POKYNY K POUŽITÍ – MÉDIA NA MISKÁCH K OKAMŽITÉMU POUŽITÍ PA-254032.07
Rev.: April 2013
BD Mueller Hinton II Agar Agar BD Mueller Hinton II Agar 150 mm Agar BD Mueller Hinton II Agar, Square ÚČEL POUŽITÍ Médium BD Mueller Hinton II Agar, které je k dispozici v několika formátech misek, se používá při standardizovaném diskovém difúzním testování ke stanovení citlivosti klinických izolátů rychle rostoucích aerobních mikroorganismů na antimikrobiální látky dle standardizace Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).1
ZÁSADY A VYSVĚTLENÍ POSTUPU Mikrobiologická metoda. Protože laboratoře klinické mikrobiologie na začátku 60. let minulého století používaly širokou škálu postupů k určení citlivosti bakterií na antibiotika a chemoterapeutické látky, Bauer, Kirby a další vyvinuli standardizovaný postup, pro který byl jako testovací médium vybrán agar Mueller Hinton, což je médium které bylo původně vynalezeno pro izolaci gonokoků.1-4 Následná mezinárodní spolupráce na studii potvrdila vhodnost agaru Mueller Hinton pro tento účel z důvodu relativně dobré reprodukovatelnosti média, jednoduchosti jeho vzorce a hodnotě experimentálních údajů, které byly pomocí tohoto média nashromážděny.5 Pečlivě prostudujte předepsanou normu z CLSI pro Bauer.Kirbyův.6 Podle Bauer-Kirbyova postupu byly vypracovány další národní normy pro testování antibakteriální citlivosti. V těchto normách se mohou hustoty nátěru, způsob očkování, velikost výsledných zón a způsob interpretace lišit od normy CLSI. Protože společné evropské normy pro testování citlivosti neexistují, je v případě, že nelze použít pokyny normy CLSI, nutno dodržovat místní státní normy. Bauer-Kirbyův postup je založen na difúzi přes agarový gel antibakteriálních látek, kterými jsou impregnované na papírových terčíky.7 Narozdíl od dřívějších metod, které využívaly terčíky s vysokou a nízkou antibakteriální koncentrací a k jejich interpretaci využívaly přítomnosti nebo absence zón, kde nastala inhibice, tato metoda využívá terčíků s jedinou koncentrací antibakteriálního činitele a průměry zón odpovídají minimálním inhibičním koncentracím (MIC).1,2,6,7 Při provádění testu se standardizovaná suspenze organismu potře po celém povrchu média. Na povrch média se pak umístí papírové terčíky impregnované předepsaným množstvím antibiotik nebo jiných antimikrobiálních látek, provede se inkubace destičky a změří se zóny kolem jednotlivých terčíků. Určení toho, zda je organismus citlivý, středně citlivý nebo resistentní proti určité látce, se provádí porovnáním velikosti získaných zón s velikostmi uvedenými v tabulce 2A až 2D v dokumentu CLSI č. M100 (M2).6 Bylo zjištěno, že difúzní terčíkové testy na citlivosti ovlivňují různé faktory. Patří k nim médium, nadměrná vlhkost povrchu média, tloušťka agaru, účinnost terčíku, koncentrace nátěru, pH a produkce ß-laktamázy testovanými organismy.5-8 BD Mueller Hinton II Agar se vyrábí tak, aby obsahovat nízkou hladinu thyminu a thymidinu9.10 a regulovanou hladinu vápníku a hořčíku.11-13 Hladina thyminu a thymidinu v surovinách se určuje pomocí terčíkovým difúzním postupem s pomocí terčíků obsahujících trimetoprim sulfametoxazol (SXT) a Enterococcus faecalis ATCC 33186 anebo 29212. Hladina vápníku a hořčíku se reguluje testováním surovin a doplněním zdrojů vápníku anebo hořčíku dle potřeby tak, aby vznikly správné průměry zón s aminoglykosidovými antibiotiky a Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. PA-254032.07
-1-
ČINIDLA BD Mueller Hinton II Agar Vzorec* na litr deionizované vody Hovězí výtažek 2,0 g Kyselý hydrolyzát kaseinu 17.5 Škrob 1.5 Agar 17.0 pH 7,3 ± - 0,2 *Upraveno anebo doplněno dle požadavků tak, aby byla splněna kritéria výkonu.
BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ . Pouze pro odborné použití. Nepoužívejte misky , které vykazují známky mikrobiální kontaminace, změny zabarvení, vysušení, popraskání nebo jiné známky poškození. Nadměrné svraštění tohoto média následkem vysušení může vést k nesprávným výsledkům citlivosti. Pokyny pro aseptickou manipulaci, biologické nebezpečí a likvidaci použitého produktu naleznete v dokumentu VŠEOBECNÉ POKYNY K POUŽITÍ.
SKLADOVÁNÍ A ŽIVOTNOST Po převzetí skladujte misky až do doby těsně před použitím v originálním pouzdru, v temnu a při teplotě 2 až 8° C. Systém nesmí zmrznout nebo se přehřát. Misky lze očkovat až do data platnosti (viz štítek na obalu) a inkubovat je lze po doporučenou dobu inkubace. Misky z otevřených sad po 10 kusech lze použít po dobu jednoho týdne, pokud jsou uloženy v čistém prostředí při teplotě 2 až 8° C.
KONTROLA KVALITY UŽIVATELEM
Při kontrole kvality uživatelem je nutno dodržet příslušné normy CLSI6 nebo státní normy, pokud se uplatňují. V zásadě je nutno sledovat postupy popsané níže v části Provedení testu včetně referenčních kmenů uvedených v části Materiál, který není součástí dodávky. Správné fungování používaných misek s agarem Mueller Hinton II a antibakteriálních terčíků kontrolujte nejméně dvakrát týdně. Vzhled nenaočkovaného média: bezbarvé až světle oranžové.
POSTUP Dodané materiály BD Mueller Hinton II Agar (dodává se v několika různých formátech misek; viz část Balení/dostupnost). Mikrobiologicky kontrolováno. Materiál, který není součástí dodávky 1. Očkovací živná půda ve zkumavkách, např. BD Trypticase Soy Breath (živná půda s výtažkem sójového kaseinu) nebo živná půda Mueller Hinton II (s upravený kationty) pro přípravu standardního nátěru a sterilní živná půda nebo fyziologický roztok pro zředění nátěru. 2. Porovnávací etalon obsahující barytovou bělobu (0,5 ml 0.048 M BaCl2 [1.175% obj. hmotnosti BaCl2 ) 2H2O] až 99,5 ml 0,18 M [0,36 N] H2SO4 [1% v/v]). 3. Fotometrické zařízení pro úpravu zakalení očkovací suspenze tak, aby odpovídalo McFarlandově normě o hodnotě 0,5. 4. Jako alternativu výše uvedených materiálů (1-3) lze použít očkovací systém BD Prompt Inoculation System (zařízení pro titrační přípravu nátěru).6,18 5. Kontrolní kultury Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218 (pouze pro kombinace s inhibitorem ß-laktam-ß-laktamázy), Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 a Enterococcus faecalis ATCC 33186 nebo ATCC 29212.6 6. Papírové terčíky impregnované předepsaným množstvím antibakteriálních látek,6 např. terčíky pro testování citlivosti BD Sensi-Disc. PA-254032.07
-2-
7. Zásobník, např. 6, 8 nebo 12-ti místné zařízení BD Sensi-Disc. I pro čtvercové misky s agarem Mueller Hinton II je k dispozici vhodné zásobníky. 8. Pravítko nebo jiné zařízení pro měření velikosti zóny v milimetrech. 9. Pomocné živné půdy, činidla a laboratorní vybavení dle potřeby. Druhy vzorků Tento produkt se používá k testování citlivosti čistých kultur izolovaných z klinických vzorků (viz také SPECIFICKÉ VLASTNOSTI ÚČINNOSTI A OMEZENÍ POSTUPU). Bylo navrženo, aby se provádělo přímé testování antibakteriální citlivosti na krevních kulturách a kulturách z moči, testy je však nutno opakovat a potvrdit pomocí čistých kultur. 14-17 Provedení testu 1. Popis přímé metody suspenze kolonie6Zajistěte si čistou, čerstvou (=přes noc) kulturu z neselektivního média, např. krevní agar. 2. U běžných testů citlivosti lze nátěr připravit vyhotovením přímé suspenze kolonií s fyziologickým roztokem nebo živnou půdou.6 Ihned tuto suspenzi upravte na zakalení podle normy barytové běloby (0,5 McFarlandovy normy) bez inkubace. Zakalení standardního a testovací nátěry lze porovnat přidržením obou zkumavek před bílým pozadím s jemně nakreslenými černými čarami, nebo lze použít fotometrické zařízení. 3. Bylo zjištěno, že pro účely běžného testování jsou přijatelní alternativní metody přípravy nátěru pomocí zařízení, která umožňují přímou standardizaci nátěru bez úpravy zakalení, například očkovací systém BD Prompt Inoculation System. 4. Do 15 minut od úpravy zakalení v nátěru ponořte sterilní tampón do řádně rozpuštěného nátěru a pevně jej několikrát přitiskněte k horní části vnitřní stěny zkumavky, aby se vyloučil nadměrný obsah kapaliny. 5. Celý povrch destičky s agarem naočkujte třikrát a mezi nátěry přitom otáčejte miskou o 60° tak, aby bylo dosaženo rovnoměrného očkování. 6. Víčko může zůstat otevřené po dobu 3 až 5 minut a miska může zůstat v pokojové teplotě po dobu nejdéle 15 minut, což umožní absorbování případné povrchové vlhkosti před aplikací terčíků impregnovaných antibakteriální látkou. 7. Pomocí dávkovače antibakteriálních terčíků aplikujte terčíky a použijte přitom aseptická bezpečnostní opatření. Uložte terčíky tak, aby jejich středy byly alespoň 24 mm od sebe. Po uložení na agar terčíky přitlačte sterilní jehlou nebo pinzetou, aby byly v úplnému kontaktu s povrchem média. Tento krok není nutný, pokud jsou disky uloženy pomocí samopřitlačného zásobníku BD Sensi-disc. 8. Do 15 minut po aplikaci terčíků misky otočte a umístěte do je inkubátoru o teplotě 35°C. Misky nesmí být inkubovány při zvýšené koncentraci oxidu uhličitého. 9. Misky inkubujte po dobu 16 až 18 h. Celých 24 hodin inkubace je nutno dodržet pro Staphylococcus aureus testovaný oxicilinem kvůli určení methicilin-resistentního S. aureus (MRSA)19, a pro Enterococcus spp. testovaný vankomycinem kvůli určení vankomycin-resistentních kmenů. Indikací resistence je růst ve viditelné zóně inhibice.20 Výsledky 1. Po inkubaci by měl být vidět slévající se „povlak“ rostoucí flóry. Rostou-li pouze izolované kolonie, nátěr byl příliš slabý a test je nutno opakovat. 2. Pomocí posuvného měřítka a pravítka nebo šablony připravené pro tento účel změřte průměr zón úplné inhibice (při posouzení prostým okem) včetně průměru terčíku na nebližší celý milimetr. Měřidlo přidržte u spodní části otočené destičky oproti černému neodrážejícímu povrchu tak, aby osvětlení dopadalo shora. 3. Za hraniční bod je nutno považovat oblast, která při zjištění prostým okem nevykazuje zjevný viditelný růst. Slabého růstu drobných kolonií, které lze zjistit jen s obtížemi u okraje zjevné zóny inhibice, si nevšímejte. Výjimkou je Staphylococcus aureus testovaný pomocí terčíku s oxacilinem, stejně jako enterokoky testované pomocí vankomycinu. V těchto případech je nutno použít procházejícího světla ke zjištění jemného zakalení kolem terčíku, kterým se projevují "skrytě rezistentní" kmeny MRSA19 nebo vankomycin-rezistentní enterokoky.6 Je-li u druhu Proteus zóna inhibice dostatečně zřetelná, aby se dala změřit, nevšímejte si případného plazivého růstu uvnitř zóny. U trimetoprimu a sulfonamidů mohou PA-254032.07
-3-
antagonisté v médiu zapříčinit mírný růst, proto si nevšímejte mírného růstu (20% povlakového růstu nebo méně) a průměr zóny změřte pouze podle zřetelného okraje. Výpočet a interpretace výsledků Průměry zón změřených kolem terčíků je nutno porovnat s průměry uvedenými v tabulce 2A až 2D v dokumentu M100 (M2) normy CLSI.6 Výsledky získané u konkrétních organismů pak lze zapsat jako rezistentní, přechodné nebo citlivé. Poznámka: Pravidelně vycházejí informační dodatky k dokumentu M2 normy CLSI nebo revidované verze obsahující revidované tabulky antibakteriálních terčíků a interpretačních norem. Pro současná doporučení je nutno použít nejnovější tabulky. Celou normu a informační dodatky lze objednat od Národního výboru pro klinické laboratorní normy na adrese Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087-1898, USA. Telefon: ++1-610-688-1100.
VÝKONOVÉ CHARAKTERISTIKY A OMEZENÍ POSTUPU Agar Mueller Hinton je standardní médium používané k testování citlivosti rychle rostoucích aerobních nebo fakultativně anaerobních bakteriálních bakterií, např. stafylokoků, enterokoků, členů rodiny Enterobacteriaceae a aerobních Gram negativních tyček (např. Pseudomonas spp). Pro testování náročných druhů, jako je např. Haemophilus spp., Neisseria spp. a S. pneumoniae a enterokoky, byly vypracovány odlišné postupy a jiná média a podmínky. Standardizovaný postup CLSI se nepoužívá k testování výhradně anaerobních organismů, organismů vykazujících slabý nebo pomalý růst na agaru Mueller Hinton nebo organismů vykazujících výrazný rozdíl mezi kmeny ve vztahu k rychlosti růstu.6 Citlivé organismy (např. Haemophilus influenzae) je nutno testovat podle směrnic uvedených v dokumentu M2 normy CLSI.6 U některých kombinací organismů a antibakteriálních látek nemusí mít zóna inhibice ostře ohraničený okraj, což může vést k nesprávné interpretaci. Nevhodná koncentrace nátěru může vést k nesprávným výsledkům. Je-li nátěr příliš silný, mohou být zóny inhibice příliš malé, a je-li nátěr příliš slabý, mohou být tyto zóny příliš velké a těžko měřitelné. Nevhodné uskladnění antibakteriálních terčíků může způsobit ztrátu účinnosti a zdánlivě rezistentní výsledek. Nadměrné svraštění tohoto média následkem nesprávného skladování může vést k ke zdánlivě citlivému výsledku. Citlivost organismu na určitou antibakteriální látku in vitro nemusí nutně znamenat, že tato látka bude účinná také in vivo. Pokyny pro interpretaci výsledků naleznete v příslušných citacích.7,8 Mohou se objevit bakterie, které vyžadují thymin nebo thymidin.20,21 Na agaru Mueller Hinton, který obsahuje nízkou hladinu thyminu nebo thymidinu, tyto organismy nerostou dobře. Byly vypracovány nové postupy využívající terčíků s vysokým obsahem gentamicinu (120 mg) a streptomycinu (300 mg), s jejichž pomocí se provádí zjišťování vysoké rezistence proti aminoglykosidům jako indikace toho, že na enterokokový izolát nebude součinně působit kombinace penicilinu nebo glykopeptidu s aminoglykosidem.6,21,22 Úplné pojednání o zjišťování MRSA, rezistentních enterokoků, Gram negativních bacilů rozšířeného spektra produkujících ß-laktamázu a dalších omezeních testů naleznete v dokumentu M2 a M7 norem CLSI.23 Bylo prokázáno, že agar Mueller Hinton II spolehlivě určuje MRSA, které produkuje zakalenou zónu inhibice kolem oxacilinových terčíků.19 V případě pochybností je nutno použít další metodu, např. kontrolní agar BD Oxacillin Screen Agar. Způsob očkování, interpretace a hranice velikosti zón uvedené v tomto dokumentu a normě CLSI se mohou lišit od státních norem. 6, 24
CITACE 1. Bauer, A.W., W.M.M. Kirby, J.C. Sherris, and M. Turck. 1966. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45:493-496. PA-254032.07
-4-
2. Ryan, K.J., F.D. Schoenknecht, and W.M.M. Kirby. 1970. Disc sensitivity testing. Hospital Practice 5:91-100. 3. Barry, A.L., F. Garcia, and L.D. Thrupp. 1970. An improved single-disk method for testing the antibiotic susceptibility of rapidly-growing pathogens. Am. J. Clin. Pathol. 53:149-158. 4. Mueller, J.H., and J. Hinton. 1941. A protein-free medium for primary isolation of the gonococcus and meningococcus. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 48:330-333. 5. Ericsson, H.M., and J.C. Sherris. 1971. Antibiotic sensitivity testing. Report of an international collaborative study. Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sec. B, Suppl. 217. 6. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved standard: M2. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at www.clsi.org 7. Woods, G.L., and J.A. Washington. 1995. Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods, p. 1327-1341. In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.C. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, DC. 8. Thornsberry, C., T.L. Gavan, and E.H. Gerlach. 1977. Cumitech 6, New developments in antimicrobial agent susceptibility testing. Coordinating ed., J.C. Sherris. American Society of Microbiology, Washington, DC. 9. Koch, A.E., and J.J. Burchall. 1971. Reversal of the antimicrobial activity of trimethoprim by thymidine in commercially prepared media. Appl. Microbiol. 22:812-817. 10. Ferone, R., S.R.M. Bushby, J.J. Burchall, W.D. Moore, and D. Smith. 1975. Identification of Harper-Cawston factor as thymidine phosphorylase and removal from media of substances interfering with susceptibility testing to sulfonamides and diaminopyrimidines. Antimicrob. Agents Chemother. 7:91-98. 11. Reller, L.G., F.D. Schoenknecht, M.A. Kenny, and J.C. Sherris. 1974. Antibiotic susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa: selection of a control strain and criteria for magnesium and calcium content in media. J. Infect. Dis. 130:454-463. 12. Pollock, H.M., B.H. Minshew, M.A. Kenny, and F.D. Schoenknecht. 1978. Effect of different lots of Mueller-Hinton Agar on the interpretation of the gentamicin susceptibility of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 14:360-367. 13. D'Amato, R.F., and C. Thornsberry. 1979. Calcium and magnesium in Mueller-Hinton agar and their influence on disk diffusion susceptibility results. Current Microbiol. 2:135-138. 14. Wegner, D.L., C.R. Mathis, and T.R. Neblett. 1976. Direct method to determine the antibiotic susceptibility of rapidly growing blood pathogens. Antimicrob. Agents Chemother. 9:861-862. 15. Johnson, J.E., and J.A. Washington II. 1976. Comparison of direct and standardized antimicrobial susceptibility testing of positive blood cultures. Antimicrob. Agents Chemother. 10:211-214. 16. Waterworth, P.M., and M. Del Piano. 1976. Dependability of sensitivity tests in primary culture. J. Clin. Pathol. 29:179-184. 17. Hollick, G.E., and J.A. Washington II. 1976. Comparison of direct and standardized disk diffusion susceptibility testing of urine cultures. Antimicrob. Agents Chemother. 9:804-809. 18. Baker, C.N., C. Thornsberry, and R.W. Hawkinson. 1983. Inoculum standardization in antimicrobial susceptibility testing: evaluation of overnight agar cultures and the rapid inoculum standardization system. J. Clin. Microbiol. 17:450-457. 19. Hindler, J.A., and C.B. Anderbied. 1985. Effect of the source of Mueller-Hinton agar and resistance frequency on the detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 21:205-210. 20. Maskell, R., O.A. Okubadejo, R.H. Payne, and L. Pead. 1977. Human infections with thymine-requiring bacteria. J. Med. Microbiol, 11:33-45. 21. Haltiner, R.C., P.C. Migneault, and R.G. Robertson. 1980. Incidence of thymidinedependent enterococci detected on Mueller-Hinton agar with low thymidine content. Antimicrob. Agents Chemother. 18:365-368. 22. Murray, B.E. 1990. The life and times of the Enterococcus. Clin. Microbiol. Rev. 3:46-65. 23. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved standard: M7. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at www.clsi.org PA-254032.07
-5-
24. Jorgensen, J.H., and J.D. Turnidge. 2003. Susceptibility test methods: dilution and disk diffusion methods. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
BALENÍ/DOSTUPNOST BD Mueller Hinton II Agar (90 mm destičky Stacker; [standardní velikost]). Kat. č. 254032 Médium na miskách k okamžitému použití, 20 misek Kat. č. 254081 Médium na miskách k okamžitému použití, 120 misek BD Mueller Hinton II Agar (150 mm) Kat. č. 254062 Médium na miskách k okamžitému použití, 20 misek BD Mueller Hinton II Agar, čtvercový (120 x 120 mm) Kat. č. 254518 Médium na miskách k okamžitému použití, 20 misek
DALŠÍ INFORMACE Další informace vám poskytne místní zástupce společnosti BD.
Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 – 12 D-69126 Heidelberg/Germany Phone: +49-62 21-30 50 Fax: +49-62 21-30 52 16
[email protected] http://www.bd.com http://www.bd.com/europe/regulatory/ Prompt is a trademark of 3M. ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are the property of Becton, Dickinson and Company. © 2013 BD
PA-254032.07
-6-
