16
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini mempelajari karakter protein IgG dari kolostrum sapi yang divaksin dengan vaksin AI H5N1. Standar yang digunakan sebagai pembanding pada penghitungan ukuran molekul IgG adalah broad range marker. Marker protein ini terdiri dari delapan pita protein standar, yaitu 25 kDa, 35 kDa, 50 kDa, 75 kDa, 100 kDa, 150 kDa, 175 kDa, dan 225 kDa. IgG kontrol yang digunakan adalah IgG kolostrum pada induk sapi bunting yang tidak diberikan vaksin anti H5N1 Berat molekul pada tiap sampel dihitung menggunakan cara penghitungan ukuran molekul yang didasarkan pada rumus regresi marker dan penghitungan mobilitas relatif. Penghitungan mobilitas relatif didapatkan dengan menggunakan rumus : Mobilitas Relatif
Jarak migrasi dari awal resolving gel sampai !" Jarak pergerakan !"
Data yang diperoleh dibuat regresi linier hubungan antara mobilitas relatif (sumbu x) dengan nilai logaritma berat molekul pita protein marker (sumbu y). Persamaan regresi linier ini dipakai sebagai persamaan standar untuk menghitung ukuran molekul protein sampel berdasarkan nilai mobilitas relatifnya. Persamaan regresi yang diperoleh dari data mobilitas relatif marker adalah y = -1.188x + 2.418. Ukuran molekul protein sampel yang diperoleh dengan menggunakan persamaan tersebut dapat dilihat pada Tabel 2. Imunoglobulin kontrol memiliki tiga pita protein sedangkan pita protein IgG kolostrum sampel memiliki 5-6 pita protein, hal ini disebabkan karena sampel IgG kolostrum yang digunakan tidak melalui tahap pemurnian terlebih dahulu, sehingga terdapat beberapa protein yang belum diketahui identitasnya. Berdasarkan hasil penelitian Hansen et. al (1949), terdapat beberapa protein globulin pada kolostrum sapi (Tabel 3).
17
Tabel 2 Berat molekul komponen-komponen protein dari masing-masing pita penyusunnya.
Sampel IgG Kontrol
Kol II Sp4
Kol I Sp4
Kol III Sp4
Pita yang
Berat Molekul Pita
Ditemukan A B C D E F G H I J K L M O P Q R S T U
(kDa) 203,32 185,46 161,57 222,9 147,37 104,39 54,85 43,58 20,41 228,09 147,37 106,82 42,59 19,49 222,9 140,75 106,82 56,12 44,6 21,87
Perkiraan/Dugaan
IgG IgG
Heavy Chain Light Chain IgG
Light Chain IgG
Heavy Chain
Light chain
Tabel 3. Protein globulin pada kolostrum sapi Protein Globulin Valine Isoleucine Proline Phenylalanine Methionine Tryptophan Arginine
Berat Molekul (kDa) 117,15 131,17 115,13 165,19 149,21 204,23 174,20
Lysine Aspartaic Acid Threonine Tyrosine
146,19 133,10 119,12 181,19
Sumber : Hansen et. al (1947) dan Kirste B. (1998).
18
Hasil pengujian kolostrum sapi yang mengandung IgG anti H5N1
didapatkan adanya 5-6 pita protein. Berat molekul protein tersebut berkisar antara 19,49 sampai 228,09 kDa (Gambar 5 dan Tabel 2). Imunoglobulin kontrol Memiliki 3 susunan pita protein dengan ukuran 203,32 kDa, 185,46 kDa, dan
161,57 kDa. Menurut Tizard (1988), (1988), berat molekul IgG antara 150.000 – 160.000 Da. Pada pita C dengan berat molekul 161,57 (Tabel 2) diduga sebagai IgG
Gambar 5. Profil pita protein hasil SDS-PAGE dengan pewarnaan Commasie Blue. Ket: 1: Marker, 2: IgG kontrol, 3: Kol II Sp4, 4: Kol I Sp4, 5: Kol III Sp4.
Molekul IgG yang diberi perlakuan dengan bahan kimia (SDS) yang dapat memecah ikatan disulfida akan menyebabkan molekul IgG akan terurai menjadi empat rantai polipeptida yang terpisah. Dua diantaranya “berat” karena masingmasing mempunyai berat molekul sekitar 50 kDa dan dua rantai lainnya “ringan”
karena masing-masing mempunyai berat molekul sekitar 25 kDa (Tizard 1988). Protein pada sampel Kol II Sp4 terdiri atas 6 pita protein, yaitu pita D, E, F, G, H, I. Pita E dengan berat molekul 147,37 kDa, diduga sebagai IgG. Pita G
dengan berat molekul 54,85 kDa diduga sebagai heavy chain. Pita I dengan berat molekul 20,41 kDa diduga sebagai light chain. Protein pada sampel Kol 1 Sp4 terdiri atas 5 protein, yaitu pita J, K, L, M, O. Pita K dengan berat molekul 145
kDa diduga sebagai IgG. Pita O dengan berat molekul 19,49 kDa diduga sebagai light chain. Protein pada sampel Kol III Sp4 terdiri dari 6 protein, yaitu P, Q, R, S, T, U. Pita Q dengan berat molekul 140,75 kDa diduga sebagai IgG. Pita S dengan
19
berat molekul 56,12 kDa diduga sebagai heavy chain. Pita U dengan berat molekul 21,87 kDa diduga sebagai light chain. Teknik elektroforesis menggunakan bahan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) banyak digunakan pada proses pemisahan protein dan asam nukleat. Metode SDSPAGE memilki kelebihan yaitu mekanismenya dalam mengklasifikasi suatu protein berdasarkan berat molekul dari bahan yang digunakan. Menurut Rantam (2003), SDS akan mengikat residu hidrofobik dari bagian belakang peptida secara komplit,
dengan
demikian
protein
SDS-komplek
bermigrasi
melalui
poliakrilamid, tergantung pada berat molekul. Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE), merupakan metode standar pengujian terhadap berat molekul protein, struktur subunit dan kemurnian protein (Rantam 2003). Penggunaan poliakrilamid sebesar 12%, dimaksudkan agar mobilitas protein yang diperoleh cukup besar serta berat molekul yang tinggi dapat dipisahkan. Poliakrilamid adalah matrik pilihan untuk memisahkan protein yang mempunyai berat molekul antara 500-250.000 Dalton (Natih et. al. 2010). Protein sampel yang dimasukkan pada gel elektroforesis akan dipecah menjadi rantai polipeptida linear yang seragam (bermuatan negatif), dan akan dipisahkan oleh gel tersebut berdasarkan ukuran berat molekulnya. Ukuran berat molekul yang lebih besar akan tertahan pada bagian atas gel, sedangkan ukuran berat molekul yang kecil akan kebawah gel. Pita protein yang terbentuk dari hasil elektroforesis akan menunjukkan karakteristik dari polipeptida penyusun IgG tersebut. Mekanisme penentuan berat molekul diawali dengan memasukkan imunoglobulin yang telah diperoleh ke dalam sumur gel yang terdapat pada bagian paling atas, gel tersebut adalah buffer gel pengumpul dengan pori yang lebih besar dibandingkan dengan gel bagian bawah (resolving gel). Pori-pori pada matrik
dibentuk
oleh
rantai
cross-linking
linear
polyacrilamide
dan
bisacrylamide. Ukuran pori-pori berkurang sesuai dengan peningkatan total persentasi acrylamide atau terjadi peningkatan derajat persentasi konsentrasi campuran bisacrylamide. Melalui pembuatan atau pemilihan konsentrasi total yang tepat, maka ukuran protein dapat ditentukan. Semakin tinggi total persentasi akan
20
menghalangi pergerakan protein ke dalam gel. Demikian halnya jika terlalu rendah total persentasi, maka akan mengakibatkan pergerakan protein menjadi terlalu cepat, sehingga protein spesifik menjadi rendah dan tidak sesuai dengan yang diharapkan (Natih et. al. 2010).
