NÁVOD K POUŽITÍ – MÉDIA NA MISKÁCH URČENÁ K OKAMŽITÉMU POUŽITÍ PA-254030.07
Rev.: April 2013
BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood (150 mm) BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep blood, Square ÚČEL POUŽITÍ Médium BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood, které je k dispozici v několika formátech misek, se používá pro diskové difúzní testování citlivosti klinických izolátů Streptococcus pneumoniae a jiných streptokoků dle standardizace Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).1
ZÁSADY A VYSVĚTLENÍ POSTUPU Mikrobiologická metoda. Postup dle Bauer-Kirbyho je založen na difúzi antibakteriálních látek, které jsou naneseny na papírových terčících, přes agarový gel.2 Během testovacího postupu je standardizovaná suspenze mikroorganismu rozetřena přes celý povrch média. Na povrch média se pak umístí papírové terčíky impregnované předepsaným množstvím antibiotik nebo jiných antimikrobiálních látek, provede se inkubace destičky a změří se zóny kolem jednotlivých terčíků. Pečlivě prostudujte předepsanou normu z CLSI pro Bauer-Kirbyův postup.1 Podle Bauer-Kirbyova postupu byly vypracovány další národní normy pro testování antibakteriální citlivosti. V těchto normách se mohou hustoty nátěru, způsob očkování, velikost výsledných zón a způsob interpretace lišit od normy CLSI. Protože společné evropské normy pro testování citlivosti neexistují, je v případě, že nelze použít pokyny normy CLSI, nutno dodržovat místní státní normy. Nesuplementovaný agar Mueller Hinton, i přesto, že je dostačující pro testování citlivosti rychle rostoucích aerobních patogenů, nedostačuje pro náročnější mikroorganismy, jako je např. Streptococcus pneumoniae. Dokument CLSI Document M2 doporučuje agar Mueller Hinton suplementovaný 5 % defibrinované ovčí krve a uvádí podrobnosti o postupech kontroly kvality i interpretační kritéria pro použití u S. pneumoniae a jiných streptokoků.1
ČINIDLA Agar BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood Složení* na jeden litr čištěné vody Hovězí výtažek 2,0 g Kyselý hydrolyzát kaseinu 17,5 Škrob 1,5 Agar 17,0 g Defibrinovaná ovčí krev 5% pH 7,3 ± 0,2 *Upraveno anebo doplněno dle požadavků tak, aby byla splněna kritéria účinnosti.
BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ Pro diagnostiku in vitro . Pouze k odbornému použití. Pokud misky vykazují známky mikrobiální kontaminace, změny zabarvení, vysušení, popraskání nebo jiné známky poškození, nepoužívejte je. Nadměrné svraštění tohoto média následkem vysušení může vést k nesprávným výsledkům citlivosti. Pokyny pro aseptickou manipulaci, informace týkající se biologického nebezpečí a pokyny pro likvidaci použitého produktu naleznete v dokumentu VŠEOBECNÉ POKYNY K POUŽITÍ.
PA-254030.07
-1-
SKLADOVÁNÍ A ŽIVOTNOST Po převzetí skladujte misky až do doby těsně před použitím v originálním pouzdru, v temnu a při teplotě 2 až 8° C. Systém nesmí zmrznout nebo se přehřát. Misky lze očkovat až do data platnosti (viz štítek na obalu) a inkubovat je lze po doporučenou dobu inkubace. Misky z otevřených sad po 10 kusech lze použít po dobu jednoho týdne, pokud jsou uloženy v čistém prostředí při teplotě 2 až 8° C.
KONTROLA KVALITY UŽIVATELEM
Při kontrole kvality uživatelem je nutno dodržet příslušné normy CLSI1 nebo státní normy, pokud se uplatňují. Obecně je nutné dodržovat postupy popsané v části Provedení testu, včetně kontrolního kmene, S. pneumoniae ATCC 49619 a antimikrobiálních terčíků, které se normálně používají v laboratoři. Tyto součásti je nutné minimálně dvakrát týdně testovat pro zajištění správné účinnosti. Správné průměry zón jsou uvedeny v tabulce 3A v dokumentu CLSI Document M100, který je součástí dokumentu CLSI Document M2.1 Vzhled nenaočkovaného média: červená (barva krve), neprůsvitná.
POSTUP Dodaný materiál Agar BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood (dodává se v několika různých formátech misek; viz část Balení/Dostupnost). Mikrobiologicky kontrolováno. Materiál, který není součástí dodávky 1. Inokulační bujón v množství po 5 mL, jako např. bujón Mueller Hinton II Broth (BBL kat. č. 4397701, zkumavka 16 x 102 mm) nebo 0,9% fyziologický roztok, pro přípravu standardního inokula. 2. Porovnávací standard sulfátu barnatého (0,5 mL 0,048 M BaCl2 [1,175% w/v BaCl22H2O] s 99,5 mL 0,18 M [0,36 N] H2SO4 [1% v/v]). 3. Fotometrické zařízení pro úpravu zakalení očkovací suspenze tak, aby odpovídalo McFarlandově normě předepisující hodnotu 0,5. 4. Jako alternativu výše uvedených materiálů (1-3) lze použít očkovací systém BD Prompt Inoculation System (zařízení pro titrační přípravu nátěru).1,3 5. Kontrolní kultura - Streptococcus pneumoniae ATCC 49619. 6. Papírové terčíky impregnované předepsaným množstvím antibakteriálních látek, např. terčíky pro testování citlivosti BD Sensi-Disc. 7. Zásobník terčíků, např. 6, 8 nebo 12místné samotěsnící zařízení BD Sensi-Disc. 8. Zařízení pro měření nebo interpretaci průměrů zón, jako např. posuvná měřidla nebo pravítko. 9. Inkubátor, který je schopen vytvořit atmosféru s 5 % CO2, nebo jiné zařízení, které vytváří stejnou atmosféru obohacenou o CO2. 10. Pomocná kultivační média, činidla a laboratorní vybavení dle potřeby. Typy vzorků Tento produkt se používá k testování citlivosti čistých kultur izolovaných z klinických vzorků (viz také SPECIFICKÉ VLASTNOSTI ÚČINNOSTI A OMEZENÍ POSTUPU). Provedení testu Při testování S. pneumoniae je nutné používat metodu přímé suspenze kolonií.1 Dodržujte aseptický postup. 1. Zajistěte si čistou, čerstvou (=přes noc) kulturu z neselektivního krevního agaru. 2. Narostlé kolonie suspendujte v bujónu, jako je např. bujón Mueller Hinton II Broth nebo sterilní 0,9% fyziologický roztok. Upravte zakalení tak, aby odpovídala standardu ze sulfátu barnatého (McFarlandova norma předepisující hodnotu 0,5). Zakalení standardního a testovacího inokula lze porovnat přidržením obou zkumavek před bílým pozadím s jemně nakreslenými černými čarami, nebo lze použít fotometrické zařízení. 3. Bylo zjištěno, že pro účely běžného testování jsou přijatelné alternativní metody přípravy nátěru pomocí zařízení, která umožňují přímou standardizaci nátěru bez úpravy zakalení, PA-254030.07
-2-
4. 5. 6.
7.
například očkovací systém BD Prompt Inoculation System.1,3 Do 15 minut od úpravy zakalení inokula ponořte do řádně rozpuštěného inokula sterilní tampón a několikrát jím ráznými pohyby otáčejte proti horní vnitřní stěně zkumavky, aby se vyloučilo nadměrné množství tekutiny. Naočkujte na agar Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood tak, že rozetřete inokulum třikrát po celém povrchu agaru a po každém rozetření otočíte misku o 60°, abyste dosáhli rovnoměrného naočkování. Vraťte zpět víčko misky a ponechte ji minimálně 3 minuty při pokojové teplotě, ne však déle než 15 minut, aby mohlo dojít k absorpci povrchové vlhkosti před aplikací terčíků impregnovaných léčivem. Na misku o rozměru 150 mm nepoužívejte více než devět terčíků a na misku o rozměrech 90 a 100 mm maximálně čtyři terčíky. Pro testování S. pneumoniae na penicilin použijte terčík s 1 µg oxacillinu.4 Inkubujte po dobu 20 až 24 hodin při teplotě 35 °C v atmosféře s 5 % CO2.
Výsledky Po inkubaci by měl být vidět slévající se růst. Rostou-li pouze izolované kolonie, nátěr byl příliš slabý a test je nutno opakovat. Pomocí posuvného měřítka nebo pravítka od horní části misky se sejmutým víčkem změřte průměr zón úplné inhibice (při posouzení prostým okem) včetně průměru terčíku na nejbližší celý milimetr. 5 Za hraniční bod je nutno považovat oblast, která při zjištění prostým okem nevykazuje zjevný viditelný růst. Slabého růstu drobných kolonií, které lze zjistit jen s obtížemi u okraje zjevné zóny inhibice, si nevšímejte. U agaru BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood je nutné měřit zónu inhibice růstu, nikoli zónu inhibice hemolýzy. Výpočet a interpretace výsledků Průměry zón je nutné porovnávat s průměry uvedenými v tabulce 2G pro S. pneumoniae a v tabulce 2H pro ostatní streptokoky v dokumentu CLSI Document M100 (M2), ve kterém jsou uvedena kritéria pro interpretaci.1 Získané výsledky je poté možné hlásit jako rezistentní, středně citlivé nebo citlivé. Dodržujte speciální kritéria pro interpretaci izolátů S. pneumoniae s průměrem zóny pro oxacillin o velikosti 19 mm, která jsou uvedena v této normě (viz také SPECIFICKÉ VLASTNOSTI ÚČINNOSTI A OMEZENÍ POSTUPU). Poznámka: Pravidelně vycházejí informační dodatky k dokumentu M2 normy CLSI nebo revidované verze obsahující revidované tabulky antibakteriálních terčíků a interpretačních norem. Pro současná doporučení je nutno použít nejnovější tabulky. Celou normu a informační dodatky lze objednat od Národního výboru pro klinické laboratorní normy na adrese Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087-1898, USA. Telefon: ++1-610-688-1100. www.clsi.org
SPECIFICKÉ VLASTNOSTI ÚČINNOSTI A OMEZENÍ POSTUPU Difúzní terčíkové testy citlivosti jsou navrženy pouze k použití s čistými kulturami. Před přípravou testu se doporučuje provést Gramovo barvení a předběžnou identifikaci izolátu.1 Toto médium se používá pro testování citlivosti S. pneumoniae a dalších streptokoků na vybrané antimikrobiální látky.1,2,5 Mějte na paměti, že neexistují spolehlivá kritéria pro difúzní testy amoxycilinu, ampicilinu, cefepimu, cefotaximu, ceftriaxonu, cefuroximu, imipenemu a meropenemu u S. pneumoniae. Aktivita in vitro těchto antimikrobiálních látek se nejlépe zjišťuje metodou MIC.1 Pro stanovení citlivosti S. pneumoniae na penicilin je možné použít terčík s oxacilinem. Izoláty S. pneumoniae s průměrem zóny pro oxacilin o velikosti 20 mm jsou citlivé (MIC 0,06 mg/mL) na penicilin. Vzhledem k tomu, že u penicilinu rezistentních, středně citlivých a některých citlivých kmenů se nacházejí zóny o velikosti 19 mm u screeningových terčíků oxacilinu, je nutné u všech izolátů S. pneumoniae s průměrem zóny pro oxacilin o velikosti 19 mm stanovit MIC pro penicilin, meropenem a cefotaxim nebo ceftriaxon.1 Pro jiné streptokoky, než je S. pneumoniae, se nedoporučuje oxacilinový test pro stanovení citlivosti na penicilin. Pro beta-hemolytické streptokoky použijte terčíky s penicilinem nebo ampicilinem. U viridujících skupin streptokoků není testování pomocí difúzních terčíku na penicilin a oxacilin spolehlivé. Citlivost u těchto skupin je nutné stanovit testováním MIC.1 Terčíkové difúzní testování citlivosti na antibiotika s použitím Streptococcus pneumoniae ATCC PA-254030.07
-3-
49619 bylo provedeno v domácím prostředí s cefaklorem, cefprozilem, chloramfenikolem, erythromycinem, ofloxacinem, tetracyklinem, trimethoprimem/sulfamethoxazolem a vankomycinem. Po provedení testu, popsaného v dokumentu M2-A5, bylo v průběhu 10 dní provedeno dvacet testů s použitím kmenů pro kontrolu kvality a osmi antimikrobiálních terčíků. U všech osmi antimikrobiálních látek spadalo 100 % (160/160) velikostí zón do očekávaného rozsahu, který je publikován v dokumentu M2-A5 a tabulce 3C v dokumentu NCCLS Document M100-S6.6,7 Standardní odchylka pro tetracyklin byla menší než 1 mm a pro všechny ostatní antimikrobiální látky byla menší než 2 mm.8 Studie reprodukovatelnosti (3 testy za den po dobu 3 dní) byly provedeny na dvou pracovištích s použitím výše uvedených antimikrobiálních látek, kmene S. pneumoniae ATCC 49619 a devíti dalších dobře charakterizovaných kmenů S. pneumoniae. U každé antimikrobiální látky byly dodržovány interpretační standardy pro průměr zóny, uvedené v tabulce 2C v dokumentu NCCLS Document M2-A5 a v Dodatku M100-S6. 6,7 Testování chloramfenikolu, erythromycinu, ofloxacinu, tetracyklinu a vankomycinu mělo za výsledek více než 95% shodu v rámci kategorie v porovnání s referenční metodou dle NCCLS. Testování trimethoprimu/ sulfamethoxazolu mělo za výsledek 90% shodu v rámci kategorie v porovnání s referenční metodou dle NCCLS. Pro cefaklor a cefprozil nebylo možné stanovit reprodukovatelnost kvůli nepřítomnosti interpretačních standardů pro tato dvě antibiotika. Za základě výše zmíněných studií se použití cefakloru, ceprozilu nebo trimethoprimu/sulfamethoxazolu spolu s tímto médiem nedoporučuje pro testování S. pneumoniae. Dále, odkazy na literaturu uvádějí rozsáhlé chyby v interpretaci terčíkového difúzního testování trimethoprimu/sulfamethoxazolu na destičkách agaru Mueller Hinton s ovčí krví.9 U některých kombinací organismů a antimikrobiálních látek nemusí mít zóna inhibice ostře ohraničený okraj, což může vést k nesprávné interpretaci. Bylo zjištěno, že difúzní terčíkové testy na citlivosti ovlivňují různé faktory. Mezi tyto faktory patří médium, hloubka agaru, kapacita disku, koncentrace inokula, stáří inokula a pH.2 Nesprávná koncentrace nátěru může vést k nesprávným výsledkům. Je-li nátěr příliš silný, mohou být zóny inhibice příliš malé, a je-li nátěr příliš slabý, mohou být tyto zóny příliš velké a těžko měřitelné. Nevhodné uskladnění antibakteriálních terčíků může způsobit ztrátu účinnosti a zdánlivě rezistentní výsledek. Citlivost organismu na určitou antibakteriální látku in vitro nemusí nutně znamenat, že tato látka bude účinná také in vivo. Pokyny pro interpretaci výsledků naleznete v příslušných odkazech na literaturu.2,10 Toto médium nepoužívejte pro testování citlivosti jiných bakterií než je S. pneumoniae a betahemolytické streptokoky.
ODKAZY 1. Clinical and Laboratory Standards Institute Approved Standard: M2. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at www.clsi.org 2. Washington, J.A., and G.L. Woods. 1995. Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods, p. 1327-1341. In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 3. Baker, C.N., C. Thornsberry, and R.W. Hawkinson. 1983. Inoculum standardization in antimicrobial susceptibility testing: evaluation of overnight agar cultures and the rapid inoculum standardization system. J. Clin. Microbiol. 17:450-457. 4. Swenson, J.M., B.C. Hill, and C. Thornsberry. 1986. Screening pneumococci for penicillin resistance. J. Clin. Microbiol. 24:749-752. 5. Hindler, J.F., and J.M. Swenson. 2003. Susceptibility test methods: fastidious bacteria. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8thed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 6. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1993. Approved Standard: M2-A5. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 5th ed. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 7. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1995. Sixth informational PA-254030.07
-4-
supplement: M100-S6. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, Pa. 8. Data v archivu společnosti Becton Dickinson Microbiology Systems. 9. Jorgensen, J.J. 1994. Detection of antimicrobial resistance in Streptococcus pneumoniae by use of standardized susceptibility testing methods and recently developed interpretive criteria. Clin. Microbiol. Newsl. 16(13)97-104. 10. Neumann, M.A., D.F. Sahm, C. Thornsberry, J.E. McGowan, Jr. 1991. Cumitech 6A, New developments in antimicrobial agent susceptibility testing: a practical guide. Coordinating ed., J.E. McGowan, Jr. American Society of Microbiology, Washington, D.C.
BALENÍ/DOSTUPNOST Agar BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood (90mm destičky Stacker) Kat. č. 254030 Médium na miskách k okamžitému použití, 20 kusů v balení Kat. č. 254080 Médium na miskách k okamžitému použití, 120 kusů v balení Agar BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood (150 mm) Kat. č. 255080 Médium na miskách k okamžitému použití, 20 kusů v balení Agar BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep blood, Square (čtvercový) (120 x 120 mm) Kat. č. 254517 Médium na miskách k okamžitému použití, 20 kusů v balení
DALŠÍ INFORMACE Další informace vám poskytne místní zástupce společnosti BD. Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 – 12 D-69126 Heidelberg/Germany Phone: +49-62 21-30 50 Fax: +49-62 21-30 52 16
[email protected] http://www.bd.com http://www.bd.com/europe/regulatory/ Prompt is a trademark of 3M. ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. BD, BD Logo and all other trademarks are property of Becton, Dickinson and Company.
PA-254030.07
-5-
© 2013 BD
