BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
A. Proses Analisis Penelitian Penelitian ini dimaksudkan untuk mengetahui pengaruh pemberian secretome sel punca mesenkimal terhadap ekspresi IL-6 dan kadar mikroalbuminuria pada mencit model lupus dengan induksi pristan. Sebelum sampai pada pengujian hipotesis penelitian, terlebih dahulu dilakukan penjelasan deskripsi variabel penelitian yaitu IL-6 dan mikroalbuminuria pada mencit sampel yang dibagi dalam tiga kelompok yaitu kelompok kontrol, pristan, dan pristan+secretome. Penelitian ini dilakukan terhadap 21 ekor mencit yang dikelompokkan menjadi tiga kelompok masing-masing kelompok berjumlah 7 ekor mencit sebagai obyek penelitian. Variasi dan perbedaan variabel yang dianalisis dalam ketiga kelompok sampel itu meliputi ekspresi IL-6 dan kadar mikroalbuminuria, masing-masing apakah terpengaruh dengan induksi pristan dan terapi secretome sel punca mesenkimal setelah diinduksi pristan tersebut. Variabel-variabel penelitian dalam masing-masing kelompok sampel, setelah dijelaskan secara deskriptif yaitu nilai parameter rata-rata dan standar deviasinya, selanjutnya dilakukan pengujian normalitas data-data variabel penelitian tersebut untuk memastikan apakah distribusi data variabel benar-benar berdistribusi normal atau tidak berdistribusi normal. Pengujian normalitas data variabel ini penting untuk menentukan analisis statistik selanjutnya yang akan digunakan untuk menganalisis variabel penelitian ekspresi IL-6 dan kadar mikroalbuminuria itu. Uji Normalitas data variabel pada penelitian ini menggunakan uji Shapiro-Wilk. Analisis penelitian ini diharapkan dapat mengidentifikasi terjadinya variasi atau perbedaan tiga rata-rata IL-6 maupun mikroalbuminuria. Variasi atau perbedaan tiga rata-rata IL-6 yang dimaksud adalah rata-rata IL-6 pada kelompok kontrol, pristan, dan pristan + secretome. Variasi atau perbedaan tiga rata-rata
mikroalbuminuria yang
dimaksud adalah rata-rata mikroalbuminuria pada kelompok kontrol, pristan, dan pristan+secretome. Dengan demikian penelitian ini menggunakan analisis statistik beda
38
39
k rata-rata (dalam hal ini 3 rata-rata) untuk sampel yang independen atau analisis variance atau uji F. Apabila hasil uji normalitas data variabel-variabel yang diteliti yaitu IL-6 dan mikroalbuminuria mendapatkan bahwa distribusi data masing-masing variabel untuk masing-masing kelompok sampel adalah berdistribusi normal, maka uji variasi atau perbedaan beberapa rata-rata dapat menggunakan alat uji statistik perametrik yaitu Analysis of Variance (ANOVA) atau disebut juga Uji F. Dan apabila variasi atau beda ketiga rata-rata atau rata-rata masing-masing variabel berdasarkan kelompok sampel itu signifikan (meyakinkan), analisis akan diteruskan dengan mencari perbedaan 2 rata-rata antar kelompok sampel untuk masing-masing variabel dengan menggunakan uji lanjutan ANOVA yaitu Post Hoc Test dengan LSD/ Bonferroni. Syarat menggunakan parametrik adalah harus memenuhi dua syarat, dimana distribusi harus normal dan homogen. Namun apabila hasil uji normalitas data masingmasing variabel menunjukkan bahwa distribusi data untuk masing-masing kelompok sampel adalah berdistribusi tidak normal atau berdistribusi normal tetapi tidak homogen maka uji variasi atau beda beberapa rata-rata dapat menggunakan uji statistik non parametrik Kruskal Wallis. Penelusuran lebih lanjut untuk menguji beda rata-rata antar masing-masing kelompok sampel dapat menggunakan analisis statistik non parametrik Mann-Whitney. B. Deskripsi Variabel Penelitian
Variabel penelitian yang diduga dipengaruhi oleh terapi secretome terdiri dari dua variabel yaitu variabel ekspresi IL-6 dan kadar mikroalbuminuria dan yang masingmasing bersifat kuantitatif dengan skala data rasio. Deskripsi variabel ekspresi IL-6 dan kadar mikroalbuminuria yang bersifat kuantitatif dibatasi pada pengungkapan nilai statistik rata-rata dan standar deviasi. Pengujian normalitas data variabel ekspresi IL-6 pada ketiga kelompok berdistribusi normal. Kemudian dilanjutkan dengan uji homogenitas dengan uji Levene, dimana didapatkan ekspresi IL-6 tidak homogen. Sementara untuk data variabel kadar mikroalbuminuria untuk ketiga kelompok kontrol berdistribusi normal dan tidak homogen. Deskripsi obyek penelitian berdasarkan nilai rata-rata dan standar deviasi serta hasil pengujian normalitas data atas variabel ekspresi IL-6 adalah sebagai berikut:
40
Tabel 4. Deskripsi dan Uji Normalitas Variabel ekspresi IL-6 (per 100 sel makrofag) Kelompok
Rata-rata±SD
1. Kontrol
7,57±1,51
Uji Normalitas Stat-SW Sig 0,915 0,432
2. pristan
15,00±5,42
0,925
0,508
3. pristan + secretome 9,14±1,77 0,920 Sumber: Data Primer 2016, diolah. Keterangan : * Signifikan pada derajat signifikansi 5% **Signifikan pada derajat signifikansi 1%
0,471
Berdasarkan deskripsi variabel IL-6 di atas, nampak bahwa mencit yang diberikan perlakuan pristan memiliki rata-rata IL-6 lebih tinggi dibandingkan pada kelompok kontrol. Pemberian secretome menurunkan rata-rata ekspresi IL-6 pada mencit yang telah diinduksi pristan, meskipun tidak sampai normal. Selanjutnya deskripsi obyek penelitian berdasarkan nilai rata-rata dan standar deviasi variabel kadar mikroalbuminuria adalah sebagai berikut: Tabel 5. Deskripsi dan Uji Normalitas Variabel kadar mikroalbuminuria (µg/ml) Kelompok
Rata-rata ± SD
1. Kontrol 2. pristan 3. pristan+
secretome
Uji Normalitas Stat-SW
Sig
27,53± 3,03
0,916
0,438
48,70 ± 23,70
0,834
0,087
31,04± 2,84
0,876
0,211
Sumber: Data Primer 2016, diolah. Keterangan : * Signifikan pada derajat signifikansi 5%. **Signifikan pada derajat signifikansi 1% Berdasarkan deskripsi variabel kadar mikroalbuminuria di atas, nampak bahwa induksi pristan meningkatkan kelompok
kontrol.
Pemberian
rata-rata kadar mikroalbuminuria dibandingkan secretome
mampu
menurunkan
rata-rata
mikroalbuminuria. Dari hasil uji homogenitas Levene didapatkan hasil tidak homogen. Dengan demikian distribusi data variabel espresi IL-6 dan kadar mikroalbuminuria sudah dideskripsikan secara ringkas dan sudah dilakukan pengujian normalitas dan
41
homogenitas data terhadap variabel tersebut dan hasilnya distribusi data variabel IL-6 normal namun tidak homogen, sedangkan distribusi variabel mikroalbuminuria normal dan tidak homogen. 1. Analisis
Pengaruh
Secretome
terhadap
ekspresi
IL-6
dan
kadar
mikroalbuminuria pada Mencit yang Terinduksi Pristan
Langkah pertama menguji variasi atau beda k rata-rata berdasarkan kelompok sampel untuk variabel IL-6. Distribusi data variabel IL-6 berdistribusi normal dan tidak homogen, maka pengujian variasi atau beda 3 rata-rata menggunakan uji non parametrik Kruskall Wallis dilanjutkan Mann-Whitney. Hasil pengujian Kruskal Wallis untuk variabel IL-6 adalah sebagai berikut: Tabel 6. Variasi atau Perbedaan Tiga Rata-rata Variabel IL-6 menurut Kelompok Sampel (per 100 sel makrofag) Kontrol
Pristan
Rata-rata ± SD Rata-rata ± SD 7,57±1,51 15,00±5,42 Chi square 9,539 Asymp sig 0,008** Sumber: Data Primer 2016, diolah. Keterangan : * Signifikan pada derajat signifikansi 5%. **Signifikan pada derajat signifikansi 1%
Pristan+secretome Rata-rata ± SD 9,14±1,77 Signifikan
Hasil analisis variasi atau beda 3 rata-rata di atas menunjukkan bahwa perbedaan 3 rata-rata variabel IL-6 tersebut menghasilkan nilai Chi-square 9,539 dengan tingkat signifikansi sebesar 0,008 yang berarti beda 3 rata-rata itu signifikan atau meyakinkan pada derajat signifikansi 1 persen (p < 0,01). Hal itu berarti beda rata-rata variabel IL-6 pada kelompok kontrol, pristan dan pristan+secretome benar-benar berbeda secara meyakinkan. Jika dibandingkan dengan rata-rata IL-6 kelompok kontrol, kelompok pristan memiliki kecenderungan rata-rata IL-6 lebih tinggi (meningkat), kemudian ratarata IL-6 pada kelompok terapi secretome memiliki rata-rata lebih rendah dibandingkan pada kelompok pristan atau berarti IL-6 dapat diturunkan/ditekan dengan pemberian secretome. Hasil penelusuran beda dua rata-rata variabel IL-6 antar kelompok sampel dapat dijelaskan dengan tabel sebagai berikut:
42
Tabel 7. Penelusuran Beda Dua Rata-rata Variabel IL-6 Antar Kelompok Sampel (Per 100 Sel Makrofag) Kelompok
Mann-
Wilcoxon
Z
Sig.
Kontrolvs Pristan Pristan vs Pristan
Whitney U 3,000 9,000
W 31,000 37,000
-2,762 -1,998
(2 tailed) 0,006 0.046
12,000
40,000
-1.619
0,106
+ Secretome Kontrol
vs
pristan+secretom e Sumber: Data Primer 2016, diolah. Keterangan : * Signifikan pada derajat signifikansi 5%. **Signifikan pada derajat signifikansi 1% Perbedaan ekspresi IL-6 antara kelompok kontrol dan kelompok pristan terdapat pada tabel 7, dimana didapatkan ekspresi IL-6 berbeda secara signifikan (asymp.significan (2-tailed) =0,006), sehingga dengan pemberian pristan berpengaruh terhadap ekspresi Interleukin 6. Perbedaan ekspresi IL-6 antara kelompok pristan dan kelompok pristan+ secretome terdapat pada tabel 7, dimana didapatkan ekspresi IL-6 berbeda secara signifikan (asymp.significan (2-tailed) =0,046), dan perbedaan ekspresi antara kelompok kontrol dan pristan+secretome (asymp.significant(2 tailed))=0,106) sehingga dengan pemberian secretome berpengaruh menurunkan terhadap ekspresi interleukin 6 pada kelompok mencit model lupus dengan induksi pristan dengan nilai yang kembali ke normal.
43
Perbedaan rata-rata kadar IL-6 antar kelompok sampel itu dapat digambarkan sebagai berikut: p = 0,106
p = 0,006**
p = 0,046*
Gambar 11. Perbandingan Nilai Rata-rata ekspresi IL-6 (per 100 sel makrofag) antar Kelompok Sampel Hasil analisis beda 2 rata-rata sampel independen menggunakan penelusuran Kruskall Wallis dilanjutkan Mann Whitney diatas menunjukkan bahwa uji terhadap variabel IL-6 antara kelompok kontrol dan pristan signifikan pada asymp significan (2tailed) sebesar 0,006 persen (p < 0,01). Hal itu dapat dikatakatan bahwa pada mencit kelompok pristan variabel IL-6 berbeda secara meyakinkan dibandingkan kelompok kontrol. Setelah diberikan terapi secretome maka rata-rata variabel IL-6 lebih rendah) dibandingkan pada kelompok pristan dengan tingkat asymp. Signifikansi (2-tailed) sebesar 0,046 (p < 0,05). Dengan demikian hipotesis kedua yang menyatakan bahwa: “Pemberian secretome menurunkan terhadap ekspresi IL-6 pada mencit model lupus induksi pristan” benar-benar dapat terbukti secara meyakinkan. Berikut ini gambar ekspresi IL-6 dengan teknik pengecatan imunohistokimia pada mikroskop:
44
Gambar 12. Ekspresi Interleukin 6 pada kontrol dengan perbesaran 400x. Anak panah menunjukkan makrofag yang tercat coklat.
Gambar 13. Ekspresi IL-6 pada kelompok pristan dengan perbesaran 400x.
45
Gambar 14. Ekspresi IL-6 pada kelompok pristan+secretome dengn perbesaran 400x Langkah kedua menguji variasi atau beda k rata-rata berdasarkan kelompok sampel untuk variabel kadar mikroalbuminuria. Distribusi data variabel kadar mikroalbuminuria semua berdistribusi normal, namun tidak homogen, maka pengujian variasi atau beda 3 rata-rata itu menggunakan Kruskall Wallis dilanjutkan MannWhitney. Hasil pengujian Kruskall Wallis untuk variable kadar mikroalbuminuria adalah sebagai berikut: Tabel 8. Variasi atau Perbedaan Tiga Rata-rata Variabel kadar
mikroalbuminuria
(µg/ml) menurut Kelompok Sampel. Kontrol
pristan
Pristan+secretome
Rata-rata
SD
Rata-rata
SD
Rata-rata
SD
27,53
3,03
48,70
23,70
31,04
2,84
Chi-square 10,180
Signifikansi = 0,006**
Signifikan
Sumber: Data Primer 2016, diolah. Keterangan : *) Signifikan pada derajat signifikansi 5 persen. **) Signifikan pada derajat signifikansi 1 persen. Hasil analisis variasi atau beda 3 rata-rata di atas menunjukkan bahwa perbedaan 3 rata-rata variabel kadar mikroalbuminuria tersebut menghasilkan nilai chi square=10,180 dengan tingkat signifikansi sebesar 0,006 yang berarti beda 3 rata-rata itu signifikan atau meyakinkan pada derajat signifikansi 1 persen (p<0,05). Hal itu
46
berarti beda rata-rata variabel kadar mikroalbuminuria pada kelompok kontrol, pristan, dan pristan+secretome benar-benar berbeda secara meyakinkan. Jika dibandingkan dengan rata-rata kadar mikroalbuminuria pada kelompok kontrol, kelompok pristan memiliki kecenderungan rata-rata kadar mikroalbuminuria lebih tinggi (meningkat), kemudian rata-rata kelompok pristan+secretome memiliki rata-rata lebih rendah atau berarti kadar mikroalbuminuria dapat ditekan dengan pemberian secretome . Hasil penelusuran beda dua rata-rata variabel kadar mikroalbuminuria antar kelompok sampel dapat dijelaskan dengan tabel sebagai berikut: Tabel 9. Penelusuran Beda Dua Rata-rata Variabel kadar mikroalbuminuria (µg/ml) antar Kelompok Sampel Kelompok
MannWhitney U 3,500 5,000
Wilcoxon W 31,500 33,000
Z
Kontrol vs Pristan -2,689 Pristan vs Pristan -2,497 + Secretome Kontrol vs 13,500 41,500 -1,409 Pristan+secretom e Sumber: Data Primer 2016, diolah. Keterangan : *) Signifikan pada derajat signifikansi 5 persen. **) Signifikan pada derajat signifikansi 1 persen. Perbedaan
Sig. (2 tailed) 0,007 0.013 0,159
rata-rata kadar mikroalbuminuria antar kelompok sampel itu dapat
digambarkan sebagai berikut:
47
p = 0,159
p = 0,007**
p = 0,013*
pristan
pristan + secretome
Gambar 15. Perbandingan Nilai kadar mikroalbuminuria (µg/ml) antar
Kelompok
Sampel Hasil analisis beda 2 rata-rata sampel independen menggunakan penelusuran Mann-Whitney
diatas
menunjukkan
bahwa
uji
terhadap
variabel
kadar
mikroalbuminuria antara kelompok Kontrol dan pristan signifikan pada derajat signifikansi sebesar 0,007 persen (p < 0,01). Hal itu dapat dikatakatan bahwa pada mencit kelompok pristan rata-rata kadar mikroalbuminuria lebih tinggi (meningkat) secara meyakinkan dibandingkan kelompok kontrol. Setelah diberikan terapi secretome (pristan+secretome) maka rata-rata variabel kadar mikroalbuminuria lebih rendah (mengalami penurunan) dibandingkan pada kelompok pristan dengan tingkat signifikansi sebesar 0,013 (p < 0,05). Sedangkan perbandingan kontrol dengan pristan +secretome tidak terdapat perbedaan bermakna (p=0,159). Dengan demikian hipotesis kedua yang menyatakan bahwa: “Pemberian secretome menurunkan terhadap kadar mikroalbuminuria pada mencit model lupus induksi pristan” benar-benar dapat terbukti secara meyakinkan. Pengaruh rata-rata kadar mikroalbuminuria akibat terapi pristan yaitu mendekati normal.
48
C. Pembahasan 1. Berdasarkan Prinsip Ontologi Berdasarkan prinsip ontologi, pemberian secretome akan menurunkan ekspresi IL-6, kadar mikroalbuminuria pada mencit model lupus dengan induksi pristan. Mekanisme utama pristan dalam menginduksi autoimunitas adalah dengan adanya produksi interferon 1, yaitu berupa IFN α dan IFN β. IFN 1 akan berikatan dengan reseptornya IFNAR dan menyebabkan aktifasi respon imun innate dan adaptif (Reeves et al, 2009). Adanya inflamasi pada peritoneum akan menyebabkan pengeluaran dari monosit imatur Ly6C dari sumsum tulang. Monosit imatur Ly6C inilah yang berperan memproduksi IFN 1 melalui berbagai mekanisme yang komplek. Monosit ini akan berubah menjadi makrofag di jaringan. Adanya sisa apoptosis dari sel akan dikenali oleh TLR7, suatu sensor untuk unmethylated CpG DNA yang dapat mengenali asam nukleat (Reeves et al., 2009) Rangsangan endosomal TLR 7 selanjutnya akan merangsang molekul adaptor MyD88 (Kawai dan Akira, 2007). Langkah selanjutnya melibatkan kinase IRF (interferon regulatory factor) 7. Sinyal dari IRF 7 ini akan menyebabkan transkripsi gen IFN 1 dan terjadi produksi IFN 1 yaitu IFN α dan IFN β (Reeves et al, 2009). Interferon α akan mengaktifkan dari sel T autoreaktif, sel dendritik imatur, dan sel T CD8 sitotoksik. Selanjutnya akan mengaktifkan dari sel limfosit B autoreaktif, terjadi proliferasi dari sel B dan sel plasma. Terjadi peningkatan produksi IG G, yaitu anti ds DNA. Adanya auto antigen, antibodi ds DNA bersama dengan sistem komplemen dan beberapa faktor lainnya akan menimbulkan kompleks imun (Banchereau dan Pasqual, 2006). Kompleks antigen-autoantibodi yang berada di sirkulasi akhirnya akan terdisposisi pada sel target, termasuk sel mesangial, podosit, sel tubulus dan sel endotel di glomerulus. Kompleks ini akan menyebabkan terjadinya glomerulosklerosis dan fibrosis interstisial pada ginjal, selanjutnya menyebabkan kerusakan pada ginjal dan terjadilah mikromikroalbuminuria. Disamping itu, terjadinya disfungsi endotel pada pembuluh darah, juga akan terjadi disfungsi endotel kapiler glomerulus yang akan mengurangi negatifitas sehingga terjadi mikroalbuminuria. (Banchereau dan Pasqual, 2006).
49
Penggunaan pristan akan terjadi reaksi inflamasi akibat bahan-bahan kimiawi (pristan) dan fragmentasi sel ataupun molekul damage-associated molecular pattern (DAMP) akibat proses apoptosis dapat menimbulkan aktivasi makrofag, menginduksi terjadinya aktivasi NFβ dan memproduksi sitokin proinflamasi. Sitokin IL-6 akan menginduksi endotelin, endotelin akan mengaktifkan NADPH dan terbentuklah ROS. Selain itu, TNF-α juga akan mengaktifkan NADPH untuk membentuk ROS (Boeltz, 2013). Ekspresi gabungan sitokin dan ROS menghasilkan inflamasi ginjal dan fibrosis, yang mengakibatkan kerusakan jaringan kumulatif baik di tingkat glomerular dan tingkat tubular (Nowling dan Gilkeson, 2011). Mekanisme injeksi pristan menginduksi lupus pada mencit juga menyebabkan penyerapan autoantigen yang dihasilkan oleh kematian sel yang berkelanjutan dalam pengaturan lingkungan inflamasi dan kekurangan clearance pada
lokasi paparan
minyak hidrokarbon (pristan) dapat menyebabkan meningkatnya dan menyimpangnya presentasi autoantigen. Signalling dari TLRs dan induksi IFN tipe I tampaknya sangat penting (Boeltz, 2013). Proses selanjutnya NfB menjadi lebih aktif sehingga akan mengekspresikan sitokin-sitokin pro-inflamasi antara lain TNF-, IL-1 maupun IL-6. TNF- bersifat proteolitik, akan merusak glikoprotein sehingga muatan negatip permukaan podosit menjadi berkurang. Keadaan ini akan menyebabkan daya tolak-menolak antara podosit dan albumin berkurang, akhirnya albumin mudah menembus membran filtrasi dan akan terjadi mikromikroalbuminuria (Purwanto, 2010). Sel punca mesenkimal merupakan tipe sel punca yang dalam perkembangannya dapat menghasilkan tendon, stroma sumsum tulang, tulang rawan, tulang keras, dan sel adiposa. Sel tipe ini memiliki sifat khas yaitu tidak memiliki molekul HLA kelas II, sedangkan HLA kelas I hanya diekspresikan dalam tingkat sangat rendah. Hal ini memungkinkan penggunaan sel punca mesenkimal secara alogenik tanpa perlu pencocokan HLA terlebih dahulu. Lebih lanjut, sel punca mesenkimal ini justru memiliki kemampuan untuk meningkatkan populasi sel T regulatory, yang bersifat mensupresi imunitas yang berlebih (Hakim et al, 2008). Aktifitas terapi dari sel punca mesenkimal dipicu oleh kebutuhan fisiologis dari sel punca mesenkimal pada kultur standar yang menggunakan monolayer dan akan mensekresikan sitokin, micro RNA (miRNA), exosomes dan microvesicles. Teori konsep
50
bahwa sel punca messenkimal berfungsi sebagai “repaircells ” bagi tubuh menunjukkan bahwa sel punca mesenkimal tidak hanya mensekresi factor regenerative, akan tetapi juga beberapa factor yang tergantung dari rangsangan. Ada beberapa rangsangan yang ditambahkan pada medium kultur, meliputi prekondisi hipoksia, penambahan rangsang inflamasi, dan penumbuhan sel kultur dalam bidang 3 dimensi akan merangsang sekresi dari faktor terapi sesuai yang diharapkan (Madrigal et al, 2014).Sel punca messenkimal akan menekan sel B autoreaktif dan diferensiasi (Sun et al, 2009). Secretome sel pada penelitian ini diperoleh dengan metode hipoksia, sehingga mendukung aktivasi caspase 3, Bcl-2, MTP-2, TGF- β1 pada sel target meningkatkan resistensi apoptosis, antiinflamasi, meningkatkan kapasitas regeneratif dari otot dan selsel endotel (Madrical et al., 2014). Media sekresi sel punca mesenkimal mempunyai efek imunomodulasi dan anitinflamasi. Pada prekondisi hipoksia akan menyebabkan sekresi dari VEGF, HGF 1, IGF -1, SDF-1. (Madrigal et al, 2014; Coradini et al., 2004)) VEGF akan meningkatkan angiogenesis dan mencegah apoptosis endotel (Oyama et al., 1998) sehingga akan mengurangi derajat vaskulitis. HGF berperan dalam menurunkan aktifitas autoreaktif sel limfosit B (Khuwoira et al., 2006), sehingga produksi antibodi akan menurun. Selain itu HGF juga akan menurunkan apoptosis endotel (Nakagami, 2004; Yasuda et al, 2012) sehingga akan menurunkan vaskulitis. IGF 1 berperan dalam menurunkan apoptosis endotel (Koojiman et al., 2004) dan meningkatkan toleransi dari sel APC (Fernandez et al., 2004). Sedangkan SDF akan meningkatkan
apoptosis sel T autoreaktif) dan
menurunkan sel B autoreaktif (Biajoux et al., 2012). Sehingga dengan pemberian media sekresi sel punca mesenkimal ini akan terjadi perbaikan dari kerusakan organ sasaran, yaitu dan perbaikan dari lupus nefritis yang ditandai dari menurunnya ekspresi IL-6 dan menurunnya kadar mikroalbuminuria 2. Berdasarkan Prinsip Epistemologi Berdasarkan prinsip epistemiologi, pemberian secretome akan berpengaruh terhadap ekspresi IL-6, kadar mikroalbuminuria pada mencit model lupus dengan induksi pristan. Hal ini dapat dilihat dari pemberian secretome 0,45 ml dosis tunggal akan menurunkan ekspresi IL-6, kadar mikroalbuminuria pada mencit model lupus dengan induksi pristan.
51
Induksi pristan 0,5 ml pada mencit BALB C akan memberikan gambaran lupus setelah 14 hari pasca perlakuan, dimana terjadi peningkatan ekspresi IL-6 dan kadar mikroalbuminuria. Hal ini sesuai dengan penelitian Chowdary (2007), dimana pada mencit setelah 14 hari pasca injeksi pristan 0,5 ml intra peritoneal terjadi peningkatan kadar IL-6 dan IL-10, peningkatan dsDNA, dan gambaran nefritis lupus WHO kelas II dan gambaran histologi paru menunjukkan gambaran makrofag yang dominan. Secretome sel punca mesenkimal pada penelitian ini dikultur dalam kondisi hipoksia, dimana menurut Chang (2011) bahwa secretome dari sumsum tulang belakang sel punca mesenkimal dapat memperbaiki fungsi neurologis pada tikus model brain injury lebih baik daripada secretome yang diproduksi dalam kondisi normoxia. Yasuda (2012) meneliti sel punca mesenkimal yangdikultur dalam kondisi hipoksia pada tikus model gagal ginjal yang diinduksi cisplatin dosis tinggi, dimana HGF yang dihasilkan menekan apoptosis. Penelitian sebelumnya tentang penggunaan secretome pada pasien gagal ginjal akut yang dilakukan oleh Wang (2011) pada hewan coba mencit. Dimana didapatkan hasil secretome memiliki efek regeneratif. Hal ini senada dengan penelitian Skullk dan Schoetheiss (2015) mengenai efek secretome pada myocarditis autoimun yang dilakukan pada mencit BALB/C yang diperiksa kadar sitokin proinflamasinya setelah 21 hari pasca injeksi secretome, dimana terjadi pengurangan lesi apoptosis dan nekrosis, diduga karena adanya penekanan inflamasi autoimun oleh penghambatan CD4+ cell dependent inflamation. Lee (2009) menunjukkan efek anti-inflamasi dan pengurangan ukuran infark jantung merupakan akibat dari secretome sel punca, hal ini didukung dengan ditemukannya sel punca messenkimal sebagai emboli pada paru-paru dan hanya beberapa sel bermigrasi ke daerah infark jantung (Lee, 2009). Sun (2009) memberi terapi 4 pasien dengan SLE dan lupus nefritis yang tidak respon dengan siklofosfamid dan prednison oral (≥ 20 mg/day) .The Disease Activity Index (SLEDAI) meningkat secara bermakna pada bulan ke 1, 6, dan ke 12, dan juga protein urin. Sel limfosit CD4+ Foxp3 (T regulatory) meningkat pada bulan ke 3, dan dosis terapi diturunkan. Tidak ada komplikasi dalam 12-18 bulan. Hasil penelitian ini mendorong penelitian lagi dengan sampel lebih besar yaitu 15 pasien SLE refrakter termasuk 4 kasus yang dilaporkan terdahulu. Pada penelitian ini sepertiga pasien
52
sebelumnya gagal terapi dengan mycophenolatemophetil (1-2 gr/day x 3 bulan) (Liang et al., 2010). Manifestasi klinis dan serologis meningkat secara dramatis. Follow up pasien selama 17.2 (3-36) bulan tanpa adanya efek buruk atau kematian. Proteinuria 24 jam menurun secara drastis adalam waktu 1 minggu setelah terapi sel punca mesenkimal, anti dsDNA menurun dalam 1 dan 3 bulan setelah terapi. Treg dimana pada SLE aktif menurun baik kuantitatif atau kualitatif (La Cava et al., 2008; Valencia et al., 2007) kembali normal dalam waktu 1 minggu dengan menghitung persentase sel limfosit CD4+ Foxp3+ pada darah tepi. Penelitian kedua dari Nanjing China dengan penggunaan sel punca mesenkimal dari darah tali pusat pada 15 pasien lupus berat (n=16). (n=16) (Sun et al., 2010). 5 pasien dari 15 kasus ginjal dengan gambaran hsitologis proliferatif nefritis dan 11 pasien mendapatkan infus siklofosfamid. Tali pusat untuk kultur sel punca mesenkimal berasal dari kelahiran normal, dikultur dalam 10% serum bovine. Follow up pasien hanya 8,25 bulan akan tetapi terjadi perbaikan yang bermakna pada skor SLEDAI, albumin serum, proteinuria urin 24 jam, creatinin, complement, dan antibodi anti dsDNA. Penelitian pengaruh secretome sel punca mesenkimal pada mencit model lupus ini diberikan secretome dosis tunggal intraperitoneal dan pemeriksaan dilakukan dalam 3 hari, berdasarkan manfaat epistomologi yaitu Gnecchi berpendapat bahwa efek klinis sel punca messenkimal tidak karena diferensiasi sel, setelah mengamati pembangunan kembali fungsi jantung dan pencegahan remodeling ventrikel dalam waktu kurang dari 72 jam pasca injeksi (Gnecchi et al, 2005). 3. Berdasarkan Prinsip Axiologi Berdasarkan manfaat axiologi, secara keseluruhan hasil penelitian ini adalah pemberian secretome dapat memberikan perbaikan pada nefritis lupus. Induksi pristan pada mencit selama minimal 2 minggu dapat menyebakan nefritis lupus WHO kelas II (Lee et al., 2010) Tidak seperti sel induk hematopoietik, imunogenisitas MSC tanpa MHC-II dan menstimulasi ekspresi molekul. (Yan et al., 2013). Keunggulan sel punca mesenkimal dibandingkan
dengan
hipoimmunogenik
sel
karena
punca mereka
lainnya
sel
punca
mengekspresikan
mesenkimal
secara
rendah
bersifat major
53
histocompatibility (MHC) kelas I dan tidak mengekspresikan MHC kelas II atau costimulasi (CD40, CD40L, CD80 atau CD86) molekul (Flavio dan Figueroa, 2011)., sehingga secretome se punca mesenkimal dapat digunakan secara luas, tanpa perlu mencocokkannya dengan Host Leukocyte
Antigen (HLAs).Sel induk hemapoetik
memiliki resiko terjadinya penyakit autoimun sekunder (Loh et al., 2007) Media sekresi sel punca mesenkimal mempunyai efek imunomodulasi dan antiinflamasi. Pada prekondisi hipoksia akan menyebabkan sekresi dari VEGF, HGF 1, IGF -1, SDF-1. (Madrigal et al, 2014) VEGF akan meningkatkan angiogenesis dan mencegah apoptosis endotel (Oyama et al., 1998). HGF berperan dalam menurunkan aktifitas autoreaktif sel limfosit B (Khuwoira et al., 2006), sehingga produksi antibodi akan menurun. Selain itu HGF juga akan menurunkan apoptosis endotel (Nakagami, 2004) sehingga akan menurunkan vaskulitis. IGF 1 berperan dalam menurunkan apoptosis endotel dan meningkatkan toleransi dari sel APC (Fernandez et al, 2004). Sedangkan SDF akan meningkatkan apoptosis sel T autoreaktif dan menurunkan sel B autoreaktif (Biajoux et al., 2012). Sehingga dengan pemberian media sekresi sel punca mesenkimal ini akan terjadi perbaikan dari kerusakan organ sasaran, yaitu dan perbaikan dari lupus nefritis yang ditandai dari menurunnya ekspresi IL-6 dan menurunnya kadar mikroalbuminuria. Pemberian secretome sel punca mesenkimal diharapkan lebih praktis, hipoimunogenik, dan tidak menimbulkan penyakit autoimun sekunder. 4. Nilai Kebaruan Penelitian
Nilai-nilai kebaruan suatu penelitian meliputi berbagai aspek, yang secara lengkap disajikan pada gambar 16.
54
Masalah W i l a y ai hB aBraur u P eSrtsrpa S etoekl g u t isf i BBaarruu K o nAdl ai st i Bb aa rruu
Gambar 16. Aspek-aspek Nilai-nilai Kebaruan Nilai-nilai kebaruan dari penelitian ini adalah: a. Solusi baru. Kerangka konsep dan hasil penelitian ini merupakan solusi baru pemberian secretome akan menurunkan ekspresi IL-6 dengan menurunkan kadar mikroalbuminuria pada mencit model lupus induksi pristan. Secretome sel punca mesenkimal ini bersifat antiinflamasi, lebih hipoimmunogenik. b. Strategi baru. Dari hasil penelitian ini akan memberikan suatu informasi, bahwa dalam penggunaan secretome sebagai terapi alternatif untuk memperbaiki lupus, khususnya nefritis lupus dan lupus yang refrakter. c. Perspektif baru. Hasil penelitian ini dapat digunakan, dikembangkan lebih lanjut dalam usaha mengurangi keparahan dari nefritis lupus. Perspektif baru dapat dimungkinkan penggunaan secretome sel punca mesenkimal yang berdasarkan patogenesis biomolekuler. d. Kondisi baru. Hasil penelitian ini menginformasikan kondisi nefritis lupus menjadi lebih baik, bila dalam terapi lupus menggunakan secretome sel punca mesenkimal, sehingga kualitas hidup pasien lebih baik. Hal tersebut diatas akan membuat kondisi baru bagi penderita nefritis lupus yang mendapatkan terapi secretome.
55
