21
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan dari bulan Agustus sampai dengan September tahun 2008. Tempat penelitian di Laboratorium Bagian Kesehatan Masyarakat Veteriner (KESMAVET) Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner (IPHK) Fakultas Kedokteran Hewan (FKH), Institut Pertanian Bogor (IPB).
Bahan dan Alat Penelitian Susu UHT Impor Bahan penelitian yang digunakan adalah susu UHT impor yang melewati Balai Besar Karantina Pertanian Soekarno Hatta, berjumlah 30 sampel untuk keseluruhan penelitian.
Bahan Media dan Reagen Plate Count Agar (PCA/Oxoid CM 325), Mannitol egg Yolk Polymixin (MYP/Oxoid CM 0929), Buffer Pepton Water (BPW/Oxoid CM 509) 0.1%, spora B. stearothermophyllus var. Calidolactis (koleksi Lab Bagian Kesmavet, FKHIPB), Biakan B. cereus ATCC (13061), Trypticase soy broth (Bacto), Polymyxin B solutions, ammoniumsulfat (NH4)2 SO4 (Merck 1.01216), Media VogesProskauer (MR-VP CM43), agar darah (darah domba 5-7%), Yeast Extract (Bacto), Nutrient Agar (Merck), dan Media semi solid (SIM /Oxoid CM 435), Kultur Yoghurt (S. Thermophilus) (koleksi Lab Bagian Kesmavet, FKH-IPB).
Alat Alat yang digunakan antara lain pipet volumetrik (1, 5, 10, 25 ml), cawan petri (berdiameter 100 mm, tinggi 15 mm), tabung reaksi, labu Erlenmeyer (ukuran 50-100 ml), Osè, inkubator (30 0C ± 2 0C, 35 0C ± 2 0C, 37 0C ± 1 0C), autoklaf, lemari steril, pembakar bunsen, penangas air, pengocok mekanis/tube sheaker, rak tabung reaksi, timbangan elektronik, spreader dari batang gelas/logam bengkok (hockey stick/spatel), Mikroskop, Anaerobic jar, BBL
22
GasPack, cakram steril, cakram berisi antibiotika (penicilline, tetracycline, sulfa), pinset, Quebec Colony Counter.
Metode Penelitian Penelitian dilakukan dengan pengujian susu UHT terhadap status mikrobiologi menggunakan pengujian Total Plate Count, B. cereus, uji residu antibiotik, dan kesempurnaan proses UHT. Sumber metode pengujian mengacu kepada Metode Pengujian Susu Segar, Standar Nasional Indonesia SNI 01-27821998 (SNI 1998) serta Bacteriological Analytical Manual, US Food and Drug Administration
(Bergey
1994).
Metode
kesempurnaan
proses
sterilisasi
menggunakan Aschaffenburg test (Wiesner 1985 dan Lukman et al. 2008).
Penentuan Angka Lempeng Total (Total Plate Count) Metode Pengujian Pengujian cemaran mikroba dalam susu segar bertujuan sebagai indikator sanitasi dalam proses produksi atau penanganan susu serta sebagai indikator kesehatan dan keamanan susu. Berbagai macam uji mikrobiologi dapat dilakukan, meliputi uji kuantitatif mikroba untuk menentukan kualitas, uji kualitatif bakteri patogen untuk menentukan tingkat keamanannya, serta uji bakteri indikator untuk menentukan tingkat sanitasi susu tersebut. Uji Total Plate Count ini dilakukan sebagai Standar metode pengujian kuantitatif. Angka lempeng total (Total Plate Count) dimaksudkan untuk menunjukkan jumlah mikroorganisme yang terdapat dalam susu dengan metode hitungan cawan. Jika sel mikroba yang masih hidup ditunjukkan pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop.
Prosedur Pengujian Pemupukan dan Penuangan Media Pada Cawan Siapkan contoh susu secara aseptis. Pengenceran contoh susu secara desimal dilakukan (menjadi pengenceran 1:10, 1:100) mengunakan BPW (0.1%). Letakkan labu erlenmeyer secara berderet dan masing-masing diberi tanda 1:10,
23
1:100, dan 1 (satu) labu erlenmeyer lainnya dengan tanda K (Kontrol). Deretkan pula cawan petri steril di depan labu erlenmeyer disesuaikan dengan pengencerannya.
Untuk
meningkatkan
ketepatan
pengujian,
sebaiknya
pemupukan dilakukan secara duplo. Menggunakan pipet steril pindahkan 1 ml contoh susu kedalam cawan petri bertanda 100 (duplo), demikian pula hal yang sama untuk pengenceran 101, 102 dan K (kontrol). Selanjutnya masukan agar PCA ke dalam masing-masing cawan petri (8 cawan untuk setiap contoh), homogenkan dan di inkubasi pada suhu 35 0C selama 24-48 jam. Setelah 24 jam dilakukan penghitungan koloni dari setiap cawan. Hal yang sama dilakukan setelah inkubasi 48 jam. Jumlah koloni per ml susu dihitung dengan mengalikan jumlah rata-rata koloni dari pengenceran yang dipilih dengan kebalikan dari faktor pengenceran. Jumlah koloni yang diperoleh dinyatakan dengan Colony Forming Units (CFU) per ml.
Pengujian Bakteri B. cereus Prosedur Pengujian Lakukan pengenceran 10-1 dengan cara memindahkan 10 ml sampel ke dalam 90 ml BPW 0,1%. Selanjutnya 0.1 ml sampel (100, 10-1) di inokulasikan kedalam cawan petri yang berisi media MYP dan disebarluaskan ke permukaan agar menggunakan spreader/spatel. Inkubasikan plat agar MYP selama 24 jam pada suhu 30 0C dan lakukan pengamatan terhadap timbulnya zona presipitasi pada koloni berwarna merah muda, yang mengindikasikan terjadi produksi lecithinase oleh koloni B. cereus. Jika reaksi belum jelas, inkubasikan kembali selama 24 jam sebelum dilakukan penghitungan koloni. Pilih plat yang berisi 15-150 koloni penghasil lecithinase yang berwarna merah muda, tandai dengan marker hitam. Metode ini disebut sebagai presumptive plate count of B. cereus. Selanjutnya lakukan uji konfirmasi B. cereus
Uji Konfirmasi B. cereus Ambil minimal 5 koloni lecithinase positif yang berwarna merah muda dari setiap plat agar MYP dan pindahkan ke agar nutrient. Inkubasikan agar nutrient selama 24 jam pada suhu 30 0C. Menggunakan pewarnaan Gram, buat preparat
24
dari koloni yang tumbuh di agar nutrient. B cereus akan tampak sebagai batang besar yang saling berhubungan membentuk untaian rantai pendek sampai panjang, dan termasuk gram positif. Spora akan tampak berbentuk ellips dan terletak di pusat atau di tepi. Pindahkan 1 osè (3 mm) kultur dari agar nutrien ke tabung reaksi (13x100 mm) yang berisi 0.5 ml BPW 0.1% dan dikocok dengan vortex mixer. Pengujian selanjutnya dilakukan dengan menginokulasikan suspensi ke dalam phenol red glucose broth untuk uji glukose anaerob, Modified Voges Proskauer medium (MVP), menggoreskan ke media agar darah (darah domba 5-7%) dan uji motilitas menggunakan media SIM.
Pengujian Residu Antibiotik Yoghurt Test Prosedur Pengujian Masukkan 10 ml sampel susu UHT ke dalam tabung reaksi steril. Panaskan sampel susu UHT tersebut pada suhu 85 0C selama 5 menit. Dinginkan sampel susu sampai mencapai suhu 45 0C kemudian tambahkan 1 ml starter yoghurt dan diamkan selama 3-4 jam pada suhu 42 0C-45 0C. Cara penilaian sebagai berikut, apabila konsistensi susu menjadi kental berarti sampel susu tidak mengandung antibiotik. Sebaliknya bila konsistensi tetap encer, berarti sampel susu mengandung antibiotik.
Blaettchen Test (Nach Kundrat) Prosedur Pengujian Buat media uji dengan cara mencampurkan 200 ml agar nutrien dengan 1 ampul spora Bacillus stearothermophillus var calidolactis. Tuangkan media yang telah disiapkan ke dalam petridis steril, biarkan sampai media membeku. Menggunakan pinset (steril) ambil cakram steril, dan celupkan dalam sampel susu (20-30 detik) kemudian letakkan dalam media uji. Letakkan cakram berisi antibiotika dengan konsentrasi tertentu sebagai kontrol positif dan letakan juga satu cakram steril (tanpa dicelupkan dalam sampel) sebagai kontrol negatif. Masukkan ke dalam inkubator 57 -62 0C selama 20-24 jam. Amati zona terang
25
sekitar cakram serta bandingkan dengan kontrol positif yang berisi penicillin, tetrasiklin, preparat sulfa, juga dibandingkan dengan kontrol negatif.
Pengujian kesempurnaan proses UHT (Aschaffenburg test) Prosedur Pengujian Sebanyak 20 ml sampel susu UHT dalam tabung reaksi ditambahkan 4 gram amonium sulfat jenuh (NH4O2 SO4) dan dikocok. Kemudian campuran tersebut disaring ke dalam tabung reaksi dan filtratnya dimasukkan dalam penangas air (mendidih) selama lima menit. Filtrat yang menunjukkan kekeruhan di masukan dalam kelompok Susu UHT, sedangkan filtrat yang jernih dimasukan dalam kelompok susu steril.
ANALISIS DATA Analisis data yang digunakan dalam penelitian ini adalah analisis deskripsi dengan menyajikan dalam bentuk tabel dan gambar. Statistik deskripsi adalah bidang statistik yang membicarakan cara atau metode mengumpulkan, menyederhanakan dan menyajikan data sehingga dapat memberikan informasi. (Mattjik dan Sumertajaya 2002).
