BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, rumah kaca Kebun Percobaan Cikabayan, University Farm, Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Virologi Tumbuhan Balai Penelitian Tanaman Hias (Balithi) Segunung, Cianjur dari bulan Maret sampai September 2011.
Lokasi Pengambilan Sampel Tanaman Sakit Sampel daun tanaman sakit famili Cucurbitaceae yaitu mentimun (Cucumis sativus) diambil dari Desa Situ Gede Kecamatan Darmaga, oyong (Luffa acutangula) dari Desa Petir Cibereum Kecamatan Darmaga, melon (Cucumis melo) dari Taman Buah Mekarsari Amazing Tourism Park Jalan Raya CileungsiJonggol, zucchini (Cucurbita pepo) dan labu siam (Sechium edule) dari Balai Penelitian Tanaman Sayuran-Litbang Pertanian (Balitsa) Lembang Bandung, serta kabocha (Cucurbita maxima) dari Desa Cibedug Lembang Bandung.
Deteksi Virus dengan Indirect-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (I-ELISA) Metode I-ELISA dilakukan menurut Dijkstra & de Jager (1998). Antigen disiapkan dengan menggerus sampel daun yang diberi GEB (general extract buffer/polyvinylpyrrolidone 20 g, chicken egg albumin 2 g, Na2SO3 1.3 g, yang dilarutkan dalam 100 ml PBST) pH 7.4
dengan perbandingan 1:10 (b/v).
Sumuran pelat mikrotiter diisi dengan 100 µl bufer ekstrak, kontrol negatif, kontrol positif, dan sap sampel daun yang dibuat duplo.
Kontrol negatif
merupakan sap tanaman Cucurbitaceae sehat sedangkan kontrol positif merupakan sap tanaman Cucurbitaceae yang terinfeksi oleh virus yang sesuai (Agdia, USA). Pelat mikrotiter kemudian diinkubasi pada suhu 4 °C selama satu malam. Selanjutnya suspensi pada pelat mikrotiter dibuang dan pelat dicuci menggunakan PBST (phosphate buffer saline tween/NaCl 8 g, Na2HPO4 1.15 g, KH2PO4 0.2 g, KCl 0.2 g, air destilata 1 000 ml + Tween 20 0.5 ml) sebanyak 4-8 kali.
18 Setelah dicuci, protein yang terikat pada sumur pelat mikrotiter diblok dengan menambahkan 100 µl blocking solution (PBST yang mengandung susu skim 2%). Pelat mikrotiter kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 30 menit. Pelat mikrotiter kemudian dicuci menggunakan PBST sebanyak 4-8 kali. Antiserum (As) dari masing-masing virus kemudian dimasukkan sebanyak 100 µl ke masing-masing sumuran sesuai peta yang telah dibuat. Antiserum dimasukkan setelah dilakukan pengenceran dengan bufer konjugat (bovine serum albumin 0.2 g, polyvinylpyrrolidone 2 g, PBST 100 ml) sesuai perbandingan yang tertera pada kemasan antiserum.
Antiserum yang digunakan yaitu As CMV
(1:200), As SqMV (1:200), As TRSV (1:1 000), As WMV (1:200), dan As ZYMV (1:1 000) (Agdia, USA). Pelat mikrotiter kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 2 jam. Pelat mikrotiter selanjutnya dicuci menggunakan PBST seperti sebelumnya. Antiserum kedua (goat anti-rabbit globulin/GAR, Sigma, USA) kemudian dimasukkan pada sumuran sebanyak 100 µl setelah dilakukan pengenceran menggunakan bufer konjugat dengan perbandingan 1:5 000.
Pelat mikrotiter
kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 2 jam. Pelat mikrotiter kemudian dicuci menggunakan PBST sebanyak 4-8 kali. Keberadaan virus dideteksi dengan memasukkan 100 µl substrat solution (p-Nitrophenyl Phospate 5 mg dalam bufer substrat 5 ml/MgCl2 0.1 g, NaN3 0.2 g, dietholamine 97 ml, air destilata 1 000 ml) ke dalam sumuran pelat mikrotiter. Pelat mikrotiter tersebut kemudian diinkubasi dalam ruang gelap pada suhu ruang selama 30 menit sampai 60 menit.
Nilai absorbansi pelat mikrotiter dibaca
menggunakan ELISA reader model 550 (Bio-Rad, USA) pada panjang gelombang 405 nm pada 30 menit dan 60 menit setelah penambahan substrat solution. Sampel dinyatakan positif jika nilai absorbansi sampel 1.5-2 kali lebih besar dari nilai kontrol negatif.
Pengujian Benih Benih yang diuji terdiri dari beberapa jenis tanaman Cucurbitaceae, yaitu benih mentimun, oyong, melon, semangka, zucchini, dan kabocha. Benih yang
19 diuji merupakan benih yang diproduksi oleh berbagai produsen benih di Indonesia maupun luar negeri dan umum digunakan oleh para petani. Benih mentimun varietas Penus diproduksi oleh PT. East West Seed Indonesia Purwakarta, benih oyong hibrida Jaka F1 cap Mutiara Bumi diproduksi oleh PT. Prabu Agro Mandiri Purwakarta, benih melon F1 Hybrid Emerald Jewel diproduksi oleh Sakata Seed Corporation Yokohama Jepang, benih semangka Hybrid F1 SW-144 diprodukasi oleh Chung-Shin Seed Co. LTD Taiwan dengan PT. Winon Intercontinental Jakarta Indonesia sebagai distributor, benih zucchini F1 Hibrida Jacky Z-6 diproduksi dan diedarkan oleh PT. Agrosid Manunggal Sentosa Jakarta Utara, dan benih kabocha F1 Hybrid Pumpkin Golden Mama yang didistribusikan oleh PT. Tanindo Subur Prima Surabaya.
Benih kabocha merupakan benih yang
berasal dari Bangkok Thailand. Jumlah benih yang diuji adalah 15 benih dari masing-masing tanaman. Benih tersebut ditumbuhkan pada media tanah steril yang mengandung kompos dengan perbandingan 1:1. Benih ditanam hingga muncul kotiledon dan daun pertama. Keberadaan virus selanjutnya diuji menggunakan metode I-ELISA dari daun pertama yang telah muncul. Pengujian dilakukan menggunakan dua jenis antiserum yaitu As SqMV dan As ZYMV. Hal ini untuk mengetahui persentase SqMV dan ZYMV terbawa benih maka dilakukan uji terhadap kedua virus tersebut. Bibit-bibit yang telah dideteksi dan positif terinfeksi oleh SqMV atau ZYMV kemudian di pindahkan ke rumah kaca di Kebun Percobaan Cikabayan untuk dipelihara dan diamati gejala yang muncul selama pertumbuhan tanaman. Tanaman tersebut dipelihara sampai menghasilkan buah dan diamati bentuk buah serta persentase virus yang terbawa biji setelah dilakukan penanaman satu kali. Biji dari tanaman yang positif terinfeksi oleh SqMV atau ZYMV kemudian ditumbuhkan dan dideteksi keberadaan virusnya menggunakan metode I-ELISA.
Pemurnian Virus Pemurnian virus SqMV dilakukan berdasarkan gabungan metode yang dilakukan oleh van Kammen & de Jager (1978) serta Lastra & Munz (1969) dengan sedikit modifikasi.
20 Perbanyakan Inokulum SqMV Perbanyakan inokulum SqMV dilakukan pada tanaman mentimun varietas Penus menurut Dijkstra & de Jager (1998). Inokulum virus yang digunakan untuk perbanyakan berasal dari tanaman kabocha varietas Golden Mama yang berasal dari Lembang Bandung yang terinfeksi tunggal oleh SqMV. Inokulasi dilakukan pada kotiledon tanaman mentimun yang berumur 4-5 hari setelah tanam (HST) sebelum daun pertama muncul pada pagi hari atau sore hari. Daun sumber inokulum SqMV digerus dengan menambahkan 0.1 M bufer fosfat pH 7.0 (1 M K2HPO4 61.5 ml dan 1 M KH2PO4 38.5 ml dilarutkan dalam air destilata 900 ml) dengan perbandingan 1:10 (b/v) dan 2-mercapto ethanol (1% dari bufer yang digunakan).
Kotiledon yang akan diinokulasi
ditaburi karborundum untuk melukai jaringan tanaman. Setelah itu, kotiledon diolesi dengan sap tanaman yang mengandung virus.
Selanjutnya kotiledon
tersebut dicuci dengan cara mengalirkan aquades di atas kotiledon. Tanaman ditunggu sampai muncul daun pertama ± 7 hari setelah inokulasi dan menunjukkan gejala kemudian daunnya dipanen.
Tanaman ditunggu kembali
hingga daun kedua atau ketiga muncul ± 5 hari setelah pemanenan daun pertama dan menunjukkan gejala kemudian daunnya dipanen kembali. Daun yang telah dipanen tersebut kemudian ditimbang, disiram dengan nitrogen cair kemudian disimpan dalam almari pendingin bersuhu -80 °C. Daun yang sudah dipanen dikumpulkan hingga mencapai 200-300 g.
Pemurnian SqMV Daun yang dipanen dihomogenisasikan dengan blender dalam 0.1 M bufer fosfat pH 7.0 sebanyak dua kali berat daun.
Hasil homogenisasi diperas
menggunakan dua lembar Miracloth dan hasil perasan disentrifugasi pada 15 000 g selama 20 menit. Supernatan kemudian diambil dan ditambahkan 0.7 volume campuran chloroform dan n-butanol (1:1). Campuran supernatan tersebut kemudian diaduk selama 1 menit menggunakan pengaduk magnetik. Campuran supernatan tersebut kemudian disentrifugasi menggunakan “Sorvall Dupont Instrument RC-5 Superspeed Refrigerated Centrifuge” pada kecepatan rendah (5 000 g) selama 10 menit, kemudian bagian cairan yang jernih
21 dipindahkan dan virus diendapkan dengan menambahkan polyethylene glycol 6000 (PEG) menjadi 4% dan NaCl menjadi 0.2 M dan kemudian diaduk menggunakan pengaduk magnetik selama 60 menit pada suhu ruang. Campuran tersebut kemudian disentrifugasi pada 15 000 g selama 15 menit dan endapannya disuspensikan dengan 0.1 M bufer fosfat (0.25 ml/g daun terinfeksi).
Hasil
suspensi tersebut disentrifugasi pada 27 000 g selama 15 menit dan supernatan yang mengandung virus kemudian diambil.
Supernatan tersebut kemudian
disentrifugasi pada 80 000 g selama 90 menit menggunakan “Beckman Coulter Optima™ LE-80K Ultracentrifuge”.
Supernatan dibuang dan pelet yang
dihasilkan pada tiap tabung diresuspensi dengan 0.01 M bufer fosfat 1 ml pada tiap tabung.
Resuspensi pelet dilakukan dengan mendiamkan tabung selama
semalam pada suhu 4 °C.
Pelet pada masing-masing tabung yang telah
diresuspensi kemudian di-vortex dan dijadikan satu kemudian di-vortex kembali. Hasil resuspensi tersebut kemudian disentrifugasi pada 5 000 g selama 10 menit. Supernatan kemudian diambil dan ditambahkan 0.01 M bufer fosfat hingga volumenya menjadi 10 ml. Campuran tersebut kemudian disentrifugasi kembali pada 80 000 g selama 90 menit. Pelet pada tabung kemudian diberi 0.01 M bufer fosfat 0.5 ml. Hasil pemurnian diendapkan kembali dengan menambahkan polyethylene glycol 6000 (PEG) menjadi 4% dan NaCl menjadi 0.2 M. Campuran tersebut digoyang selama 120 menit pada suhu ruang. Setelah itu, campuran tersebut disentrifugasi pada 15 000 g selama 15 menit.
Pelet kemudian diresuspensi
dengan 0.01 M bufer fosfat 0.1 ml diikuti sentrifugasi pada 14 000 rpm selama 15 menit.
Western Blotting Western blot dilakukan menurut metode Dijkstra & de Jager (1998) yang bertujuan untuk mendeteksi partikel virus dan menentukan massa molekul virus.
22 Analisis Protein dengan Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) Analisis protein dilakukan terhadap SqMV hasil pemurnian, SqMV dari daun tanaman sakit sebagai kontrol positif, dan daun tanaman sehat sebagai kontrol negatif. Ekstraksi protein tanaman dilakukan dengan menggerus sampel daun menggunakan lumpang porselen dan dengan menambahkan bufer fosfat perbandingan 1:4 (b/v). Sampel yang telah halus kemudian disentrifugasi pada 12 000 rpm selama 10 menit. Supernatan kemudian diambil, ditambahkan bufer sampel (Sigma, USA/0.125 M Tris-HCl pH 6.8, 20% glycerol, 4 % SDS, 10% 2-mercapto ethanol, 0.004% bromophenol blue 0.2 ml) dengan perbandingan 1:1 (v/v) kemudian dipanaskan pada suhu 95 °C selama 10 menit. Gel dibuat dua buah yaitu yang satu untuk diwarnai dengan Coomassie blue dan yang satu untuk Analisis Western Blot. Analisis protein dengan SDS-PAGE membutuhkan dua jenis gel, yaitu separating gel dan stacking gel. Separating gel 12.5% (air destilata 6 ml, 1.5 M Tris-HCl pH 8.8 + SDS 0.4% 4.5 ml, acrylamide/bis 7.5 ml, ammonium persulfat 10% 120 µl [selalu baru], TEMED 12 µl) dimasukkan ke dalam cetakan gel hingga tiga perempat bagian cetakan. Kemudian air destilata ditambahkan sampai penuh ke dalam cetakan untuk menghilangkan gelembung udara dan gel dibiarkan sampai polimerasi. Stacking gel (air destilata 1.8 ml, 0.5 M Tris-HCl pH 6.8 + SDS 0.4% 0.75 ml, acrylamide/bis 0.45 ml, ammonium persulfat 10% [selalu baru] 30 µl, TEMED 3.75 µl) yang telah dibuat kemudian dimasukkan ke dalam cetakan yang telah berisi separating gel yang telah polimerasi. Sisir (comb) kemudian dipasang di atas stacking gel dan dilepas setelah gel polimerasi. Gel yang telah siap kemudian dipasang pada alat elektroforesis “MiniVE Vertical Electrophoresis System” (Hoefer®, USA). Marker (Fermentas, USA), virus murni, dan sampel protein tanaman yang telah dipanaskan masing-masing sebanyak 20 µl dimasukkan ke dalam sumur-sumur yang terdapat pada gel. Gel kemudian dielektroforesis pada 150 volt selama 2 jam. Gel yang telah dielektroforesis dilepas dari cetakan dan dimasukkan ke dalam wadah yang berisi larutan pewarna Coomassie blue (Coomassie blue R-250 0.5 g dilarutkan dalam larutan fiksasi 500 ml/metanol 400 ml, asam asetat 100 ml,
23 aquades 500 ml).
Gel tersebut kemudian digoyang selama semalam.
Gel
kemudian dicuci dengan larutan pencuci (metanol 200 ml, asam asetat 100 ml, aquades 700 ml) sambil digoyang sampai terlihat pita-pita protein. Setelah pitapita timbul, gel kemudian direndam dalam larutan fiksasi.
Analisis Western Blot Analisis Western blot dilakukan untuk menentukan massa molekul SqMV. Transfer protein dari gel ke membran nitroselulosa dilakukan menggunakan “Mini Trans Blot Ellectrophoretic Transfer Cell Biorad” (Bio-Rad, USA). Sebelum protein ditransfer ke membran, bagian gel yang mengandung marker protein dipotong dan diwarnai dengan Coomassie blue sedangkan gel yang lain direndam dalam bufer transfer selama 5 menit. Gel yang telah direndam dengan bufer transfer kemudian ditandai dengan memotong bagian ujung kiri bawah untuk konfirmasi gel. Membran dipotong sesuai ukuran gel, kemudian direndam dalam metanol absolut selama 15 detik dan selanjutnya dicuci dengan akuades selama 2 menit, lalu direndam dalam bufer transfer selama 5 menit. Kertas Whatman 3MM disiapkan sebanyak 2 lembar yang ukurannya disesuaikan dengan gel. Selain itu, 2 lembar scoth brit pads disiapkan lalu direndam dalam bufer transfer selama 30 detik. Selanjutnya disusun secara berturut-turut scoth brit pads, kertas Whatman 3MM, membran, gel, kertas Whatman 3MM, dan scoth brit pads serta pada lapisan tersebut diusahakan tidak terdapat gelembung udara. Susunan trans blot tersebut kemudian ditempatkan dalam blotting tank yang diberi bio ice cooling dan pengaduk magnetik.
Bufer transfer kemudian
ditambahkan secukupnya. Mesin blotter ditutup dan transfer protein dilakukan pada 100 V selama 1 jam. Membran nitroselulosa selanjutnya diambil dan direndam dalam PBS, lalu diblok dengan blotto solution (PBST yang mengandung susu skim 5%) pada suhu 4 °C selama semalam. Setelah itu membran dicuci sebanyak 5 kali masingmasing 10 menit dengan PBST. Antiserum primer (As SqMV) diencerkan dengan PBST dengan perbandingan 1:500 dan membran direndam dalam antiserum tersebut selama 2 jam. Membran kemudian dicuci sebanyak 5 kali masing-masing 10 menit dengan PBST. Antiserum sekunder (konjugat) diencerkan dengan PBST
24 dengan perbandingan 1:5 000 lalu membran direndam dalam antiserum sekunder (konjugat) selama 2 jam. Membran kemudian dicuci sebanyak 3 kali masingmasing 10 menit dengan PBST. Selanjutnya membran direndam dalam 5-bromo4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) 20 µl dan nitro blue tatrazolium (NBT) 42 µl dalam bufer substrat (Tris 60.5 g, NaCl 29.2 g, MgCl2 5.1 g) pH 9.5. Reaksi yang terjadi diamati dan selanjutnya dihentikan dengan akuades. positif, akan muncul pita berwarna ungu.
Bila reaksi
