BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Pengambilan Sampel Ascidian Didemnum molle Pengambilan sampel dilakukan pada Bulan Maret 2013 di perairan Kepulauan Seribu meliputi wilayah Pulau Pramuka, Pulau Panggang dan Pulau Semak Daun. Ketiga perairan tersebut memiliki karakteristik yang tidak jauh berbeda dilihat dari parameter fisika dan kimia yang diukur (Lampiran 3) sehingga tidak menyebabkan perbedaan kandungan metabolit sekunder. Karena menurut Murniasih pada tahun 2005 lingkungan laut sangat mempengaruhi keaktifan dari metabolit sekunder yang dihasilkan biotanya. Ascidian Didemnum molle ditemukan pada kedalaman 2 meter hingga 10 meter, hidup pada substrat yang keras seperti karang massive dan tiang pancang dermaga. Pada kedalaman 2 meter ukuran ascidian Didemnum molle yang ditemukan berkisar 1 cm hingga 5 cm sedangkan pada kedalaman 10 meter ukurannya berkisar antara 10 cm hingga 15 cm. Sehingga untuk pengambilan sampel sebaiknya dilakukan pada kedalaman 10 meter. Sampel yang diperoleh dari ketiga lokasi memiliki kisaran ukuran 5 cm hingga 15 cm. Sampel dikumpulkan sebanyak 3,5 kg dan dimasukkan ke dalam kantong plastik. Ascidian Didemnum molle akan terus menerus mengeluarkan lendir ketika dikeluarkan dari dalam air laut, hal ini merupakan bentuk pertahanan diri dari ascidian Didemnum molle. Ascidian Didemnum molle segera dimasukkan ke dalam coolbox berisi es batu untuk meminimalisir aktivitas mikroba yang akan menyebabkan pembusukan sehingga sampel tetap segar hingga penanganan selanjutnya. Sampel dibuat ke dalam bentuk sediaan kering (simplisia), tujuannya untuk mengurangi kadar air dan terjadinya pertumbuhan mikroba selama masa penyimpanan sehingga sampel bisa bertahan dalam waktu yang lama. Ascidian Didemnum molle yang sudah kering berbentuk tipis berwarna coklat (Gambar 16). Serbuk dari Didemnum molle berwarna coklat dengan berat 247 gram.
34
35
Gambar 16. Bentuk dan Warna Ascidian Didemnum molle sebelum dikeringkan (kiri) dan setelah dikeringkan (kanan)
4.2. Identifikasi Metabolit Sekunder Ascidian Didemnum molle Identifikasi metabolit sekunder dengan metode uji fitokimia dilakukan untuk mengetahui kandungan senyawa metabolit sekunder dalam suatu bahan secara kualitatif. Dilakukan lima uji metabolit sekunder diantaranya uji alkaloid, uji flavonoid, uji triterpenoid, uji steroid dan uji saponin. Hasilnya, ascidian Didemnum molle positif mengandung alkaloid, steroid dan saponin (Tabel 4).
Tabel 4. Hasil Uji Fitokimia Didemnum molle Metabolit Sekunder
Hasil
Keterangan
Alkaloid
Positif
Endapan putih
Flavonoid
Negatif
Warna kuning
Triterpenoid
Negatif
Warna hijau kebiruan
Steroid
Positif
Warna hijau kebiruan
Saponin
Positif
Terbentuk busa
Dari Tabel 4, hasil positif alkaloid ditunjukkan dengan adanya endapan putih pada uji alkaloid dengan menggunakan pereaksi Mayer (HgCl2 + KI). Warna larutan berubah dari bening menjadi keruh dan terbentuk endapan putih (Gambar 17a). Diperkirakan bahwa endapan putih tersebut merupakan kompleks kaliumalkaloid. Alkaloid mengandung atom nitrogen dan bersifat basa sehingga untuk mengekstraknya dibutuhkan penambahan asam sulfat. Atom nitrogen pada
36
alkaloid mempunyai pasangan elektron bebas dan akan bereaksi dengan ion logam K+ dari pereaksi Mayer (McMurry 2004). Alkaloid pada umumnya berbentuk kristal yang disebut dengan garam-garam alkaloid. Pada uji alkaloid dengan pereaksi Wagner ditandai dengan terbentuknya endapan cokelat muda hingga kekuningan (Gambar 17b). Perekasi Wagner terdiri dari kalium iodida (KI) dan iodin (I 2) sehingga ketika iodine bereaksi dengan Idari kalium iodide menghasilkan I3 - yang berwarna cokelat. Pada uji Wagner, ion logam K+ akan membentuk ikatan kovalen koordinat dengan nitrogen pada alkaloid dan membentuk kompleks kalium-alkaloid yang mengendap.
Gambar 17a. Ascidian Didemnum molle Positif Mengandung Alkaloid dengan Pereaksi Meyer
Gambar 17b. Ascian Didemnum molle Positif Mengandung Alkaloid dengan Pereaksi Wagner Hasil positif steroid ditunjukkan dengan terjadinya perubahan warna menjadi hijau biru sesuai dengan pernyataan Harborne tahun 1987. Pereaksi Lieberman Burchard asam asetat anhidrida dan asam sulfat pekat bereaksi dan menghasilkan warna hijau biru (Gambar 18). Reaksi yang terjadi antara steroid
37
dengan asam asetat anhidrat adalah reaksi asetilasi gugus –OH pada steroid yang akan menghasilkan kompleks asetil steroid. Penambahan asam sulfat pekat bertujuan untuk mendestruksi kompleks asetil steroid.
Gambar 18. Ascidian Didemnum molle Positif Mengandung Steroid Hasil positif saponin ditunjukkan dengan terbentuknya busa. Saponin merupakan suatu glikosida dengan gugus hidroksil pada molekulnya. Saponin mempunyai sifat seperti sabun ketika dilarutkan ke dalam air yaitu akan membentuk busa. Gugus hidrofil dan hidrofob bertindak sebagai permukaan aktif dalam pembentukan busa. Saponin bersifat polar dan dapat larut dalam air karena adanya gugus hidrofil (OH) yang dapat membentuk ikatan hidrogen dengan molekul air. Busa yang dihasilkan diuji kestabilannya dengan penambahan HCl . Hasilnya busa tetap stabil selama 10 menit ketika ditambahkan HCl (Gambar 19). Hal ini menandakan bahwa di dalam ascidian Didemnum molle terkandung senyawa saponin.
Gambar 19. Ascidian Didemnum molle Positif Mengandung Saponin
38
Berdasarkan penelitian Arlyza pada tahun 2008 dan Aulia pada tahun 2011 tahun ditemukan kesamaan metabolit sekunder pada sampel ascidian Didemnum molle yang berasal dari perairan Kepulauan Seribu yaitu alkaloid. Alkaloid merupakan salah satu senyawa yang khas dari ascidian. Kurang lebih sebanyak 300 struktur senyawa alkaloid telah berhasil diisolasi (Menna 2011). Senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam ascidian Didemnum molle seperti saponin dan alkaloid masuk ke dalam golongan senyawa polar. Menurut Arlyza tahun 2008 golongan senyawa polar yang diekstraksi dengan menggunakan pelarut metanol memiliki kemampuan sebagai antibakteri.
4.3 Ekstraksi Ascidian Didemnum molle Ekstraksi simplisia ascidian Didemnum molle dilakukan dengan metode maserasi atau perendaman. Simplisia direndam dengan pelarut metanol. Metanol merupakan pelarut organik yang mampu mengekstrak total senyawa metabolit sekunder. Proses perendaman dilakukan selama 1x24 jam dengan perbandingan antara sampel dan pelarut 1:5 dalam penelitian ini digunakan 247 gram serbuk ascidian Didemnum molle. Untuk mengekstrak seluruh senyawa metabolit yang terkandung dalam ascidian Didemnum molle dibutuhkan pengulangan perendaman atau penggantian pelarut. Pada perendaman pertama, pelarut kemungkinan sudah jenuh sehingga tidak mampu untuk mengekstrak senyawa metabolit sekunder yang diharapkan. Pengulangan perendaman dihentikan ketika filtrat menunjukkan warna asli pelarut metanol yaitu bening (Lampiran 4). Pada ascidian Didemnum molle dibutuhkan pengulangan hingga 5 kali agar seluruh metabolit sekunder yang ada dalam simplisia dapat terekstrak. Warna pada pelarut menandakan adanya kandungan metabolit sekunder pada simplisia. Hasil dari perendaman pertama diperoleh larutan atau filtrat berwarna hijau tua yang sangat pekat kemudian pada perendaman berikutnya warna filtrat berangsur-angsur berkurang kepekatannya hingga berwarna kuning bening (Lampiran 4). Hal tersebut menunjukkan bahwa senyawa metabolit sekunder dalam simplisia sudah terekstrak dalam metanol. Warna hijau yang didapat merupakan warna dari mikroalga yang bersimbiosis dalam jaringan
39
ascidian Didemnum molle yaitu Prochloron. Menurut Hirose pada tahun 2004 Prochloron merupakan alga hijau biru atau cyanophyta yang memiliki klorofil a dan b. Filtrat yang telah diperoleh kemudian diuapkan dengan menggunakan alat rotary vacuum evaporator hingga terbentuk esktrak padat. Suhu yang digunakan untuk menguapkan pelarut metanol adalah 43C. Hal ini untuk menjaga senyawa metabolit sekunder agar tidak rusak. Karena senyawa metabolit sekunder pada umumnya dapat rusak dalam suhu tinggi. Pada saat proses pemekatan ekstrak, filtrat akan berbuih atau berbusa ketika keadaan vakum. Busa tersebut disebakan oleh saponin yang terkandung didalamnya. Sesuai dengan pernyataan Harborne pada tahun 1987 bahwa dalam memekatkan ekstrak yang mengandung saponin akan terjadi pembentukan busa sehingga sangat sukar untuk memekatkan ekstrak yang mengandung saponin. Ekstrak yang dihasilkan berbentuk pasta berwarna hijau pekat dan berbau agak amis (Lampiran 4). Ekstrak yang terbentuk sebanyak 26,5 gram dengan rendemen sebesar 10,37%. Ekstrak yang berbentuk pasta ini selanjutnya dilarutkan menggunakan akuades untuk membuat konsentrasi yang akan digunakan pada uji aktivitas antibakteri dengan
konsentrasi 10 ppm, 100 ppm, 1000 ppm,
10.000 ppm dan 100.000 ppm (Lampiran 5).
4.4
Uji In Vitro Zona Daya Hambat Ekstrak Ascidian Didemnum molle Uji in vitro ekstrak ascidian Didemnum molle terhadap bakteri
Vibrio harveyi memperlihatkan bahwa ekstrak tersebut memiliki aktivitas sebagai antibakteri.
Adanya
aktivitas
antibakteri
tersebut
ditunjukkan
dengan
terbentuknya zona daya hambat disekitar paper disc (Lampiran 6). Ekstrak ascidian
Didemnum
molle
mampu
menghambat
pertumbuhan
bakteri
Vibrio harveyi. Pada Tabel 5 terlihat bahwa rata-rata diameter zona hambat berkisar antara 8 – 11,3 mm. Mengacu pada Davis dan Stout (1971), aktivitas senyawa antibakteri yang terkandung dalam Didemnum molle memiliki aktivitas yang sedang hingga kuat karena berada pada kisaran diameter zona hambat sebesar 5-
40
10 mm dan 10 - 20 mm. Aktivitas antibakteri dari ekstrak Didemnum molle tidak lebih besar dibandingkan dengan kontrol positifnya yaitu antibiotik kloramfenikol sebesar 30 ppm. Hal tersebut dikarenakan kloramfenikol merupakan senyawa murni.
Tabel 5. Diameter Zona Daya Hambat Ekstrak Ascidian Didemnum molle terhadap Bakteri Vibrio harveyi dalam Waktu Inkubasi 24 jam Diameter Zona Hambat (mm) Konsentrasi Rata-Rata (ppm) (mm) I II III 0 0 0 0 *Kontrol 17,1 15,6 15,3 16 *Kontrol + 7,7 8,4 8,1 8,0 10 9,5 7,5 8,6 8,5 100 10,1 10,1 13,1 11,1 1000 10,1 10,3 12,6 11,0 10000 10,8 11,8 11,4 11,3 100000 *Keterangan : Ukuran paper disc 7 mm, (-) akuades, (+) kloramfenikol
Berdasarkan hasil pengamatan, ekstrak dari Didemnum molle diameter zona daya hambat terbesar ditunjukan oleh konsentrasi 100.000 ppm yaitu 11,3 mm dan terendah adalah 10 ppm yaitu 8 mm. Sementara itu, tidak terdapat perbedaan diameter zona hambat yang signifikan antara konsentrasi 1000 ppm, 10.000 ppm dan 100.000 ppm (Gambar 20). Secara visual zona hambat yang terbentuk pada konsentrasi 10 ppm hingga 10.000 ppm tidak jernih atau masih terdapat beberapa koloni bakteri. Zona hambat terlihat sangat jelas pada konsentrasi 100.000 ppm dimana tidak terlihat koloni bakteri tumbuh di dalamnya (Lampiran 6). Pada perlakuan kontrol positif zona hambat yang terbentuk sangat jernih. Zona hambat yang terlihat bersih disebut dengan zona hambat radikal dimana sama sekali tidak terdapat adanya pertumbuhan bakteri sedangkan zona hambat yang ditumbuhi bakteri disebut dengan zona hambat iradikal karena pada daerah tersebut pertumbuhan bakteri dihambat namun tidak sampai mati (Sulistyawati 2009).
41
Diameter Zona Hambat (mm)
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
16 11,1 8
11
11,3
8,5
0
Konsentrasi Ekstrak (ppm)
Gambar 20. Grafik Rata-rata Diameter Zona Hambat Ekstrak Ascidian Didemnum molle terhadap Bakteri Vibrio harveyi
Antibakteri dapat diklasifikasikan menjadi bakteriostatik dan bakteriosidal. Bakteriostatik yaitu kemampuan antibakteri dalam menghambat pertumbuhan bakteri, tetapi tidak sampai membunuh bakteri. Bakterisidal yaitu antibakteri memiliki kemapuan untuk membunuh bakteri (Brooks et al. 2005). Cara kerja antibakteri secara umum yaitu menyebabkan kerusakan dinding sel, mengubah permeabilitas sel, mengubah molekul protein dan asam nukleat, menghambat kerja enzim serta menghambat sintesis asam nukleat dan protein (Pelczar dan Chan 2005). Aktivitas antibakteri dari Didemnum molle bersifat bakteriostatik karena zona daya hambat yang terbentuk pada hampir seluruh perlakuan masih terlihat adanya koloni bakteri yang tumbuh. Ekstrak yang dibuat dalam penelitian merupakan ekstrak kasar dimana masih banyak terdapat beberapa komponen kimia yang tidak dibutuhkan seperti lipid dan pigmen yang terekstrak oleh pelarut metanol. Hal tersebut menurunkan kemurnian dari senyawa antibakteri. Aktivitas antibakteri disebabkan oleh kandungan bahan alam yang ada di dalam ekstrak. Hasil uji fitokimia, ascidian Didemnum molle mengandung senyawa metabolit sekunder alkaloid, steroid dan saponin. Keberadaan metabolit sekunder digunakan hewan atau tumbuhan untuk mempertahankan kelangsungan
42
hidupnya, contoh : toksin, antibiotik, antijamur, antivirus, antibodi dan lainnya (Sunarminingsih 2002). Sifat bioaktif yang paling banyak ditemukan pada metabolit sekunder adalah antibiotik. Alkaloid dapat menghambat pertumbuhan mikroba karena kemampuannya dalam menghambat sisntesis dinding sel dan DNA. Saponin bekerja sebagai antibakteri dengan mengganggu stabilitas membran sel bakteri sehingga menyebabkan sel bakteri lisis dan keluarnya berbagai komponen penting dari dalam sel seperti protein, asam nukleat dan nukleotida (Ganiswarna 1995). Aktivitas senyawa antibakteri juga dipengaruhi oleh respon dari bakteri. Respon setiap bakteri terhadap senyawa antibakteri berbeda-beda. Menurut Morin et al. pada tahun 1982 dalam Trianto pada tahun 2004, bakteri Vibrio merupakan bakteri gram negatif yang mempunyai kandungan peptidoglikan yang dapat menentukan bentuk sel serta memberikan kekakuan yang dibutuhkan untuk melindungi sel dari perobekan osmotik. Sementara itu, dengan adanya senyawa metabolit sekunder dalam ekstrak maka pembentukan dinding sel bakteri menjadi terganggu. Akibatnya Vibrio tidak mampu mereplikasi diri dan tumbuh dalam media agar.
4.5 Uji LC50 Ekstrak Didemnum molle terhadap Udang Windu Salah satu ciri-ciri antibakteri yang baik menurut Pelczar dan Chan tahun 2005 adalah tidak bersifat racun bagi manusia maupun hewan. Maka, uji LC 50 bertujuan untuk mengetahui batas toleransi udang windu terhadap ekstrak ascidian Didemnum molle dan untuk melihat sejauh mana toksisitasnya. Salah satu faktor yang mempengaruhi taraf toksisitas adalah besar konsentrasi dari bahan yang akan diuji. Berdasarkan hasil uji aktivitas antibakteri dari ekstrak ascidian Didemnum molle konsentrasi 10 ppm, 100 ppm, 1000 ppm, 10.000 ppm dan 100.000 ppm menunjukkan potensi sebagai antibakteri. Pembuatan konsentrasi ekstrak yang digunakan dalam uji LC50 disajikan dalam Lampiran 7. Hasil pengamatan uji LC50 yang dilakukan selama 48 jam memberikan hasil kelangsungan hidup dan mortalitas larva udang windu yang berbeda-beda (Lampiran 8). Jumlah udang windu tiap perlakuan sebanyak 6 ekor. Pada
43
konsentrasi 10.000 ppm seluruh udang windu mati dengan lama perendaman 6 jam. Hal tersebut disebabkan oleh tingginya bahan aktif yang bersifat toksik salah satunya saponin yang bersifat racun bagi hewan berdarah dingin. Saponin ditandai dengan terbentuknya busa ketika diberi aerasi (Gambar 21). Pada konsentrasi 1.000 ppm mortalitas udang cukup tinggi yaitu sebanyak 4 ekor pada pengulangan pertama,pada pengulangan kedua seluruh udang windu mati. Sementara itu, kelangsungan hidup larva udang windu yang tinggi terlihat pada konsentrasi 10 ppm dan 100 ppm. Pada konsentrasi 10 ppm tidak ada udang windu yang mati, pada konsentrasi 100 ppm hanya 1 udang yang mati yaitu pada pengulangan
kedua.
Semakin
tinggi
konsentrasi
ekstrak
ascidian
Didemnum molle, tingkat mortalitas udang pun semakin tinggi.
Gambar 21. Tingginya Kandungan Saponin yang Ditandai Terbentuknya Busa pada Konsentrasi 10.000 ppm
dengan
Hasil analisis uji LC50 dengan program EPA Probit 1.5 memberikan nilai konsentrasi sebesar 387 ppm dengan konsentrasi ambang bawah sebesar 180,124 ppm dan konsentrasi ambang atas sebesar 810,578 ppm (Lampiran 9). Hal ini menandakan bahwa dengan konsentrasi ekstrak ascidian Didemnum molle sebesar 387 ppm dapat menyebabkan kematian larva udang windu sebanyak 50% dalam waktu 48 jam. Untuk itu, konsentrasi ekstrak ascidian Didemnum molle yang aman digunakan untuk udang windu berada di bawah konsentrasi 387 ppm.
44
4.6. Hasil Uji In Vivo Udang Windu yang Terinfeksi Bakteri Vibrio harveyi 4.6.1. Hasil Pengamatan Gejala Klinis Udang Windu Pengamatan gejala klinis pada uji in vivo dilakukan setelah penginfeksian hingga pengobatan menggunakan ekstrak. Tujuannya untuk melihat pengaruh ekstrak ascidian
Didemnum
molle
terhadap
pengobatan udang
windu.
Pengamatan yang dilakukan meliputi perubahan morfologi udang (pengamatan warna tubuh, hepatopankreas, nekrosis) dan tingkah laku (pergerakan dan respon terhadap pakan). Gejala klinis udang windu terinfeksi bakteri Vibrio harveyi terlihat 1 jam setelah perendaman dalam larutan bakteri kepadatan 10 6 CFU/mL. Gejala klinis awal yang terlihat adalah udang terlihat stres dan gerakan renang tidak normal. Gerakan udang melemah dan diam di dasar akuarium. Pada tubuh udang terjadi perubahan warna tubuh dari berwarna putih menjadi kemerahan. Perubahan hepatopankreas dari coklat kekuningan menjadi coklat kehitaman terlihat 24 jam setelah diinfeksi (Gambar 22).
Gambar 22. Hepatopankreas Larva Udang yang Normal Hepatopankreas Larva Udang yang Terinfeksi (b)
(a)
dan
Gejala klinis yang terlihat dalam uji in vivo sesuai dengan pernyataan Maryani (2003) bahwa udang yang terinfeksi bakteri Vibrio harveyi menunjukan perubahan morfologi dan tingkah laku. Perubahan yang terlihat diantaranya gerakan renang tidak normal, udang diam di dasar, bentuk badan melengkung
45
melebihi normal, aktivitas makan menurun, ekor berwarna kemerahan dan hepatopankreas berwarna cokelat kehitaman. Setelah penginfeksian, gejala klinis yang terlihat pada tiap perlakuan hampir sama. Namun terjadi perubahan gejala klinis ketika udang windu yang terinfeksi diberi perlakuan perendaman ekstrak. Pengamatan gejala klinis udang windu setelah diberi perlakuan perendaman ekstrak dilakukan selama 7 hari. Pengamatan terhadap pergerakan udang disajikan dalam Tabel 6 dan respon udang terhadap pakan disajikan dalam Tabel 7.
Tabel 6. Pengamatan Pergerakan Larva Udang Windu pada Uji In Vivo Ekstrak Ascidian Didemnum molle Konsentrasi Ekstrak Ascidian Didemnum molle Hari Ke-
A Kontrol
B 96,75 ppm
1-2
+
+
+
+
+
3-5
+
++
++
+++
++
6-7
++
++
+++
+++
+++
C D E 193,50 ppm 290,25 ppm 387,00 ppm
Keterangan : + : abnormal ++ : diam di dasar +++ : aktif berenang Tabel 7. Pengamatan Respon Larva Udang Windu terhadap Pemberian Pakan pada Uji In Vivo Ekstrak Ascidian Didemnum molle Konsentrasi Ekstrak Ascidian Didemnum molle Hari Ke-
A Kontrol
B 96,75 ppm
C 193,50 ppm
D 290,25 ppm
E 387,00 ppm
1-2
+
+
+
+
+
3-5
+
+
++
+++
++
6-7
++
++
+++
+++
+++
Keterangan : + : tidak responsif ++ : kurang responsif +++ : responsif
46
4.6.2. Hasil Pengamatan Mortalitas dan Tingkat Kelangsungan Larva Udang Windu Setelah gejala klinis terlihat, udang windu direndam dalam ekstrak sesuai dengan perlakuan yaitu, perlakuan A (tanpa ekstrak), B 96,75 ppm (25% dari LC50), C 193,5 % (50% dari LC50), D 290,25 ppm (75% dari LC50) dan E 387 ppm (100% dari LC50) selama 15 menit untuk dilakukan pengobatan. Udang yang sudah diberi perlakuan dikembalikan ke dalam akuarium pemeliharaan kemudian dilakukan pengamatan terhadap mortalitas dan tingkat kelangsungan hidup udang windu selama 7 hari untuk melihat efektivitas dari pengobatan menggunakan ekstrak ascidian Didemnum molle. Hasil pengamatan mortalitas dan tingkat kelangsungan hidup disajikan pada Tabel 8.
Tabel 8. Mortalitas Tingkat dan Kelangsungan Hidup Larva Udang Windu Setelah Pengobatan dengan Ekstrak Ascidian Didemnum molle
Perlakuan
Jumlah Udang Di Awal
Mortalitas Udang Windu Hari Ke(ekor)
1
2
3
4
5
6
7
A1
30
12
10
2
1
0
0
0
A2
30
8
12
1
1
0
0
0
B1
30
6
15
2
2
0
0
0
B2
30
2
10
1
2
0
0
0
C1
30
3
9
2
0
0
0
0
C2
30
7
11
1
2
0
0
0
D1
30
2
7
3
1
0
0
0
D2
30
4
9
3
0
0
0
0
E1
30
4
3
6
3
0
0
0
E2
30
10
10
3
0
0
0
0
Jumlah Udang Di Akhir
5 8 5 15 16 9 17 14 14 7
Kelangsungan Hidup (%)
16,7 26,7 16,7 50 53,3 30 56,7 46,7 46,7 23,3
RataRata (%)
21,7 33,4 41,7 51,7 35
Pada Tabel 8, terlihat bahwa mortalitas larva udang windu pada seluruh perlakuan mulai terjadi pada hari ke-1 sampai hari ke-4 dan pada hari ke-5 sudah tidak terjadi mortalitas. Mortalitas tertinggi terjadi di hari ke-2 masa pengamatan pada seluruh perlakuan. Perlakuan D (290,25 ppm) memberikan tingkat kelangsungan hidup tertinggi, sedangkan perlakuan A (tanpa ekstrak) memberikan tingkat kelangsungan hidup terendah.
47
Pada Tabel 8 terlihat bahwa tingkat kelangsungan hidup larva udang windu yang diberi perlakuan lebih tinggi dibandingkan larva udang windu tanpa pemberian ekstrak (kontrol). Hal tersebut memperlihatkan bahwa antibakteri yang terkandung dalam ekstrak ascidian Didemnum molle berperan dalam pengobatan udang windu yang terinfeksi bakteri Vibrio harveyi walaupun berada pada kategori sedang. Berdasarkan uji diameter zona daya hambat, ekstrak ascidian Didemnum molle pada konsentrasi 100 ppm menghasilkan diameter 8,5 mm, menurut Davis dan Stout (1971) aktivitas antibakteri dikategorikan sedang bila diameter zona daya hambat yang terbentuk berada pada kisaran 5 - 10 mm. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak ascidian Didemnum molle memberikan tingkat kelangsungan hidup yang semakin tinggi sampai batas perlakuan D (290,25 ppm). Diatas konsentrasi 290,25 ppm yaitu pada perlakuan E (387 ppm), kelangsungan hidup larva udang windu mengalami penurunan (Gambar 23). Terjadinya hal tersebut dikarenakan ekstrak pada konsentrasi 387 ppm justru bersifat toksik bagi hewan uji. Sifat toksik pada ekstrak disebabkan kandungan bahan aktif yang tinggi.
60 Tingkat Kelangsungan Hidup (%)
51,7 50 41,7 40 30 21,7 20 10 0 0
.
35
33,4
96,75
193,5
290,25
387
Perlakuan (ppm)
Gambar 23. Grafik Rata-Rata Tingkat Kelangsungan Hidup Udang Windu Setelah Pengobatan dengan Ekstrak Ascidian Didemnum molle
48
Pada perlakuan A (kontrol) atau tanpa perendaman ekstrak, tingkat kelangsungan hidupnya sangat rendah yaitu sebesar 21,7%. Pergerakan udang windu pada perlakuan kontrol cenderung pasif dengan gerakan renang yang tidak normal. Hari ke-6 dan ke-7 masa pengamatan pada Tabel 6, udang mulai aktif bergerak namun 70% udang masih diam didasar. Respon udang terhadap pakan sangat rendah, terlihat dari banyaknya sisa pakan pada perlakuan A (Tabel 7). Vibrio harveyi diketahui menyerang saluran pencernaan udang, hal inilah yang menyebabkan respon udang terhadap pakan menjadi rendah. Akibatnya metabolisme udang windu terganggu dan daya tahan tubuh udang menurun. Morfologi udang yang terlihat pada perlakuan A (kontrol) adalah warna tubuh terlihat merah pada pengamatan hari ke-1 hingga hari ke-4, warna tubuh kembali normal di hari ke-5. Hepatopankreas udang terlihat berwarna coklat kehitaman pasca penginfeksian, perubahan menuju normal terjadi di hari ke-6 yaitu berwarna coklat kekuningan. Selain itu, pada perlakuan kontrol terlihat adaya nekrosis di ujung ekor udang (Gambar 24).
Gambar 24. Ekor Udang Normal (kiri) dan Nekrosis pada Ekor Udang Windu (kanan)
Pada perlakuan kontrol udang windu masih mampu bertahan hidup walaupun tingkat kelangsungan hidupnya rendah. Udang windu kembali pada keadaan normal di hari ke-6 masa pengamatan. Sejalan dengan pernyataan Maftuch tahun 2009, udang yang terserang penyakit pada kenyataannya masih
49
mampu untuk bertahan hidup dan tumbuh normal. Udang windu secara alami memiliki sistem pertahanan tubuh non spesifik yang dijalankan oleh hemosit, namun sistem pertahanan tubuh udang perlu diaktifkan dengan imunostimulan agar dapat melawan patogen. Selain itu, kekebalan tubuh udang windu dalam stadia larva masih lemah. Hal tersebutlah yang menyebabkan proses pemulihan pada udang cukup lama dan menyebabkan kematian yang tinggi pada larva. Pemberian ekstrak ascidian Didemnum molle dapat memberikan tingkat kelangsungan hidup yang tinggi bagi larva udang windu dan terjadi pemulihan yang lebih cepat dibandingkan dengan tanpa pemberian ekstrak. Perlakuan B (96,75 ppm) dan C (193,5 ppm) menunjukkan tingkat kelangsungan hidup yang lebih tinggi dibandingkan perlakuan A (tanpa ekstrak) yaitu berturut-turut sebesar 33,4% dan 41,7% (Gambar 23). Rata-rata udang mulai memperlihatkan perubahan gejala klinis menuju normal pada pengamatan hari ke-6. Sebagian besar udang mulai aktif bergerak di kolom air dan terlihat responsif terhadap pakan yang diberikan (Tabel 6). Udang pada perlakuan B (96,75 ppm) dan C (193,5 ppm) menunjukan perubahan morfologi menuju normal pada pengamatan hari ke-4 yaitu 75% warna tubuh udang windu dari kemerahan menjadi putih.
Hepatopankreas udang
berangsur-angsur
menjadi coklat
kekuningan. Perubahan gejala klinis udang windu menuju normal pada perlakuan B dan C lebih cepat dibandingkan perlakuan kontrol, namun mortalitasnya masih cukup tinggi bila dibandingkan perlakuan D. Hal ini menandakan bahwa ekstrak ascidian Didemnum molle pada konsentrasi 96,75 ppm dan 193,5 ppm berperan terhadap pengobatan udang windu namun masih belum optimal. Pada ekstrak konsentrasi 96,75 ppm dan 193,5 ppm diduga kandungan bahan aktifnya masih rendah sehingga kurang efektif untuk menghambat infeksi dari bakteri Vibrio harveyi pada udang windu. Perlakuan D (290,25 ppm) merupakan perlakuan yang menunjukkan hasil terbaik. Pada perlakuan D udang windu memiliki tingkat kelangsungan hidup tertinggi yaitu sebesar 51,7% (Gambar 23). Perubahan gejala klinis udang windu menuju normal terlihat lebih cepat dibandingkan perlakuan lainnya. Hal tersebut
50
terlihat di hari pengamatan ke-3. Pergerakan udang windu terlihat aktif dan responsif ketika diberi pakan. Pada hari ke-4, 85% udang aktif berenang di kolom air. Perubahan morfologi menuju kondisi normal sudah terlihat pada pengamatan hari ke-3. Perubahan tersebut meliputi warna tubuh udang dari kemerahan menjadi putih, hepatopankreas dari coklat kehitaman menjadi coklat kekuningan. Selain itu, pada hari ke-3 mortalitas udang windu sangat rendah dibandingkan perlakuan lainnya hanya 1 ekor yang mati (Tabel 8). Hal tersebut menunjukan bahwa ekstrak ascidian Didemnum molle pada konsentrasi 290,25 ppm, relatif efektif dan aman digunakan untuk mengobati udang windu yang terinfeksi bakteri Vibrio harveyi. Perlakuan E (387 ppm) menunjukan tingkat kelangsungan hidup lebih rendah dibandingkan perlakuan C (193,5 ppm) dan D (290,25 ppm) yaitu sebesar 35%. Mortalitas udang windu cukup tinggi selama masa pengamatan hari ke-1 hingga hari ke-4, hampir sama dengan perlakuan A (kontrol). Namun gejala klinis udang windu sudah hilang pada pengamatan hari ke-4, lebih cepat dibandingkan udang pada perlakuan kontrol. Pada perlakuan E (387 ppm) ekstrak dapat mengobati infeksi bakteri Vibrio harveyi, namun pada konsentrasi tersebut diduga bahan aktif yang terkandung terlalu tinggi sehingga bersifat toksik bagi udang windu. Konsentrasi ekstrak yang tinggi mengakibatkan kandungan bahan aktif yang bersifat racun juga tinggi, salah satunya adalah saponin. Saponin dalam ekstrak ditunjukkan dengan terbentuknya busa pada konsentrasi 387 ppm dan menurut Harborne (1987), adanya saponin dalam ekstrak ditunjukan dengan terbentuknya busa. Kandungan saponin yang tinggi bersifat racun bagi hewan berdarah dingin. Selain akibat infeksi bakteri Vibrio harveyi, tingginya mortalitas larva udang windu pada perlakuan E juga disebabkan oleh konsentrasi ekstrak ascidian Didemnum molle yang tinggi. Keefektivan ekstrak ascidian Didemnum molle dalam mengobati udang windu yang terinfeksi bakteri Vibrio harveyi dipengaruhi oleh besarnya konsentrasi ekstrak. Karena besarnya konsentrasi berhubungan dengan kuantitas
51
kandungan metabolit sekunder yang menjadi bahan aktif antibakteri dalam ekstrak. Semakin rendah konsentrasi ekstrak menyebabkan proses pengobatan kurang efektif, namun bila konsentrasi ekstrak terlalu tinggi, metabolit sekunder yang terkandung bersifat toksik bagi biota uji. Metabolit sekunder yang terkandung dalam ekstrak ascidian Didemnum molle berperan secara langsung terhadap bakteri Vibrio harvereyi. Menurut Robinson tahun 1995 senyawa alkaloid dan saponin merupakan senyawa yang berkhasiat sebagai antibakteri. Alkaloid diketahui keaktifan biologisnya yang disebabkan gugus basa (nitrogen). Gugus basa bila mengalami kontak dengan bakteri akan bereaksi dengan senyawa-senyawa asam amino yang menyusun dinding sel dan DNA bakteri. Akibatnya terjadi perubahan komponen penyusun peptidoglikan pada sel bakteri sehingga lapisan dinding sel tidak terbentuk sempurna.
Kerusakan
pada
DNA
bakteri
mengakibatkan
terganggunya
metabolisme bakteri. Menurut Rheinheimer tahun 1985 dalam Hidayat tahun 2011 salah satu akibat infeksi dari Vibrio harveyi yaitu rusaknya lapisan kutikula yang mengandung kitin akibat enzim kitinase. Vibrio diketahui memiliki enzim kitinase, lipase dan protease. Ekstrak ascidian Didemnum molle berperan dalam mengganggu proses metabolisme pada bakteri. Bila metabolisme sel bakteri terganggu maka dapat menghambat proses sintesis enzim. Akibatnya, bakteri tidak dapat menginfeksi udang windu lebih lanjut. Saponin dalam ekstrak dapat mengganggu stabilitas membran sel bakteri sehingga membran sel bakteri rusak. Bila membran sel rusak, sel bakteri dapat mengalami lisis (Ganiswarna 1995). Semakin banyak sel bakteri yang mengalami lisis akan mengurangi kepadatan sel bakteri dalam tubuh udang. Akibatnya, patogenitas bakteri berkurang. Keberhasilan dari pemeliharaan udang windu selain bebas dari penyakit ditentukan juga oleh keadaan lingkungannya. Keadaan lingkungan diusahakan sesuai dengan habitat alami dari udang windu. Untuk itu dalam penelitian ini dilakukan pengamatan dan kontrol terhadap kualitas air yang meliputi salinitas, suhu, kandungan oksigen terlarut dan pH. Kondisi media pemeliharaan selama
52
penelitian berada dalam keadaan terkontrol. Pengukuran dilakukan pada awal, tengah dan akhir percobaan. Data kualitas air yang meliputi suhu, salinitas, kandungan oksigen terlarut (DO) dan tingkat keasaman (pH) dalam penelitian disajikan pada Tabel 9.
Tabel 9. Parameter Kualitas Air Selama Uji In Vivo
Perlakuan
A1 A2 B1 B2 C1 C2 D1 D2 E1 E2
Suhu (C) I 27 28 26 27 27 27 26 26 26 29
II III 26 29 29 29 26 27 28 27 27 27 28 28 26 26 26 26 26 26 27 27
Parameter Fisik Salinitas DO (mg/L) (0/00) I II III I II III 32 34 34 6,4 6,9 7,0 32 34 34 6,8 5,5 6,9 32 32 31 8,9 6,5 7,6 32 31 31 8,7 6,6 7,7 32 30 33 7,7 6,8 7,5 33 34 34 7,3 6,5 7,2 32 31 31 7,8 6,8 7,8 33 31 31 8,1 6,6 7,6 33 31 31 7,9 5,9 7,8 33 34 33 7,5 6,6 7,5
pH I 6,5 6,4 6,5 6,4 6,5 6,5 6,3 6,9 6,8 6,9
II 7,1 7,3 7,1 7,1 7,2 7,3 7,2 7,3 7,3 7,3
III 7,6 7,6 7,5 7,6 7,6 7,6 7,6 7,6 7,5 7,6
Kualitas air selama masa pengamatan yaitu dengan kisaran suhu 26 - 29C, salinitas 30 ppm – 34 ppm, oksigen terlarut (DO) 6,4 mg/L – 8,9 mg/L dan pH 6,3 – 7,6. Menurut Amri 2003 untuk pertumbuhan yang optimum udang windu memerlukan suhu 25 - 30C, DO 4 – 8 mg/L, salinitas 15 0/00 – 30 0/00 dan pH 6-9. Bila dibandingkan, parameter kualitas air selama masa penelitian masih berada dalam keadaan terkontrol dan masih memenuhi persyaratan optimum untuk budidaya udang windu. Dengan demikian, parameter kualitas air pada saat penelitian secara umum tidak berpengaruh terhadap kematian udang windu sehingga kematian udang windu disebabkan oleh faktor perlakuan saja.
