BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikologi, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, dan Laboratorium Mikrobiologi dan Kesehatan Tanah, Balai Penelitian Tanah, Cimanggu. Penelitian ini dilakukan pada bulan September 2010 sampai Januari 2011. Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan adalah tomat varietas San Marino, asam humat, kompos, dan tanah yang terinfeksi Fusarium sp.. Bahan penunjang yang digunakan adalah PDA (Potato Dextrose Agar), NA (Nutrien Agar), NB (Nutrien Broth), NaCl, aquades, dan alkohol 70%. Isolat murni yang digunakan adalah Fusarium sp., bakteri 5 (B5), bakteri 9 (B9), bakteri 13 (B13), bakteri 15 (B15), bakteri X1 (BX1), dan bakteri X2 (BX2) (Koleksi Surono, SP). Alat yang digunakan adalah cawan petri, tabung reaksi, gelas ukur, pipet mikrometer, plastik, shaker, laminar air flow, vortek, sentrifugasi, timbangan, plastik perekat, polybag (3 cm x 5 cm), penggaris, mikroskop medan terang, dan labu erlenmeyer. Metode Penelitian Penyediaan Isolat Fusarium sp. dan Bakteri Aktivator Survei dilakukan untuk menentukan lahan dan tanaman tomat terinfeksi Fusarium sp. penyebab rebah kecambah. Tanaman tomat yang terinfeksi penyakit rebah kecambah digunakan sebagai sumber isolat patogen, sedangkan tanah yang terinfestasi alami oleh Fusarium sp. digunakan sebagai uji media tanam. Survei dilakukan di Kampung Pasir Cina, Kecamatan Pacet, Kabupaten Cianjur. Bagian tanaman yang diduga terinfeksi oleh Fusarium sp. dipotong dan dicuci dengan alkohol 70%, kemudian dicuci dengan menggunakan aquades selama 1 menit dan dikering-anginkan. Selanjutnya, bagian tanaman tersebut diinkubasi pada suhu ruang selama 5-7 hari. Tanah dari tanaman yang terinfeksi Fusarium sp. digunakan sebagai uji media tanam.
8 Isolat bakteri murni diperoleh dari Laboratorium Kelompok Peneliti Biologi dan Kesehatan Tanah, Balai Penelitian Tanah, Cimanggu. Isolat bakteri terdiri dari enam bakteri dengan karakter dan sifat yang berbeda, yaitu B5, B9, B13, B15, BX1, dan BX2. Bakteri aktivator dibiakkan pada media NB. Selanjutnya, suspensi bakteri diambil sebanyak 1 ml dengan pipet mikrometer, dan diencerkan berseri hingga 10-7. Suspensi 10-7 diambil sebanyak 0,1 ml dan ditumbuhkan pada NA hingga bakteri mempunyai kepadatan 108 cfu/ml. Pembuatan Media NA dengan Penambahan Asam Humat Asam humat yang digunakan sebagai campuran media NA berbentuk larutan. Konsentrasi media yang akan dibuat antara lain, 0,1%, 0,2%, dan 0,5%. Pembuatan larutan asam humat dengan konsentrasi 10%, yaitu 1 g asam humat ditumbuk halus, dilarutkan dengan aquades dalam gelas ukur hingga 10 ml. Pembuatan media NA asam humat untuk konsentrasi 0,1%, yaitu larutan asam humat yang berkonsentrasi 10% diambil dengan pipet mikrometer sebanyak 1 ml dan ditambahkan media NA dalam gelas ukur hingga 100 ml. Pembuatan media 0,2%, larutan asam humat diambil sebanyak 2 ml, kemudian ditambahkan NA hingga 100 ml. Pembuatan media 0,5%, larutan asam humat diambil sebanyak 5 ml, kemudian ditambahkan NA hingga 100 ml. Pengujian Patogenisitas Bakteri Aktivator Pengujian patogenesitas bakteri aktivator dilakukan pada daun tembakau (Suwanto 1996). Biakan bakteri aktivator pada NB disuntikkan ke daun tembakau sebanyak 1 ml. Bakteri yang mempunyai sifat patogenesitas akan menimbulkan gejala nekrosis pada daun tembakau. Pengamatan uji patogenisitas dilakukan 16 sampai 24 jam setelah inokulasi. Pengujian Kemampuan Tumbuh Bakteri Aktivator Terhadap Asam Humat Pengujian menggunakan media NA asam humat, B5, B9, B13, B15, BX1, dan BX2. Konsentrasi asam humat yang digunakan 0,1% (AS01), 0,2% (AS02), 0,5% (AS05), dan kontrol (tanpa asam humat). Setiap perlakuan diulang sebanyak tujuh kali. Pengujian menggunakan metode pengenceran bertingkat (Suciamith 2006) hingga 10-7. Pada 10-7, masing-masing suspensi bakteri diinokulasi
9 sebanyak 0,1 ml dengan pipet mikrometer dan disebar menggunakan spatula pada media NA (kontrol) dan NA dengan penambahan asam humat (perlakuan), dilakukan di laminar air flow. Parameter yang diamati yakni jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada 12 jam, 24 jam, 36 jam, dan 48 jam setelah inokulasi. Populasi koloni bakteri ditentukan dengan rumus (Hadioetomo 1999): Populasi Bakteri = Keterangan:
x pxv x : jumlah koloni yang tumbuh faktor pengenceran ke- (cfu) p : faktor pengenceran kev : volume suspensi yang disebar pada cawan (ml)
Pengujian Serangan Rebah Kecambah dan Pertumbuhan Bibit Tomat Perlakuan dilakukan pada media kombinasi antara kompos, asam humat, dan bakteri aktivator. Kombinasi pengujian tertera pada Tabel 1. Pengujian menggunakan bakteri aktivator dan asam humat dengan konsentrasi yang terbaik pada pengujian sebelumnya. Media perlakuan merupakan pencampuran antara kompos dan tanah yang terinfeksi Fusarium sp. secara alami dengan perbandingan 2 : 1. Media tersebut dimasukkan ke dalam polybag sebanyak 100 gram/polybag. Biakan bakteri aktivator pada NB diambil sebanyak 5 ml, dan dicampurkan dengan media perlakuan. Selanjutnya, media tersebut diinkubasi selama 1 minggu. Pengujian dilakukan dengan 5 ulangan, tiap ulangan diulang sebanyak 10 kali, setiap polybag berisi 3 bibit tomat. Pengamatan dilakukan pada 7 sampai 14 hari setelah tanam (HST). Tabel 1 Kombinasi perlakuan pada media tumbuh Percobaan Perlakuan yang dilakukan TIAx Tanah tanpa perlakuan (kontrol negatif) TIAy
Tanah yang disterilisasi (kontrol positif)
TIA1
Tanah + kompos
TIA2
Tanah + kompos + asam humat
TIA3
Tanah + kompos + bakteri aktivator
TIA4
Tanah + kompos + asam humat + bakteri aktivator
Keterangan: TIA: Tanah yang terinfestasi Fusarium sp. secara alami.
10 Peubah yang Diamati Pengamatan dilakukan pada 7 sampai 14 HST. Peubah yang diamati antara lain, kejadian penyakit, potensi tumbuh maksimum (PTM), daya berkecambah (DB), tinggi tanaman, jumlah daun, dan panjang akar. Kejadian Penyakit Kejadian penyakit merupakan perbandingan tanaman yang terserang penyakit dengan tanaman yang ditanam. Kejadian penyakit ditentukan dengan rumus (Saylendra 2007): Kejadian Penyakit = tanaman yang terserang penyakit x 100% tanaman yang ditanam Potensi Tumbuh Maksimum (PTM) Potensi tumbuh maksimum merupakan perbandingan persentasi tanaman yang berkecambah dengan tanaman yang ditanam. PTM ditentukan dengan rumus: PTM = benih yang berkecambah benih yang ditanam
x 100%
Daya Berkecambah (DB) Daya berkecambah merupakan persentasi tanaman yang berkecambah secara normal dengan tanaman yang ditanam. Daya berkecambah ditentukan dengan rumus (Hardi dan Burhan 2008): DB =
benih berkecambah normal benih yang ditanam
x 100%
Analisis Mikroba Tanah Analisis populasi mikroba dilakukan pada media tumbuh sebelum tanam dan sesudah perlakuan. Setiap sampel tanah diambil sebanyak 10 g, kemudian ditambahkan dengan larutan NaCl (8,5 gram/liter) sebanyak 90 ml dalam erlemenyer. Suspensi tanah dihomogenkan dengan shaker (150 rpm selama 30 menit). Pengenceran dilakukan hingga 10-6. Pada pengenceran 10-4, suspensi diambil 0,1 ml dengan pipet mikrometer, disebar pada media PDA dengan 3 ulangan dan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 sampai 7 hari. Pengenceran 10-6 diambil sebanyak 0,1 ml, ditumbuhkan pada media NA dengan 3 ulangan dan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 sampai 7 hari, dilakukan di laminar air flow.
11 Parameter yang diamati yaitu jumlah koloni dan keanekaragaman populasi mikroba. Populasi koloni bakteri ditentukan menggunakan rumus sebagai berikut: Populasi Total = Koloni mikroba yang tumbuh dengan pengenceran- (cfu) Faktor pengenceran ke- x Volume yang disebarkan (ml) Rancangan Percobaan Perlakuan penelitian menggunakan rancangan acak faktorial dan acak lengkap (RAL). Data penelitian ditabulasi dengan program Microsoft Office Excel 2007 dan SAS 6.12, beda nyata yang digunakan dalam uji Selang Berganda Duncan pada taraf α = 5%.
