HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ — BBL™ Enterotube II IA-273176.01
Készült:Jan. 2007
BD BBL Enterotube II HASZNÁLATI JAVASLAT A BBL Enterotube II egy azonnal használható azonosítási rendszer az Enterobacteriaceaek és számos más, oxidáz-negatív, gram-negatív bacilus azonosítására.
AZ ELJÁRÁS ELVE ÉS MAGYARÁZATA Mikrobiológiai módszer. Az Enterobacteriaceaek a fertőzések igen gyakori okai. A baktériumoknak ez a csoportja a szénhidrátokat elsősorban fermentáció és oxidáció útján használják fel. Vannak köztük kataláz pozitívak és szinte mindegyikük oxidáz-negatív. (A közelmúltban felvetették, hogy a 16S rRNS szekvenálása alapján, mivel tartalmazza a gyakori enterobakteriális antigént, a Plesiomonas shigelloidest is sorolják az Enterobacteriaceaek közé.1,2 Korábban, ezt az oxidáz-pozitív mikroorganizmust a Vibrionaceaek közé sorolták.) Az Enterobacteriaceaek azonosítása Ewing és Farmer tanulmánya alapján a biokémiai reakciók alapján történik. A részleteket lásd az irodalomjegyzékben felsorolt dokumentumokban.1-11 Miközben az elmúlt években számos fajt és nemzettséget írtak le, a klinikai mintákból izolált mikroorganizmusok ugyanahhoz a 20–25, évek óta jól ismert fajhoz tartoznak.1 A BBL Enterotube II egy minden szükséges anyagot tartalmazó, kamrákra osztott műanyag cső, amely tizenkét különböző tápközeget tartalmaz és így 15 biokémiai reakció meghatározását teszi lehetővé (glükóz, gáztermelés glükózból, lizin dekarboxiláz, ornitin dekarboxiláz, H2S, indol, adonitol, laktóz, arabinóz, szorbitol, Voges-Proskauer (VP), dulcitol, fenilalanin dezamináz (PA), urea és citrát). A mellékelt inokuláló szál egy lépésben inokulálja az összes kamrát egy izolátum akár csak egy, vagy néhány különálló telepéből kiindulva. A reakciók eredményeinek kombinációja az Interpretaion Guide (kódkönyv) útmutatásai alapján lehetővé teszi a klinikai szempontból fontos Enterobacteriaceaek azonosítását. A BBL Enterotube II Intrepretation Guide (kódkönyv) a BBL Enterotube II által használt biokémiai tesztek referenciái által tartalmazott százalékos adatok alapján lett összeállítva.3-11 A Results Pad (Eredménylap) és a Color Reaction Chart (Színreakció lap) lehetővé teszi a BBL Enterotube II segítségével kapott eredmények gyors ellenőrzését. Az ellenőrzött pozitív számok összesítése után, a kapott szám alapján az Interpretation Guide-ban azonosítható a mikroorganizmus. Ahol két vagy több mikroorganizmus is szóba jöhet, a további azonosításhoz szükséges megerősítő tesztek is megtalálhatók. A következő folyamatábra mutatja, hogyan kell az oxidáztesztet használni arra a célra, hogy differenciálni lehessen az Enterobacteriaceaek családjába tartozó mikroorganizmusokat a nem fermentáló, oxidáz-negatív vagy -pozitív, illetve a fermentáló, oxidáz-pozitív, gram-negatív baktériumoktól a BBL Enterotube II vagy a BBL Oxi/Ferm Tube II teszt alkalmazása esetén. Tiszta tenyészet nem szelektáló táptalajon ↓ Oxidázteszt pozitív negatív ↓ ↓ BBL Oxi/Ferm Tube II inokulálása BBL Enterotube II inokulálása ↓ ↓ Anaerob glükóz Glükóz Pozitív Negatív Pozitív Negatív* Aeromonas spp., Achromobacter spp., Acinetobacter spp., Enterobacteriaceae Alcaligenes spp., Bordetella Plesiomonas Stenotrophomonas maltophilia stb. shigelloides, bronchiseptica, Moraxella Vibrio spp. spp., Pasteurella spp. stb. * Ezeket a fajokat a BBL Enterotube II rendszerrel kell azonosítani, de a megerősítéshez szükség lehet a BBL Oxi/Ferm Tube II alkalmazására is.
IA-273176.01
-1-
REAGENSEK BBL Enterotube II Szubsztrátok és más aktív összetevők, valamint a nem inokulált táptalaj színe: • 1. táptalaj (Glükóz): Glükóz (20,0 g/l) megfelelő alaptápközegbe keverve, krezolvörös pHindikátorral. A táptalajt az anaerob körülmények biztosítása és a gázképződés megfigyelhetősége érdekében viasz borítja. Nem inokulált: piros. • 2. táptalaj (Lizin): Lizin (10,0 g/l) megfelelő alaptápközegbe keverve, bróm-krezol lila pHindikátorral. A táptalajt az anaerob körülmények biztosítása érdekében viasz borítja. Nem inokulált: sárga. • 3. táptalaj (Ornitin): Ornitin (10,0 g/l) megfelelő alaptápközegbe keverve, bróm-krezol lila pHindikátorral. A táptalajt az anaerob körülmények biztosítása érdekében viasz borítja. Nem inokulált: sárga. • 4. táptalaj (H2S/Indol): Nátrium-tioszulfát (4,7 g/l), vas-ammónium-citrát (0,6 g/l) és triptofán (1,2 g/l) a megfelelő alaptápközegbe keverve. Nem inokulált: drapp vagy világos sárga. • 5. táptalaj (Adonitol): Adonitol (20,0 g/l) megfelelő alaptápközegbe keverve, krezolvörös pHindikátorral. Nem inokulált: piros. • 6. táptalaj (Laktóz): Laktóz (20,0 g/l) megfelelő alaptápközegbe keverve, krezolvörös pHindikátorral. Nem inokulált: piros. • 7. táptalaj (Arabinóz): Arabinóz (20,0 g/l) megfelelő alaptápközegbe keverve, krezolvörös pH-indikátorral. Nem inokulált: piros. • 8. táptalaj (Szorbitol): Szorbitol (20 g/l) megfelelő alaptápközegbe keverve, krezolvörös pHindikátorral. Nem inokulált: piros. • 9. táptalaj (Voges-Proskauer): Glükóz (20,0 g/l) megfelelő alaptápközegbe keverve. Nem inokulált: színtelen vagy világos sárga. • 10. táptalaj (Dulcitol/PA): Dulcitol (20,0 g/l), fenilalanin (7,0 g/l) és vas-ammónium-citrát (0,5 g/l) a megfelelő alaptápközegbe keverve, brómtimolkék pH-indikátorral. Nem inokulált: zöld. • 11. táptalaj (Urea): Urea (20,0 g/l) megfelelő alaptápközegbe keverve, fenolvörös pHindikátorral. Nem inokulált: drapp vagy világos sárga. • 12. táptalaj (Citrát): Nátrium-citrát (2,0 g/l) megfelelő alaptápközegbe keverve, brómtimolkék pH-indikátorral. Nem inokulált: zöld.
FIGYELMEZTETÉS . Használata szakértelmet igényel. Ne használja a csöveket, ha azon mikrobiális szennyeződés, kiszáradás és betöredezés, illetve a károsodás bármilyen más jelét észleli. A következő tényezők bármelyike befolyásolhatja a BBL Enterotube II pontosságát: kiszáradás vagy elfolyósodás, a viasz leválása a táptalajok felületéről, a táptalajok színének bármilyen eltérése a REAGENSEK fejezet "Nem inokulált" megjegyzéseiben megjelölt színtől, illetve ha a táptalajok felszínén bármilyen szaporodás látszik. Az egyes kamrák esetében a következőkre kell ügyelni: • Glükóz: Az ebben a kamrában lévő viasz fedőréteg biztosítja a szükséges mértékű anaerobiózist, amely ahhoz szükséges, hogy egyedül az összes Enterobacteriaceaera jellemző valós fermentációs reakció jöhessen létre. Ha ez a tápközeg az inokulálás és az inkubálás után piros marad, akkor a törzs nem tartozik az Enterobacteriaceaek családjába. Például azok az oxidáz-negatív nem Enterobacteriaceae mikroorganizmusok, amelyek nem fermentálják a glükózt anaerob körülmények között a BBL Enterotube II rendszerben glükóz-negatív Acinetobacter fajok. Ezért ezeket a mikroorganizmusokat a BBL Enterotube II rendszer használatával meg lehet különböztetni az Enterobacteriaceaektől (az Interpretation Guide-ban az oxidáz-negatív, nem fermentáló adatbázist kell használni); a további azonosításhoz a BBL Oxi/Ferm Tube II használata szükséges. • Fenilalanin (PA): A tápközeg inkubálás után sötétebb zölddé válik. Ezt negatív reakciónak kell tekinteni. Figyelem: Az indol- és a VP-reagensek készítésénél valamint használatánál tartsa be a megfelelő használati utasításokat és vegye figyelembe a biztonsági útmutatásokat. IA-273176.01
-2-
A steril munkával, a biológiai veszélyekkel és a használt termékek kidobásával kapcsolatban olvassa el az ÁLTALÁNOS HASZNÁLATI ÚTMUTATÓT.
TÁROLÁS ÉS ELTARTHATÓSÁG Átvétel után a BBL Enterotube II rendszert sötét helyen, 2–8°C-on az eredeti dobozban tárolja a felhasználásig. Kerülje a termék megfagyását, illetve túlmelegedését. A csöveket a lejárati időn belül kell inokulálni (lásd: csomagolás címkéje), és az előírt inkubációs időt be kell tartani. A felbontott csomagokból a csöveket a szavatossági idő lejártáig fel lehet használni. A felnyitott csöveket azonnal fel kell használni.
FELHASZNÁLÓI MINŐSÉGELLENŐRZÉS
Citrát
Urea
Fenilalani n
Dulcitol
VP
Szorbitol
Arabinóz
Laktóz
Adonitol
Indol
H2S
Ornitin
Lizin
Gáz
MIKROOGANIZMUS
Glükóz
Inokulálja a BBL Enterotube II rendszert a lenti törzsekkel. Az inokuláláshoz, inkubáláshoz és leolvasáshoz kövesse A teszt kivitelezése részben leírtakat.
Helyes biokódok
+ +/- - + + + + +/66007 / 66006 / Proteus mirabilis 46007 ATCC™ 12453 +/(+) +/- + + + + + 63007 / 43007 Proteus vulgaris ATCC 6380 + +/- - + + + -/+ 61404 / 41405 / Providencia alcalifaciens ATCC 9886 41404 / 61405 + +/- + + - +/- + + + 74461 / 54461 / Serratia marcescens ATCC 13880 74061 / 54061 + +/- + + - + + + + 75340 / 55340 Escherichia coli ATCC 25922 + +/- + + + + + + + -/+ + 50771 / 70771 / Klebsiella 70773 / 50773 pneumoniae ATCC 27736 - -/+ -/(+) + Pseudomonas * aeruginosa ATCC 27853 * A P. aeruginosa oxidáz-pozitív, ezért, a BBL Enterotube II adatbázisa nem tartalmazza. Azonban ez a törzs kontroll mikroorganizmusként, a gáz és glükóz kamrák negatív reakcióinak kimutatásánál hasznos. += pozitív; − = negatív; (+) gyenge pozitív; +/- = pozitív vagy (ritkán) negatív; +/(+) = pozitív vagy (ritkán) gyenge pozitív; -/+= negatív vagy (ritkán) pozitív.
ELJÁRÁS Szállított anyagok BBL Enterotube II Mikrobiológiailag ellenőrzött Results Pad (Eredménylap) és Color Reaction Chart (Színreakció lap) a BBL Enterotube II rendszerhez. Nem szállított anyagok BBL Enterotube II Interpretation Guide (kódkönyv) (katalógus szám: CM-273176.CE), amely három adatbázisból tevődik össze. (1) Oxidáz-negatív nem fermentálók, (2) Enterobacteriaceae – VP nélküli módszer és (3) Enterobacteriaceae – VP-t alkalmazó módszer Kovács-féle indol reagens (Indole Dropper Reagent [Indol reagens cseppentő], 50 ampulla, katalógus szám: 261185) és Voges-Proskauer reagensek (Voges-Proskauer A Dropper Reagent [VP A reagens cseppentő], 50 ampulla, katalógus szám: 261192; Voges-Proskauer B Dropper Reagent [VP B reagens cseppentő], katalógus szám: 261193), amelyek a BD-nél beszerezhetők. Eszközök és reagensek a BBL Enterotube II Interpretation Guide által megadott kiegészítő tesztek elvégzéséhez. BBL Oxi/Ferm II azonosító rendszer (katalógus szám: 212116) a nem Enterobacteriaceaek azonosítására. Kiegészítő táptalajok, reagensek, laboratóriumi eszközök, a leírásnak megfelelően. IA-273176.01
-3-
A Kovács-féle reagens a következők alapján a laboratóriumban is elkészíthető: Amil- vagy izoamil alkohol 75 ml p-dimetil-amino-benzaldehid 5g Hidroklórsav, tömény 25 ml Oldja fel a p-dimetil-amino-benzaldehidet (a reagensnek világos sárgának kell lennie) alkoholban, majd fokozatosan adja hozzá a savat. Az elkészült reagensnek szalmasárgának kell lennie. A maximális eltarthatóság érdekében az oldatot egy barna üvegben, hűtve kell tárolni. A sötétbarna színű reagenst nem szabad felhasználni. A Voges-Proskauer reagens elkészítési módja a következő: 5%-os alfa-naftol oldat Alfa-naftol 5g Etanol (etilalkohol), abszolút 100 ml 20%-os kálium-hidroxid oldat Víz
100 ml
Kálium-hidroxid (pellet) Kreatin
20 g 300 mg
Az elkészítés után a Voges-Proskauer reagens jól lezárt üvegben, 2–8°C-on, sötétben tárolva két hétig marad stabil.
Minták típusa A BBL Enterotube II egy biokémiai azonosító rendszer, és nem használható közvetlenül klinikai mintákhoz. Használja a megfelelő táptalajokról származó izolátumokat (lásd: A teszt kivitelezése). A BBL Enterotube II különféle mintákból izolált aerob, esetleg anaerob gramnegatív bacilusok azonosítására használható. A teszt kivitelezése A BBL Enterotube II inokulálásához MacConkey (MAC), Eosin Methylene Blue (EMB, Eozinmetilénkék), Salmonella Shigelle (SS) vagy Hektoen Enteric (HE, hektoen enterikus) táptalajokon, illetve nem szelektáló véres táptalajon szaporodott kultúrák használhatók. Az inokuláláshoz használt tenyészet legkevesebb 18 órás legyen, de ne legyen öregebb 48 óránál. Győződjön meg arról, hogy az izolátum, amelyet a BBL Enterotube II útján azonosítani kíván, tiszta gram-negatív bacilus tenyészet. A BBL Enterotube II rendszert kizárólag oxidáz-negatív izolátumokkal lehet használni, mivel az oxidáz-pozitív mikroorganizmusok (nem Enterobakteriaceaek) azonosításához a BBL Oxi/Ferm Tube II rendszert kell használni. 1. Töltse ki az izolátum kódlapján a beteg nevét, a minta számát és a dátumot. Megjegyzés: A felhasználónak kell eldöntenie, hogy a VP-t alkalmazó vagy nem alkalmazó adatbázist használja. A döntésnek megfelelően használja a kódlap elülső vagy hátulsó oldalát. Ha a VP nélküli adatbázist választja, a kiválasztott mikroorganizmusok azonosításához elképzelhető, hogy kiegészítésként végre kell hajtania a VP-reakciót is. 2. Vegyen elő egy BBL Enterotube II rendszert, és a címkére írja rá a beteg nevét, a minta számát és a dátumot. 3. Távolítsa el mindkét kupakot. Az inokuláló szál hegye a fehér kupak alatt található. Ne égesse le a szálat. 4. Közvetlenül, a BBL Enterotube II inokuláló szálának hegyével emeljen le egy jól elkülönült telepet (1. ábra). Az inokuláló szál hegyén és oldalán jól láthatóan legyen inokulum. Az inokuláló szállal ne érjen hozzá a táptalajhoz. A tapasztalatnak megfelelően egy, vagy több BBL Enterotube II rendszerrel szedjen fel további telepeket. 5. A BBL Enterotube II inokulálásához először tekerje meg a szálat, majd csavaró mozdulattal húzza át mind a tizenkét kamrán (2. ábra). 6. Helyezze vissza a szálat (sterilizálás nélkül) a BBL Enterotube II rendszerbe egy csavaró mozdulattal mind a tizenkét kamrán keresztül, míg a szálon található jelzés egy vonalba nem kerül a cső nyílásával (3. ábra). A szál hegyének a citrát kamrában kell látszania. A jelzésnél meghajlítva törje el a szálat. A szál csőben maradó része tartja fent a glükóz valódi fermentációjához, a gáztermeléshez és a lizin és ornitin dekarboxilálásához szükséges anaerob körülményeket. IA-273176.01
-4-
7. A szál letört részével, az aerob szaporodás elősegítése céljából ezekben a kamrákban üssön lyukat az utolsó nyolc kamra (adonitol, laktóz, arabinóz, szorbitol, Voges-Proskauer, dulcitol/PA, urea és citrát) levegőszelepének fedőhártyáján (4. ábra). Tegye vissza mindkét kupakot. 8. Inkubálja a BBL Enterotube II csöveket 18–24 óráig, 35–37°C-on, a lapos felületén fektetve vagy álló helyzetben. Tegye lehetővé a levegő szabad áramlását az inkubált csövek között. 9. Olvassa le és jegyezze fel az indol- és a Voges-Proskauer-reakciók kivételével az összes reakció eredményét. (A BBL Enterotube II eredményeinek leolvasását lásd az Eredmények részben). Az összes többi tesztet az indol és a Voges-Proskauer tesztek elvégzése előtt le kell leolvasni, mivel az ehhez a két teszthez szükséges reagensek módosíthatják a többi BBL Enterotube II teszt eredményét. Indol és Voges-Proskauer reagensek hozzáadása: 1. Helyezze a BBL Enterotube II csöveket vízszintesen a munkaasztalra vagy függőlegesen egy állványba a glükóz kamrával lefelé. Egy tű vagy egy BBL Enterotube II cső inokuláló szálának letört végével üssön, illetve egy felhevített inokuláló szállal olvasszon egy 3–4 mm átmérőjű lyukat az Indole/H2S és VP kamra védőfóliáján. 2. Az indolteszt elvégzése: Adjon 3-4 csepp Kovács-féle reagenst (kat. sz. 261185 vagy a laboratóriumban készítve, lásd a Nem szállított anyagok című fejezetett) a H2S/indol kamrába, és adja hozzá a reagenst a kamrához. A reagensnek érintkeznie kell a táptalaj felületével. Pozitív teszt esetén a hozzáadott reagens 10 másodpercen belül pirosra színeződik. 3. A Voges-Proskauer-teszt elvégzése: Amennyiben a VP-tesztet alkalmazó adatbázist választotta, ennek a tesztnek az elvégzése kötelező. A teszt elvégzése abban az esetben is szükséges lehet, ha a VP nélküli adatbázishoz megerősítő tesztre van szükség. Ha a laboratóriumban elkészített reagenst használ (lásd a Nem szállított anyagok című fejezetet), adagoljon két csepp 20%-os kálium-hidroxid oldatot, amely 0,3% kreatint tartalmaz és három csepp 5%-os, abszolút etilalkoholban oldott alfa-naftol oldatot a kamrába. Pozitív teszt esetén 20 percen belül piros szín jelenik meg. Az eredmények kiértékeléséhez ne várjon 20 percnél tovább! Ha reagens cseppentőket használ, adagoljon 3–5 csepp Voges-Proskauer A reagenst (kat. sz. 261192) és 1–2 csepp Voges-Proskauer B reagenst (kat. sz. 261193) a kamrába. Pozitív reakció esetén 5–15 percen belül meggypiros szín jelenik meg. A rézszínű vagy barnás elszíneződést negatív eredménynek kell tekinteni. Az eredmények kiértékeléséhez ne várjon 15 percnél tovább! Eredmények Kövesse az izolátumok azonosításához adott utasításokat. A pozitív és negatív reakciók megjelenéséről az 1. táblázat ad tájékoztatást. Megjegyzés: Ha nincs színváltozás, illetve a glükóz kamrában narancssárga szín jelenik meg, és a többi kamra színváltozása nyilvánvalóan mutatja a szaporodást, az adott mikroorganizmus nem az Enterobacteriaceaekhoz tartozik. (Lásd a FIGYELMEZTETÉS című fejezetet.) 1. 18–24 óra inkubáció után minden reakciót értékeljen ki. A VP- és az indolreakció kivételével, olvassa le a reakciókat kamránként, összehasonlítva a kódoló lapok fedelén megadott színmintát az inkubáció után a csőben lévő táptalaj színével, és amennyiben szükséges, egy szobahőmérsékletre melegített, nem inokulált BBL Enterotube II csővel (5. ábra). Az összes pozitív reakció színének (különböző erősségben) meg kell egyeznie a Color Reaction Chart színeivel. 2. Jegyezzen fel minden pozitív teszteredményt úgy, hogy bekarikázza a Results Pad lapon a megfelelő kamrához tartozó számot (6. ábra). 3. Végül, végezze el az indol- és VP-tesztet. Amennyiben azok pozitívak, karikázza be a megfelelő számot az előkészített lapon. A VP-teszt csak abban az esetben kötelező, ha a VP-t alkalmazó adatbázist választotta. IA-273176.01
-5-
4. Adja össze a bekeretezett részben található összes bekarikázott számot, és írja be ezt az összeget a nyilak alatti szabad mezőbe (6. ábra). 5. Keresse ki az ötjegyű számot az Interpretation Guide (kódkönyv) adatbázisában és az „ID Value” (ID-érték) oszlopban keresse meg a legjobb válasz(oka)t. Győződjön meg arról, hogy a helyes adatbázist használja [(1) Oxidáz-negatív nem fermentálók, (2) Enterobacteriaceae – VP nélküli módszer és (3) Enterobacteriaceae – VP-t alkalmazó módszer]. A 6. ábrán látható példán az azonosítás a Klebsiella pneumoniaet adta eredményként.
1. ábra
4. ábra
2. ábra
3. ábra
5. ábra
__________________________________________________________________________
(A)
(B) 6. ábra: BBL Enterotube II Results Pad (A= adatbázis VP-vel; B= adatbázis VP nélkül) IA-273176.01
-6-
1. táblázat: A negatív és pozitív reakciók megjelenése a BBL Enterotube II rendszeren REAKCIÓK
MEGJEGYZÉSEK
Reagensek
Negatív
Pozitív
Glükóz
vörös (narancssár ga)
sárga (arany)
Gáz termelés
viasz nem emelkedett meg
viasz megemelke dett
Lizin
sárga
bíbor
Ornitin
sárga
bíbor
H2S
drapp vagy világos sárga
fekete
Indoltermelé s
színtelen
rózsaszín/v örös
Adonitol, Laktóz, Arabinóz, Szorbitol
vörös (narancssár ga)
sárga (arany)
VogesProskauer
színtelen piros vagy világos sárga
Dulcitol
zöld
sárga (arany)
PA
a zöld minden árnyalata
feketeszürke
1. KAMRA Glükóz (GLU): A glükóz bakteriális fermentációjának végterméke vagy sav, vagy sav és gáz. A savképződés miatti pH-érték eltolódás következtében a tápközeg vörös indikátora (lúgos) sárgába vált át (savas). A sárga bármilyen mértékű megjelenését pozitív eredményként kell értékelni; a narancssárga színt negatívnak kell tekinteni. Gáz termelés (GAS): A nyilvánvaló gáztermelődés esetén a viasz fedőréteg teljes mértékben elválik a glükóz-tápközeg felületétől; a tápközegben lévő buborékokat nem kell figyelembe venni. Mivel a különböző baktériumok által termelt gáz mennyisége változó, annak mértéke, hogy a viaszréteg mennyire válik el a tápközegtől a tesztelt törzs függvényében változhat.
2. KAMRA Lizin dekarboxiláz (LYS): A lizin bakteriális dekarboxilálása során képződő lúgos végtermék, a kadaverin megjelenését a tápközegben lévő halvány sárga (savas) indikátor bíborba fordulása (lúgos) jelzi. Amennyiben a lizin dekarboxilálása nem következik be, a tápközeg sárga marad. 3. KAMRA Ornitin dekarboxiláz (ORN): Az ornitin dekarboxilálása során képződő lúgos végtermék, a putreszcin megjelenését a tápközegben lévő halvány sárga (savas) indikátor bíborba fordulása (lúgos) jelzi. Amennyiben az ornitin dekarboxilálása nem következik be, a tápközeg sárga marad.
4. KAMRA Hidrogénszulfid termelés (H2S): Hidrogén-szulfidot a kéntartalmú alapanyagokat, mint például a tápközegben található peptonokat és nátrium-tioszulfátot, redukálni képes baktériumok termelnek. A hidrogénszulfid reakcióba lép a tápközegben szintén megtalálható vassókkal, és fekete vas-szulfid csapadékot képez az inokulálás területe körül. Egyes Providencia törzsek ezen a táptalajon barna elszíneződést hoznak létre, ezt azonban nem szabad összetéveszteni a valódi H2S-termeléssel, amit a megjelenő fekete szín jelez. Megjegyzés: A BBL Enterotube II cső 24 óránál hosszabb inkubációja esetén a fekete csapadék elhalványulhat vagy visszaválthat negatívba. Indoltermelés (IND): A triptofán bakteriális metabolizmusa során a bakteriális triptofanáz enzim indolt termel, aminek jelenlétét a cső 18–24 órás inkubálása után a kamrába adagolt Kovács-féle indol reagens hatására megjelenő rózsaszínű vagy vörös elszíneződés jelez (lásd a Teszt kivitelezése című fejezetet).
5., 6., 7. és 8. KAMRA Adonitol (ADON), Laktóz (LAC), Arabinóz (ARAB), Szorbitol (SORB): Az adonitol, a laktóz, az arabinóz és a szorbitol bakteriális fermentálása során képződő savas végtermékek megjelenését a tápközegben lévő piros (lúgos) indikátor sárgába fordulása (savas) jelzi. A sárga bármilyen mértékű megjelenését pozitív eredményként kell értékelni; a narancssárga színt negatívnak kell tekinteni.
9. KAMRA Voges-Proskauer (VP): Az acetilmetilkarbinol (acetoin) egy köztes termék, ami akkor képződik, amikor a glükóz butilén-glikollá fermentálódik. Az acetoin-termelést a VP-reagensek hozzáadása és inkubálás után (lásd a Teszt kivitelezése című fejezetet) lehet észlelni. Az acetoin jelenlétét az 5–20 percen belül megjelenő piros szín mutatja.
10. KAMRA
IA-273176.01
Dulcitol (DUL): A dulcitol bakteriális fermentálása során képződő savas végtermékek megjelenését a tápközegben lévő zöld (lúgos) indikátor sárgába vagy halvány sárgába fordulása (savas) jelzi. Fenilalanin dezamináz (PA): Ez a teszt a fenilalanin dezaminálása során keletkező piruvátsavat mutatja ki. A piruvátsav reakcióba lép a tápközegben található vassókkal, és jellegzetes fekete vagy szürke elszíneződést hoz létre. Mivel a tápközeg már eleve tartalmaz vassókat, további vas-klorid hozzáadása nem szükséges.
-7-
REAKCIÓK
MEGJEGYZÉSEK
Reagensek
Negatív
Pozitív
Urea
drapp vagy világos sárga
világos rózsaszín, rózsaszín
Citrát
zöld
kék
11. KAMRA Urea (UREA): Az ureáz egy, számos baktériumban megtalálható enzim, amely az ureát hidrolizálja ammóniává, aminek következtében a tápközeg sárga indikátora (savas) pirosas-bíborba vált át (lúgos). Az ureázteszt a Proteus fajok esetében szigorúan pozitív, és már 4–6 órás inkubáció után is jól látszik. A teszt Klebsiella és Enterobacter fajok esetében 18–24 óra inkubáció után gyengén pozitív.
12. KAMRA Citrát (CIT): Ez a teszt azokat a mikroorganizmusokat mutatja ki, amelyek képesek a citrátot annak nátriumsó formájában, egyedüli szénforrásként felhasználni. A citrát felhasználására képes mikroorganizmusok lúgos metabolitokat termelnek, amelyek az indikátor színét zöldről (savas) sötét kékre változtatják (lúgos). A kék bármilyen árnyalatát pozitívnak kell tekinteni. MEGJEGYZÉS: Egyes mikroorganizmusok esetén nem jelenik meg minden esetben az „intenzív” színváltozás. Ugyanannak az alapszínnek az árnyalatait is pozitívnak kell tekinteni.
TELJESÍTMÉNY JELLEMZŐK ÉS AZ ELJÁRÁS KORLÁTAI A BBL Enterotube II rendszert kifejezetten az oxidáz-negatív, gram-negatív bacilusok kimutatására fejlesztették ki, ezért kizárólag az Enterobacteriaceaek családjába tartozó mikroorganizmusok differenciálására használható. Néhány oxidáz-negatív, nem fermentáló mikroorganizmus is kimutatható ezzel a rendszerrel, de ezen mikroorganizmusok esetében a BBL Oxi/Ferm Tube II rendszer használata javasolt. Teljesítmény jellemzők A BBL Enterotube II rendszert számos külső vizsgálat alapján fejlesztették ki. A közölt adatok alapján az azonosítás megbízhatósága 87–99%.12-14 Reprodukálhatóság: Összesen tíz mikroorganizmust vizsgáltak két ismétlésben, három napon keresztül, három különböző, a BBL Enterotube II rendszert alkalmazó laboratóriumban. A mikroorganizmusok közül három (30%) minden ismétlésben azonos biokódot eredményezett mindhárom laboratóriumban. A mikroorganizmusok közül öt (50%) enyhén eltérő biokódot eredményezett, de az eredmény minden esetben ugyanaz a mikroorganizmus volt. A mikroorganizmusok közül kettő (20%) enyhe variációkat mutatott a biokódokban azonos végeredménnyel. Ezen mikroorganizmusok esetében a 18 ismétlésből két esetben azonosíthatatlan biokódot kaptak. Az összes ismétlést nézve az azonosítás egyezése 98,9%-os volt. 247 előzőleg azonosított törzset (beleértve ismert ATCC tenyészeteket) vizsgáltak a BBL Enterotube II azonosító rendszer segítségével. A kiindulási inokulálásnál kilenc mikroorganizmus mutatott biokémiai eltéréseket. Újraoltás után, az eltérések közül nyolc eltűnt. Öt esetben az új eredmény megegyezett a referencia módszer kiindulási eredményeivel. Három esetben az új eredmény megegyezett a BBL Enterotube II kiindulási eredményeivel. Egy esetben az új eredmény egyik kiindulási eredménnyel sem egyezett. Az eltérő biokémiai tesztet egy harmadik módszerrel is megvizsgálták, és az eredmény megegyezett a BBL Enterotube II rendszerrel kapott eredménnyel. A vizsgálatba bevont minták összegzése a 2. táblázatban található. A táblázat tartalmazza a nemzetségek, a fajok és a vizsgált törzsek számát, valamint százalékos formában a pozitív biokémiai reakciót adó mikroorganizmusok számát. Az eljárás korlátai A BBL Enterotube II rendszer a megadott fajok meghatározásához használható. A 3. táblázatban fel nem sorolt fajokat ne vizsgálja ezzel a rendszerrel. A BBL Enterotube II biokódjai nem használhatók ugyanannak vagy különböző minták izolátumainak fenotípusos azonosságának megállapítására. A BBL Enterotube II rendszerrel kapott biokémiai eredmények eltérhetnek a más módszerekkel észlelt vagy más vizsgálatokban közölt tapasztalatoktól. IA-273176.01
-8-
A Salmonella és Shigella fajok esetében a megerősítéshez szerológiai tesztek szükségesek. Ezen mikroorganizmusok izolátumait továbbítani kell a megfelelő referencia laboratóriumoknak, hogy ott azok teljes szerotipizálása és epidemológiai ellenőrzése megtörténhessen. A gram-negatív baktériumok azonosításánál figyelembe kell venni további jellemzőket is, mint amilyen a minta eredete, a beteg kórelőélete, a telepmorfológia és a mikroszkopikus morfológia, valamint a szerológiai és az antimikrobiális szerekkel szembeni érzékenység jellemzői. A ritka izolátumok azonosítását meg kell ismételni, illetve az ilyen mikroorganizmusok azonosságának ellenőrzésére kiegészítő teszteket kell elvégezni. Bizonyos mikroorganizmusok törzsei atípusos biokémiai tulajdonságokat mutathatnak, aminek rendkívüli tápanyag igény vagy mutáció lehet a magyarázata; ezekben az esetekben az azonosítás nehézségekbe ütközhet. Egyes mikroorganizmusok helyes azonosításához 24 óránál hosszabb inkubációs idő szükséges. A közelmúltban ugyan felvetették, hogy a Plesiomonas shigelloidest is sorolják az Enterobacteriaceaek közé, de ez a faj nem szerepel a BBL Enterotube II adatbázisában.1,2 Ezért ezt a mikroorganizmust a BBL Oxi/Ferm Tube II rendszerrel és annak adatbázisával kell tesztelni. IRODALOMJEGYZÉK 1. Farmer, J.J. III. 2003. Enterobacteriaceae: introduction and identification. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 2. Abbott, S.L. 2003. Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Plesiomonas, and other Enterobacteriaceae. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 3. Farmer, J.J, III., et al. 1985. Biochemical identification of new species and biogroups of Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens. J. Clin. Microbiol. 21:46-76. 4. Ewing, W.H. 1973. Differentation of Enterobacteriaceae by biochemical reactions, U.S. Department of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control. 5. Ewing, W.H. 1972. Biochemical characterization of Citrobacter freundii and Citrobacter diversus. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control. 6. Ewing, W.H., and M.A. Fife. 1971. Enterobacter agglomerans and the Herbicola-Lathyri bacteria. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control. 7. Darland, G., and B.R. Davis. 1973. Biochemical and serological characterization of hydrogen sulfide producing variants of Escherichia coli. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control. 8. Ewing, W.H. 1974. Isolation and identification of Salmonella and Shigella. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control. 9. Ewing, W.H., B.R. Davis, and M.A. Five. 1972. Biochemical characterization of Serratia liquefaciens and Serratia rubidaea. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control. 10. Brenner, D.J., et al. 1977. Taxonomic and nomenclature changes in Enterobacteriaceae. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control.:, Oct. 1977. 11. Ewing, W.H. 1986. Edwards and Ewing’s identification of Enterobacteriaceae. Elsevier Science Publishing Co., New York, N.Y. 12. Holmes, B. 1989. Comparative evaluation of the Roche Cobas IDA and Enterotube II systems for identifying members of the family Enterobacteriaceae. J. Clin. Microbiol. 27: 1027-1030. 13. Mastroeni, P. et al. 1983. Comparison of six systems for the identification of Enterobacteriaceae. G. Batteriol. Virol. Immunol. 76: 3-19. 14. Chiaradia, V. et al. 1983. Comparative evaluation of 3 miniaturized systems (API 20E, Enterotube II, Sensititre AP60) commonly used in clinical microbiology laboratories. Quad. Sclavo Diagn. 19: 159175 [in Italian].
IA-273176.01
-9-
IA-273176.01
- 10 -
URE
CIT
ACINETOBACTER 1 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0 0 A. anitratus 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 A. Iwoffii* Burkholderia 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 B. cepacia CEDECEA 1 100 0 0 100 0 0 0 0 0 0 0 C, davisae 1 100 0 0 0 0 0 0 100 0 0 0 C. lapagei* CITROBACTER 1 100 100 0 100 0 100 0 0 100 100 0 C: amalonaticus 4 100 100 0 0 100 0 0 50 100 100 0 C: freundii ESCHERICHIA 83 100 92 100 78 0 99 0 88 99 100 1 E: coli ENTERIKUS CSOPORT Enterikus csoport 60* 2 100 100 0 100 0 0 0 0 100 0 0 ENTEROBACTER 5 100 100 100 100 0 0 100 80 100 100 0 E. aerogenes E. amnigenus bio 1 2 100 0 100 0 0 0 0 100 100 0 0 10 100 100 10 90 0 0 10 100 100 100 20 E. cloacae EWINGELLA 1 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 E: americana HAFNIA 3 100 100 100 100 0 0 0 0 100 0 0 H. alvei* KLEBSIELLA 8 100 0 100 0 0 100 100 100 100 100 38 K. oxytoca* 4 100 100 100 0 0 100 100 100 100 100 50 K. ozaenae 20 100 100 100 0 0 0 65 100 100 100 30 K. pneumoniae KLUYVERA 1 100 100 100 100 0 100 0 100 100 0 0 K: ascorbata* MORGANELLA 2 100 100 0 100 0 100 0 0 0 0 0 M: morganii PROTEUS 4 100 75 0 100 100 0 0 0 0 0 0 P. mirabilis* PROVIDENCIA 2 100 0 0 0 0 100 100 0 0 0 0 P: rettgeri* 1 100 0 0 0 0 100 0 0 0 0 0 P: stuartii* SALMONELLA 41 100 100 100 98 100 0 0 0 100 100 100 Salmonella fajok Salmonella (ariz) IIIa 5 100 100 100 100 100 0 0 0 100 100 0 SERRATIA 3 100 100 100 100 0 0 0 67 100 100 0 S. liquefaciens 5 100 20 100 100 80 0 0 0 0 80 0 S. marcescens* 1 100 0 0 0 0 0 0 100 100 100 0 S. plymuthica SHIGELLA 10 100 0 0 0 0 20 0 0 20 0 0 Shigella szerocsoportok A,B,C 17 100 0 0 100 0 0 0 0 100 0 0 S. sonnei YERSINIA 1 100 0 0 0 0 0 0 0 100 100 0 Y. enterocolitica 2 100 100 0 100 0 100 0 100 100 100 0 Y. frederiksenii 2 100 0 50 100 0 0 0 0 0 100 0 Y. ruckeri * Ebből a csoportból egy mikroorganizmus az American Type Culture Collection-ből származik.
PA
DUL
SOR
ARA
LAC
ADO
IND
H2S
ORN
LYS
GAS
Mikrooganizmus
Tesztek száma GLU
2. táblázat: Teljesítményvizsgálat eredménye
0 0
0 0
0 0
0
0
100
0 0
0 0
100 100
0 0
100 50
100 50
0
0
0
0
0
0
0 0 0
0 0 10
100 100 80
0
0
100
0
0
0
0 0 0
100 50 100
100 100 100
0
0
100
100
100
50
100
100
100
100 100
100 0
100 100
0 0
0 0
100 80
100 0 0
100 0 0
67 100 0
0
0
0
0
0
0
0 0 0
100 0 0
0 0 0
3. táblázat: A BBL Enterotube II adatbázisába tartozó Enterobacteriaceae fajok Buttiauxella agrestis Cedecea davisae Cedecea lapagei Cedecea neteri Cedecea species 3 Cedecea species 5 Citrobacter freundii Citrobacter koseri (diversus) Citrobacter amalonaticus Citrobacter farmeri Edwardsiella tarda Edwardsiella tarda biogroup 1 Edwardsiella hoshinae Edwardsiella ictaluri Enterobacter aerogenes Enterobacter asburiae Enterobacter cloacae Enterobacter gergoviae Enterobacter sakazakii Enterobacter cancerogenus (taylorae) Enterobacter amnigenus biogroup 1 Enterobacter amnigenus biogroup 2 Escherichia coli Escherichia coli (AD), inactive Escherichia fergusonii Escherichia hermanii Escherichia vulneris Escherichia blattae Ewingella americana
Hafnia alvei Hafnia alvei biogroup 1 Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Raoultella (Klebsiella) ornithinolytica (group 47) Klebsiella ozaenae Klebsiella rhinoscleromatis Kluyvera ascorbata Kluyvera cryocrescens Leclercia adecarboxylata Leminorella sp. Moellerella wisconsensis Morganella morganii Morganella morganii biogroup 1 Obesumbacterium proteus biogroup 2 Pantoea agglomerans (Enterobacter agglomerans complex) Proteus mirabilis Proteus vulgaris Proteus penneri Proteus myxofaciens Providencia rettgeri Providencia stuartii Providencia alcalifaciens Providencia rustiganii Salmonella species Salmonella serotype Typhi Salmonella serotype Choleraesuis Salmonella serotype Paratyphi A Salmonella serotype Gallinarum
Salmonella serotype Pullorum Salmonella (arizonae) IIIa Salmonella (diarizonae) IIIb Serratia marcescens Serratia marcescens biogroup 1 Serratia liquefaciens Serratia rubidaea Serratia odorifera biogroup 1 Serratia odorifera biogroup 2 Serratia plymuthica Serratia ficaria Serratia fonticola Shigella serogroups A, B, C Shigella sonnei Tatumella ptyseos Yersinia enterocolitica Yersinia frederiksenii Yersinia intermedia Yersinia kristensenii Yersinia pestis Yersinia pseudotuberculosis Yersinia ruckeri Yokenella regensburgeri Enteric group 58 Enteric group 59 Enteric group 60
IRODALOMJEGYZÉK 15. Farmer, J.J. III. 2003. Enterobacteriaceae: introduction and identification. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 16. Abbott, S.L. 2003. Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Plesiomonas, and other Enterobacteriaceae. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken th (ed.). Manual of clinical microbiology, 8 ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 17. Farmer, J.J, III., et al. 1985. Biochemical identification of new species and biogroups of Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens. J. Clin. Microbiol. 21:46-76. 18. Ewing, W.H. 1973. Differentation of Enterobacteriaceae by biochemical reactions, U.S. Department of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control. 19. Ewing, W.H. 1972. Biochemical characterization of Citrobacter freundii and Citrobacter diversus. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control. 20. Ewing, W.H., and M.A. Fife. 1971. Enterobacter agglomerans and the Herbicola-Lathyri bacteria. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control. 21. Darland, G., and B.R. Davis. 1973. Biochemical and serological characterization of hydrogen sulfide producing variants of Escherichia coli. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control. 22. Ewing, W.H. 1974. Isolation and identification of Salmonella and Shigella. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control. 23. Ewing, W.H., B.R. Davis, and M.A. Five. 1972. Biochemical characterization of Serratia liquefaciens and Serratia rubidaea. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control. 24. Brenner, D.J., et al. 1977. Taxonomic and nomenclature changes in Enterobacteriaceae. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Public Health Service, National Center for Disease Control.:, Oct. 1977. 25. Ewing, W.H. 1986. Edwards and Ewing’s identification of Enterobacteriaceae. Elsevier Science Publishing Co., New York, N.Y. 26. Holmes, B. 1989. Comparative evaluation of the Roche Cobas IDA and Enterotube II systems for identifying members of the family Enterobacteriaceae. J. Clin. Microbiol. 27: 1027-1030. 27. Mastroeni, P. et al. 1983. Comparison of six systems for the identification of Enterobacteriaceae. G. Batteriol. Virol. Immunol. 76: 3-19. 28. Chiaradia, V. et al. 1983. Comparative evaluation of 3 miniaturized systems (API 20E, Enterotube II, Sensititre AP60) commonly used in clinical microbiology laboratories. Quad. Sclavo Diagn. 19: 159175 [in Italian]. IA-273176.01 - 11 -
CSOMAGOLÁS/KISZERELÉSEK BBL Enterotube II Katalógus szám: 273176
25 cső
TOVÁBBI INFORMÁCIÓK További információkért forduljon a BD helyi képviseletéhez.
Becton Dickinson GmbH BD Diagnostic Systems Tullastrasse 8 – 12 D-69126 Heidelberg/Németország Telefon: +49-62 21-30 50, Fax: +49-62 21-30 52 16
[email protected] BD Diagnostic Systems Europe Becton Dickinson France SA 11 rue Aristide Berges 38800 Le Pont de Claix/Franciaország Telefon: +33-476 68 3636 Fax: +33-476 68 3292
http://www.bd.com
A BD, a BD embléma és a BBL a Becton, Dickinson and Company védjegye. Az Enterotube és az Oxi/Ferm a Becton, Dickinson GmbH védjegye. Az ATCC a American Type Culture Collection védjegye. © 2007 Becton, Dickinson and Company
IA-273176.01
- 12 -
