III.
A.
BAHAN DAN METODE PENELITIAN
BAHAN DAN MEDIA
Bahan mentah yang digunakan adalah ketimun, rucah segar
(ikan peperek/ Leigona thidae) ,
(berisi ketimun, bawang merah, dan cabai rawit)
ikan acar yang
diperoleh dari penjual sate di sekitar Bogar, garam, dan gula. sp. atau
Bakteri yang digunakan adalah Alcaligenes
Achromobacter sp. DSM 30002
dan
Pseudomo-
nas fluorescens DSM 50106 dari Jerman, Escherichia coli dan Staphylococcus aureus
dari Laboratorium
Mikrobiologi Jurusan Teknologi Pangan,
Salmonella typhimuri"um, Vibrio Listeria
monocytogenes
Fateta,
IPB,
parahaemolyticus,
dan
dari Balai Penelitian
Veteriner, Bogar. Isolat bakteri asam laktat dipelihara dalam media agar MRs-CaC0 3 semi padat.
Untuk P. fluorescens digu-
nakan media agar Pseudomonas, untuk L. monocytogenes media TSA, rine,
untuk V.
parahaemolyticus media agar Ma-
dan untuk bakteri penguji lain digunakan agar
Nutrien.
Broth yang digunakan untuk menumbuhkan kul-
tur kerja bakteri asam laktat adalah
MRS broth, untuk
L. monocytogenes digunakan BHI broth, dan untuk bakteri penguji lain ditumbuhkan dalam Nutrien broth. Untuk kan
identifikasi bakteri asam laktat diguna-
Reagen Nessler, MRS arginin broth,
Streptokoki
31
arginin broth , agar Leuconostoc,
Litmus Milk, Gibson
semi padat, dan ·MRS broth. Untuk menguji aktivitas antimikroba bakteri asam laktat terhadap Alcaligenes sp. digunakan media P.
PA,
fluorescens:
E.
coli:
EMBA,
TSA,
L. monocytogenes:
TSA, S. aureus: BPA, S. typhimurium: agar McConcey, V. parahaemolyticus: TCBSA.
Untuk menghitung jumlah bakteri asam laktat yang dikontakkan. dengan P.
fluorescens dalam media ekstrak
ikan rucah digunakan agar MRS,
agar MRS-Natrium azida
digunakan untuk menghitung bakteri asam laktat yang dikontakkan
dengan
Alcaligenes
sp.,
agar
Nutrien
untuk menghitung jumlah P. fluorescens dan Alcaligenes sp. baik yang dikontakkan dengan bakteri asam laktat atau tidak dalam media ekstrak ikan rucah. Bahan-bahan lain yang digunakan yaitu NaCl sebagai pengencer,
air pepton sebagai media pertumbuhan
bakteri asam laktat untuk menghasilkan hidrogen peroksida,
dan media
pertumbuhan asam.
sintetik asam laktat
bakteri
asam
laktat
sebagai media
untuk
memproduksi
Bahan kimia yang digunakan adalah NaOH,
asam oksalat,
KI,
KI0 3 , asam sulfat,
dan amonium molibdat.
HC1,
natrium sulfat,
32
B.
"1.
METODE PENELITIAN
Isolasi
dan
Identifikasi
Bakteri Asam Laktat"dari
Pikel Ketimun Dan Acar a.
Pembuatan Pikel Ketimun
Untuk pembuatan pikel
ketimun,
dipilih
ketimun yang masih muda, dicuci, dipotong-potong agar didapat ukuran yang seragam dan dimasukkan ke dalam stoples yang berisi konsentrasi 5% NaCl.
larutan garam dengan
Sebanyak 1% glukosa ditam-
bahkan untuk membantu proses fermentasi. diusahakan supaya terendam di bawah larutan garam.
Ketimun permukaan
·Toples ditutup rapat. Fermentasi
dilakukan pada suhu kamar. b.
Isolasi Bakteri Asam Laktat
Isolasi bakteri asam laktat dari pikel ketimun dilakukan pada waktu fermentasi 2, 4, 12/ dan 16 hari.
6, 9,
Isolasi bakteri asam laktat dari
acar yang dibeli dari tukang sate dilakukan sehari setelah pembelian. Cairan dari pikel ketimun dan acar diencerkan dengan larutan NaCl 0,85% sampai pengenceran 10- 6 . Sebanyak 1 ml contoh dari pengenceran
10- 5 - 10- 6
diambil dan dipindahkan ke dalam cawan petri steril (dilakukan duplo untuk setiap pengenceran).
33
agar
MRS
goyang
dituang ke dalam cawan petri dan di-
secara
mendatar.
cawan diinkubasi
Setelah agar membeku,
dalam posisi terbalik pada suhu
37°C selama dua hari. Cawan dipilih, ukuran
dengan
kOloni-koloni
yang
terpisah
koloni-koloni yang mempunyai warna dan yang
berbeda
di~indahkan
ke
dalam
petri yang berisi agar MRS dengan membuat kuadran.
cawan
goresan
Inkubasi dilakukan pada suhu 37°C selama
2 hari.
Jika koloni dalam cawan petri belum murni
(misalnya besar koloni tidak seragam) maka diambil satu koloni dan dibuat goresan kuadran lagi pada agar
MRS
sampai
diperoleh
koloni-koloni
dengan
ukuran yang seragam. Isolat-isolat bakteri asam laktat yang telah murni ditumbuhkan dalam
MRS broth selama 2 hari.
Kultur ini akan digunakan sebagai inokulum untuk identifikasi awal. c.
Identifikasi Bakteri Asam Laktat 1. Identifikasi awal
Identifikasi awal meliputi uj i
katalase
dan pewarnaan gram. Uji katalase
kultur
cair
Larutan H202
(Fardiaz, 1987)
disebarkan 3%
pada
diteteskan
di
Satu loop gelas
obyek.
at as
kultur
34
tersebut.
Timbulnya
gelembung-gelembung
oksigen pada kultur menunjukkan uji positif. Bakteri asam laktat akan menunjukkan uji katalase negatif. Pewarnaan gram (Fardia'z, 1987).
Satu loop
kultur cair disebarkan pada gelas obyek. Kultur cair dikeringkan di udara dan difiksasi dengan nyala api kecil.
Pewarna kristal violet
diteteskan di atas film pada gelas obyek selama 1 menit, kran.
kemudian dibilas dengan air
sisa air yang tertinggal dibuang, dan
lapisan film kultur ditetesi dengan
larutan
Lugol (yodium Gram) selama 1 menit.
Setelah
dicuci kembali dengan air, kemudian dihilangkan warnanya dengan menggunakan alkohol 95% selama 10 -
20 detik atau sampai warna biru tidak
luntur lagi.
Setelah dicuci sebentar, kemudian
lapisan film kultur diwarnai dengan larutan safran in selama 10 - 20 detik.
Setelah dibilas
dengan air dan dikeringkan dengan kertas serap, lapisan film bakteri diperiksa di bawah mikroskop dengan pembesaran 1000 kali.
Bakteri asam
laktat merupakan bakteri gram positif ditandai dengan kultur yang berwarna biru-ungu.
35
Isolat yang menunjukkan uji katalase negatif dan hasil pewarnaan gram biru-ungu disimpan di dalam MRS-CaC0 3 semi padat. 2. Uji
Biokimia
Bakteri
Sebagai
inokulum
Laktat
AS~
(Nuraida,
1988)
untuk
identifikasi,
diambil satu sampai dua loop isolat dari media MRS-CaC0 3 semi padat.
Ditumbuhkan pada media
MRS broth selama 2 hari pada suhu 37°C Produksi CO 2 dari glukosa.
Tes ini untuk
membedakan bakteri homofermentatif dan heterofermentatif
4engan
semi padat. padat
menggunakan
media.
Gibson
Cara pembuatan media Gibson semi
adalah sebagai berikut
10 ml mangan
sulfat dieampur dengan 800 ml susu skim.
Ke
dalam
gr
eampuran
ekstrak
khamir
tersebut dan
50
gr
ditambahkan glukosa.
dipanaskan dalam penangas air.
2,5
Larutan
Selagi panas,
ditambahkan 200 ml agar nutrien.
Media ,didis-
tribusikan ke dalam tabung reaksi dengan kedalaman 5-6 em,
Sterilisasi dilakukan dengan
menggunakan penangas air masing-masing 30 menit selama 3 hari berturut-turut, Media Gibson semi padat steril dieairkan dan diturunkan suhunya sampai 45°C.
Kira-kira
36
1 tetes inokulum ditambahkan dengan menggunakan pipet tetes steril, kemudian ditambahkan 1 ml agar cair steril 1,5%.
Inkubasi dilakukan pada Bakteri laktat
suhu 37°C selama 2 - 5 hari.
heterofermentatif akan membentuk gas ditandai dengan pecahnya atau meloncatnya agar. Tes ini
Produksi amonia dari arginin.
digunakan untuk membedakan laktobasili heterofermentatif dan homofermentatif.
Tes ini juga
digunakan untuk membedakan Leuconostoc dengan bakteri asam laktat heterofermentatif lainnya. 3 gr L-
Cara pembuatan MRS arginin broth arginin monohidrat dilarutkan
dalam 1 liter
MRS broth, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf 121°C selama 15 menit.
Streptokoki argi-
nin broth: 5 gr tripton, 2,5 gr ekstrak khamir,
0,5 gr glukosa,
2 gr K2 2HP0 4 ,
3 gr L-
arginin monohidrat dilarutkan dalam 1 liter air destilata, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf 121°C, 15 menit. MRS arginin broth dan streptokoki arginin broth diinokulasi dengan 1 tetes
inokulum.
Kultur kemudian
diinkubasikan selama 2
hari pada
37°C.
dimasukkan
suhu
5
Sebanyak 1 ml kultur
ke dalam tabung reaksi, kemudian
ditambahkan Reagen Nessler dengan volume yang
37
amonia ditandai dengan
Pembentuk~n
sarna.
pembentukan warna oranye kecoklatan setelah penambahan Reagen Nessler. Tes ini
Produksi dekstran dari sukrosa.
digunakan untuk membedakan 'Leuconostoc tertentu dengan bakteri laktat berbentuk koki lainnya. Cara pembuatan agar Leuconostoc ton,
5 gr ekstrak khamir,
triamonium sitrat,
10 gr trip-
5 gr K2 HP0 4 ,
5 gr sukrosa,
5 gr
15 gr agar
bacto dilarutkan dalam 1 liter air destilata, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf selama 15 menit.
121°C
Kemudian agar cair tersebut
dipindahkan' ke dalam cawan petri
steril.
Sebagai kontrol digunakan media yang mengandung 0,1 % sukrosa.
Bakteri asam laktat digores secara kuadran pada agar Leuconostoc.
Cawan petri diinkubasi
pad a suhu 37°C selama 2 - 5 hari.
Pembentukan
dekstran ditandai dengan pembentukkan koloni mukoid. Pertumbuhan pada suhu berbeda.
Satu tetes
inokulum ditambahkan-ke dalam tabung MRS broth (masing-masing duplo).
Satu seri tabung diin-
kubasi pada suhu 15°C dan seri lainnya pada suhu 45°C selama 5 - 14 hari.
38
MRS broth
Pertumbuhan pada 6.5% NaCl.
dengan 6.5% NaCl diinokulasi dengan 1 tetes inokulum.
Kultur kemudian diikubasikan pada
suhu 37°C selama 5 hari. Reaksi pada Litmus Milk.
Litmus Milk
Cara pembuatan
100 gr susu skim dan 0,75 gr
litmus dilarutkan dalam 1 liter air destilata, larutan didistribusi ke dalam tabung reaksi, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf 121°C, 15 menit. Satu tetes inokulum diinokulasikan ke dalam Litmus Milk, suhu 37°C
s~lama
kemudian diinkubasi pad a 2 -
5 hari.
Reaksi yang
terjadi pad a Litmus Milk diamati a. Pemisahan whey atau penggumpalan susu karena enzim proteolitik tanpa pembentukan asam sehingga warna litmus tetap biru. b. Pembentukan asam dengan atau tanpa penggumpalan susu yang ditandai dengan perubahan warna litmus menjadi merah muda. C.
Pembentukan gas yang ditandai dengan adanya gelembung-gelembung. Diagram isolasi dan identifikasi bakteri
asam laktat yang diisolasi dari pikel ketimun dan acar dapat dilihat pada Gambar 1.
39
Isolasi bakteri asam laktat
Purifikasi
uji katalase
----~.~)
Katalase positif
Katalase negatif
Pewarnaan gram
~
Gram negatif
Gram positif
Bakteri asam laktat
Uji biokimia: - produksi CO 2 dari glukosa - produksi amonia dari arginin - produksi dekstran dari sukrosa - pertumbuhan pad a suhu berbeda - pertumbuhan pada 6.5% NaCl - reaksi pada Litmus Milk Gambar 1. Isolasi dan identifikasi bakteri asam laktat dari pikel ketimun dan acar
40
2.
SELEKSI ISOLAT BAKTERI ASAM LAKTAT
Seleksi isolat bakteri asam laktat
berdasarkan
kemampuannya dalam menghambat pertumbuhan mikroba pembusuk dan patogen dengan uji
difus~
dilakukan oleh Garriga et al.
sumur seperti yang
(1993) dengan beberapa
modifikasi. Ke
dalam
0.2 % bakteri selama sehari
medium
agar
steril diinokulasikan
indikator yang (suhu
37°C).
telah
Setelah
diinkubasi
membeku
dibuat
lubang/sumur pada medium agar tersebut dan dispotkan sebanyak 50 Ml kultur bakteri asam Iaktat yang telah diinkubasi selama 2 bari pada suhu 37°C. Sebagai kontrol dispotkan MRS broth yang belum diinokulasi ke dalam sumur.
Setelah diinkubasi selama 2 hari
areal penghambatan yang terbentuk diukur.
(37°C),
Areal peng-
hambatan berupa areal bening di tepi lubang/sumur sampai tepi dimana terjadi pertumbuhan bakteri penguji, dinyatakan dalam mm. sisi,
kemudian
Pengukuran dilakukan di beberapa
dirata-ratakan.
Uji ini dilakukan
sebanyak 2-3 ulangan. 3.
IDENTIFlKASI SENYAWA ANTIMIKROBA
a.
Uji Bakteriosin
Untuk melihat kemampuan isolat bakteri asam laktat dalam memproduksi bakteriosin digunakan uji
41
difusi sumur seperti yang dilakukan oleh Garriga et al.
(1993) dengan beberapa modifikasi.
Kultur bakteri asam laktat setelah diinkubasi selama 2 hari, dinetralkan dengan memakai NaOH 0,1 N hingga mencapai pH 7,0.
Urituk memisahkan sel,
kultur yang telah dinetralkan disaring dengan memakai kertas millipor berukuran steril 0,22 Mm. Tahap selanjutnya sarna dengan metode di atas,
ke-
cuali yang dispotkan ke dalam sumur adalah filtrat kultur bakteri asam Iaktat dan sebagai bakteri indikator digunakan P. fluorescens dan Alcaligenes sp .. b.
Kemampuan memproduksi asam Untuk menentukan kemampuan
bakteri
asam
laktat dalam memproduksi asam, digunakan medium sintetik asam Iaktat yang dibuat berdasarkan Buchta (1983) dalam Wirjantaro (1993), yang terdiri dari 50 gil glukosa, 0.05% MgS0 4 , 0.05% KCI,
0.4% urea,
0.1% K2 HP0 4 ,
0.001% FeS0 4 .7H 2 0,
dan
0.05% ekstrak khamir. Dua ose isolat dari MRS-caC0 3 semi padat dipindahkan ke dalam MRS broth.
Setelah inkubasi 2
hari, kultur digunakan sebagai inokulum untuk produksi asam. si ke
dalam
SepuIuh
persen inokulum diinokula-
media sintetik asam laktat, kultur
42
diinkubasi dalam inkubator bergoyang pad a
suhu
30°C. Analisa
terhadap
asam
laktat yang terben-
tuk dilakukan setiap hari sampai 4 hari inkubasi. Setiap hari
sejumlah media sintetik asam laktat
yang telah ditumbuhi oleh bakteri asam laktat diambil secara aseptis.
untuk memisahkan sel
bakteri asam laktat dari hasil metabolitnya maka kultur disentrifus.
Filtrat hasil sentrifus yang
akan digunakan untuk analisa asam.
Analisa asam
dilakukan dengan cara titrasi. Sebelum NaOH digunakan untuk penetapan total asam
tertitraii,
dilakukan Filtrat
standarisasi NaOH hasil sentrifus
diencerkan sampai 50 kali, sebanyak 10 ml filtrat diambil untuk dititrasi dengan NaOH 0.01 N dengan indikator fenoftalein 1% 1989).
(Apriyantono et al,
Hasilnya dinyatakan sebagai per sen asam
laktat.
% asam
c.
ml NaOH x N NaOH x 0.09 x 100 ----------------------------- x pengenceran ml sampel
Pengujian Hidrogen Peroksida (price dan Lee, 1969)
Dua ose isolat dari MRS-CaC0 3 semi padat dipindahkan ke dalam MRS broth.
Setelah inkubasi 2
43
hari. kultur digunakan sebagai inokulum untuk produksi hidrogen peroksida.
Sepuluh persen inoku-
lum diinokulasi ke dalam air pepton 1%. Inkubasi dilakukan pada
suhu 37°C.
Ke da1am 5 ml sampel bebas sel bakteri asam laktat, ditambahkan 0.5 ml KI jenuh, 0.5 ml 0.001 M amonium molibdat dalam 1 N asam sulfat, digoyang selama 1 menit, dan dititrasi dengan 0.001 N Natiosulfat sampai warna kuning yang terbentuk hampir hilang.
Sejumlah indikator amilum 1%
ditambahkan ke da1am sampel dan titrasi dilanjutkan sampai warna biru
mendadak
menentukan kon~entrasi H2 0 2 ,
lenyap.
Untuk
digunakan kurva
standar hidrogen peroksida. Sebelum digunakan Na-tiosulfat distandarisasi dengan cara sebagai berikut: ke dalam erlenmeyer ditambahkan 10 ml KI0 3 , .10 ml KI, dan 10 ml HC1. Sampel segera dititrasi dengan Na-tiosulfat sampai warna muda sekali.
Sejumlah 2 ml indikator amilum
ditambahkan ke dalam sampel, titrasi dilanjutkan sampai warna mend adak lenyap. 4.
PENGARUH
WAKTU
KONTAK BAKTERI ASAM LAKTAT DENGAN
BAKTERI PERUSAK DALAM MEDIA EKSTRAK lKAN RUCAH
Untuk menguji kemampuan bakteri asam laktat dalam menekan pertumbuhan mikroba perusak ikan (Alcaligenes
44
sp.
dan
P.
fluorescens)
media ekstrak ikan
dilakukan uji kontak dalam
(Gambar 2).
Media ekstrak ikan
dibuat berdasarkan prosedur Vatana dan Rosario (1983) dalam Olympia et al (1992). blender
Dua belas gram ikan di-
dengan 50 ml air destilata.
memakai kain saring.
Disaring dengan
Ekstrak ikan kemudian ditepatkan
pHnya menjadi 6 dengan HCl 0.1 N.
Untuk kontrol,
ke
dalam media ekstrak ikan hanya ditambahkan bakteri Interval waktu kontak yang digunakan
penguji saja.
adalah 0, 4, 8, dan 24 jam, suhu inkubasi 30°C. Untuk mempermudah pembahasan maka dilakukan analisis data dengan menghitung nilai log (Nc/No), dimana Nc adalah jumlah miKroba pad a waktu c dan No adalah jumlah mikroba tepat setelah inokulasi (0 jam). log
(Nc/No)
Jika
sama dengan nol berarti tidak terjadi
pertumbuhan mikroba, kalau lebih besar dari nol berarti
terjadi pertumbuhan, kalau lebih kecil dari nol
berarti terjadi kematian.
Untuk melihat efek bakteri-
sidal atau bakteristatik nilai log
(Nc/No)
contoh
harus dibandingkan dengan nilai log (Nc/No) kontrol. Jika nilai log
(Nc/No)
nilai log (Nc/No) efek bakterisidal.
contoh berkurang sedangkan
kontrol bertambah berarti terjadi Jika
nilai log
(Nc/No)
kontrol
bertambah dan nilai log (Nc/No) contoh juga bertambah tetapi tidak sebesar pertambahan nilai kontrol berarti terjadi efek bakteristatik.
45
Mikroba penguji
Isolat bakteri asam laktat
1
.j, MRS Broth
Nutrient Broth
37°C, 2 hari
37°C, 2 hari
j pemekatan
pengenceran
(10 9 _10 10
(10 5 -10 6
koloni/ml broth)
koloni/ml broth)
1%
1%
media ekstrak ikan 30°C, 0, 4, 8, 24 jam
1 Analisa -total bakteri asam laktat -total bakteri penguji -total asam dan pH Gambar 2.
Diagram alir uji kontak
46 5.
ANALISIS a.
Total Bakteri Asam Laktat dengan Metode
Hitungan
Cawan secara Agar Tuang (Fardiaz, 1987)
Dari
10- 5 -10- 8 ,
pengenceran
sebanyak
1
ml
ekstrak ikan rucah yang telah diinokulasi dipindahkan ke dalam cawan petri. dimasukkan agar cair
st~ril.
Cawan petri segera
Setelah agar membeku,
digoyang secara mendatar. cawan diinkubasi
Ke dalam cawan petri
pada posisi
terbalik
pada
suhu
30°C selama 2-3 hari. Untuk
menghitung
total
yang dikontakkan dengan P. media agar MRS.
bakteri
asam
fluorescens
laktat
digunakan
Untuk bakteri asam laktat yang
dikontakkan dengan Alcaligenes sp. digunakan media agar
MRS
azida.
yang
telah
ditambah
0.0075%
natrium
Penambahan natrium azida dimaksudkan untuk
menghambat pertumbuhan Alcaligenes sp .. b.
Total Bakteri Penguji dengan Metode
ra
Surface
Co~ony
Count (Miles
~les
and
and
~s
Misra, 1969
dalam Harrigan dan Cance, 1976 ).
Pada
pemupukan dengan metode ini,
agar nu-
trien steril terlebih dahulu dituangkan ke dalam cawan petri dan dibiarkan membeku.
Setelah membe-
ku dengan sempurna, kemudian sebanyak 0.02 ml contoh yang telah diencerkan
(pengenceran 10- 1 -10- 5 )
47
dipipet pada permukaan agar tersebut. dilakukan
Inkubasi
pada. suhu kamar selama sehari.
Jumlah
koloni per cawan yang memenuhi syarat untuk dihitung adalah 20
100 koloni per cawan.
Jumlah
koloni per ml yang sebenarnya didapatkan dengan mengalikan jumlah koloni per cawan dengan faktor 50. c.
Pemupukan dilakukan duplo.
Analisa Total Asam dengan Metode Titrasi (Apriyantone et aI, 1989)
Ke
dalam
destilata.
5
ml
contoh
ditambahkan
15
air
Larutan ini dititrasi dengan NaOH 0,01
N, indikator fenolftalein 1 %.
Sebelum digunakan,
NaOH distandarisasi dengan (COOH)2.2H20.
Hasilnya
dinyatakan sebagai persen asam laktat. 4.
Pengukuran Nilai pH (Apriyantono et aI, 1989).
Sebelum digunakan pH-meter dinyalakan terlebih dahulu selama 15-30 menit. dibilas
dengan
air
dengan kertas tissue.
Elektroda kemudian
destilata
dan
dikeringkan
Setelah itu elektroda dice-
lupkan ke dalam media ekstrak ikan, pengukuran pH diset.
Elektroda dibiarkan tercelup beberapa saat
sampai diperoleh pembacaan yang stabil. pengukuran sampel,
Sebelum
pH-meter distandarisasi dengan
buffer fosfat pH 7.
Langkah-langkah yang harus
dilakukan dalam standarisasi pH-meter sarna dengan
48
cara pengukuran sampel, hanya saja setelah pembacaan pH yang stabil,
tombol kalibrasi disesuaikan
sampai diperoleh angka pH yang sesuai dengan pH buffer.
