt Inoculation System, elfogadásra kerültek a rutin teszt eljárások körében. 18 4. Legfeljebb 15 perccel az inokulum turbiditásának beállítása után, merítsen bele egy steril mintavételi pálcikát a pontosan hígított inokulumba, majd néhányszor görgesse meg azt a kémcső felső részéhez nyomva, hogy a felesleges nedvességet kipréselje. 5. A lemezen az agar teljes felületét három alkalommal inokulája úgy, hogy az egyenleetes szélesztés érdekében minden inokulálás után 60°-os szögben fordítsa el a lemezt. 6. Mielőtt felhelyezné az antimikrobiotikummal átitatott korongokat, annak érdekében, hogy az agar felülete beihassa a felesleges nedvességet, a lemezek fedelét 3-5 percig hagyja félig nyitva és legfeljebb 15 percre tartsa szobahőmérsékleten a lemezeket. 7. Egy antimikrobiális korong elosztóval helyezze el a korongokat, ügyeljen a sterilitásra. A korongokat úgy helyezze el, hogy azok középpontja egymástól 24 mm-re legyen. Miután a korongokat elhelyezte a táptalajon, annak biztosítására, hogy teljes felületükkel érintkeznek, nyomkodja le azokat egy steril tű vagy csipesz segítségével. Ezt a lépést, amennyiben egy ön-tamponáló BD Sensi-Disc elosztót használ, kihagyhatja. 8. A korongok felhelyezése után, 15 percen belül fordítsa fel és inkubálja a lemezeket 35°Con. A lemezeket emelt széndioxid tartalmú légkörben kell inkubálni. 9. A lemezeket 16-18 óráig inkubálja. A teljes 24 órás inkubáció oxacillin és Staphylococcus aureus esetében a methicillin-rezisztens S. aureus (MRSA)19, valamint a vancomycin és Enterococcus fajok esetében a vancomycin-rezisztens törzsek kimutatásához szükséges. A gátlási zónán belüli növekedés rezisztenciát jelez.20 Eredmények 1. Inkubálás után a legtöbb lemezen összefolyó „pázsitot” fog találni. Amennyiben kizárólag különálló telepek fejlődnek, az inokulum túl híg colt és a tesztet meg kell ismételni. 2. Mérje meg a teljes gátlási zónák méretét (szabad szemmel észleve) a korong átmérőjével egyetemben, kerekítsen kerek milliméterre, egy tolómérő, vonalzó vagy az erre a célra készült sablon segítségével. A mérőeszközt a fekete, nem tükröződő hátéren lévő lemez aljára kell helyezni és felülről kell megvilágítani. PA-254032.07

-3-

3. A végpontokat ott kell felvenni, ahol szabad szemmel jól látható, hogy nincs növekedés. Az apró, nehezen látható telepeket hagyja figyelmen kívül. Ez alól kivételt képez az oxacillinnel tesztelt S. aureus és a vancomycinnel tesztelt enterococcusok. Ezekben az esetekben átvilágító fényt kell használni a korong körül növő fátyol észlelésére, melyet az „okkult rezisztens” MRSA törzsek19 vagy a vancomycin-rezisztens enterococcusok mutatnak. A Proteus fajok esetében, amennyiben a gátlási zóna széle nyilvánvaló, a zóna belseje felé való rajzást hagyja figyelmen kívül. A trimethoprim és a szulfonamidok esetében, a táptalajban lévő antagonisták olykor lehetővé tesznek némi gyenge növekedést, ezért a gyenge növekedést (a felület 20%-a vagy annál kevesebb nőtt csak be) hagyja figyelmen kívül és a gátlási zóna átmérőjének mérésekor a nyilvánvaló határvonalat vegye csak figyelembe. Számlálás és az Eredmények értelmezése A gátlási zónák így kapott átmérőit hasonlítsa össze az CLSI Document M100 (M2) fejezetében található 2A-2D táblázatok adataival.6 A kapott értékek alapján sorolja be az adott mikroorganizmust az érzékeny, közepesen érzékeny vagy rezisztens kategóriák egyikébe. Megjegyzés: Az CLSI Document M2 fejezetének kiegészítései, vagy az átdolgozott változatai, melyek az antimikrobiális korongok módosított táblázatait és a interpretive standardokat tartalmazzák, időszakosan jelennek meg. Az aktuális ajánlásokról a legfrissebb táblázatokból értesülhet. A teljes standard és a kiegészítő anyagok megrendelhető: Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087-1898, USA. Telefon: ++1-610-688-1100.

TELJESÍTMÉNY JELLEMZŐK ÉS AZ ELJÁRÁS KORLÁTAI A Mueller Hinton Agar egy standard táptalaj a gyorsan növő aerob vagy fakultatív anaerob baktériumok, mint pl. a staphylococcusok, enterococcusok és az Enterobacteriaceae-k tagjai, antibiotikum érzékenységének vizsgálatához. Az érzékeny fajok, pl. Haemophilus fajok, Neisseria fajok, a S. pneumoniae és a streptococcusok, teszteléséhez más eljárásokat és táptalajokat fejlesztették ki. Az CLSI standardizált eljárás nem alkalmazható obligát anaerobok, a Mueller Hinton Agaron alig vagy csak gyengén növő mikroorganizmusok, vagy olyan mikroorganizmusok esetében, melyek növekedési rátája törzsenként erősen változó.6 Az érzékeny mikroorganizmusokat (pl. Haemophilus influenzae) az CLSI Document M2 fejezetei szerint kell vizsgálni.6 Bizonyos mikroorganizmus-antibiotikum kombinációk esetében a gátlási zóna határa nem válik el élesen, ami pontatlan leolvasást eredményezhet. A nem megfelelő koncentrációjú inokulum pontatlan eredményeket adhat. A gátlási zóna túl kicsi, amikor az inokulum túl sűrű, ill. túl nagy, amikor az inokulum túl híg. Az antibiotikum érzékenység mérő korongok helytelen tárolása következtében, azok hatékonysága csökkenhet, ami hamis rezisztencia eredményekhez vezethet. Amennyiben a táptalaj a helytelen tárolás miatt erősen zsugorodott, úgy az hamis eredményekhez vezethet. Egy mikroorganizmusnak az in vitro érzékenysége egy adott antimikrobiotikummal szemben nem jelenti feltétlenül azt, hogy ez a hatóanyag in vivo is hatékony lesz. A kapott eredmények értelmezéséhez tanulmányozza az idevonatkozó szakirodalmat.7,8 A timint vagy timidint igénylő baktériumok, a Mueller Hinton Agar alacsony timin és timidin tartalma miatt nem növekednek kielégítő módon ezen a táptalajon. Új eljárásokat dolgoztak ki, melyekben magas gentamicin (120 mg) és streptomycin (300 mg) tartalmú korongokat használnak a nagyfokú aminoglikozid-rezisztencia szűrésére, annak ellenőrzésére hogy egy penicillin vagy glikopeptid egy aminoglikoziddal együtt nincs-e szinergista hatással egy enterococcusos izolátumra. Az MRSA, rezisztens enterococcusok, szélesebb spektrum, ß-laktamáz termelés, gramnegatív bacilusok detektálásának teljes leírását és más teszt limitáló tényezőket az CLSI Document M2 és M7 fejezeteiben találja meg.23 A Mueller Hinton II Agar megbízhatónak bizonyult az oxacillin korongok körül elmosódott gátlási zónát fejlesztő MRSA-k detektálásakor.19 Kétséges esetben, alkalmazzon egy kiegészítő módszert, mint pl. a BD Oxacillin Screen Agar-t. PA-254032.07

-4-

Az ebben a leírásban megtalálható inokulációs eljárások, értelmezések, valamint az itt és az CLSI standardokban megadott gátlási zóna értékek eltérhetnek a nemzeti standardoktól. 6, 24

IRODALOMJEGYZÉK 1. Bauer, A.W., W.M.M. Kirby, J.C. Sherris, and M. Turck. 1966. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45:493-496. 2. Ryan, K.J., F.D. Schoenknecht, and W.M.M. Kirby. 1970. Disc sensitivity testing. Hospital Practice 5:91-100. 3. Barry, A.L., F. Garcia, and L.D. Thrupp. 1970. An improved single-disk method for testing the antibiotic susceptibility of rapidly-growing pathogens. Am. J. Clin. Pathol. 53:149-158. 4. Mueller, J.H., and J. Hinton. 1941. A protein-free medium for primary isolation of the gonococcus and meningococcus. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 48:330-333. 5. Ericsson, H.M., and J.C. Sherris. 1971. Antibiotic sensitivity testing. Report of an international collaborative study. Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sec. B, Suppl. 217. 6. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved standard: M2. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at www.clsi.org 7. Woods, G.L., and J.A. Washington. 1995. Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods, p. 1327-1341. In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.C. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, DC. 8. Thornsberry, C., T.L. Gavan, and E.H. Gerlach. 1977. Cumitech 6, New developments in antimicrobial agent susceptibility testing. Coordinating ed., J.C. Sherris. American Society of Microbiology, Washington, DC. 9. Koch, A.E., and J.J. Burchall. 1971. Reversal of the antimicrobial activity of trimethoprim by thymidine in commercially prepared media. Appl. Microbiol. 22:812-817. 10. Ferone, R., S.R.M. Bushby, J.J. Burchall, W.D. Moore, and D. Smith. 1975. Identification of Harper-Cawston factor as thymidine phosphorylase and removal from media of substances interfering with susceptibility testing to sulfonamides and diaminopyrimidines. Antimicrob. Agents Chemother. 7:91-98. 11. Reller, L.G., F.D. Schoenknecht, M.A. Kenny, and J.C. Sherris. 1974. Antibiotic susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa: selection of a control strain and criteria for magnesium and calcium content in media. J. Infect. Dis. 130:454-463. 12. Pollock, H.M., B.H. Minshew, M.A. Kenny, and F.D. Schoenknecht. 1978. Effect of different lots of Mueller-Hinton Agar on the interpretation of the gentamicin susceptibility of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 14:360-367. 13. D'Amato, R.F., and C. Thornsberry. 1979. Calcium and magnesium in Mueller-Hinton agar and their influence on disk diffusion susceptibility results. Current Microbiol. 2:135-138. 14. Wegner, D.L., C.R. Mathis, and T.R. Neblett. 1976. Direct method to determine the antibiotic susceptibility of rapidly growing blood pathogens. Antimicrob. Agents Chemother. 9:861-862. 15. Johnson, J.E., and J.A. Washington II. 1976. Comparison of direct and standardized antimicrobial susceptibility testing of positive blood cultures. Antimicrob. Agents Chemother. 10:211-214. 16. Waterworth, P.M., and M. Del Piano. 1976. Dependability of sensitivity tests in primary culture. J. Clin. Pathol. 29:179-184. 17. Hollick, G.E., and J.A. Washington II. 1976. Comparison of direct and standardized disk diffusion susceptibility testing of urine cultures. Antimicrob. Agents Chemother. 9:804-809. 18. Baker, C.N., C. Thornsberry, and R.W. Hawkinson. 1983. Inoculum standardization in antimicrobial susceptibility testing: evaluation of overnight agar cultures and the rapid inoculum standardization system. J. Clin. Microbiol. 17:450-457. 19. Hindler, J.A., and C.B. Anderbied. 1985. Effect of the source of Mueller-Hinton agar and resistance frequency on the detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 21:205-210. 20. Maskell, R., O.A. Okubadejo, R.H. Payne, and L. Pead. 1977. Human infections with thymine-requiring bacteria. J. Med. Microbiol, 11:33-45. PA-254032.07

-5-

21. Haltiner, R.C., P.C. Migneault, and R.G. Robertson. 1980. Incidence of thymidinedependent enterococci detected on Mueller-Hinton agar with low thymidine content. Antimicrob. Agents Chemother. 18:365-368. 22. Murray, B.E. 1990. The life and times of the Enterococcus. Clin. Microbiol. Rev. 3:46-65. 23. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved standard: M7. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at www.clsi.org 24. Jorgensen, J.H., and J.D. Turnidge. 2003. Susceptibility test methods: dilution and disk diffusion methods. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

KISZERELÉSEK BD Mueller Hinton II Agar (Stacker™ 90 mm-es lemezek [standard méret])) Cat. No. 254032 Használatra kész táptalajok, 20-as csomag Cat. No. 254081 Használatra kész táptalajok, 120-as csomag BD Mueller Hinton II Agar (150 mm) Cat. No. 254062 Használatra kész táptalajok, 20-as csomag BD Mueller Hinton II Agar, Square (120 x 120 mm) Cat. No. 254518 Használatra kész táptalajok, 20-as csomag

TOVÁBBI INFORMÁCIÓK További információkért forduljon a BD helyi képviselőjéhez.

Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 – 12 D-69126 Heidelberg/Germany Phone: +49-62 21-30 50 Fax: +49-62 21-30 52 16 [email protected] http://www.bd.com http://www.bd.com/europe/regulatory/ Prompt is a trademark of 3M. ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are the property of Becton, Dickinson and Company. © 2013 BD

PA-254032.07

-6-