MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE
BAKTERIÁLNÍ OXIDACE PYRITU A BUNĚČNÝ OBSAH ATP Bakalářská práce
Lenka Nádvorníková
Vedoucí práce: doc. Ing. Martin Mandl, CSc.
Brno 2012
Bibliografický záznam Autor:
Lenka Nádvorníková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochemie
Název práce:
Bakteriální oxidace pyritu a buněčný obsah ATP
Studijní program:
Biochemie
Studijní obor:
Biochemie
Vedoucí práce:
doc. Ing. Martin Mandl, CSc.
Akademický rok:
2011/2012
Počet stran:
43
Klíčová slova:
Acidithiobacillus ferrooxidans; ATP; bioluminiscence; oxidace pyritu
Bibliographic Entry Author
Lenka Nádvorníková Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry
Title of Thesis:
Bacterial oxidation of pyrite and cellular content of ATP
Degree programme:
Biochemistry
Field of Study:
Biochemistry
Supervisor:
doc. Ing. Martin Mandl, CSc.
Academic Year:
2011/2012
Number of Pages:
43
Keyword:
Acidithiobacillus ferrooxidans; ATP; bioluminiscence; pyrite oxidation
Abstrakt Práce zahrnuje teoretické aspekty bakteriální oxidace pyritu a experimentální výsledky oxidačního procesu za katalýzy bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans. Demonstruje se kinetika oxidace s důrazem na změny obsahu ATP ve volných a vázaných buňkách a životaschopnost bakterií. Množství vázaných buněk na povrchu pyritu se pohybuje v rozmezí 3 - 10 % z celkového počtu bakterií v kultuře. Volné i vázané buňky se nelišily v obsahu ATP (asi 1 amol na buňku), což prokazuje shodu s buňkami oxidujícími Fe(II). Na základě výsledků se diskutuje spojení biooxidace pyritu s dominantní biooxidací Fe(II).
Abstract The thesis includes theoretical aspects of bacterial pyrite oxidation and experimental results of the oxidation process under Acidithiobacillus ferrooxidans catalysis. Oxidation kinetics was demonstrated to underline ATP changes in free and attached cells and cell viability. The amount of attached cells on the pyrite surface varied in a range of 3 to 10% compared to the total cell number in the culture. There was the same cellular ATP content in the free and attached cells (about 1 amol per cell), which demonstrated an agreement with the cells oxidizing ferrous iron. Based on the results, connection of pyrite biooxidation to dominant ferrous iron biooxidation was discussed.
Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat vedoucímu mé bakalářské práce doc. Ing. Martinu Mandlovi, Csc. a Mgr. Evě Pakostové za přátelský přístup a odborné vedení. Dále bych chtěla poděkovat celé své rodině za trpělivost a podporu v každé situaci během mého studia.
Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.
Brno 8. května 2012
……………………………… Lenka Nádvorníková
Obsah 1 ÚVOD ........................................................................................................................... 10 2 TEORETICKÁ ČÁST ....................................................................................................... 11 2.1 Bioloužení ............................................................................................................. 11 2.1.1 Mechanismus bioloužení .............................................................................. 12 2.1.2 Využití biooxidace v bioloužení..................................................................... 13 2.1.3 Technologické postupy ................................................................................. 13 2.1.4 Mikroorganismy využívané v bioloužení....................................................... 17 2.2 Acidithiobacillus ferrooxidans .............................................................................. 18 2.2.1 Obecná charakteristika a morfologie............................................................ 18 2.2.2 Výskyt a využití .............................................................................................. 20 2.2.3 Energetické zdroje ........................................................................................ 20 2.2.4 Tvorba ATP v A. ferrooxidans ........................................................................ 23 2.2.5 Vztah ke kyslíku a alternativní akceptory elektronů ..................................... 24 2.2.6 Tolerance a rezistence vůči kovům ............................................................... 24 2.3 Vázané buňky ....................................................................................................... 25 2.3.1 Adsorpce A. ferrooxidans .............................................................................. 25 2.3.2 Fáze vazby ..................................................................................................... 26 2.3.3 Vznik EPS ....................................................................................................... 26 2.3.4 Složení EPS .................................................................................................... 27 2.4 Thiosíranový mechanismus loužení pyritu .......................................................... 28 2.5 Chemiluminiscence .............................................................................................. 30 2.5.1 Aplikace bioluminiscence na stanovení ATP ................................................. 30 2.5.2 Využití chemiluminiscence ............................................................................ 30
3 CÍL PRÁCE .................................................................................................................... 31 4 PRAKTICKÁ ČÁST ......................................................................................................... 32 4.1 Materiál a metody................................................................................................ 32 4.1.1 Mikroorganismus a kultivace ........................................................................ 32 4.1.2 Uvolňování vázaných buněk z částeček pyritu ............................................. 33 4.1.3 Analytické metody ........................................................................................ 34 4.2 Výsledky ............................................................................................................... 35 4.2.1 Biooxidace pyritu a ATP volných a vázaných buněk ..................................... 35 4.2.2 Životaschopnost buněk ................................................................................. 43 4.3 Diskuse ................................................................................................................. 45 4.3.1 Biooxidace pyritu a ATP volných a vázaných buněk ..................................... 45 4.3.2 Životaschopnost buněk ................................................................................. 46 5 SEZNAM SKRATEK ....................................................................................................... 47 6 LITERATURA................................................................................................................. 48
1 ÚVOD Práce se v teoretické části zabývá bakteriální oxidací pyritu jako nejrozšířenější sirné látky v přírodě. Pro jeho význam v biohydrometalurgii a prostředí sulfidových dolů a odpadů je dlouhodobým předmětem zájmu v Laboratoři environmentální biotechnologie. Vedle mechanismu oxidace jsou shrnuty poznatky o úloze volných a vázaných bakterií. V souvislosti s náplní experimentální práce se teoretická část zabývá také luminiscencí a jejím využitím ve stanovení ATP. V experimentální části se používá modelová bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans, jež bývá laboratorně hojně aplikována, i když v přírodě jde často o účast směsných kultur acidofilních bakterií. Tato bakterie je však schopna realizovat všechny metabolické pochody potřebné k oxidaci zvažovaných anorganických substrátů zapojených do oxidace pyritu. Buněčný obsah ATP u volných i vázaných buněk je pak hlavním cílem experimentální práce, aby se posoudila případná metabolická odlišnost vázaných bakterií a úloha oxidace Fe(II) a S v oxidaci pyritu.
2 TEORETICKÁ ČÁST 2.1 Bioloužení Proces bioloužení může být definován jako rozpouštění minerálů způsobené přímým nebo nepřímým působením různých mikroorganismů (obr. 1). V těchto procesech se přirozená flora mikroorganismů skládá ze směsi acidofilních autotrofních bakterií [1]. Jejich rolí je produkovat chemická činidla důležitá pro loužení, jimiž jsou železité ionty a protony, dále také tvorba prostoru, ve kterém reakce probíhají (tímto místem může být EPS) [2]. Tento proces lze taktéž vysvětlit jako 2 různé mechanismy: přímý a nepřímý mechanismus bioloužení. Při nepřímém mechanismu dochází k biologickému loužení interakcí mezi povrchem minerálu a meziprodukty nebo konečnými metabolity vytvářenými bakteriemi. Loužení minerálu není uskutečňováno enzymaticky, nýbrž pomocí železitého iontu, který je bakteriemi recyklován. Opakem je přímý mechanismus, při kterém dochází nejprve k navázání bakterií na povrch minerálu a je následováno enzymatickou oxidací pomocí elektronového transportu vázaných buněk z redukovaného minerálu (obvykle S2-) na rozpuštěný kyslík [1, 3].
Obr. 1. Schéma bioloužení [4].
11
2.1.1 Mechanismus bioloužení [2] Reakce minerálního rozpouštění nejsou shodné pro všechny sulfidy kovů a oxidace různých kovových sulfidů probíhá přes odlišné meziprodukty. Thiosíranový mechanismus (obr. 2) byl navržen pro oxidaci sulfidů nerozpustných v kyselinách, jako je pyrit FeS2 a molybdenit MoS2, naopak polysulfidový mechanismus pro sulfidy rozpustné v kyselinách jako sfalerit ZnS, chalkopyrit CuFeS2 nebo galenit PbS. V thiosíranovém mechanismu (obr. 2) dochází k rozpouštění pomocí útoku železitého iontu na nerozpustný sulfid kovu, kde je thiosíran hlavním meziproduktem a síran hlavním konečným produktem (podrobněji je tento mechanismus popsán v kapitole 2.4). Pro ukázku těchto reakcí byl použit pyrit: (1) (2) V případě polysulfidového mechanismu dochází k rozpouštění rozpustného sulfidu kovu pomocí kombinovaného útoku železitých iontů a protonů za vzniku elementární síry jako hlavního meziproduktu. Takto vzniklá elementární síra je relativně stabilní, ale může být dále oxidována na síran pomocí síru-oxidujících mikrobů (reakce 5). (3) (4) (5) (6) Železnatý ion produkovaný v reakcích 1 až 4 může být oxidován zpět na železitý pomocí železo-oxidujících mikroorganismů. Úkolem mikroorganismů při rozpouštění sulfidů kovů spočívá v utváření kyseliny sírové (reakce 5) pro protonový útok a zachování železa v oxidovaném Fe(III) stavu (reakce 6) pro oxidační útok na minerál.
12
Obr. 2. Schéma thiosíranového a polysulfidového mechanismu [5]. 2.1.2 Využití biooxidace v bioloužení Ekonomicky důležité je biologické loužení rud s obsahem mědi a uranu a taktéž biooxidace rud obsahujících zlato. Mikroorganismy lze ovšem také použít k biologickému odsiřování uhlí [6] a k extrakci dalších kovů. Nejčastěji se přeměňují nerozpustné sulfidy kovů na jejich rozpustné sírany (běžné kovy: Cu, Ni, Co, Mn a Zn), uran je vyzískáván z oxidů [7]. 2.1.3 Technologické postupy [8] V současné době existují dva hlavní druhy technologických postupů v bioloužení, jde o zavodněné systémy a promíchávané tanky (obr. 3). V prvním z nich horniny s nízkým obsahem sulfidů jsou nahromaděny do velkých hald nebo hromad (upravené haldy), které jsou poté zavlažovány kyselou tekutinou pro stimulaci činnosti mikroorganismů, které se buď vyskytují v rudě přirozeně, nebo se do hromad očkují. Prosakující tekutina je obohacována kovy (a sírany), které se uvolňují ze sulfidových ale také dalších minerálů, které jsou v kyselých roztocích nestabilní.
13
Obr. 3. Schéma biotěžby v haldách (nahoře), hromadách (uprostřed) a tancích (dole) [8].
14
Třetí typ technologických postupů v biotěžbě je znám jako „in situ“, tedy „na místě“ (obr. 4).
Obr. 4. Schéma „in situ“ bioloužení. Bílé šipky znázorňují směr toku loužícího roztoku, černé šipky směr toku roztoku bohatého na kovy [8]. 2.1.3.1 Loužení v haldách [8] Loužení v haldách se stalo prvním praktickým biotěžebním postupem, který byl přijat a v dnešní době se v mnoha dolech stále používá při získávání mědi z rud obsahujících příliš málo kovu (méně než 0,5% hmotnosti), aby mělo význam je zpracovávat tradičním způsobem (rozemletí, zakoncentrování a tavení).
Kameny
a mohutné balvany, které jsou jinak považovány za odpad, se shromáždí do hald (mohou být extrémně velké - přes 100 metrů do výšky) a proces bioloužení může pokračovat po několik let nebo desetiletí. Při využití tohoto postupu dochází jen zřídka k naočkování mikroorganismů, a protože finanční návratnost z hlediska výtěžnosti mědi je často pouze okrajová, dochází k minimalizaci provozních nákladů. Navzdory tomu se odhaduje, že asi 13% celosvětové produkce mědi pochází z loužení rud v haldách (a asi 65% se získává za využití biologického zpracování rud). 2.1.3.2 Loužení v hromadách [8] Loužení v hromadách je dokonalejším technologickým postupem, který opět zahrnuje zavlažování vybudovaných hromad z minerálních rud s nízkým obsahem kovu. Hlavní rozdíly mezi loužením v haldách a hromadách jsou následující: (a) rudy jsou nejprve rozemlety a poté jemné částice mohou být nahromaděny spolu s kyselinou sírovou; (b) hromady jsou obecně nižší (6-10 m) než haldy; (c) hromady jsou obvykle zespodu provzdušňovány a shora zavlažovány, aby bakterie i archea měli zajištěný 15
příjem jak kyslíku, tak oxidu uhličitého; (d) hromady jsou stavěny na podložkách, které jsou potažené nepropustnou syntetickou vrstvou (obvykle jde o polyethylen o vysoké hustotě, na ně navazují drenážní trubky, které se využívají k shromažďování a transportu daného matečního roztoku); (e) používá se inokulačních nádrží, ve kterých příslušně bakterie a archea mohou narůst do vysokých buněčných koncentrací poté je možné je dále využívat, ať už přidáním do zavlažovací tekutiny, nebo očkováním na začátku procesu loužení v hromadách. Při tomto postupu dochází také k rychlejšímu (trvá obvykle jeden rok) a účinnějšímu (až 90%) vyzískání kovu než při loužení v haldách. Rozdíly mezi systémy pro loužení v haldách a hromadách často nejsou naprosto jasné. 2.1.3.3 Loužení v tancích [8] Loužení v tancích (nádržích) zahrnuje biologické zpracovávání koncentrátů sulfidových
minerálů.
Dochází
k němu
v míchaných
nádržích,
které
jsou
provzdušňovány a kultivovány za předepsaných teplot a hodnot pH. Tyto technologické postupy představují v dnešní době nejúčinnější způsob biologické těžby a to jak z hlediska rychlosti, tak účinnosti. Systém těchto nádrží může být různý, mohou fungovat jednotlivě, ale také je možné sestavit více nádrží za sebe, do kterých lze minerální koncentrát dodávat postupně. 2.1.3.4 „In situ“ loužení [8] Tento technologický postup umožňuje zpracování minerálů v hlubinných dolech. Lze ho ovšem použít pouze v místech, kde se nachází nepropustné podloží. Tímto způsobem docházelo především k těžbě uranu. Tento způsob je založen na zaplavení dolu na několik týdnů (nebo i déle) loužícím roztokem. Postupem času jsou přístupné minerální látky degradovány pomocí přítomných mikroorganismů, poté je roztok odčerpáván a dochází k vyzískávání kovů přímo z tohoto obohaceného roztoku. Hlavní výhodou tohoto postupu je, že se vyhne nákladnému hloubení, nebo hlubinné těžbě dané rudy. Vhodné geologické vrstvy nutné pro vodorovnou migraci kyselých vod bohatých na kovy mohou způsobit vážné znečištění podzemních vod, které se mohou nacházet v blízkosti.
16
2.1.4 Mikroorganismy využívané v bioloužení Tyto mikroorganismy lze izolovat z vody v okolí dolů a dalších míst, kde probíhá minerální bioloužení a biooxidace. V následujících tabulkách (I, II) je klasifikace mikroorganismů například podle minerálů nebo podle teplot, ve kterých tyto procesy probíhají. Tabulka I: Acidofilní prokaryotické mikroorganismy spojované s důlní vodou [9]. klasifikace podle teploty oxidující železo: Leptospirillum ferrooxidans L. ferriphilum L. thermoferrooxidans “Thiobacillus ferrooxidans” m-1 “Ferrimicrobium acidiphilum” Ferroplasma acidiphilum “Fp. acidarmanus” oxidující síru: Acidithiobacillus thiooxidans At. Caldus Thiomonas cuprina Hydrogenobacter acidophilus oxidující železo a síru: Acidithiobacillus ferrooxidans redukující železo: Acidiphilium spp. oxidující/redukující železo: Acidimicrobium ferrooxidans oxidující/redukující železo a oxidující síru: Sulfobacillus spp. heterotrofní acidofilové (nedegradují minerál): Acidocella spp. Acidisphaera rubrifaciens Acidobacterium capsulatum Acidomonas methanolica Alicyclobacillus spp. Picrophilus spp. Thermoplasma spp.
mezo mezo stř. termo mezo mezo mezo mezo mezo stř. termo mezo stř. termo mezo mezo mezo mezo a stř. termo mezo mezo mezo mezo mezo stř. termo stř. termo
Vysvětlivky: mezo - mezofilní (Toptimum < 40°C) stř. termo - středně termofilní (Toptimum 40-60°C)
17
Tabulka II: Acidofilní prokaryota identifikovaná při loužení v tancích [10]. minerální koncentrát
T (°C)
identifikovaná prokaryota
pyrit s obsahem zinku/olova
35-40
Leptospirillum ferrooxidans1, Acidithiobacillus thiooxidans2, Acidiphilium cryptum3, Acidithiobacillus ferrooxidans3
pyrit/arzenopyrit (zlato) Biox® kultura
40
L. ferrooxidans1, At. thiooxidans2, At. ferrooxidans
kobaltoželeznatý pyrit
35
L. ferrooxidans, At. thiooxidans, Sulfobacillus thermosulfidooxidans
polykovové koncentráty (Cu, Zn a Fe sulfidy)
45
Leptospirillum ferriphilum, Acidithiobacillus caldus, Sulfobacillus sp., Ferroplasma acidophilum
pyrit, arzenový pyrit a chalkopyrit
45
At. caldus, Sb. thermosulfidooxidans, ‘Sulfobacillus montserratensis’
chalkopyrit
78
Sulfolobus shibitae4 5, Sulfurisphaera ohwakuensis4 5, Stygiolobus azoricus4, Metallosphaera sp. 4, Acidianus infernus4
Poznámky: 1 L. ferrooxidans byl pravděpodobně L. ferriphilum, nebylo možné tyto dva druhy vzájemně odlišit. 2 1 At. thiooxidans byl pravděpodobně At. caldus ze stejného důvodu jako u poznámky . 3 Tyto dva druhy byly nalezeny v tzv. „batch“ tancích, nikoliv v tancích s kontinuálním přítokem. 4 Nejbližší příbuzná archea, která lze kultivovat pro získání klonů. 5 Klony pravděpodobně představují nový druh v řádu Sulfobales.
2.2 Acidithiobacillus ferrooxidans 2.2.1 Obecná charakteristika a morfologie Bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans je zařazována mezi extrémofilní bakterie, je tedy její hlavní charakteristikou schopnost růst ve velmi agresivních prostředích, se kterými souvisejí fyzikální i chemické vlivy. Mezi fyzikální vlivy lze zařadit teplotu a hodnoty pH, při kterých jsou bakterie schopné růstu, a k chemickým vlivům se řadí schopnost růstu buněk v přítomnosti některých iontů kovů o určité koncentraci a lze mluvit o rezistenci k těmto kovům [1]. A. ferrooxidans je chemolitotrofní bakterie, která využívá jako zdroj uhlíku CO2 z atmosféry, řadí se tedy mezi obligátně autotrofní organismy [4, 11]. Optimální pH je při 1,5 - 2,5 a teplotní optimum se pohybuje v rozmezí 28°C - 35°C [11]. Tolerancí a rezistencí vůči kovům se zabývá kapitola 2.2.6. A. ferrooxidans je jednou z neprostudovanějších bakterií, které jsou schopné oxidace sirných sloučenin za vzniku kyseliny sírové a železnatých iontů na železité. Energii vzniklou touto přeměnou mohou dále využívat pro vlastní potřebu. Přirozeným
18
substrátem jsou tedy sirné rudy s obsahem železa, nejčastěji je to pyrit FeS2, chalkopyrit CuFeS2 atd. [11, 12]. Tabulka III: Taxonomické zařazení Acidithiobacillus ferrooxidans [4, 12, 13]. Kmen: Oddělení: Třída: Řád: Čeleď: Rod: Druh:
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Acidithiobacillales Acidithiobacillaceae Acidithiobacillus Acidithiobacillus ferrooxidans
A. ferrooxidans je Gramm-negativní bakterie tyčinkovitého tvaru (obr. 5), jejíž velikost dosahuje 0,3 - 0,5 µm v průměru a 1,0 - 1,7 µm délky [4, 11, 13]. Její slizovitý obal je tvořen EPS [1, 2, 11]. Tento obal bakterie utváří pouze po navázání na povrch minerálu, nikoliv ve volné formě [2], může sloužit k silnějšímu přichycení na povrch a následné tvorbě biofilmu. Někdy mohou mít jeden, nebo více bičíků důležitých k pohybu. V membráně mohou být také ukotveny fimbrie nebo pili [11, 13].
Obr. 5. A. ferrooxidans pozorována při zvětšení 30 000x [4].
19
2.2.2 Výskyt a využití A. ferrooxidans je ekologicky i průmyslově důležitým organismem [4]. Obecně je možné tyto bakterie izolovat z míst, kde probíhá minerální oxidace, jako jsou doly (přesněji řečeno AMD), horké prameny bohaté na síru a v uhelných ložiscích [1]. Nejdůležitějším využitím A. ferrooxidans je v oboru biohydrometalurgie při tzv. bioloužení, které využívá metabolických vlastností těchto bakterií pro získávání kovů obsažených v rudách. Například světová produkce mědi a zlata pomocí bioloužení zaujímá více než 50% a 30% [14]. 2.2.3 Energetické zdroje Mikroorganismy, které hrají hlavní roli při loužení kovů z minerálů, jsou buď železo- nebo síru-oxidující organismy. Železo a síra slouží jako donor elektronů během respirace [2]. Respirační procesy mohou probíhat buď za aerobních podmínek, tedy terminálním akceptorem elektronů je vzdušný kyslík, nebo za podmínek anaerobních, kdy molekula kyslíku jako terminálního akceptoru musí být nahrazena jinou anorganickou molekulou a dochází k její redukci (obr. 6) [12]. Tvorbou ATP se zabývá kapitola 2.2.4.
Obr. 6. Aerobní a anaerobní dráhy pro zisk energie u bakterií [4]. 2.2.3.1 Oxidace železa Železnatý ion je snadno oxidován na železitý a při této reakci může sloužit jako donor elektronu. Fe(II)/Fe(III) redoxní pár má velmi pozitivní standardní elektronový potenciál (+770 mV při pH 2). Výsledkem je, že pouze kyslík je schopen být přírodním akceptorem elektronů a v přítomnosti protonů je produktem reakce voda (O2/H2O 20
+820 mV při pH 7). Použití železa jako donoru elektronů bude tedy možné pouze za aerobní respirace. Avšak za anaerobních podmínek dochází ke spontánní oxidaci Fe(II) na Fe(III), pokud je hodnota pH nízká. Proto extrémní acidofilní bakterie jsou schopné použít železnatý ion jako donor elektronu způsobem, který není možný u bakterií, které rostou při neutrálním pH. Protože rozdíl v redoxním potenciálu mezi redoxními páry Fe(II)/Fe(III) a O2/H2O je malý a protože pouze jeden mol elektronů se uvolní z molu oxidovaného železa, rozsáhlé množství železnatých iontů potřebuje k oxidaci produkci relativně malého množství buněčné hmoty. Tato velká množství železa nejsou transportována přes buněčnou membránu, ale zůstávají mimo buňku a elektron ze železnatého iontu je vázán na přenašeč umístěný v buněčné stěně [2]. Tento mechanismus je nejlépe prostudován na bakterii A. ferrooxidans. Model je znázorněn na obr. 7. Elektrony jsou přenášeny z membránově vázaného cytochromu c (Cyc 2) na rusticyanin a poté podél jedné ze dvou drah. Exergonická dráha pokračuje přes cytochrom c4 (Cyc 1) na cytochrom aa3, kde je kyslík redukován za vzniku vody. Endergonickou cestou neboli reverzním elektronovým transportním řetězcem přechází elektrony přes cytochrom c4 (Cyc A1) na bc1 I komplex a NADH-Q oxidoreduktasu, kde dochází k přeměně NAD+ na NADH [2, 11, 12]. A. ferrooxidans má až dvanáct cytochromů c a rozmanitou škálu cytochromoxidas, z nichž některé hrají zřejmě odlišnou roli v závislosti na tom, zda je oxidováno železo nebo síra [2].
Obr. 7. Model elektronového transportu při oxidaci železa u A. ferrooxidans [2].
21
2.2.3.2 Síra jako zdroj energie Kyselina zodpovědná za velmi nízké pH prostředí, ve kterém se extrémní acidofilové nacházejí je kyselina sírová. Tato kyselina je produkována oxidací redukovaných anorganických sloučenin síry (RISC). Pro uskutečnění biologické oxidace slouží RISC jako donor elektronů a kyslík slouží jako energeticky nejvýhodnější elektronový akceptor. Potenciální množství energie, které je k dispozici, když se atom síry ze sulfidu oxiduje na síran, je mnohem větší než energie získaná při oxidaci železa. Přirozeně se vyskytující RISC jsou přítomny všude tam, kde jsou povrchová ložiska minerálů obsahujících sulfidy. Řada RISC se uvolní v důsledku chemické reakce sulfidových minerálů s vodou, železitými ionty a kyslíkem [2, 15]. Chemická reaktivita mnoha sirných meziproduktů znamená, že některé meziprodukty mohou být produkovány kombinací spontánních a enzymatických reakcí. Extracelulární elementární síra je mobilizována na thiolových skupinách specifických proteinů vnější membrány a transport do cytoplasmy probíhá ve formě persulfidsulfanové síry. Tento persulfid síry je oxidován dále na síran pomocí siřičitan:akceptoroxidoreduktasy
a
elektrony
jsou
pravděpodobně
přeneseny
na cytochromy. Glutathion hraje roli katalyzátoru v aktivaci elementární síry, ale není spotřebováván během této oxidace sulfanové síry. Volný sulfid je v periplasmě oxidován na síru pomocí sulfid:chinonoxidoreduktasy [2,15]. Biochemické studie zabývající se oxidací síry zaznamenaly, že bc1 komplex a cytochromoxidasy (bd a ba3) jsou produkovány ve vyšší míře, jestliže buňka roste na síře než při růstu na železe [2, 15]. Bez ohledu na použité dráhy konečným produktem oxidace RISC je síran a to vede k poklesu pH [2]. Model elektronového transportu A. ferrooxidans je znázorněn na obr. 8. Thiolové skupiny umístěné na proteinech vnější membrány (OMP) přemisťují síru z vnějšího prostředí do periplasmy, kde dochází k její oxidaci pomocí periplasmatické sulfurdioxigenasy (SDO) na siřičitan a siřičitan:akceptoroxidoreduktasou (SOR) na síran. Hlavní roli během oxidace síry hrají pravděpodobně ba3 cytochromoxidasa, bc1 II komplex společně s bd ubichinoloxidasou [2, 15].
22
Obr. 8. Model elektronového transportu při oxidaci síry u A. ferrooxidans [2, 15]. 2.2.3.3 Ostatní zdroje energie [2] Ve vysoce kyselém prostředí jsou často přítomné rozpustné ionty kovů ve vysokých koncentracích. Ionty kovů, které existují ve více než v jednom oxidačním stavu a jejichž redoxní potenciál je více negativní než u redoxního páru O 2/H2O, mohou sloužit jako donory elektronů pro acidofilní bakterie. U bakterií A. ferrooxidans byla zaznamenána přímá oxidace Cu+ na Cu2+ a U4+ na U6+ v aerobních podmínkách. Podobně bylo také zaznamenáno, že Mo5+ může být oxidováno na Mo6+ a molybden oxidasa byla izolována z buněčného extraktu A. ferrooxidans. Jako alternativní donor elektronů u acidofilních organismů mohou také fungovat oxoanionty, pokud dochází k jejich oxidaci. Příkladem je oxidace As3+ (AsO2-) na As5+ (AsO43-). Ze šesti testovaných kmenů A. ferrooxidans je jeden schopný využívat vodík jako donor elektronů. 2.2.4 Tvorba ATP v A. ferrooxidans [16] Podle chemiosmotické hypotézy vytvářejí organismy ATP pomocí H+ gradientu, který je přítomný napříč plasmatickou membránou, a energie (proton-motivní síly spojené s tímto gradientem) je využívána pro syntézu ATP (přes tok H+ ve spojení s adenosin trifosfátovým komplexem). Některé bakterie mají schopnost utvářet H+ gradient přemisťováním H+ z vnitřní části buňky přes cytoplasmatickou membránu do vnějšího okolí. V takovém případě je 23
energie potřebná pro utváření gradientu dodávána z katabolických procesů energeticky bohatých substrátů. U A. ferrooxidans kultivovaných na železe je gradient způsoben nízkým pH jejich přirozeného vnějšího prostředí a zároveň relativně vysokou hodnotou pH uvnitř buňky. Zdá se, že jsou jedinečně přizpůsobené pro růst ve vysoce kyselém prostředí a využívají výhod tohoto H+ gradientu. Jejich buněčná membrána musí být bariérou pro H+, aby se udrželo relativně vysoké vnitřní pH ve srovnání s vnějším prostředím. 2.2.5 Vztah ke kyslíku a alternativní akceptory elektronů [2] Chemolitotrofní acidofilové vyžadují velké množství energie na podporu svého autotrofního stylu života. Jak lze očekávat, jejich nejčastěji užívaným terminálním elektronovým akceptorem je kyslík, který je energeticky nejvýhodnější. Jak již bylo popsáno, redoxní potenciál Fe(II)/Fe(III) páru je téměř tak pozitivní jako u O2/H2O, železitý ion je potenciálně vhodným alternativním elektronovým akceptorem. Aby byli autotrofní acidofilové schopní použít železitý ion jako akceptor elektronů, musí být schopní používat RISC nebo jiné molekuly než s železnatým iontem jako donor elektronů. Oxidace síry a tetrathionanu spojený s redukcí železitého iontu v anaerobních podmínkách byla prokázána u A. ferrooxidans. Taktéž bylo zjištěno, že některé izoláty této bakterie mohou vykazovat růst s použitím H2 nebo S0 spojeného s redukcí železitého iontu. A. ferrooxidans je také schopen redukce Mo6+, Cu2+ a Co2+, pokud je elementární síra použita jako donor elektronů. 2.2.6 Tolerance a rezistence vůči kovům [2] Důležitou charakteristikou acidofilních chemolitotrofů je jejich obecná tolerance k vysokým koncentracím kovových ale i dalších iontů. Úroveň rezistence několika acidofilních bakterií a archeí byla zkoumána u obsahu iontů As3+, Cu2+, Zn2+, Cd2+ a Ni+. Žádné studie však nebyly zaměřeny na molekulární mechanismus této rezistence vůči kovům. A. ferrooxidans se jeví jako částečně rezistentní ke kovům. Bakterie rostly v mediu, které obsahovalo Co2+ (30 g.l-1), Cu2+ (55 g.l-1), Ni2+ (72 g.l-1), Zn2+ (120 g.l-1), U3O8 (12g.l-1) a Fe2+ (160 g.l-1).
24
2.3 Vázané buňky [17] Adsorpce bakterií na povrch minerálů je klíčovým krokem a zároveň předpokladem celého procesu oxidace. Zmíněné adsorpci bakteriálních buněk na minerální povrch je věnována velká pozornost, a to z důvodu jejího působení ve spojení s kapalnou i pevnou fází. Při procesu vázání buněk bakterií k povrchu minerálu hrají velmi důležitou roli složky, které tvoří bakteriální povrch. Je prokázáno, že vnější membrány se podílejí na adhezi mikroorganismů k minerálům, zatímco vnitřní membrány a ostatní organely nemají na tento proces téměř žádný vliv. Tyto fyziologické struktury bakterií, především vnější membrány, ovlivňují rychlost a intenzitu tohoto navázání buněk k minerálnímu povrchu. Proteiny mukózní membrány, mají mnoho druhů polárních skupin, které umožňují elektrostatické interakce mezi minerálním povrchem a bakteriemi. 2.3.1 Adsorpce A. ferrooxidans [17] Adsorbované množství A. ferrooxidans na povrch sulfidových minerálů je ovlivňováno časem, hodnotami pH a teplotou. Pokud se experimenty loužení provádí delší dobu, adsorpce A. ferrooxidans k povrchu pyritu vzrůstá na maximum dvacátý den při kultivační teplotě 30°C a počáteční hodnotě pH v rozmezí 1 - 2. Za těchto optimálních podmínek je množství vázaných buněk nejvyšší na chalkopyritu, na pyritu a christofitu je shodné. Jestliže experimenty bioloužení probíhají v kratším časovém rozmezí, k navázání maximálního množství buněk na minerální povrch dochází po dvou hodinách a dále je již stabilní. Důležitá je taktéž počáteční koncentrace naočkovaných buněk (maximum bylo pozorováno při 2,4.107 buněk.ml-1) a koncentrace minerálního prášku (10% poměru hmotnosti k objemu). Množství vázaných buněk jsou různá v závislosti na typu daného minerálu. Adsorpční množství na chalkopyritu je vyšší než na pyritu. Po navázání buněk na povrch sulfidového minerálu se mění jeho mezifázové vlastnosti (kontaktní úhel, zeta potenciál). Tato změna zahrnuje tři fáze: rostoucí fázi, stacionární fázi a klesající fázi.
25
2.3.2 Fáze vazby [1] Vázání bakterií je charakterizováno třemi fázemi. V počáteční fázi (prvních 24 hodin) dochází k maximálnímu vázání bakterií na povrch minerálu. Což je nezbytné pro dosažení vysoké rychlosti rozpouštění vzhledem k počátečnímu uvolňování Fe(II) kontaktním bioloužením. V druhé fázi roste s časem počet volných buněk v roztoku vzhledem k povrchové saturaci bakteriemi i přítomnosti Fe(II) v roztoku. To podporuje růst bakterií oxidujících železo (Fe(II)) v roztoku a rychlost minerálního rozpouštění. V třetí fázi dochází k ustanovení rovnováhy mezi volnými a vázanými buňkami. Vzniká spolupráce mezi oběma typy buněk. Vázané buňky napadají minerál (pyrit) a utváří Fe(II). To je poté oxidováno volnými buňkami v roztoku a regenerováno pro nepřímé bioloužení. 2.3.3 Vznik EPS Model vázání bakterií na povrch minerálu předpokládá, že adsorpce probíhá ireverzibilní kinetikou 2. řádu s ohledem na koncentraci bakterií a povrch substrátu v systému. Skládá se ze dvou stupňů: počáteční stupeň reverzibilní adheze, která je následována ireverzibilním vázáním [1]. (7)
Obr. 9: Schéma adsorpce bakterií na povrch minerálu [1].
26
Počáteční vzájemné působení mezi bakterií (B) a povrchovými místy (S) zahrnuje formování metastabilního komplexu ([BS]*), kde jsou bakterie přichyceny v jisté vzdálenosti od povrchu pomocí přitažlivých a odpudivých sil. Po ustálení může komplex reverzibilně disociovat za vzniku volných buněk a povrchových míst. Bakterie může taktéž vynaložit energii na produkci biopolymerů nutných pro zajištění permanentního připojení bakterie k povrchovému místu (rovnice 7, obr. 9) [1]. Procesem utváření vrstev EPS můžeme také rozumět utváření tzv. biofilmů na povrchu minerálu. Biofilm se tedy skládá ze shluků bakterií a EPS, jež jsou odděleny vodními kanálky nebo dutinami [3]. 2.3.4 Složení EPS [1] Složení exopolymeru je následovné: 42% polysacharidy, 54% hexahydráty Fe(III) molekul, 0,5% kyselina glukuronová a 3,5% ostatní složky. Dále se množství obsahu železa v této vrstvě odhaduje přibližně na 53 g/l. Na obr. 10 je A. ferrooxidans pozorována po přichycení k povrchu pyritu.
Obr. 10. A. ferrooxidans pozorována pod elektronovým mikroskopem - na povrchu pyritu [17].
27
2.4 Thiosíranový mechanismus loužení pyritu [18] Jak již bylo řečeno, pyrit je degradován pomocí útoku hexahydrátu železitého iontu. Prvními produkty této degradace jsou thiosíran a hexahydráty železnatých iontů (rovnice 8). (8) Následující kroky jsou oxidace Fe(II) iontů a přeměny thiosíranu. Thiosíran je dále oxidován na tetrathionan za současné redukce Fe(III) iontů (rovnice 9). (9) Tato rekce soutěží s následující (rovnice 10) v závislosti na koncentraci Fe(III) iontů a hodnotě pH. Přičemž v hodnotách pH nižších než 1,7 převládá rovnice 9. (10) Rovnice 11 znázorňuje hydrolytickou reakci tetrathionanu. Tato reakce může být zprostředkována pomocí tetrathionanhydrolasy [19]. Vzniká vysoce reaktivní disulfan-monosulfonová kyselina, která může být dále oxidována kyslíkem za vzniku trithionanu (rovnice 12). Trithionan je dále hydrolyzován na thiosíran a síran (rovnice 13). (11) (12) (13) Thiosíran může vniknout zpět do cyklu tím, že je oxidován na tetrathionan. Shrneme-li tyto reakce, pak ze 2 molů thiosíranu vzniká oxidací 1 mol thiosíranu, 2 moly síranu a 4 moly protonů (v cyklickém procesu). Disulfan-monosulfonová kyselina může reagovat s tetrathionanem za vzniku pentathionanu a thiosíranu (rovnice 14). (14)
28
Disulfan-monosulfonová kyselina se také může rozkládat za vzniku elementární síry (rovnice 15). Jestliže tato reakce proběhne 4krát, vznikne 1 mol elementární síry vedle 4 molů siřičitanu. (15) Thiosíran se může účastnit reakce se sulfan-monosulfonovou kyselinou za vzniku pentathionanu (rovnice 16). (16) Kombinací všech reakcí vzniká cyklické schéma degradace pyritu, které je znázorněno na obr. 11.
Obr. 11. Schéma mechanismu cyklické degradace pyritu [18]. Proti výše uvedené představě stojí tvorba síranu jako prvního a konečného produktu oxidace pyritu (bez sirných meziproduktů) a Fe(III) iontů. To by mohlo probíhat za vysokého redoxního potenciálu v roztoku, tedy za vysoké oxidační aktivity bakterií [20]. 29
2.5 Chemiluminiscence Luminiscence je proces, při němž dochází k vyzáření světla látkou. Tento proces vzniká při reakcích produkujících energii. Energie se využije k excitaci elektronu, který se následně vrací do svého základního stavu a energie se uvolní ve formě světla. Princip bioluminiscence
je
shodný
s principem
luminiscence
s jediným
rozdílem,
bioluminiscence je vyvolána živými organismy. V naší práci se chemiluminiscence využila na určení buněčného obsahu ATP. 2.5.1 Aplikace bioluminiscence na stanovení ATP Bioluminiscenční metoda určující hladinu ATP je založena na schopnosti luciferasy (enzym umožňující bioluminiscenci u živočichů, např. světlušek) oxidovat D-luciferin v přítomnosti ATP za emise světla, jehož intenzita je přímo úměrná koncentraci ATP [21]. Luciferasa světlušky se katalyticky účastní reakce, která je znázorněná rovnicí 17. Přičemž tato reakce probíhá v několika krocích (rovnice 18 - 21) [22]. ě á
(17) (18)
á
(19) (20) (21)
Tato metoda je specifická a dostatečně senzitivní pro stanovení nízkých koncentrací ATP (až 10-12 mol.l-1) [21]. 2.5.2 Využití chemiluminiscence [22] Chemiluminiscenci je možné využít různými způsoby - rybářské návnady, zdroj světla, ale především může být využita jako analytický nástroj. Jednou z hlavních oblastí pro využití chemiluminiscence je analýza enzymů a
metabolitů.
Byly
vytvořeny
tři
systémy
umožňující
stanovení
značného
množství analytů: (a) luciferin - luciferasa ze světlušky pro ATP; (b) bakteriální luciferasa - oxidoreduktasa pro NAD(P)H; (c) ftalazindiony pro H2O2.
30
3 CÍL PRÁCE 1. Teoretická část: literární rešerše o biooxidaci pyritu 2. Experimentální část: buněčný obsah ATP při oxidaci pyritu bakteriemi A. ferrooxidans, podíl živých buněk a vazba bakterií na povrchu minerálu.
31
4 PRAKTICKÁ ČÁST 4.1 Materiál a metody 4.1.1 Mikroorganismus a kultivace Používaným mikroorganismem byl Acidithiobacillus ferrooxidans (CCM 4253), který pochází z ložisek ve Zlatých Horách. Kultivace bakterií rostoucích na pyritu probíhala v 9K mediu bez přídavku železa. 4.1.1.1 Složení 9K media bez Fe [23] Složení media je uvedeno na 1 l deionizované vody. Složka A1: 600 ml H2O 3,0 g (NH4)2SO4 0,1 g KCl 0,5 g MgSO4 . 7H2O Složka A2: 100 ml H2O 0,5 g K2HPO4 Složka B: 300 ml H2O (pH upraveno H2SO4 na 1,7) Složka C: 100 ml H2O 0,71 g Ca(NO3)2 . 4H2O Každá složka byla sterilizována varem a po vychladnutí na laboratorní teplotu byly smíchány složky A1 a A2 za vzniku složky A. Tato složka byla přidána ke složce B a za stálého míchání byly přidány 2 ml složky C. Medium bylo skladováno v chladové místnosti při 5°C. 4.1.1.2 Kultivace bakterií na třepačce Aplikace kultury A. ferrooxidans proběhla 10% inokulací do sterilní baňky s kultivačním mediem. Před inokulací bylo Fe(II) nahrazeno před inokulací práškovým pyritem (promytý zředěnou H2SO4 o pH 1,5) a byla provedena sterilizace varem. Kultivace probíhala na rotační třepačce při teplotě 28°C. Pro pokusy s měřením ATP vázaných buněk bylo použito medium o objemu 1 l, kde Fe(II) z 9K media bylo nahrazeno 20 g práškového pyritu. Pro určení životaschopnosti buněk se bakterie kultivovaly v mediu o objemu 100 ml a přídavek práškového pyritu byl 2 g (dále byla prováděna inokulace na tuhé medium, viz níže).
32
4.1.1.3 Kultivace bakterií na miskách Kultivace na miskách ve dvou opakováních probíhala po odebrání vzorku bakteriální kultury, která byla kultivována na třepačce. Následovalo příslušné ředění (vypočtené z počtu buněk, který byl zjištěn mikroskopicky) a poté inokulace na tuhé medium označované Feo. Kultivace probíhala při 28°C po dobu 2-3 týdnů (podle velikosti narostlých kolonií A. ferrooxidans) tak, aby je bylo možné spočítat. 4.1.1.4 Složení Feo media [24] Medium se skládá ze tří níže popsaných složek. Složka 1: roztok základních solí/tryptonový sojový vývar, okyseleno na pH 2,5 a tepelně sterilizováno Složka 2: 1M železnatý síran, okyselený na pH 2,0 a sterilizovaný Složka 3: koncentrát tepelně sterilizované agarosy (2%) Tyto tři roztoky byly po ochlazení na teplotu 45°C smíchány dohromady, tím vznikl roztok o požadovaných koncentracích. Konečné koncentrace jednotlivých složek jsou následovné: železnaté ionty 25 mM, TSB 0,025% (w/v) a agarosa 0,5% (w/v). Medium bylo aplikováno na sterilní Petriho misky za vzniku tenké vrstvy gelu. 4.1.2 Uvolňování vázaných buněk z částeček pyritu Kultivace probíhala v 1 l 9K media bez železa s 20 g pyritu a 10% inokulací Fe-kultury. Mícháno na magnetické míchačce a vzdušněno. Pro uvolnění vázaných buněk z povrchu pyritu byl odebrán vzorek 4 ml kultury s obsahem práškového pyritu. Po sedimentaci pyritu byl supernatant odebrán a použit pro měření týkajících se volných buněk (měření ATP, mikroskopické počítání buněk). Sediment (práškový pyrit s navázanými buňkami) byl promyt zředěnou kyselinou sírovou (pH 2). Následně bylo k promytému sedimentu přidáno 400 µl zředěné H2SO4 o pH kultury 2. Z tohoto pyritového sedimentu byly bakterie uvolněny intenzivním třepáním (vortex) po dobu 5 minut [25], poté byl supernatant použit pro další analýzy (ATP vázaných buněk, mikroskopický počet buněk).
33
4.1.3 Analytické metody 4.1.3.1 Měření pH Hodnoty pH byly měřeny pomocí kombinované skleněné pH elektrody a pH metru PHM 93 (Radiometer, Copenhagen). 4.1.3.2 Stanovení počtu bakterií Počet bakterií byl stanovován mikroskopicky (mikroskop BX50, Olympus, Japonsko a Cyrusova komůrka II). Pro stanovení počtu bakterií na miskách byly počítány vyrostlé kolonie. 4.1.3.3 Stanovení železitých iontů Fe3+ bylo stanoveno UV absorpční spektrofotometrií při vlnové délce 300 nm (spektrofotometr Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech). [26] 4.1.3.4 Stanovení ATP Množství ATP v kultuře bylo provedeno chemiluminiscenční metodou na luminometru Junior LB 9509 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) s použitím komerčního kitu ATP Biomass Kit HS (BioThema, Švédsko). Obsah sady kitu [27]:
ATP Reagent HS - lyofilizovaný reagent obsahující luciferin a luciferasu
Diluent B - pufr k rozpuštění ATP reagentu
Extraktant B/S - extrakční činidlo uvolňující ATP z buněk
ATP standard (100 nmol.l-1)
Složení reakční směsi [28]:
50 µl 300x zředěného zř. H2SO4 (pH 2 - 2,6)
50 µl extraktantu B/S
400 µl ATP reagentu HS
1 µl standardu ATP (10x ředěný destilovanou vodou - pro měření vzorků s RLU do 1000 jednotek; neředěný - pro vzorky s hodnotou RLU vyšší než 1000 jednotek)
34
Měření probíhalo za laboratorní teploty. Nejprve bylo ATP z buněk uvolněno extraktantem B/S a poté proběhla analýza reagentem HS. Reakční směs byla před měřením promíchána. Průběh luminiscence vystihuje rovnice (17). Intenzita světla je přímo úměrná množství ATP a je měřena luminometrem. Emise světla je měřena před a po přídavku známého množství ATP standardu, to umožňuje spočítat množství ATP ve vzorku v pmol podle následujícího vztahu (rovnice 22), který platí pro přídavek 10 µl standardního roztoku ATP (o koncentraci 100 nM) [27]. (22) Obecně lze zavést koeficient k, pro který platí k = 0,1ε, kde ε je přídavek výše zmíněného standardního roztoku ATP v μl (rovnice 23). (23)
4.2 Výsledky 4.2.1 Biooxidace pyritu a ATP volných a vázaných buněk Na následujících obrázcích (12 - 21) jsou výsledky z experimentů týkajících se buněčného obsahu ATP vázaných a volných buněk. Na obr. 12 je znázorněna růstová křivka, tedy závislost koncentrace buněk v jenom mililitru na čase. Obr. 13 ukazuje závislost koncentrace železitých iontů v čase, jde tedy o sledování množství produktu oxidace pyritu během růstu bakteriální kultury. Na obr. 14 je znázorněn průběh intenzity bioluminiscence v buněčné kultuře. Souhrnně tyto tři obrázky znázorňují růst buněk a oxidaci pyritu (tvorba produktu Fe(III)).
35
8
10 8 buněk.ml-1
6
4
2
0 0
200
400
600
h
Obr. 12. Růst bakterií A. ferrooxidans na pyritu. Kultura inkubována na třepačce při 28°C.
50
Fe III (mM)
40
30
20
10
0 0
200
400
600
h
Obr. 13. Průběh koncentrace Fe(III).
36
3000
RLU
2000
1000
0 0
200
400
600
h
Obr. 14. Průběh intenzity luminiscence v kultuře z obr. 13 - 14 (hodnoty RLU v reakční směsi pro stanovení ATP).
Následující grafy dokumentují lineární závislosti mezi měřenými veličinami, které byly měřeny. Tyto linearizace je možné provést s daty získanými pouze v aktivní fázi růstu kultury. Jde o lineární závislosti intenzity luminiscenčního signálu a koncentrace Fe(III) na koncentraci buněk (obr. 15, 16). Rovněž na obr. 17 je znázorněna linearita závislosti intenzity luminiscence na koncentraci Fe(III). Z obr. 17 je také patrné, že měření koncentrace Fe(III) je stejně vhodné jako měření intenzity luminiscence pro indikaci bakteriálního růstu v průběhu kultivace.
37
3000 2500
RLU
2000 1500 1000 500 0 0
1
2
3
10 8 buněk.ml-1
Obr. 15. Závislost intenzity luminiscence (v reakční ATP směsi) na koncentraci buněk v kultuře během aktivní oxidační fáze. y = 917,18x + 30,62 (r = 0,982).
50
Fe (III) (mM)
40
30
20
10
0 0
2
4 108
buněk . ml
6
8
-1
Obr. 16. Závislost koncentrace Fe(III) na koncentraci buněk. y = 6,65x + 1,60 (r = 0,991).
38
3000 2500
RLU
2000 1500 1000 500 0 0
5
10
15
20
25
Fe (III) (mM)
Obr. 17. Závislost RLU (v reakční ATP směsi) na koncentraci Fe(III) v kultuře. y = 102,72x + 71,97 (r = 0,999).
39
Na obr. 18 je znázorněn celkový obsah ATP na celkovém počtu buněk (tedy v objemu kultury 1 l) během aktivní fáze růstu a oxidace pyritu. Směrnice regresní rovnice odpovídá střední hodnotě obsahu ATP v buňce. Pro 95% intervalu spolehlivosti (r = 0,978) je tato hodnota 1,00 ± 0,39 amol ATP.buňka-1.
7 6
10 11 ATP (amol)
5 4 3 2 1 0 0
2
4
6
10 11 buněk
Obr. 18. Závislost celkového obsahu ATP na celkovém počtu buněk v aktivní (lineární) fázi růstu kultury o objemu 1 l. Směrnice 1,00 ± 0,39 amol ATP.buňka-1 (95% interval spolehlivosti, r = 0,978) odpovídá střední hodnotě obsahu ATP v buňce.
40
Obr. 19 ukazuje srovnání buněčného obsahu ATP ve volných a vázaných bakteriích. Je patrné, že buňky rostoucí na pyritu mají v rámci experimentálních chyb shodný obsah ATP jak ve formě volných buněk, tak vázaných.
ATP (amol . buňka -1)
2
1
0 0
200
400
600
h
Obr. 19. Průběh obsahu ATP v buňce během růstu na pyritu. Srovnání volných (♦) a vázaných buněk (♦).
41
Na následujících dvou obrázcích (20, 21) je porovnání počtu volných a vázaných buněk během kultivace na pyritu. Obr. 20 popisuje růstovou křivku obou typů buněk. Oproti tomu na obr. 21 je znázorněno procentuální vyjádření množství vázaných buněk v průběhu kultivace bakteriální kultury, ze kterého vyplývá, že množství vázaných buněk se pohybuje kolem 3 - 10%.
7 6
10 8 buněk.ml -1
5 4 3 2 1 0 0
200
400
600
h
Obr. 20. Růst buněk na pyritu, koncentrace volných (♦) a vázaných (♦) buněk.
42
20 18
% vázaných buněk
16 14 12 10 8 6 4 2 0 0
200
400
600
h
Obr. 21. Procentuální vyjádření počtu vázaných buněk (vzhledem k celé kultuře). 4.2.2 Životaschopnost buněk Na následujících obrázcích (22, 23) jsou výsledky z experimentů zabývajících se životaschopností buněk během kultivace. Obr. 22 znázorňuje růst bakterií A. ferrooxidans na pyritu, a to v porovnání počtů buněk zjištěných mikroskopickým počítáním a kultivací na miskách (vždy ve dvou paralelních vzorcích). Do 642,5 hodiny (kdy nastává inhibice kyselinou sírovou) je rozdíl mezi miskami a mikroskopickým počítáním nevýznamný (P > 0,05). To znamená, že v aktivní fázi nejsou měřitelné mrtvé buňky. Poté jsou rozdíly již významné (P < 0,05), což naznačuje, že ve stacionární fázi začínají buňky A. ferrooxidans odumírat, patrně vlivem inhibice H2SO4. Obr. 23 udává koncentrační průběh vzniklého produktu (Fe(III)) v čase, což je využito pro indikaci růstu bakteriální kultury A. ferrooxidans.
43
7 6
10 8 buněk.ml-1
5 4 3 2 1 0 0
500
1000
1500
h
Obr. 22. Růst bakterií A. ferrooxidans na pyritu. Kultura inkubována na třepačce při 28°C. Počet buněk byl počítán mikroskopicky (♦) a na miskách (♦).
30
Fe(III) (mM)
20
10
0 0
500
1000
1500
h
Obr. 23. Průběh koncentrace Fe(III), viz obr 22.
44
4.3 Diskuse 4.3.1 Biooxidace pyritu a ATP volných a vázaných buněk Z analýzy počtu buněk v kultuře, intenzity luminiscence a koncentrace Fe(III) plyne, že všechny tři veličiny dobře korelují (obr. 15 - 17). Intenzita luminiscence může výhodně sloužit k rychlému monitorování živé biomasy i v suspenzi obsahující sraženiny železa či jiné nerozpustné látky. Zároveň velmi přesně vymezuje konec aktivní oxidační fáze v důsledku inhibice kyselinou sírovou, neboť se v ní odrážejí jakékoli jemné metabolické změny. Ze srovnání buněčného obsahu ATP volných a vázaných bakterií oxidujících pyrit, 1 amol na buňku, je patrná shoda obsahu ATP v obou typech buněk po celou dobu oxidace (obr. 19). Tato shoda naznačuje, že volné i vázané buňky vykazují dominantně oxidaci Fe(II), bez detekovatelné účasti sirné oxidace, neboť oxidace sirných látek vyúsťuje ve významně nižší buněčný obsah ATP [29]. Tato skutečnost je v souladu se staršími výsledky o dominantní oxidaci pyritu bez sirných meziproduktů [20], i když většina prací tvorbu sirných meziproduktů akceptuje (viz kap. 2.4). Je zjevné, že intenzita bioluminiscence je užitečný indikátor růstu i oxidace a může sloužit k posouzení typu aktuálně využívaného substrátu. V procentuálním vyjádření množství vázaných buněk v kultuře během kultivace se ukázalo, že toto množství se pohybuje v rozmezí okolo 3 - 10%. Tyto výsledky odpovídají aktivní fázi oxidace. Na počátku kultivace, kdy převládá adsorpce nad růstem, bylo zaznamenáno 18% vázaných buněk. Podobné hodnoty na počátku kultivace uvádí literatura [30], kde se na povrch pyritu se vázalo 24% buněk A. ferrooxidans (měření probíhalo po 1 min vortexování a následných 5 min stání). Podobná hodnota je taktéž uvedena v [31], kde na pyrit přisedlo 26% bakterií (měření probíhalo po 1 min vortexování a následných 10 min stání). Naše relativně nízké hodnoty (během aktivní fáze) opět naznačují dominantní úlohu volných bakterií oxidujících ionty Fe(II) uvolněné během chemické oxidace pyritu ionty Fe(III).
45
4.3.2 Životaschopnost buněk Případné rozdíly mezi počtem celkových a živých buněk jsou významné z hlediska určení buněčného obsahu ATP, neboť mrtvé buňky zkreslují výpočet z naměřených údajů. Do doby, kdy dochází k inhibici kultury vznikající kyselinou sírovou, je rozdíl mezi mikroskopickým počítáním a počty kolonií na miskách nevýznamný. To naznačuje, že v aktivní fázi nedochází k měřitelnému odumírání buněk. Přechodem k stacionární fázi a inhibičnímu vlivu kyseliny sírové začíná být rozdíl významný. Každopádně údaje z aktivní fáze oxidace pyritu, jež sloužila ke kinetickým pozorováním a vyhodnocením, odpovídají pouze živé biomase, jak je možné v rámci experimentálních chyb konstatovat.
46
5 SEZNAM SKRATEK AMD
kyselé důlní vody, z anglického „acid mine drainage“
ATPsmp
koncentrace ATP ve vzorku
EPS
extracelulární polymerní vrstva
Ismp
intenzita chemiluminiscence vzorku
Ismp+st
intenzita chemiluminiscence vzorku s přídavkem standardu ATP
Lf
Leptospirillum ferrooxidans
NDH1
NADH dehydrogenasa
OMP
proteiny vnější membrány
Q
ubichinon
QH2
ubichinol
RISC(s)
redukované anorganické sloučeniny síry
RLU
relativní jednotka luminiscence
SDO
sulfurdioxygenasa
SOR
siřičitan:akceptoroxidoreduktasa
SQR
sulfid:chinonoxidoreduktasa
Tf
Thiobacillus ferrooxidans
TSB
tryptonový sojový vývar
Tt
Thiobacillus thiooxidans
47
6 LITERATURA 1. Rodríguez Y, Ballester A, Blázquez ML, González F, Munoz JA. 2003. Study of Bacterial Attachment During the Bioleaching of Pyrite, Chalcopyrite, and Sphalerite. Geomicrobiology Journal, 20: 131 - 141. 2. Rawlings DE. 2005. Characteristics and adaptability of iron- and sulfur-oxidizing microorganisms used for the recovery of metals from minerals and their concentrates. Microbial Cell Factories 4: 13. 3. Crundwell F. 1996. The formation of biofilms of iron-oxidising bacteria on pyrite. Minerals Engineering 9: 1081 - 1089. 4. http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Acidithiobacillus_ferrooxidans. 2011. 5. Schippers A, Sand W. 1999. Bacterial Leaching of Metal Sulfides Proceeds by Two Indirect Mechanisms via Thiosulfate or via Polysulfides and Sulfur. Applied and Environmental Microbiology 65: 319 - 321. 6. Pronk JT, de Bruyn JC, Bos P, Kuenen JG. 1992. Anaerobic Growth of Thiobacillus ferrooxidans. Applied and Enviromental Microbiology 58: 2227 - 2230. 7. Marková R. 2005. Bakalářská práce. Přírodovědecká fakulta MU. Brno. 8. Johnson DB. The Biochemistry of Biomining. In: Barton L, Mandl M, Loy A (editors). Geomicrobiology: Molecular and Environmental Perspective. Springer, Dordrecht 2010. 401 - 426. 9. Hallberg KB, Johnson DB. 2005. Mine Water Microbiology. Mine Water and the Environment 24: 28 - 32. 10. Rawlings DE, Johnson DB. 2007. The microbiology of biomining: development and optimization of mineral-oxidizing microbial consortia. Microbiology 153: 315 - 324. 11. Pelikánová D. 2012. Bakalářská práce. Přírodovědecká fakulta MU. Brno.
48
12. Poskerová L. 2012. Bakalářská práce. Přírodovědecká fakulta MU. Brno. 13. Linhartová P. 2006. Bakalářská práce. Přírodovědecká fakulta MU. Brno. 14. Chen Y, Suzuki I. 2006. Electron transport pathways for oxidation of endogenous substrate(s) in Acidithiobacillus ferrooxidans. Canadian Journal of Microbiology 52: 317 - 327. 15. Pakostová E. 2007. Bakalářská práce. Přírodovědecká fakulta MU. Brno. 16. Apel WA, Dugan PR, Tuttle JH. 1980. Adenosine 5´-Triphosphate Formation in Thiobacillus ferrooxidans Vesicles by H+ Ion Gradients Comparable to Those of Environmental Conditions. Journal of Bacteriology 142: 295 - 301. 17. Jian-she L, Xue-hui X, Bang-mei L, Quing-hai D. 2005. Adsorption characteristics of Thiobacillus ferrooxidans on surface of sulfide minerals. Journal of Central South University of Technology 12: 671 - 676. 18. Sand W, Gehrke T, Jozsa PG, Schippers A. Novel mechanism for bioleaching of metal sulfides. In: International biohydrometallurgy symposium IBS97 Biomine 97 "Biotechnology comes of age". Australian Mineral Foundation, Glenside 1997. QP2.1 - QP2.10. 19. Sand W, Gehrke T, Jozsa PG, Schippers A. 2001. (Bio)chemistry of bacterial leaching - direct vs. indirect bioleaching. Hydrometallurgy 59: 159 - 175. 20. Mandl M, Zeman J, Bartáková I, Veselá H. Pyrite biooxidation: Electrochemical and kinetic data. In: Amils R, Ballester A (editors). Biohydrometallurgy and the Environment Toward the Mining of the 21st Century, part A. Elsevier, Amsterdam 1999. 423 - 429. 21. Efremenko EN, Azizov RE, Makhlis TA, Abbasov VM, Varfolomeev SD. 2005. Determination of Minimal Concentrations of Biocorrosion Inhibitors by a Bioluminiscence Method. Applied Biochemistry and Microbiology 41: 377 - 381. 22. Pakostová E. 2009. Diplomová práce. Přírodovědecká fakulta MU. Brno.
49
23. Silverman M., Lundgren D. G. 1959. Studies on the chemoautotrophic iron bacterium Ferrobacillus ferrooxidans: 1. An improved medium and a harvesting procedure for securing high cell yields. Journal of Bacteriology 77: 642 - 647. 24. Johnson DB, Hallberg KB. Techniques for detecting and identifying acidophilic mineral-oxidizing microorganisms. In: Rawlings DE, Johnson DB (editors). Biomining. Heidelberg: Springer 2007. 237-262. 25. Escobar B, Godoy I. 2002. Enumeration of Acidithiobacillus ferrooxidans adhered to agglomerated ores in bioleaching processes. World Journal of Microbiology & Biotechnology 18: 875 - 879. 26. Mandl M., Nováková O. 1993. An ultraviolet method for the determination of oxidation of iron sulphide mineral by bacteria. Biotechnology Techniques 7: 573 - 574. 27. ATP Biomass Kit HS, Instructions for Use. BioThema AB, Handen, Sweden. 28. Marková R. 2008. Diplomová práce. Přírodovědecká fakulta MU, Brno. 29. Pakostova E, Mandl M, Omesova Pokorna B, Diviskova E, Lojek A. 2012. Cellular ATP changes in Acidithiobacillus ferrooxidans cultures oxidizing ferrous iron and elemental sulfur. Geomicrobiology Journal, v tisku. 30. Ohmura N, Kitamura K, Saiki H. 1993. Selective Adhesion of Thiobacillus ferrooxidans to Pyrite. Applied and Enviromental Microbiology 59: 4044 - 4050. 31. Sampson MI, Blake RC. 1999. The cell attachment and oxygen consumption of two strains of Thiobacillus ferrooxidans. Minerals Engineering 12: 671 - 686.
50
