SUMBER BELAJAR PENUNJANG PLPG 2017
MATA PELAJARAN/PAKET KEAHLIAN AGRIBISNIS PERBENIHAN DAN KULTUR JARINGAN TANAMAN
BAB IX KULTUR JARINGAN TANAMAN PANGAN DAN HORTIKULTURA
KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN DIREKTORAT JENDERAL GURU DAN TENAGA KEPENDIDIKAN 2017
BAB IX KULTUR JARINGAN TANAMAN PANGAN DAN HORTIKULTURA Kompetensi Inti : Menguasai materi, struktur, konsep, dan pola pikIr keilmuan yang mendukung mata pelajaran yang diampu. Indikator Pencapaian Kompetensi (IPK) : 1. Melakukan sanitasi laboratorium kultur jaringan 2. Menyiapkan alat dan bahan kegiatan kultur jaringan tanaman 3. Membuat media kultur 4. Memodifikasi komposisi media 5. Menyiapkan dan menanam eksplan 6. Subkultur dan pemeliharaan kultur 7. Melakukan aklimatisasi
Uraian Materi Sanitasi dan Teknik Aseptik dalam Kultur JaringanTanaman Salah satu faktor pembatas dalam keberhasilan kultur jaringan adalah kontaminasi yang dapat terjadi pada setiap saat dalam masa kultur. Kontaminasi dapat berasal dari: 1. Eksplan, baik kontaminasi eksternal maupun internal. 2. Organisme kecil yang masuk ke dalam media seperti semut. 3. Botol kultur atau alat-alat tanam yang kurang steril. 4. Lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor (banyaknya spora jamur di udara). 5. Kecerobohan dalam pelaksanaan. Teknik aseptik yang harus diperhatikan meliputi sanitasi lingkungan kerja, sterilisasi alat-alat dan media kultur, dan sterilisasi bahan tanaman. Sanitasi Lingkungan Kerja Lingkungan kerja untuk teknik kultur jaringan dapat dibagi atas lingkungan umum dan lingkungan spesifik. Yang dimaksud dengan lingkungan umum
adalah ruangan 1
transfer secara keseluruhan, sedangkan lingkungan spesifik adalah lingkungan di dalam laminar air flow cabinet (LAF) dimana proses penanaman eksplan dan prosedur lain seperti isolasi eksplan dan subkultur dilakukan. Kebersihan lingkungan umum dipertahankan dengan membatasi orang yang keluar masuk ruangan, serta membersihkan ruangan secara teratur setiap hari dengan menggunakan disinfektan: karbol, lysol atau clorox. Agar kotoran dari luar tidak terbawa masuk ke dalam ruangan, petugas yang masuk ruangan harus memakai alas kaki dan jas laboratorium khusus yang hanya digunakan di dalam ruangan tersebut. Penanaman eksplan dan prosedur lain seperti
isolasi dan sterilisasi eksplan,
dilakukan di dalam LAF atau kotak pindah (transfer box/transfer food). Di dalam LAF terdapat lampu ultra violet untuk mensterilkan permukaan tempat kerja. Di samping lampu ultra violet, LAF ini dapat juga disterilkan dengan menyemprotkan alkohol 70% atau formalin. LAF dilengkapi dengan filter HEPA (High Efficiency Particulate Air) dengan pori-pori <0.3 um dan blower yang mengalirkan udara halus melalui filter kira-kira 100 flow per menit. Aliran udara ini mencegah kontaminan yang airborne masuk ke ruang kerja selama pekerjaan penanaman. Sebelum menggunakan LAF, lampu ultra violet dinyalakan selama ½ - 1 jam untuk mematikan kontaminan yang terdapat di permukaan tempat kerja. Laminar air flow cabinet harus dalam kondisi bersih. Sebelum mulai bekerja, permukaan tempat kerja LAF disemprot dengan alkohol 70% atau dilap dengan kain lap steril yang telah dicelupkan ke dalam alkohol 70%. Selesai bekerja, permukaan tempat kerja dibersihkan dan di lap dengan alkohol 70% atau dengan lampu ultra violet selama ½ - 1 jam.
Strelisasi Alat-Alat dan Media Alat-alat gelas dan diseksi/alat isolasi eksplan serta aquades yang dipakai untuk penanaman, harus dalam keadaan steril, dapat disterilkan dalam autoclave selama satu jam. Alat tanam seperti pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pemanasan dalam bacticinerator atau pembakaran dengan lampu bunsen. Khusus untuk scalpel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan, namun pisaunya (blade) dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam suhu tinggi. Oleh karena itu untuk bladenya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit. 2
Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset, gunting, gagang scalpel, kertas saring, cawan petri/petri dish, botol-botol kosong, jarum suntik untuk isolasi meristem, dan pipet untuk memindahkan suspensi sel. Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal atau ditaruh dalam baki stainless steel dan bakinya dibungkus dengan kain tebal sebelum dimasukkan ke dalam autoclave. Aluminium foil tidak direkomendasikan sebagai pembungkus, karena uap tidak dapat masuk ke dalam bungkusan. Suhu yang digunakan untuk sterilisasi adalah 121° C pada tekanan 17.5 psi (pounds per square inch) selama 1 jam. Penghitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan yang diinginkan tercapai. Autoclave yang dapat digunakan ada bermacam-macam, mulai dari yang sederhana sampai yang programable. Autoclave yang sederhana menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoclave. Pemanasan air dapat menggunakan kompor atau api bunsen (bunsen burner). Pada autoclave sederhana ini, tekanan dan suhu diatur dengan jumlah panas dari api. Kelemahan autoclave ini adalah bahwa perlu penjagaan dan pengaturan panas secara manual selama masa sterilisasi dilakukan. Di samping kelemahannya, penggunaan autoclave ini ada juga keuntungannya, yaitu sederhana, harganya relatif murah, tidak tergantung dari aliran listrik yang sering merupakan problema untuk negara-negara yang sedang berkembang, serta lebih cepat dari autoclave listrik yang seukuran dan setaraf. Autoclave yang lebih komplit menggunakan sumber energi dari listrik. Alatnya dilengkapi dengan timer dan thermostat. Bila pengatur automatik ini berjalan dengan balk, maka autoclave dapat dijalankan sambil mengerjakan pekerjaan lain. Kelemahannya adalah bila salah satu pengatur tidak bekerja, maka pekerjaan persiapan media menjadi sia-sia, dan kemungkinan menyebabkan kerusakan total pada autoclave. Seperti halnya pada autoclave sederhana, autoclave ini juga menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang ada di dalam autoclave. Untuk laboratorium komersial, diperlukan autoclave dengan kapasitas besar dan sumber uap biasanya dari boiler yang terpisah. Autoclave ini sangat cepat dan waktu sterilisasi dan pendinginan dapat diprogram. Setelah sterilisasi bahan atau alat selesai, suhu dan tekanan autoclave diturunkan secara perlahan-lahan dalam waktu 15 – 20 menit. Pada autoclave yang programmable, pengaturan panas berjalan secara automatic, 3
sedangkan pada autoclave yang sederhana pengaturan panas harus dilakukan secara manual. Media dan aquadest juga disterilkan dalam autoclave. Untuk aquadest sebaiknya dimasukkan ke dalam wadah kecil, misalnya Erlenmeyer 250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif. Waktu sterilisasi sama dengan waktu untuk sterilisasi alatalat, yaitu 1 jam pada tekanan 17.5 psi. Untuk media kultur yang tidak mengandung bahan-bahan yang Heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoclave pada suhu 121° c, tekanan antara 15 – 17.5 psi dengan waktu antara 20 - 25 menit tergantung dari volume wadah dan volume media. Untuk 15 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 75 ml, sterilisasi dilakukan pada tekanan 15 psi dengan waktu 20 menit. Volume yang lebih besar membutuhkan tekanan yang lebih tinggi, dengan waktu yang lebih lama. Dalam sterilisasi aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi yang diinginkan sudah tercapai, tekanan autoclave tidak boleh diturunkan secara mendadak
Bila tekanan diturunkan secara
mendadak, cairan di dalamnya akan mendidih dan meluap (Bubbled up). Untuk bahan-bahan yang heat-labile dalam bentuk larutan, sterilisasi dilakukan dengan menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran pori 0.20 - 0.22 um. Diameter filter bermacam-macam tergantung dari volume larutan yang ingin disterilkan. Untuk volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang dipasang di ujung jarum suntik. Bahan yang yang bersifat heat labile antara lain GA3, Thiamin-HCl, Ca-panthothenate, antibiotik : carbenocillin. Botol-botol/tabung reaksi/erlenmeyer yang dipergunakan sebagai wadah, biasanya disterilkan dalam oven. Botol-botol yang sudah dicuci bersih, dimasukkan ke dalam oven dan dipanaskan selama 4 jam pada suhu 160° C. Setelah disterilkan, dapat langsung digunakan. Bila botol akan disimpan untuk beberapa lama, maka sewaktu sterilisasi, mulut botol harus ditutup dengan aluminium foil.
4
Sterilisasi dengan Autoclave Gas Pada prinsipnya. sterilisasi autoclave menggunakan panas dan tekanan dari uap air. Temperatur sterilisasi biasanya 121° C. tekanan yang biasa digunakan antara 17,5 - 20 psi (pound per square inch). Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alatalat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan. Sterilisasi media yang terlalu lama menyebabkan: 1.
Penguraian gula
2.
Degradasi vitamin dan asam-asam amino
3.
Inaktifasi sitokinin zeatin riboside
4.
Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar. Autoclave gas atau listrik portable pada umumnya mempergunakan sumber uap
dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoclave, sedangkan autoclave besar pada laboratorium komersil pada umumnya menggunakan uap dari broiler sentral. Bagian-bagian autoclave gas portable (Gambar 3.2): 1.
Panci luar
2.
Panci dalam tempat meletakkan botol dengan alur tempat saluran uao
3.
Tutup beserta penunjuk tekanan dan saluran uap
4.
Katup pengeluaran uap
5.
Pengunci
Cara menggunakan autoclave gas portable: 1. Isi panci luar dengan air, kalau dapat dengan aquadest untuk menghindarkan pengendapan Ca yang biasa terdapat pada air ledeng, sebanyak 1 liter untuk autoclave kecil, dan 1,5 liter untuk autoclave besar. 2. Botol-botol media yang akan disterilkan, dimasukkan ke dalam panci-dalam. Susun botol-botol tersebut hingga mencapai permukaan panci. 3. Atur posisi panci dengan memperhatikan alur tempat saluran uap yang terdapat di dalam panci-dalam, serta tanda panah yang terdapat pada tutup dan lingkaran permukaan panci-luar (Gambar 3.3) 4. Tutup dengan erat (kencangkan pengunci tanpa menggunakan alat) 5
5. Biarkan katup pengeluaran uap dalam keadaan terbuka 6. Letakkan autoclave diatas kompor gas atau pembakar bunsen 7. Panaskan sampai air dalam autoclave mendidih dan uap mulai keluar dari katup pengeluaran uap. 8. Biarkan uap keluar selama 5 menit (minimum), untuk mengeluarkan udara yang terperangkap dalam autoclave. 9. Tutup katup pengeluaran uap 10. Amati kenaikan temperature dan tekanan. 11. Setelah tekanan mencapai 17.5 - 18 psi, api kompor dikecilkan. 12. Jaga keadaan tekanan 17.5 psi ini dengan mengatur besar kecilnya api kompor secara manual. Selama sterilisasi, jangan meninggalkan autoclave dan mengerjakan hal lain di ruang lain, karena tekanan dapat meningkat sampai melewati batas. Keadaan ini berbahaya dan dapat menyebabkan kerusakan alat. 13. Setelah waktu sterilisasi tercapai, matikan api kompor. 14. Keluarkan uap sedikit-sedikit dengan mengatur katup pengeluaran uap (buka sedikitsedikit). Jangan sekali-kali membuka katup dan membiarkan uap keluar sekaligus. Keadaan ini menyebabkan media atau air bubble up. 15. Setelah tekanan turun sampai 0, buka pengunci dan keluarkan panci yang berisi media.
Sterilisasi botol kosong, aquadest, dan alat-alat 1. Botol bersih diberi beberapa tetes aquadest dan tutup dengan kertas atau aluminium foil (Jangan terlalu kencang bila menggunakan al-foil) Untuk botol-botol yang mempunyai tutup autoclaveable, jangan tutup terlalu kencang
karena selama
pemanasan terjadi permuaian. 2. Sterilisasi aquadest, lebih efektif bila digunakan wadah yang mempunyai volume antara 300 - 500 ml. lsi wadah tersebut sampai 80% (volume), dan tutup dengan plastik atau aluminium foil, diikat dengan karet gelang. 3. Alat - alat diseksi seperti pinset, gunting, gagang scalpel, dan jarum, dibungkus dengan kertas kopi atau kertas merang. Hindarkan penggunaan Al-foil karena uap sukar masuk ke dalam bungkusan sehingga sterilisasi kurang efektif. 6
4. Petridish yang akan disterilkan, juga dibungkus dengan kertas kopi atau kertas merang 5. Waktu sterilisasi minimal 1 jam setelah tekanan tercapai 17.5 psi.
Sterilisasi Bahan Tanaman Dalam kultur jaringan, eksplan dan mata tunas yang bebas dari kontaminan merupakan langkah yang sangat penting. Bahan tanaman dari lapangan mengandung debu, kotoran, dan berbagai kontaminan hidup pada permukaannya. Kontaminan hidup dapat berupa cendawan, bakteri, serangga dan telurnya, tungau, serta spora-spora. Bila kontaminan ini tidak dihilangkan, maka pada media yang mengandung gula, vitamin, dan mineral, kontaminan terutama cendawan dan bakteri akan tumbuh secara cepat. Dalam beberapa hari, kontaminan akan memenuhi seluruh botol kultur. Eksplan yang tertutup kontaminan akhirnya mati, dapat sebagai akibat langsung dari serangan cendawan atau bakteri atau secara tidak langsung akibat persenyawaan toxic yang diproduksi cendawan atau bakteri. Pada beberapa jenis tanaman, ditemukan juga kontaminan yang berasal dari dalam jaringan tanaman, terutama bakteri. Bakteri-bakteri ini sampai sekarang belum diidentifikasi. Kontaminan internal ini sangat sulit diatasi, karena sterilisasi permukaan tidak menyelesaikan masalah. Pada bahan tanaman yang mengandung kontaminan internal, harus diberi perlakuan antibiotikk atau fungisida yang sistemik. Setiap bahan mempunyai tingkat kontaminasi permukaan yang berbeda, tergantung dari: 1. Jenis tanamannya. 2. Bagian tanaman yang dipergunakan. 3. Morfologi pemukaan (misalnya: berbulu atau tidak). 4. Lingkungan tumbuhnya (green house atau lapangan). 5. Musim waktu mengambil (musim hujan/kemarau). 6. Umur tanaman (seedling atau tanaman dewasa). 7. Kondisi tanamannya (sakit atau dalam keadaan sehat). Keadaan ini menyukarkan penentuan suatu prosedur sterilisasi standard yang berlaku untuk semua tanaman. Juga sukar untuk menentukan prosedur standard yang dapat dipergunakan untuk suatu jenis tanaman yang berasal dari tempat yang berbeda. 7
Prosedur
sterilisasi setiap bahan tanaman harus ditentukan melalui percobaan
pendahuluan. Hal yang penting yang harus mendapat perhatian adalah bahwa sel tanaman dan kontaminan adalah sama-sama benda hidup. Kontaminan harus dihilangkan tanpa mematikan sel tanaman. Di negara-negara tropis, kontaminasi permukaan ini biasanya merupakan hal yang cukup serius, sehingga beberapa tahap sterilisasi harus dilakukan. Beberapa jenis bahan yang dipergunakan dalam sterilisasi permukaan beserta kisaran konsentrasinya tertera dalam Tabel 3.1.
Tabel
3.1 Beberapa jenis bahan sterilisasi beserta kisaran konsentrasi dan lama perendaman
Bahan
Konsentrasi
Lama Perendaman
Kalsium hipoklorid
1-10%
5-30 menit
Natrium hipoklorid
1-2%
7-15 menit
Hidrogen peroksida
3-10%
5-15 menit
Gas klorin
-
1-4 jam
Perak Nitrat
1%
5-30 menit
Merkuri klorid
0.1-0.2%
10-20 menit
Betadine
2.5-10%
5-10 menit
Fungisida
2 gram/l
20-30 menit
Antibiotik
50 mg/l
½ - 1 jam
Alkohol
70%
½ - 1 menit
Sumber : Gunawan (1992) Bahan-bahan sterilisasi ini, pada umumnya bersifat toxic terhadap jaringan tanaman. Pembilasan yang berkali-kali sesudah perendaman eksplan di dalam larutan bahan sterilisasi sangat perlu dikakukan untuk menghilangkan sisa-sisa bahan aktif yang masih menempel di permukaan bahan tanaman. Dalam sterilisasi, kadang-kadang digunakan dua atau lebih bahan sterilisasi, misalnyaL perendaman dalam alkohol dulu, kemudian dalam natrium hipoklorid dan dibilas. Dapat juga perendaman dimulai dengan larutan fungisida atau antibiotik, kemudian baru merkuri klorid, dan dibilas dengan air
8
steril. Prosedur mana yang paling efektif, harus ditentukan melalui percobaan pendahuluan. Sterilisasi bahan tanaman (misalnya tunas kentang atau kencur), dimulai dengan pencucian dan pembuangan bagian-bagian yang kotor dan mati di bawah pancuran air ledeng. Pencucian dapat dilakukan dengan menggunakan detergent lembut. Kadangkadang bahan yang sudah bersih, dibiarkan di bawah pancuran air selama 11 - 1 jam untuk memecahkan koloni kontaminan permukaan, agar koloni-koloni tersebut lebih peka terhadap bahan-bahan sterilisasi. Bahan yang sudah bersih dikecilkan sampai ukuran tertentu. Ukuran ini harus lebih besar dari ukuran eksplan yang direncanakan. Bahan tanaman kemudian direndam dalam larutan fungisida dan/atau antibiotik. Setelah waktu perendaman tercapai, bahan ditiriskan dan dibawa masuk ke dalam laminar air flow cabinet. Prosedur lain dijalankan di dalam laminar air flow cabinet. Bahan-bahan tanaman dicelupkan dulu selama 1/2 menit dalam alkohol 70%, kemudian dimasukkan ke dalam larutan natrium/kalsium hopoklorid yang diberi' beberapa tetes bahan surfactant seperti Tritone-x, Tween 20, atau Tween 80. Setelah waktu perendaman dalam larutan natrium/kalsium hipoklorid tercapai, bahan tanaman dibilas 3 kali dalam aquadest steril selama 10 menit untuk tiap pembilasan. Setelah semua prosedur tersebut dijalankan, berarti bahan tanaman sudah siap untuk ditanam. Prosedur ini dapat dimodifikasi tergantung dari bahan yang digunakan, misalnya dengan menggunakan: 1. Fungisida/antibiotik - merkuri klorid - bilas dengan aquadest steril 2. Alkohol - sodium hipoklorid - merkuri klorid - aquadest steril 3. Alkohol - sodium hipoklorid - betadine - aquadest steril. Masing-masing peneliti dan laboratorium dapat mengembangkan sendiri cara yang paling efektif untuk keadaan setempat. Dalam laboratorium yang mempunyai pompa vacum, sterilisasi dapat dilakukan dalam keadaan vacum dan dikocok dengan meletakkan botol di atas magnetic-stirrer. Hal ini dapat meningkatkan efisiensi sterilisasi. Ke dalam larutan juga ditambahkan surfactant beberapa tetes. Bila gas klorin yang digunakan, maka prosedur harus dilakukan dalam fume hood atau lemari asam. Gas klorin dapat diperoleh dengan cara: 50 ml NaClO (bahan pemutih komersial/bleach), ditambah dengan 5 ml HCl pekat. HCI pekat tidak ditambahkan sekaligus, tetapi mula-mula 3 ml dulu, sesudah 3 menit dapat ditambahkan 2 ml. Bahan 9
tanaman yang akan disterilkan misalnya umbi kentang dan wadah yang berisi natrium hipoklorit + HCl dimasukkan ke dalam botol besar yang bertutup (Gambar 3.5). Untuk menghindarkan pemborosan media perlakuan, bahan tanaman tidak langsung ditanam di dalam media perlakuan. Eksplan terlebih dahulu ditanam di dalam media preconditioning (pre-con) yang merupakan media komposisi dasar tanpa zat pengatur tumbuh (ZPT), untuk menguji keefektifan prosedur sterilisasi. setelah 3 - 7 hari di dalam media pre-con dan tidak menunjukkan gejala kontaminasi, barulah eksplan ditanam di dalam media perlakuan yang sesungguhnya. Eksplan yang menunjukkan kontaminasi yang berlebih-lebihan, sebaiknya dibuang. Untuk eksplan yang sukar diperoleh dan masih menunjukkan integritas yang baik setelah sterilisasi pertama, sterilisasi kedua dapat dilakukan bila kontaminasi masih muncul di permukaan.
Dalam kasus kontaminasi
internal, langkah yang dapat diambil adalah
perendaman bahan tanaman yang sudah dicuci bersih, di dalam larutan antibiotik selama 4 - 5 jam. Kemudian prosedur selanjutnya, sama dengan sterilisasi permukaan bahan tanaman yang lain. Tindakan ini menolong keadaan tanaman dengan kontaminan internal yang berupa bakteri. Cara lain yang dapat ditempuh, adalah menambahkan antibiotik yang tepat ke dalam media tumbuh. Apabila antibiotik yang digunakan termasuk yang heat- labile, make antibiotik tidak dimasukkan ke dalam media sebelum sterilisasi dengan autoclave. Media diautoclave tersendiri dan antibiotik ditambahkan setelah difiltrasi dengan micro-filter dengan pori 0.2 µm.
Penggunaan Laminar Air Flow Cabinet Seperti yang sudah disebutkan terdahulu, laminar air flow cabinet (LAF) adalah suatu alat yang digunakan dalam pekerjaan: persiapan bahan tanaman, penanaman, dan pemindahan tanaman dari satu botol ke botol yang lain dalam kultur in vitro (subkultur). Alat ini diberi nama Laminar Airflow Cabinet, karena meniupkan udara steril secara kontinyu melewati tempat kerja sehingga tempat kerja bebas dari debu dan spora-spora yang mungkin jatuh ke dalam media pada saat pelaksanaan penanaman (Gambar 3.6). Aliran udara berasal dari udara ruangan yang ditarik ke dalam alat melalui filter pertama
10
(pre-filter), yang kemudian ditiupkan ke luar melalui filter yang sangat halus yang disebut HEPA (High efficiency Particulate Air Filter), dengan menggunakan blower.
Pada Laminar Air Flow cabinet terdapat 2 macam filter: 1. Pre-filter, yang merupakan saringan pertama terhadap debu-debu dan bendabenda yang kasar. Pori-porinya kira-kira 5µ sehingga efisiensinya dapat mencapai 95% untuk obyek-obyek yang ≥ 5µ. 2.
HEPA filter dengan pori-pori 0.3µ dan terdapat pada bidang ke luar udara ke arah permukaan tempat kerja.
Pre-filter harus sering dibersihkan dengan vacuum cleaner dan sebaiknya diganti 1 tahun sekali. Sedangkan HEPA filter diganti setelah melalui pemeriksaan dengan particulate count atau dengan alat yang isebut magnehelic gauge. Laminar air flow cabinet ada yang dilengkapi dengan lampu UV; ada juga yang tanpa. Pada laminar air flow cabinet yang tidak
dilengkapi dengan lampu U.V., blower harus
dijalankan terus menerus walaupun laminar airflow cabinet tersebut sedang tidak dipergunakan. Hal ini dilakukan untuk menjaga kebersihan ruang kerja di dalam laminar air flow tersebut. Pada laminar air flow yang dilengkapi dengan lampu U.V., dianjurkan agar menyalakan lampu U.V. minimum 30 menit sebelum laminar air flow digunakan. Ketika laminar air flow sedang digunakan, lampu U.V. harus dimatikan, sedangkan blower dijalankan. Blower pada laminar air flow cabinet yang dilengkapi dengan lampu U.V. hanya dijalankan pada saat laminar air flow sedang digunakan. Alat-alat yang dimasukkan ke dalam Laminar Air Flow Cabinet: 1.
Lampu alkohol/ Bacti cinerator.
2.
Wadah alkohol: botol/gelas piala ≥ 250 ml.
3.
Pinset, scalpel, gunting, dan jarum.
4.
Petri dish steril.
5.
Disecting Microscope, jika melakukan isolasi meristem.
6.
Kertas tissue/ kapas.
7.
Alumunium steril
8.
Lap/kain steril
9.
Sprayer berisi alkohol 70% (tidak harus dalam cabinet). 11
Cara Menggunakan LAF ‘ 1.
Hubungkan LAF dengan sumber arus listrik
2.
Nyalakan lampu U. V., minimum selama 30 menit, sebelum laminar air flow digunakan. Hindarkan sinarnya dari badan dan mata.
3.
Jika LAF menggunakan kaca penutup depan, dibuka terlebih dahulu
4.
Semprot permukaan dalam LAF dengan alkohol 70%
5.
Semua alat-alat steril yang akan dipergunakan dimasukkan ke dalam LAF dengan disemprotkan alkohol 70% terlebih dahulu.
6.
Jalankan air flow nya dengan menghidupkan blower.
7.
Nyalakan lampu neon yang ada dalam ruang LAF
8.
Sebelum bekerja dalam LAF tangan pekerja disemprot dahulu dengan Alkohol 70%.
9.
Nyalakan lampu alkohol.
Hal yang perlu diperhatikan: 1.
Jangan meletakkan lampu alkohol terlalu dekat dengan filter.
2.
Jangan menumpuk alat-alat, botol-botol media, dan lain-lain benda di depan tempat bekerja sehingga menghalangi aliran udara.
3.
Jangan mencelupkan alat tanam dengan nyala api ke dalam alkohol. Nyala api alkohol yang terdapat pada alat tanam, tidak terlihat dengan jelas di tempat yang terang. HATI-HATI!!!
4.
Jangan mendekatkan
tangan yang baru disemprot alkohol
dengan lampu
alkohol/bunsen. 5.
Jangan mendekatkan botol berisi alkohol dengan lampu alkohol/bunsen
6.
Bersihkan Laminar Air Flow Cabinet selesai bekerja. Jangan meninggalkan botol bekas, kapas bekas, dan sebagainya, di dalam LAF.
Media Kultur Jaringan Tanaman Keberhasilan dalam penggunaan metode kultur jaringan, sangat bagantung pada media yang digunakan. Media kultur jaringan tanaman tidak hanya menyediakan unsur12
unsur hara makro dan mikro, tetapi juga karbohidrat yang umumnya berupa gula untuk menggantikan karbon yang biasanya didapat dari hasil fotosintesis. Hasil kultur jaringan yang baik akan diperoleh bila ke dalam media tersebut ditambahkan vitamin-vitamin, asam amino, dan zat pengatur tumbuh. Walaupun sudah diusahakan untuk menghindarkan penggunaan bahan-bahan organik alamiah yang tidak jelas komponennya seperti juice, yeast extracts dan casein hydrolysate, tetapi kadang-kadang hasil yang lebih tinggi dapat diperoleh dengan penambahan bahan tersebut. Sebagai contoh, air kelapa masih sering digunakan di laboratorium-laboratorium penelitian, sedangkan pisang masih merupakan komponen tambahan yang popular pada media anggrek. Media kultur tersusun dari beberapa komponen berikut: 1.
Hara makro yang digunakan pada semua media.
2.
Hara mikro hampir selalu digunakan. Ada beberapa komposisi media yang hanya menggunakan besi atau besi-kelat.
3.
Vitamin-vitamin, umumnya ditambahkan dalam jumlah yang bervariasi.
4.
Gula, merupakan keharusan, kecuali untuk tujuan yang sangat khusus.
5.
Asam amino dan N organik.
6.
Persenyawaan-persenyawaan kompleks alamiah seperti air kelapa, ekstrak ragi (yeast extract), jus tomat, ekstrak kentang, dan sebagainya.
7.
Buffer, terutama buffet organik.
8.
Arang aktif, sering dipergunakan untuk menstimulir pertumbuhan akar.
9.
Zat pengatur tumbuh, terutama auksin dan sitokinin. Zat pengatur tumbuh merupakan komponen yang sangat panting dalam rnedia kultur janngan. Tetapi jenis dan konsentrasinya sangat tergantung pada jenis tanaman dan tujuan kulturnya.
10. Bahan pemadat media, biasanya digunakan agar-agar untuk membuat media padat. Pada umumnya media kultur jaringan dibedakan menjadi media dasar dan media perlakuan. Resep media dasar adalah resep kombinasi zat yang mengandung hara esensial (makro dan mikro), sumber energi dan vitamin. Dalam teknik kultur jaringan dikenal puluhan macam media dasar. Penamaan resep media dasar umumnya diambil dari nama penemunya. Beberapa media dasar yang banyak digunakan antara lain: 1. Media dasar Murashige dan Skoog (1962) yang dapat digunakan untuk hampir 13
semua jenis
kultur, terutama
pada tanaman herbaceus.
2. Media dasar B5 untuk kultur sel kedelai, alfafa, dan legume lain. 3. Media dasar White (1934) yang sangat cocok kultur akar tanaman tomat 4. Media dasar Vacin dan Went yang biasa digunaan untuk kultur jaringan anggrek. 5. Media dasar Nitsch dan Nitsch yang biasa digunakan dalam kultur tepung sari (pollen) kultur sel. 6. Media dasar Schenk dan Hildebrandt (1972) yang cocok untuk kultur jaringan tanaman- tanaman monokotil. 7. Medium khusus tanaman berkayu atau Woody Plant Medium (WPM). 8. Media N6 untuk serealia terutama padi Dari sekian banyak media dasar, yang paling sering dan banyak digunakan adalah komposisi media dari Murashige dan Skoog. Kadang-kadang untuk kultur tertentu, kombinasi zat kimia dari Murashige dan Skoog masih tetap digunakan tetapi konsentrasi yang diubah. sebagai contoh media 1/2 MS, berarti konsentrasi persenyawaan yang digunakan adalah setengah konsentrasi Media MS.
Pembuatan Media Dewasa ini beberapa media kultur jaringan dapat dibeli dalam bentuk bubuk yang telah dipersiapkan. Tergantung dari jenisnya, ada yang hanya mengandung garam makro dan mikro serta vitamin, ada memang memudahkan
juga yang lengkap sampai ZPT dan gula. Formula ini
pekerjaan,
tapi untuk suatu penelitian yang memerlukan
perubahan komposisi dalam satu atau beberapa komponen, maka pemisahan komponen-komponen penyusun media perlu dilakukan. Pembuatan Larutan Stok Dalam pembuatan media, langkah pertama adalah membuat larutan stok dari formula media terpilih. Pembuatan larutan stok bertujuan menghemat pekerjaan menimbang bahan yang berulang-ulang setiap kali membuat media. Selain itu, juga kadang-kadang timbangan yang dibutuhkan untuk menimbang bahan dalam jumlah kecil tidak tersedia dalam laboratorium. Volume larutan stok yang dibuat harus mempertimbangkan volume media yang akan dibuat dan masa kadaluwarsa larutan stok. Jika volume larutan stok dibuat terlalu banyak sedangkan media yang akan dibuat 14
hanya beberapa liter, maka larutan stok yang tersedia akan banyak tersisa. Jika larutan stok terlalu lama disimpan dapat terkontaminasi atau terjadi pengendapan sehingga tidak boleh digunakan lagi. Larutan stok dikelompokkan berdasarkan fungsi dan jumlah (bobot) senyawa yang dibutuhkan per liter media. Larutan stok dapat dikelompokkan ke dalam stok hara makro, mikro, stok Fe, vitamin, dan stok hormon. Stok vitamin tidak dapat disimpan terlalu lama, biasa dibuat untuk digunakan dalam 1-2 minggu. Stok hormon dapat disimpan antara 2-4 minggu, sedangkan stok hara dapat disimpan 4-8 minggu. Larutan yang sudah mengalami pengendapan, tidak dapat digunakan
lagi.
Pengendapan
larutan stok umumnya terjadi bila kepekatan larutan terlalu tinggi. Oleh karena itu pengendapan larutan dapat dihindari dengan membuat larutan yang tidak terlalu pekat atau tidak menggunakan
larutan campuran, yaitu dengan membuat satu larutan
stok hanya untuk satu jenis bahan (terutama untuk unsur hara makro). Kondisi simpan juga perlu diperhatikan, karena ada beberapa bahan yang tidak tahan dalam suhu tinggi
atau
cahaya. Larutan
stok kadang-kadang ditumbuhi mikroba atau
mikroorganisme lain sehingga tidak dapat digunakan lagi. Oleh karena itu kondisi simpan harus dijaga
kebersihannya dan wadah
larutan harus
ditutup serapat
mungkin. Berikut ini akan dikemukakan cara-cara pembuatan larutan stok untuk media Murashige dan Skoog (1962). Stok Hara Makro. Senyawa-senyawa sumber unsur hara makro diperlukan dalam jumlah yang cukup besar, oleh karena itu sebaiknya dibuat dalam larutan stok tunggal. Selain itu, karena jenis anion senyawa sumber unsur hara makro tidak sama, ada kemungkinan akan mempercepat pengendapan larutan bila dibuat larutan stok campuran. Biasanya larutan stok hara makro dibuat beberapa macam dan diberi nama sebagai berikut: 1. Larutan stok A untuk persenyawaan NH4NO3 2. Larutan stok B untuk persenyawaan 4KNO3 3. Larutan stok C untuk persenyawaan CaCl2.2H2O 4. Larutan stok D untuk persenyawaan MgSO 4.7H2O dan KH2PO4 5. Larutan stok E untuk persenyawaan FeSO4.7H2O dan Na2EDTA
15
Prosedur pembuatan Larutan Stok A (MS) sebanyak 1 liter dengan konsentrasi 50x kebutuhan
Amonium nitrat (NH4NO3) ditimbang sebanyak 83.50 gram, dimasukkan ke dalam gelas piala yang sudah berisi aquadest atau air bebas ion kira-kira 700 ml. Kemudian diaduk hingga larut.
Larutan dimasukkan ke dalam labu takar 1 liter yang telah dibilas dengan aquadest. Gelas piala bekas wadah larutan dibilas dengan aquadest 2-3 kali dan air bilasan dituangkan ke dalam labu takar. Kemudian ke dalam labu takar ditambahkan aquadest hingga volume larutan tepat 1 liter.
Larutan yang telah jadi, dipindahkan ke dalam Erlenmeyer/botol reagen ukuran 1 liter, diberi label “A” dan ditutup rapat. Larutan stok A dapat disimpan pada suhu kamar.
Alat-alat yang telah dipakai segera dibersihkan dan dibilas dengan aquadest.
Untuk membuat 1 liter media, dibutuhkan 20 ml larutan stok A
Pembuatan Larutan Stok B sebanyak 1 liter (50x konsentrasi)
Senyawa KNO3 ditimbang sebanyak 95 gram, kemudian dilarutkan dalam gelas piala (kapasitas 1 liter) yang telah berisi 700 ml aquadest. Larutan kemudian diaduk hingga larut.
Larutan dituang ke dalam labu takar 1 liter seperti pada proses pembuatan stok A
Setelah itu volume larutan diterakan 1 liter, larutan dipindahkan ke dalam enlemeyer 1 liter, diberi label “B”, ditutup rapat dan disimpan dalam kondisi suhu kamar
Untuk membuat 1 liter media MS diperlukan 20 ml larutan stok B.
Larutan Stok C sebanyak 1 liter (100x konsentrasi)
Senyawa CaCl2.2H2O ditimbang sebanyak 44 gram, kemudian dilarutkan ke dalam 700 ml aquadest dalam gelas piala 1 liter
Kalsium klorida akan membebaskan kalor bila dilarutkan ke dalam air, oleh karena itu sebelum ditepatkan volumenya, larutan dibiarkan dingin terlebih dahulu hingga kembali ke suhu kamar.
Prosedur selanjutnya sama dengan pembuatan larutan stok A dan B. 16
Larutan stok C dapat disimpan pada suhu kamar.
Untuk membuat 1 liter media MS diperlukan 10 ml larutan stok C
Larutan Stok D sebanyak 1 liter (100x konsentrasi)
Timbang 37 gram persenyawaan MgSO 4.7H2O dan 17 gram KH2PO4. Larutkan secara terpisah masing-masing bahan dalam 350 ml aquadest. Setelah larut, kedua bahan dituangkan ke dalam 1 labu takar ukuran 1 liter
Proses selanjutnya sama seperti proses pembuatan stok sebelumnya
Larutan stok D dapat disimpan dalam suhu kamar
Untuk membuat media MS 1 liter dibutuhkan 10 ml larutan stok D.
Cara membuat Larutan Stok E sebanyak 1 liter dengan kepekatan 200x keperluan per liter media
Timbang 5,57 gram FeSO4.7H2O dan 7,45 gram Na2EDTA. Kedua bahan tersebut dilarutkan secara terpisah ke dalam kira-kira 350 ml aquadest, menggunakan gelas piala 1 liter. Larutan Na2EDTA dipanaskan hingga 40-60°C selama beberapa menit, kemudian ditambahkan larutan FeSO 4.7H2O dan diaduk hingga tercampur merata. Biarkan hingga suhu kembali ke suhu kamar.
Setelah mendingin, masukkan larutan campuran itu ke dalam labu takar, seperti proses pembuatan larutan stok terdahulu. Setelah volume larutan ditepatkan 1 liter, pindahkan ke dalam Erlenmeyer/botol ukuran 1 liter dan seluruh sisinya ditutup dengan alumunium foil. Larutan stok E dapat disimpan dalam kondisi suhu kamar, tetapi lebih baik disimpan di dalam lemari es. Karena larutan Fe ini peka terhadap cahaya,
maka
perlu
diselubungi
aluminium
foil
pada
Erlenmeyer/botol
penyimpanannya.
Untuk mebuat 1 liter media MS, diperlukan 5 ml larutan stok E.
Stok hara Mikro Unsur hara mikro sangat sedikit diperlukan dalam pembuatan media. Biasanya larutan hara mikro dibuat dengan kepekatan 200 kali konsentrasi kebutuhan media per liter. Prosedur pembuatan larutan stok hara mikro dapat dirinci sebagai berikut:
17
Timbang bahan-bahan sumber hara mikro dengan menggunakan timbangan analitik dalam jumlah sebagai berikut: 1. MnSO4.H2O
3380.0 mg
2. ZnSO4.7H2O
1720.0 mg
3. H3BO3
1240.0 mg
4. KI
166.0 mg
5. Na2MoO4.2H2O
50.0 mg
6. CoCl.6H2O
5.0 mg
7. CuSO4.5H2O
5.0 mg
Masukkan bahan satu per satu ke dalam gelas piala 1 liter yang telah berisi 700 ml aquadest. Setiap memasukkan bahan diikuti dengan pengadukan agar larut, baru disusul oleh bahan berikutnya.
Setelah semua bahan larut, baru dimasukkan ke dalam labu takar 1 liter dan volume ditepatkan 1 liter dengan penambahan aquadest.
Larutan yang telah jadi selanjutnya dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dan diberi label “F”, ditutup rapat dan disimpan pada suhu kamar.
Satu liter media MS hanya memerlukan 5 ml larutan stok F.
Vitamin dan zat pengatur tumbuh, merupakan bahan-bahan kimia organik. Bahan-bahan organik, umumnya peka terhadap suhu tinggi dan cahaya. Selain itu, zat organik dalam bentuk larutan mudah mengalami perubahan, sehingga tidak awet disimpan. Oleh karena itu, larutan stok vitamin dan zat pengatur tumbuh, harus disimpan di dalam lemari es dan sebaiknya dalam membuatnya tidak usah terlalu banyak agar segera habis terpakai. Larutan stok vitamin. Bila stok vitamin bukan merupakan perlakuan, artinya semua media menggunakan konsentrasi vitamin yang sama, maka larutan stok vitamin dapat dibuat sebagai stok campuran. Sebagai contoh akan dibuat media dasar yang memerlukan thiamine HCl 0.1 mg, nicotinic acid 0.5 mg, pyridoxine.HCL 0.5 mg dan glycine 2.0 mg per liter media. Larutan stok umumnya dibuat 1000 kali konsentrasi yang diperlukan untuk satu liter media. sebanyak 100 ml. Langkah pembuatan larutan stok vitamin sebanyak 100 ml dengan kepekatan 1000 kali adalah sebagai berikut:
Timbang bahan-bahan: 18
1.
Thiamine.HCL
10.0 mg
2.
Nicotinic acid
50.0 mg
3.
Pyridoxine.HCl
50.0 mg
4.
Glycine
200.0 mg
Semua bahan selanjutnya dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml yang telah berisi aquadest kira-kira 25 ml. Usahakan volume awal tidak melebihi 50 ml, hati-hati dalam membilas bahan yang dimasukkan ke labu. Labu takar kemudian dikocok hingga semua bahan larut merata. Setelah larut merata, kemudian volume labu ditepatkan sampai 100 ml dengan menambahkan aquadest. Larutan yang telah jadi, kemudian dipindahkan ke botol 100 ml, ditutup rapat, diberi label, lalu disimpan dalam lemari es
Satu liter media yang dibuat, hanya membutuhkan 1 ml larutan stok vitamin. Khusus myo-inositol, dibuat larutan stok tunggal dengan kepekatan 100 kali konsentrasi akhir media.
Larutan stok zat pengatur tumbuh Zat pengatur tumbuh
umumnya dibutuhkan dalam jumlah yang sedikit. Proses
penimbangan zat pengatur tumbuh untuk larutan stok, sulit untuk digeneralisasikan, karena biasanya zat pengatur tumbuh merupakan perlakuan dalam media kultur jaringan. Biasanya larutan stok zat pengatur tumbuh dibuat dengan kepekatan 1-10 mg/ml. Sebagai contoh, berikut ini diuraikan pembuatan larutan stok zat pengatur tumbuh dengan kepekatan 1 mg/ml sebanyak 100 ml. 1. Larutan stok auksin (IAA , NAA, IBA, 2,4-D): Timbang bahan sebanyak 100 mg, kemudian dituangkan ke dalam gelas piala 100 ml yang berisi 70 ml aquadest. Sambil diaduk-aduk, teteskan sedikit larutan NaOH 1 N dengan hati-hati hingga bahan larut benar-benar. Setelah larut merata, kemudian dipindahkan dalam labu takar 100 ml, dan volume ditepatkan 100 ml dengan menambahkan aquadest. Larutan yang telah ditepatkan volumenya itu dipindahkan ke dalam Erlenmeyer 100 ml, ditutup rapat dan diberi label untuk seterusnya disimpan dalam lemari es. Untuk membuat 1 liter media, bila perlakuan zat pengatur tumbuh (auksin) yang digunakan 1 ppm maka dibutuhkan 1 ml, bila 2 ppm diperlukan 2 ml dan seterusnya. 19
Sebagai pengganti larutan NaOH, dapat digunakan bahan pelarut alkohol 40%, atau dengan pemanasan larutan awal (larutan sebelum diterakan dalam labu takar) selama beberapa menit hingga bahan benar-benar larut (menjadi jernih).
2. Larutan stok sitokinin: Seperti auksin, sitokinin sebaiknya dibuat stok dalam jumlah sedikit (100 ml). Umumnya kepekatan yang digunakan hampir sama dengan auksin, yaitu 1-10 mg/ml. Berikut ini diuraikan pembuatan larutan stok kinetin 1 mg/ml sebanyak 100 ml.
Timbang kinetin 100 mg dan tuang ke dalam gelas piala 100 ml yang berisi 70 ml aquadest
Sambil diaduk-aduk, ditetesi dengan larutan HCl 1 N dan dipanaskan sebentar hingga bahan benar-benar larut (terlihat jernih). Setelah larut dan dingin, larutan dipindahkan ke dalam labu takar 100 ml untuk ditepatkan volumenya menjadi 100 ml dengan menambahkan aquadest.
Larutan yang telah jadi dipindahkan ke dalam botol 100 ml, ditutup rapat dan diberi label dan disimpan dalam lemari es.
Bila 1 ml larutan stok ini ditambahkan dalam pembuatan 1 liter media, maka perlakuan kinetin pada media tersebut adalah 1 ppm.
Ketentuan pembuatan larutan stok auksin dan sitokinin ini dapat berlaku umum untuk golongan zat pengatur tumbuh yang lain. Zat pengatur tumbuh yang bereaksi asam seperti auksin dan giberelin, dapat dilarutkan dengan bantuan penambahan larutan NaOH (basa), atau menggunakan bahan pelarut alkohol 40%, atau dengan pemanasan. Sedangkan zat pengatur tumbuh yang bereaksi basa seperti golongan sitokinin, dapat dibantu pelarutannya dengan menambahkan beberapa tetes larutan HCl 1 N, atau dengan pemanasan. Hal-hal yang perlu diperhatikan pada larutan stok: a. Larutan stok unsur hara, sebaiknya tidak disimpa lebih dari dua bulan sebelum dipergunakan. Stok vitamin dan zat pengatur tumbuh, sebaiknya digunakan segar (kurang dari 2 minggu). Oleh karena itu sebelum membuat larutan stok, harus ditentukan dahulu kebutuhan media, jadwal pembuatan media, dan semua sarana pembuatan media harus benar-benar siap 20
b. Larutan stok yang telah mengalami pengendapan dan yang sudah ditumbuhi mikroorganisme (terkontaminasi), tidak boleh digunakan lagi (dibuang) c. Semua alat-alat gelas (alat ukur, takar, wadah) sebelum digunakan untuk membuat larutan, harus dibilas dulu dengan aquadest. Setelah selesai digunakan atau sebelum digunakan lagi, harus pula segera dibilas dengan aquadest. Bila tidak digunakan lagi, tempatkanlah pda rak penyimpanan secara terbalik supaya kering dan bagian dalam tidak berdebu
Proses Pembuatan Media Cara menghitung kebutuhan larutan stok untuk satu liter media (dalam hal ini media MS), dapat digunakan rumus sebagai berikut: Misalnya larutan stok A, 1 liter larutan stok A mengandung 82.5 gram NH 4NO3. Konsentrasi NH4NO3 yang dibutuhkan dalam media MS adalah 1650 mg/l. Dengan demikiian, volume larutan stok A untuk 1 liter media adalah:
Cara membuat media dengan menggunakan larutan stok hanya dengan metode pengenceran. Untuk itu perlu diketahui benar-benar volume kebutuhan larutan stok masing-masing. sebagai contoh, akan dibuat 1 liter media MS dengan perlakuan 1 ppm NAA dan 2 ppm kinetin. Media yang dibuat adalah media padat dengan 0.8% agar dan mengandung 3% gula sukrosa. Labu takar diisi air destilata kira-kira 400 ml, tambahkan 20 ml stok A, 20 ml stok B, 10ml stok C, 5ml stok E, 5 ml stok F, 1 ml stok vitamin, 1 ml stok NAA, dan 2 ml stok kinetin. Setelah semua larutan stok ditambahkan ke dalam labu takar, ditambahkan gula sebanyak 30 gram dan diaduk. Kemudian volume larutan ditepatkan mendekati 1 liter dengan menambahkan aquadest ke dalam labu takar. Setelah itu, larutan dipindahkan ke dalam wadah tempat memanaskan, misalnya panci dengan lapisan enamel, lalu
21
dilakukan penepatan pH. Setelah pH diatur pada 5.6-5.8, ditambahkan agar-agar sebanyak 8 gr. Kemudian larutan dimasak hingga mendidih dan terlihat jernih. Larutan dituangkan ke dalam botol yang telah disterilkan sebanyak 25 ml/botol. Botol kultur yang telah berisi media ditutp rapat dengan aluminium foil atau tutup khusus yang dibuat dengan bahan tahan panas. Pada tutup tersebut, selanjutnya dibubuhkan label yang berisikan nama media, selanjutnya disterilkan dengan autoclave selama 20-25 menit pada tekanan 20 psi. Media yang sudah disterilkan, sebelum digunakan sebaiknya diinkubasikan terlebih dahulu selama 3-4 hari untuk memastikan bahwa media kultur yang dibuat sudah benarbenar steril.
Modifikasi Komposisi Media Kultur Jaringan Tanaman Pada awalnya, unsur-unsur makro pada media kultur jaringan tanaman dibuat berdasarkan larutan untuk hidroponik. garam-garam anorganik.
Unsur-unsur hara diberikan dalam bentuk
Komposisi media dan perkembangannya didasarkan pada
pendekatan masing-masing peneliti. Media yang paling sering digunakan untuk induksi akar adalah media White, media ini mengandung garam-garam makro dengan konsentrasi rendah. Pada tahun 1937 Nobecourt untuk menumbuhkan kalus wortel menggunakan setengah konsentrasi dari larutan Knop yang biasa digunakan untuk hidroponik. Hildebrant dan kelompoknya pada tahun 1946 telah memodifikasi media White untuk kultur jaringan tumor tembakau dan bunga matahari. Pada tahun 1922, Knudson menemukan bahwa penambahan 7,6 mM NH4 + di samping 8,5 mM NO3+ sangat baik untuk perkecambahan dan pertumbuhan biji anggrek. Penelitian perbaikan komposisi media di laboratorium Skoog dikulminasikan dalam publikasinya tahun 1962 tentang kebutuhan garam anorganik yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur jaringan tembakau. Media hasil modifikasi dari penelitian-penelitian terdahulu tersebut diberi nama media Murashige & Skoog (MS). Media MS ini mengandung unsur hara makro dan mikro yang lebih tinggi dibandingkan media Miller, Hildebrant, dan White.
Setelah penemuan media MS, banyak
22
dikembangkan media lain berdasarkan media MS tersebut seperti media Durzan dkk. (1973). Walaupun unsur-unsur makro MS merupakan titik tolak pengembangan mediamedia lain, namun pada kasus-kasus tertentu, pemakaian konsentrasi unsur-unsur makro yang lebih rendah dari pada konsentrasi yang terdapat pada media MS terbukti lebih baik. Penelitian terakhir menunjukkan bahwa dalam media MS dapat terjadi pengendapan persenyawaan yang dapat dilihat pada media cair. Pada tahun 1983, Dalton dan kawan-kawan menemukan, bahwa pada media cair MS terjadi pengendapan Fe sebanyak 50% dan 13 % PO4+ . Untuk mengatasi pengendapan Fe, Dalton dan kawan-kawan menganjurkan supaya konsenrasi Fe dikurangi sampai 1/3 dengan EDTA yang tetap. Media MS dan modifikasinya saat ini paling luas penggunaannya. Apabila akan memodifikasi komposisi media kultur, hal yang harus menjadi pertimbangan adalah tahapan regenerasi kultur seperti stadia pembentukan akar, tunas, pucuk, atau kalus; serta kebutuhan unsur hara, vitamin, dan zat pengatur tumbuh tanaman.
Persiapan eksplan Tanaman Pangan dan Hortikultura Eksplan adalah bagian dari tanaman yang digunakan dalam kultur jaringan atau mikropropagasi tanaman. Seluruh bagian tanaman (daun, batang, akar, pucuk, biji) dapat dipergunakan sebagai bahan eksplan, namun yang biasanya dipergunakan adalah mata tunas dan tunas pucuk (shoot tip). Eksplan dapat juga berupa embrio (kelapa), biji (anggrek), umbi (wortel), keping biji (kotiledon pada kacang-kacangan), benang sari dan putik (padi). Bahan eksplan dapat diambil dari tanaman yang tumbuh di lapang atau tanaman hasil kultur jaringan in vitro. Tanaman induk yang akan digunakan sebaiknya dari jenis yang unggul
dan diketahui varietasnya. Jika eksplan yang akan digunakan bagian
vegetative tanaman, maka tanaman induk dipilih yang sehat dan sedang dalam fase pertumbuhan cepat. Sebelum dilakukan pengambilan bahani eksplan, tanaman induk yang tumbuh di lapang, perlu disemprot dengan fungisida dan insektisida untuk mencegah terdapatnya kontaminan yang berasal dari lapang. Pemelihan bagian tanaman sebagai bahan eksplan menentukan keberhasilan eksplan untuk dikulturkan. 23
Pada dasarnya setiap bagian tanaman dapat dijadikan sebagai bahan eksplan, tetapi dalam
memilih bagian
tanaman
yang
akan
dijadikan
bahan
eksplan
harus
mempertimbankan faktor kemudahan beregenerasi dan tingkat kontaminasinya. Bagian tanaman yang mudah beregenerasi adalah organ yang jaringannya meristematik seperti pucuk (ujung batang atau cabang) dan ujung akar. Bahan eksplan yang diperoleh dari dalam tanah seperti umbi (gladiol, kentang) tingkat kontaminasinya lebih tinggi dibandingkan bahan eksplan yang berada di atas permukaan tanah (biji, embrio). Oleh karena itu, jika harus menggunakan bahan eksplan yang berada di bawah permukaan tanah, terlebih dahulu tanaman induk dikodisikan
dalam lingkungan yang lebih
terkendali, misalnya menggunakan media tanam yang bebas patogen, ditanam dalam green house dan menggunakan pot, dan pemeliharaan yang intensif. Pengambilan
bahan
eksplan
dari
tanaman
induk
dilakukan
dengan
mempergunakan peralatan yang bersih dan tajam. Bahan eksplan selanjutnya dibawa ke dalam laboratorium untuk dilakukan sterilisasi. Tahapan, bahan, dan durasi sterilisasi pada tiap jenis tanaman dan sumber eksplan tidak sama, namun secara umum sterilisasi eksplan dilakukan dengan mencuci eksplan dalam air bersih yang mengalir, merendam dalam larutan deterjen, merendam dalam larutan fungisida, merendam dalam larutan sublimat (HgCl2), sterilisasi bertingkat dengan larutan Clorox (pemutih pakaian, Bayclin®), serta pembilasan dengan aquadest steril berkali-kali.
Penanaman eksplan Setelah media kultur dibiarkan selama 3 hari dan tidak menunjukkan adanya kontaminan pada permukaan media, maka kegiatan penanaman eksplan dapat dilakukan. Eksplan sebelum ditanam pada media kultur, terlebih dahulu dilakukan sterilisasi, seperti bahasan sebelumnya. eksplan yang telah dibilas dengan air steril diletakkan di dalam petridish yang di dalamnya dialasi tissue steril. Fungsi tissue ini adalah sebagai penyerap air bekas bilasan, sehingga eksplan kering. Peralatan dan bahan yang perlu disiapkan dan diletakkan di atas meja laminar adalah ; pinset, gunting, pisau scapel, botol berisi alkohol 96 % atau spritus putih, lampu bunsen, lap steril, dan air steril. Peralatan dan bahan ini disemprot terlebih dahulu dengan alkohol 70 % sebelum dimasukkan ke dalam meja laminar. 24
Proses penanaman eksplan 1. Langkah awal adalah, menata peralatan dan bahan sedemikian rupa di dalam LAF sehingga memudahkan proses penanaman. Botol berisi media disusun dan diletakkan di sebelah kiri, petridish tepat di depan, lampu bunsen letakkan di depan sebelah kiri dari petridish, botol yang berisi alkohol sebagai tempat pinset diletakkan di sebelah kanan. 2. Kemudian nyalakan lampu bunsen. 3. Bakar pinset di atas lampu bunsen dari pangkal sampai ujung. Lakukan 2 – 3 kali. Langkah ini untuk memusnahkan spora jamur atau bakteri yang masih menempel pada pinset. 4. Letakkan pinset di atas petridish steril 5. Ambil botol media dan buka. 6. Ambil eksplan dengan pinset dan masukkan langsung ke dalam botol kultur. 7. Tutup rapat dan letakkan di sebelah kanan. 8. Agar kontaminan dari luar tidak masuk, tutup botol dapat dilapisi plastik klin wrap. 9. Beri label tanggal penanaman, jenis tanaman dan nama media. Apabila metode sterilisasi bahan eksplan dan teknik isolasi sudah dilakukan sesuai prosedur, dan eksplan dianggap sudah aseptis, namun ternyata beberapa hari setelah penanaman masih terdapat kontaminan dalam media kultur, hal ini diduga penyebab kontaminan tersebut adalah ruang tanam (LAF) yang tidak steril disamping media dan eksplan terlalu lama terbuka pada saat penanaman.
Subkultur Subkultur adalah pemindahan kultur dari media lama ke media baru setelah suatu masa kultur untuk memperoleh pertumbuhan baru yang diinginkan. Alasan pengadaan subkultur adalah sebagai berikut. 1. Pertumbuhan kultur yang cepat dan telah memenuhi botol. 2. Kultur perlu diperbanyak lebih lanjut, terutama dalam tujuan perbanyakan.
25
3. Terjadi proses pencokelatan (browning) terutama pada awal inisiasi, akibat persenyawaan-persenyawaan polifenolik yang keluar dari bekas irisan. 4. Media tumbuh mengering (agar-agar menciut) atau media cair sudah habis. 5. Nutrient dalam media sudah habis, kultur sudah mulai menunjukkan gejala defisiensi. 6. Kultur memerlukan media yang susunannya baru, agar berdiferensiasi lebih lanjut. Dalam kultur kalus, pemindahan kalus ke media lain dapat menginduksi terbentuknya pucukatau embrio somatik. 7. Kultur menunjukkan gejala vitrous (daun dan batang lunak, agak transparan akibat kurang lignin) dan perlu dipindahkan ke media lain dengan sitokinin yang lebih rendah. Dalam usaha perbanyakan tanaman, subkultur diperlukan agar diperoleh populasi pucuk yang banyak sekali. Dari satu pucuk yang kemudian menjadi 20 pucuk, dapat dipisahkan menjadi 20 propagul. Setelah masa induksi 6-8 minggu, ke-20 propagul masing-masing telah membentuk sejumlah pucuk lagi. Biasanya subkultur dilakukan sampai 6 kali, sampai terjadi populasi yang besar. Kelebihan kultur in vitro adalah bahwa pucuk atau hasil perbanyakan pertama dapat langsung dipergunakan untuk perbanyakan selanjutnya. Pelaksanaan subkultur perlu juga memperhatikan propagul yang disubkulturkan. Bila pucuk menunjukkan pertumbuhan yang abnormal seperti: pucuk yang gemuk pendek bergerombol, berwarna pucat, dan kecil-kecil menggerombol tanpa meninggi maka pucuk demikian tidak disubkulturkan. Pada jenis tanaman yang beruas, selain pemisahan longitudinal juga dapat dilakukan pemisahan transfersal, yaitu per ruas.
Aklimatisasi Planlet Tanaman Pangan dan Hortikultura Pucuk-pucuk dan planlet dari in vitro yang diregenerasikan di dalam lingkungan dengan kelembapan yang tinggi dan bersifat heterotrof, harus berubah menjadi autotrof bila dipindahkan ke tanah atau lapangan. Proses pemindakan merupakan langkah akhir dari prosedur mikropropagasi dan diistilahkan sebagai tahap aklimatisasi. Aklimatisasi yaitu suatu upaya mengkondisikan planlet atau tunas mikro hasil perbanyakan melalui
26
kultur in vitro ke lingkungan in vivo yang aseptik. Aklimatisasi merupakan proses yang penting dalam rangkaian aplikasi kultur jaringan untuk mendukung pengembangan pertanian. Masa aklimatisasi merupakan masa yang kritis karena pucuk atau planlet yang diregenerasikan dari kultur in vitro menunjukkan beberapa sifat yang kurang menguntungkan seperti lapisan lilin (kutikula) tidak berkembang dengan baik, kurangnya lignifikasi batang, jaringan pembuluh dari akar ke pucuk kurang berkembang dan stomata sering sekali tidak berfungsi (tidak menutup ketika penguapan tinggi). Keadaan ini menyebabkan pucuk-pucuk in vitro sangat peka terhadap transpirasi, serangan candawan dan bakteri, cahaya dengan intensitas yang tinggi dan suhu yang tinggi. oleh karena itu, aklimatisasi pucuk-pucuk in vitro memerlukan penanganan yang khusus, bahkan diperlukan modifikasi terhadap kondisi kondisi lingkungan terutama dalam kaitannya dengan suhu, kelembapan, dan intensitas cahaya. Di samping itu, medium tumbuh pun memiliki peranan yang cukup penting, khususnya bila pucuk-pucuk mikro yang diaklimatisasikan belum membentuk sistem perakaran yang baik Karakteristik planlet kultur In vitro Tanaman yang berasal dari kultur in vitro sangat berbeda bila dibandingkan dengan tanaman yang hidup pada kondisi in vivo. Beberapa karakteristik khas tanaman hasil perbanyakan in vitro diuraikan sebagai berikut.
Daun Tanaman yang berasal dari kultur in vitro sering memperlihatkan lapisan lilin (kutikula) yang kurang berkembang sebagai akibat tingginya kelembapan di dalam wadah kultur (90-100%). Hal ini menyebabkan tanaman kehilangan air dalam jumlah yang cukup besar melalui evaporasi kutikula pada saat tanaman dipindahkan ke tanah karena kelembapan udara pada kondisi in vivo jauh lebih rendah dibandingkian dengan kondisi in vitro. Planlet kadang-kadang memiliki daun yang tipis, lunak, tidak aktif berfotosintesis, dan tidak adaptif terhadap kondisi in vivo. Sel- sel palisade lebih kecil dan lebih sedikit jumlahnya sehingga tidak dapat menerima cahaya secara efisien dengan rongga udara mesofil yang lebih besar dibandingkan tanaman normal. Stomata tidak berfungsi dengan sempurna
27
dan tidak menutup sehingga menyebabkan terjadinya cekaman air pada beberapa jam pertama aklimatisasi.
Jaringan angkut
Pada planlet hasil kultur jaringan, sistem pumbuluh angkut antara pucuk dan akar sering tidak terhubung dengan sempurna sehingga menyebabkan berkurangnya transport air dan unsur hara. Harus diingat bahwa dalam keadaan in vitro tanaman bersifat heterotrof sedangkan pada keadaan in vivo tanaman dituntut untuk menjadi autotrof, kebutuhan karbohidratnya harus disuplai melalui fotosintesis yang salah satu bahan bakunya adalah air.
Sistem perakaran pada planlet yang berasal dari kultur jaringan cenderung mudah rusak dan tidak berfungsi dengan sempurna pada keadaan in vivo, misalnya akar yang terbentuk sedikit atau tidak ada sama sekali. Akar yang tidak berkembang dengan sempurna akan membuat pertumbuhanm tanaman pada kondisi in vivo sangat tertekan, terutama pada evaporasi tinggi. Untuk mengatasi masalah perkembangan system perakaran pada tahap aklimatisasi, dapat diterapkan langkah-langkah sebagai berikut :
Upayakan tanaman yang masih berada pada lingkungan in vitro membentuk primordial akar yang akan tumbuh menjadi akar fungsional pada kondisi in vivo,
Ciptakan kondisi yang memungkinkan untuk terjadinya perkembangan akar in vitro, misalnya menggunakan medium cair kemudian akar-akar tersebut akan berfungsi secara normal pada saat planlet dipindahkan ke tanah.
Aklimatisasikan planlet ke tanah setelah tahap perakaran. Pada saat memasuki tahap perakaran, rendam bagian pangkal planlet dalam larutan auksin untuk merangsang pembentukan akar.
Faktor-faktor yang mempengaruhi tahap aklimatisasi
Keberhasilan aklimatisasi ditentukan oleh berbagai faktor. Secara umum, faktor- faktor yang berpengaruh terhadap keberhasilan aklimatisasi tanaman adalah kondisi planlet 28
(ukuran bibit, perakaran), kondisi lingkungan (ketepatan media tumbuh yang digunakan dan kelembapan udara), ketepatan perlakuan pra dan pasca transplantasi dari media in vitro ke media tanah, dan sanitasi lingkungan dari infeksi penyakit Ukuran Bibit Ukuran bibit hasil kultur in vitro memengaruhi keberhasilan tahap aklimatisasi tanaman. Penggunaan bibit kultur yang kurang vigor menyebabkan tanaman banyak yang mati. Bibit yang berukuran besar berpeluang tumbuh dengan baik dan sehat. Akar Salah satu faktor yang sangat menentukan keberhasilan aklimatisasi adalah perakaran. Akar yang makin banyak akan meningkatkan bidang serapan hara. Jangkauan akar yang luas dapat memenuhi kebutuhan air secara cepat yang hilang akibat laju transpirasi yang tinggi. Laju transpirasi bibit kultur umumnya sangat tinggi akibat kurang sempurnanya jaringan dan sistem pembuluh tanaman. Hal ini juga dipengaruhi oleh perubahan suhu dan kelembapan dari lingkungan in vitro ke lingkungan in vivo yang berbeda. Lingkungan Faktor lingkungan yang mempengaruhi tahap aklimatisasi adalah suhu, kelembapan udara, intensitas cahaya, dan infeksi penyakit.
Suhu Udara Selama dalam lingkungan in vitro, planlet memperoleh suhu yang relatif sama, yaitu 25 ± 1°C. saat dipindahkan ke kondisi in vivo maka suhu udara akan mengalami variasi yang terkadang cukup besar. Suhu lingkungan in vivo dapat mencapai 18°C pada malam hari atau 32°C pada siang hari. Kondisi suhu yang ekstrim, terutama suhu tinggi akan mengakibatkan pertumbuhan planlet tertekan, bahkan dapat berakibat pada kegagalan aklimatisasi. Oleh karena itu, suhu di areal aklimatisasi harus diatur sedemikian ruipa agar mendekati suhu in vitro, kemudian secara bertahap dapat dinaikkan seiring dengan semakin kuatnya pertumbuhan tanaman. Kelembapan udara
29
Planlet hasil mikropropagasi terbiasa hidup di lingkungan dengan kelembapan tinggi, berkisar 90-100%. Kondisi tersebut menyebabkan planlet tidak mengembangkan system pertahanan yang baik dalam menghadapi cekaman kekeringan. Oleh karena itu, aklimatisasi hendaknya dilakukan dengan menurunkan kelembapan udara secara bertahap. Pada tahap awal, planlet dapat di tempatkan di bawah sungkup plastik secara individual, kemudian sungkup tersebut dibuka dan planlet dipelihara di bawah naungan massal sebelum akhirnya dipindahkan ke lapangan. Intensitas cahaya Intensitas cahaya memiliki hubungan yang erat dengan suhu dan kelembapan udara. Biasanya dengan intensitas cahaya yang tinggi dapat menginduksi terciptanya suhu lingkungan yang tinggi, dan sebaliknya. Oleh karena itu, intensitas cahaya di areal aklimatisasi harus diperhatikan agar suhu dan kelembapan dapat dipertahankan pada tingkat yang tidak membahayakan planlet. Pemberian naungan merupakan cara yang baik untuk menurunkan intensitas cahaya dan suhu dengan mempertahankan kelembapan agar tetap tinggi. Infeksi penyakit Kematian bibit kultur sering disebabkan oleh serangan hama atau penyakit. Kondisi lingkungan tumbuh yang kurang steril dapat menyebabkan akar atau batang bibit terserang hama. Luka akibat serangan hama dapat menjadi tempat infeksi penyakit. Serangan penyakit yang umum dijumpai adalah karena jamur dan bakteri. Serangan jamur dapat dipicu oleh pencucian bibit kultur yang kurang bersih dari media in vitro sebelum ditanam pada media berikutnya. Faktor-faktor yang harus diperhatikan untuk keberhasilan aklimatisasi
Untuk meningkatkan laju keberhasilan pada tahap aklimatisasi, perlu diperhatikan hal-hal berikut:
30
Untuk menghindari infeksi dari cendawan atau bakteri maka sisa-sisa medium (agar-agar) hendaknya dicuci sampai bersih dan gunakan tanah steril sebagai substrat aklimatisasi.
Musnahkan semua hama atau pathogen, seperti serangga, siput, cendawan, dan bakteri karena kondisi planlet masih lamah sehingga sangat rentan terhadap serangan hama dan pathogen. Lakukan pemyemprotan pestisida secara teratur.
Untuk menghindari kerusakan akar, sebaiknya lakukan penanaman planlet pada tanah yang diayak (strukturnya seragam).
Gunakan medium dengan kadar garam yang rendah pada tahap perakaran. Misalnya komposisi medium MS ½
Terkadang diperlukan perlakuan suhu rendah (5°C) selama 4-8 minggu pertama untuk mematahkan dormansi, terutama terhadap umbi-umbi in vitro.
31
