BÁLINT András Beszámoló az AGRISAFE által támogatott tanulmányútról 2008 november – 2009 február
1. Az IPK bemutatása 2. A TILLING módszer
Hol található az IPK?
Gatersleben
Általános adatok az IPK-ról Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (1945)
-
87 kutatóintézetből álló hálózat tagja (2006-), részben államilag finanszírozott és ellenőrzött
-
kb. 500 dolgozó
-
ca: 180 kutató
-
6000 m2 laborhely
-
3000 m2 üvegház
-
90 ha terület
-
2010: családbarát munkahely
Szervezeti felépítés Igazgató: Andreas Graner (2007-) IPK osztályok: -
1. Genebank – Prof. A. Graner, 3 kutatási program, 8 kutatócsoport
-
2. Cytogenetics and Genome analysis – Prof. I. Schubert, 8 kutatócsoport
-
3. Molecular Genetics – Prof. T. Altman, 6 kutatócsoport
-
4. Phisiology and Cell Biology – Prof. N. von Wirén, 10 kutatócsoport 5. Administration and Central Services: 1. Personnel 2. Finances 3. Technology Transfer and Legal Matters 4. Materials, Management and General Services 5. Buildings and Equipments 6. Experimental Fields and Nurseries
A Genebank szervezeti felépítése Characterization and Documentation (A. Graner) 1. Genomediversity
(Andreas Graner, Nils Stein, 29 fő)
2. Genbank Documentation 3. Plant Architecture
(Helmut Knüpffer, 6 fő)
(Thorsten Schnurbusch, 3 fő)
Management and Evaluation (A. Börner) 4. Resources Genetics and Reproduction 5. In vitro storage and cryopreservation 6. Satellite Collections North
(Andreas Börner, 39 fő) (Joachim Keller, 9 fő)
(External Branch North) (Klaus J. Dehmer, 12 fő)
Taxonomy and Evolution (F. Blattner) 7. Experimental Taxonomy (Frank Blattner, 13 fő) 8. Taxonomy of Plant Genetic Resources
(F. Blattner 8 fő)
Összesen: 119 fő dolgozik az osztályon
Genomediversity kutatócsoport Genomics Lab (Andreas Graner): genetikai diverzitás megőrzése és felhasználása Diversity Lab (Nils Stein): Triticeae genomok strukturális és funkcionális elemzése
Nagyobb témák: -
árpa fizikai térképezés, szekvenálás
-
Árpa TILLING (mutánsok segítségével génfunkciók vizsgálata)
-
Árpa genomdiverzitás feltárása, kiaknázása agronómiailag fontos jellegek térképezésére, ill. javítására (maláta minőség, abiotikus/biotikus stresszek, stb)
Az IPK madártávlatból
Ami különösen tetszett az IPK-ban 1. Szervezettség: mindenre kidolgozott protokollok vannak 2. Minőségbiztosítás: Quality Management: laborjegyzőkönyvek (blue book), kutatói munka Kutatócsoportok értékelése (7 évente, nemzetközi szakértők,‘without heads’) 3. Közösségi élet: klubok, tanfolyamok, szakkörök
4. Tudományos műhely: intenzív kommunikáció az egyes kutatócsoportok között: Institutstag – Institute’s Day, Vavilov seminar, Gatersleben lecture, Journal Club, Ph.D. konferencia, intézeti kiadványok (éves jelentés)
5. Tudományos eredmények népszerűsítése: Open Day, Tag der offener Tür – nyílt napok
Targeting (Induced) Local Lesion IN Genomes Mit is jelent a TILLING? -
Olyan genetikai technika, mely a tradicionális kémiai mutagenezis segítségével mutáns egyedek ezreit hozza létre, majd ezeket az egyedeket nagy áteresztőképességű technikák felhasználásával mutációk azonosítására használja fel Génfunkció vizsgálata -
Adott egy azonosított gén, amelyről feltételezem, hogy egy adott fenotípus pl. szárazságtűrés kialakításában részt vesz – hogyan tudom ezt igazolni?
-
1. csendesítem a gént (kikapcsolom),
-
2. transzformálom egy másik genotípusba/fajba (expresszáltatom/túlexpresszáltatom), vagy
-
3. megváltoztatom (mutagenizálom) és megnézem, hogyan változik a fenotípus
Árpa TILLING az IPK-ban (Sven Gottwald, Ph.D.) TILLING populáció létrehozása -
„Barke” sörárpa (ez az ún vadtípus) – olyan jellegekben jó, ami érdekli a németeket
-
Magok mutagenizálása EMS-sel, felszaporítás
-
DNS izolálás a mutáns vonalakból (kb. 10 000 vonal!)
-
DNS Poolok létrehozása: 8 x Pool (Barke és 7 mutáns), így a 10 000 vonalból 1430 DNS „Mixem” lesz – csak ennyit kell megvizsgálnom Mutánsok azonosítása heteroduplex képződés felhasználásával: -
1. Az adott génszakaszt (pl. 1000 bp) a génre specifikus primerekkel felszaporítom, úgy hogy heteroduplex képződjön
-
2. CEL I (heteroduplexnél hasít) enzimmel kezelem a PCR terméket. Ha nincs heteroduplex (mutáció a vad típushoz képest), csak 1000 bp hosszú fragmentjeim lesznek, ha van, akkor rövidebbek is, de olyanok, amelyek együttes hossza 1000 bp (pl. 830 és 170)
-
3. Azonosítom, hogy melyik mutáns vonal hordozz a mutációt, majd szekvenálással is megnézem, hogy pontosan hol van a mutáció. Tiszta mutáns vonalak előállítása -
1. Mivel a mutáns vonalak több pontmutációt is tartalmazhatnak, ezért visszakeresztezéssel (vadtípushoz) olyan vonalakat állítok elő, melyek csak az engem érdeklő génben különböznek a vadtípustól – ez után jöhet a fenotipizálás
Feladatom az IPK-ban Olyan gén vizsgálata, mely agronómiai jellegeket és/vagy abiotikus stressztűrést befolyásol -
Első jelölt: árpa: Yrg1 gén, yield related gene encoding protein (Törjék Ottó) 588 7
532 3
8 9 7 9 5 2 8 2 P2: 762
P1: 1540
EXON
404 397 5 8
228 2 217 9 208 7 192 184 4 6 176 167 4 162 154 2 148 6 1 9
201
0
1696
128 8
1278
P3: 1856
INTRON
P4: 1391
POtto: 489
P4: 113
P3: 160
POtto: 489
P2: 415 P1: 167 201
0
5 2
2 0 1
4 6
2 5 3
8 2
2 9 9
1 6 3
3 8 1
1 0 3
5 4 4
6 7
6 4 7
5 6 4
7 1 4
1278
Accession: EU333863, Yrg1 mRNA, yield-related gene encoding protein, Hordeum vulgare, 1275 bp
Második jelölt: árpa Nud gén Mi is az a nud gén? -
Nud: pelyvás és pelyvátlan (csupasz) karakter kialakításáért felelős (többek között)
-
ERF géncsaládba tartozó transzkripciós faktor, mely a lipid bioszintézisben játszik szerepet
-
Új gén, 2008-ban írták le (PNAS, 105: 4062-4067),
-
Egyszerű a szerkezete: kb. 1100 bp, 2 exonból és 1 intronból áll
Miért nagyon izgalmas számunkra a nud gén (lókusz)..? -
1000 szemtömeget is befolyásolja
-
Hatással van a sótűrésre (A. Weidner)
-
Befolyásolja az aratás előtti csírázást (preharvest-sprouting) (U. Lohwasser)
-
Hatással van az ozmotikus stressz és szárazságtűrésre is
Munka a Nud génnel Módszerbelövés -
Szekvencia ismeretében több primerpár tervezése, megrendelése, tesztelése (PCR program belövése, termék ellenőrzése)
-
Működő primerpár kiválasztása (NudF1R1, termék 1036 bp), jelölt primerek rendelése
TILLING munkafolyamat -
1. PCR reakció a mutáns pool-okat tartalmazó plate-tel
-
2. PCR termék ellenőrzése agaróz gélen
-
3. Emésztés CEL 1 enzimmel
-
4. Kicsapás (az enzimes emésztés utáni tisztitási lépés)
-
5. Denaturálást követő fragment analízis LICOR 4300 készülékkel
-
6. Mutánsok azonosítása GelBuddy programmal
-
7. Igazolás szekvenálással
Eredmény -
5712 mutáns vonalat teszteltem
-
9 mutánst sikerült azonosítani
• Köszönöm a figyelmet!
