BAB IV Hasil dan Pembahasan Dalam bab ini akan dipaparkan hasil tiap tahap penelitian beserta analisis dan pembahasannya yang terdiri atas analisis 584 sampel berupa urutan nukleotida lengkap mtDNA manusia dari berbagai suku bangsa di dunia yang diwakili oleh tiga suku
bangsa yaitu suku bangsa Asia, Eropa dan Afrika dengan program Mito
Mutation Analyzer (MMA) dan analisis urutan nukleotida lengkap menggunakan empat belas enzim restriksi endonuklease.
IV.1 Analisis Urutan Nukleotida Lengkap dengan Metode MMA Pada penelitian ini pertama kali dilakukan pengeditan sampel, sebanyak 584 sampel yang diterima penulis berformat .seq, selanjutnya sampel-sampel tersebut diedit untuk mendapatkan urutan nukleotidanya saja. Tujuan pengeditan sampel adalah untuk mencegah pengkaburan informasi mutasi yang dikeluarkan oleh program MMA. Contoh salah satu file sampel file sampel urutan nukleotida lengkap yang belum diedit dapat di lihat pada Gambar IV.1, Sedangkan sisanya sebanyak 584 sampel dapat dilihat di lampiran dan di Compact Disc (CD) di dalam tesis ini.
Gambar IV.1 Contoh salah satu file sampel urutan nukleotida lengkap yang belum di edit. Ditampilkan sebagian urutan nukleotida lengkap mtDNA manusia dari sampel AB055387 yang terdiri atas 16554 pb.
Setelah semua sampel selesai diedit, tahap selanjutnya adalah penulisan nama file-file ke dalam file leogane. txt. File yang akan dianalisis harus dituliskan tepat pada setiap baris dalam file leogane.txt. Contoh salah satu file sampel yang telah diedit dapat dilihat pada Gambar IV.2. Hal ini bertujuan untuk menghindari berhentinya program MMA sehingga file-file sampel yang tertulis setelah kesalahan akan dianalisis oleh program MMA, sedangkan sisa file sampel dapat dilihat di lampiran dan di Compact Disc (CD) yang terdapat di dalam tesis ini.
Gambar IV.2 Contoh salah satu file sampel urutan nukleotida lengkap yang telah selesai diedit. Ditampilkan sebagian urutan nukleotida lengkap mtDNA manusia dari sampel AF347000 yang terdiri atas 16569 pb. Semua file sampel yang akan dianalisis, file leogane. txt, program MMA harus ditempatkan pada folder yang sama. Jika tidak ditempatkan pada folder yang sama, maka program MMA tidak dapat dijalankan. Setelah semuanya ditempatkan pada folder yang sama, maka program MMA dapat dijalankan. Analisis urutan nukleotida keseluruhan dengan program MMA menghasilkan luaran berupa jenis, posisi dan jumlah mutasi, insersi serta delesi, yang salah satu contoh ilustrasinya dapat dilihat
pada Gambar IV.3. Sisa sampel yang telah di analisis dengan program MMA sebanyak 584 dapat di lihat di lampiran dan sebagian lagi di simpan di Compact Disc (CD) yang terdapat di dalam tesis ini.
Gambar IV.3 Contoh salah satu File sampel urutan nukleotida lengkap yang telah dianalisis dengan program MMA. Ditampilkan sebagian urutan nukleotia lengkap mtDNA manusia dari sampel AY495108 yang terdiri atas 16569 pb yang dianalisis dengan program MMA Jenis, posisi dan jumlah mutasi, insersi serta delesi yang dihasilkan dari analisis dengan program MMA sangat bervariasi. Jumlah mutasi tertinggi terdapat pada kode sampel AF34699 sebanyak 129 mutasi, yang diwakili oleh suku bangsa Afrika. Sedangkan mutasi terendah terdapat pada kode sampel AY339426 dan AY495120 sebanyak 12 mutasi yang diwakili oleh suku Bangsa Asia. Jenis dan posisi mutasi selanjutnya akan digunakan untuk menentukan haplogroup mtDNA manusia menggunakan empat belas enzim restriksi endonuklease.
IV.2 Penentuan Haplogroup dengan Enzim Restriksi Endonuklease Hasil analisis dengan program MMA berupa jenis dan posisi mutasi dari urutan nukleotida lengkap mtDNA manusia dipindahkan ke program Excel, tujuan pemindahan ke program Excel adalah untuk memudahkan penentuan haplogorup menggunakan empat belas enzim restriksi endonuklease. Haplogroup, enzim restriksi, sisi pemotongan (recognition site), jenis dan posisi mutasi urutan
nukleotida yang digunakan untuk menentukan haplogroup dapat dilihat pada Tabel IV.1 Tabel IV.1 Haplogroup, enzim restriksi, sisi pemotongan dan jenis dan posisi mutasi urutan nukleotida. Terdapat 16 haplogroup dan masingmasing haplogroup diwakili oleh enzim-enzim tertentu, dimana enzim tersebut memiliki jenis dan posisi urutan nukleotida No
Haplogroup
Enzim
Posisi basa
1 2 3
A B C
4 5 6
D E G
7 8 9
F H I
10
J
HaeIII HaeIII AluI HincII Alu I AluI HhaI HaeII RSaI AluI MboI AvaII BamHI AluI NIaIII HinfI
663 16517 13262 -13259 -5176 10397 4831 4830 -16303 -7025 16390 -16390 16389 10032 4216 -16065
11 12
K L
RSaI RSaI HinfI
-16310 16310 16389
AvaII
-16390
HpaI TaqI MboI HinfI
-3592 14068 13104 -13103
AluI RSaI NIaIII BamHI AluI AvaII MboI NIaIII AccI
11329 4643 4216 13366 15606 -13367 13367 -4577 14465
13
U
14
T
15 16
V X
Sisi pemotongan
CRS
Posisi dan jenis mutasi
GGCC GGCC AGCT GTYRAC AGCT AGCT GCGC RGCGCY GTAC AGCT GATC GGRCC GGATCC AGCT CATG GANTC GA A/G C/T TC GTAC GTAC GANTC GA A/G C/T TC GAACTC GGRCC GGG/ACC GGGCC GTTAAC TCGA GATC GANTC GA A/G C/T TC AGCT GTAC CATG GGATCC AGCT GGRCC GATC CATG GTVWAC GT A/C G/T AC
AGCC GGTC AACT GTCAAC AGCT AACT GCAC GGCACC GTAC AGCC GGTC GTACA GGGTCC AGTT TATG
663G 9bp Delesi 13263G 13263G 5178C-A 10400T 4833G 4833G 16304C 7028C 16391A 16390A 16391A 10034C 4216C
GACTCC GTAC GTAC GGGTCC
16069T 16311T 16311 C 16390 A
GGTCC
16390A
GTCAAC TCAA AATC
3594 T/C 14070G 13104G 13104G
GTAT TATG GGGTCC AACT GGTCC GGTC CATG
11332T 4646C 4216C 13368A 15607G 13368A 13368A 4580A
GTATAT
14470C
Enzim-enzim yang digunakan dalam penentuan haplogroup yaitu enzim HaeIII, AluI, HincII, HhaI, HaeII, HpaI, RsaI, MboI, AvaII, BamHI, NIaIII, HinfI, TaqI dan AccI. Selanjutnya dilihat satu persatu jenis dan posisi mutasi dari urutan nukleotida yang
diwakili oleh enzim tertentu, contohnya enzim HaeIII,
jenis mutasi urutan
nukleotida dari enzim tersebut adalah A menjadi G, pada posisi 663 (A663G), jika terdapat mutasi urutan nukleotida dari A menjadi G pada posisi 663 (A663G), maka individu tersebut dikelompokkan ke haplogroup A. Hal yang sama dilakukan pada keseluruhan sampel yaitu 584 sampel dengan melihat jenis dan posisi mutasi basa pada urutan nukleotida dari enzim yang digunakan. Contoh salah satu hasil analisis menggunakan empat belas enzim restriksi diperlihatkan pada Gambar IV.4, sedangkan sisanya terdapat pada lampiran dan sebagian disimpan di Compact Disc (CD) di dalam tesis ini.
Gambar IV.4 Contoh salah satu hasil analisis urutan nukleotida lengkap yang dengan empat belas enzim restriksi. Individu dengan kode AY255152, jumlah basa 16567pb setelah dianalisis dengan enzim restriksi menghasilkan empat haplogroup yaitu H, F, I dan L secara berturut-turut yang ditandai dengan adanya enzim AluI pada posisi c7028t, RsaI pada posisi t16304c, untuk haplogroup I dan L ditandai dengan enzim AvaII di posisi g16390a.
Penentuan haplogroup mtDNA manusia menggunakan empat belas enzim restriksi memberikan hasil berupa haplogroup yang sangat variatif untuk sejumlah individu. Sebanyak 584 individu yang dianalisis, individu yang memiliki satu haplogroup berjumlah 133 individu, terdiri atas haplogroup H dan F, haplogroup H sebanyak 120 individu dan haplogroup F, 13 individu. Ilustrasi salah satu hasil analisis urutan nukleotida lengkap mtDNA manusia dengan empat belas enzim restriksi pada individu yang memiliki satu haplogroup dapat dilihat pada Gambar IV.5, sebagian sampel hasil analisis dengan empat belas enzin restriksi terdapat pada lampiran, sedangkan sisanya terdapat di dalam Compact Disc (CD) dalam tesis ini.
Gambar IV.5 Contoh salah satu hasil analisis dengan enzim restriksi untuk satu haplogroup. Individu dengan kode sampel AY195768 memilki satu haplogroup yaitu haplogroup H yang ditandai dengan adanya enzim AluI pada posisi C7028T.
Pada haplogroup satu, jumlah haplogroup yang sama dengan metode RFLP adalah 83 individu yaitu haplogroup H dan 12 individu untuk haplogroup F. Haplogroup yang tidak sesuai dengan metode RFLP berjumlah 38 individu, untuk haplogroup H 37 individu dan satu individu untuk haplogroup F. Contoh sebagian kode sampel dan haplogroup yang diperoleh dari hasil analisis dengan enzim restriksi untuk individu yang memiliki satu haplogroup dapat dilihat pada Tabel IV.2, sedangkan sisanya terdapat pada lampiran. Tabel IV.2 Individu yang memiliki satu haplogroup. Terdapat delapan belas individu yang termasuk ke dalam haplogroup H dan tiga belas individu termasuk ke dalam haplogroup F No
Sampel
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
AY339513 AY339545 AY339547 AY339548 AY289083 AY289084 AY495306 AY495307 AY495308 AY495309 AY275531 AY275532 AY275533 AY275534 AY275535 AY275536 AY275537 AY289086 AY339430 AY339431 AY339432 AF346974 AF346975 AF346974 AF346975 AY495173 AY495175 AY495176 AY495171 AY495167 AY495168
A 1
B 2
C 3
D 4
E 5
G 6
F 7
Haplogroup H I J K 8 9 10 11 H H H H H H H H H H H H H H H H H H
F F F F F F F F F F F F F
L 12
U 13
T 14
V 15
W 16
X 17
Kelompok yang memiliki dua haplogroup berjumlah 129 individu. Individu yang termasuk ke dalam dua haplogroup yaitu EH, HL, HV, HI, HU, HX, FH, AH dan DE, masing-masing secara berturut-turut berjumlah 48, 46, 21, 5, 2, 2, 2, 2 dan 1. Untuk haplogroup EH yang sesuai dengan metode RFLP sebanyak 45 individu, 28 individu untuk haplogroup E dan 17 individu untuk haplogroup H, yang tidak sama dengan haplogroup RFLP berjumlah tiga individu. Untuk HL yang sesuai dengan metode RFLP berjumlah 33 individu, terdiri dari haplogroup L 11 individu dan 22 individu untuk H dan sisanya tidak sesuai dengan metode RFLP. Contoh salah satu hasil analisis dengan enzim restriksi untuk individu yang memiliki dua haplogroup dapat dilihat pada Gambar IV.6. Sebagian dapat dilihat di lampiran, sedangkan sisanya disimpan di Compact Disc (CD) di dalam tesis ini.
Gambar IV.6 Hasil analisis dengan enzim restriksi untuk individu yang memiliki dua haplogroup. Individu dengan kode AF347006 yang memiliki dua haplogroup yaitu haplogroup HV, yang ditandai dengan adanya enzim NIaIII di posisi G4580A dan enzim AluI di posisi C7028T. Individu yang memiliki haplogroup HV berjumlah 21 individu, sembilan belas individu sesuai dengan RFLP, hanya 2 individu yang tidak sesuai. Untuk haplogroup HI, HU, FH, DE semuanya sama dengan haplogroup RFLP, sedangkan AH hanya satu yang sama dengan RFLP dan HX tidak terdapat kesamaan dengan haplogroup
RFLP. Contoh untuk sejumlah individu yang memiliki dua haplogroup dapat dilihat pada Tabel IV.3, sedangkan sisanya dapat dilihat di lampiran. Tabel IV.3 Contoh individu yang memiliki dua haplogroup. Terdapat dua puluh dua individu yang termasuk ke dalam haplogroup HV, enam individu termasuk ke dalam haplogroup HL dan lima individu termasuk ke haplogroup EH No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
20 21
22 1 2 3 4 5 6
7 8
1 2 3 4 5 6 7
Sampel AY339433 AY339434 AY339436 AY339437 AY339439 AY339440 AY339441 AY339442 AY339443 AY339444 AY339448 AY339449 AY339450 AY339452 AY339455 AY339457 AY339458 AY339459 AF381990 AF347006 AY195750 AY195781 AF347000 AF346976 AY339544 AY289095 AY495251 AY275527 AY275528 AY275529 AF347012 AF346966 AF346972 AY289097 AY289098 AY519491 AY519493
A 1
B 2
C
D
E
G
3
4
5
6
E E E E E E E
F 7
Haplogroup H I J K 8 9 10 11 H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H
L 12
U 13
T 14
V 15 V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V
L L/L L L L L L L
W 16
X 17
Individu yang termasuk kedalam tiga haplogroup berjumlah 119 individu yaitu HJT, HIL, EHL, DEH, CEH dan FHI, masing-masing berjumlah 80, 16, 15, 5, 2 dan 1. Untuk haplogroup HJT dari 80 individu, yang sama dengan haplogroup RFLP 78 individu, hanya 2 individu yang haplogroupnya tidak sama dengan RFLP. Untuk haplogroup HIL semuanya sama dengan metode RFLP, sebanyak 5 individu termasuk kedalam haplogroup L, dan enam individu tergolong ke haplogroup HI, serta 5 individu masuk ke dalam haplogroup IL. Terdapat 15 individu yang tergolong ke dalam haplogroup EHL, yang sama dengan metode RFLP sebanyak 14 individu, sedangkan sisanya tidak sama. Contoh salah satu hasil analisis dengan enzim restriksi untuk individu yang memiliki tiga haplogroup dapat dilihat pada Gambar IV.7 dan sebagian terdapat di lampiran serta sisanya di simpan di dalam Compact Disc (CD) di dalam tesis ini.
Gambar IV.7 Contoh salah satu hasil analisis dengan enzim restriksi untuk tiga haplogroup. Individu dengan kode AF381987 yang memiliki tiga haplogroup yaitu haplogroup HJT, yang ditandai dengan adanya enzim NIaIII di posisi T4216C untuk haplogroup T, AluI di posisi C7028T untuk haplogroup H dan HinfI di posisi C16069T untuk haplogroup J
Untuk individu yang memiliki haplogroup DEH, yang sama dengan metode RFLP sebanyak 3 individu dan sisanya tidak sama. Haplogroup CEH berjumlah 2 individu, hanya satu individu yang sama dan sisanya tidak sama, untuk FHI haplogroupnya sesuai dengan metode RFLP. Sejumlah individu yang memiliki tiga haplogroup beserta kode sampelnya dapat dilihat pada Tabel IV.4 dan sisanya terdapat di lampiran. Tabel IV.4 Contoh kode sampel untuk individu yang memiliki tiga haplogroup. Terdapat sebelas individu yang termasuk ke dalam haplogroup EHL, sebelas individu termasuk ke dalam haplogroup HIL, tiga individu termasuk ke haplogroup DEH dan dua individu termasuk ke dalam haplogroup CEH. No 1 2 3 4
5 6
7 8
9 10
11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 1 2
Sampel AY289089 AY289090 AF347003 AY255151 AY255154 AY255160 AF347003 AF381984 AF381996 AY255176 AY289071 AY195766 AF346995 AY195785 AF346998 AF346999 AY339502 AY339503 AY339504 AY339505 AY339507 AY339508 AF346984 AF346989 AF346990 AF346970 AF347013
A 1
B 2
C
D
E
G
3
4
5 E E E E E E E E E E E
6
D D D
E E E E E
C C
F 7
Haplogroup H I J K 8 9 10 11 H H H H H H H H H H H H I H I H I H I H I H I/I H I/I H I/I H I/I H I/I H I/I H H H H H
L 12 L L L L L L L L L L L L/L L/L L/L L/L/L L/L/L L L L L L L
U 13
T 14
V 15
W 16
X 17
Kelompok individu yang memiliki empat haplogroup berjumlah 32 individu, terdiri atas haplogroup FHJT, HJLT, EHIL masing-masing berjumlah 21, 4, 3, sedangkan EHJT, AEHL, HIJT dan FHIL masing-masing berjumlah 1. Contoh salah satu hasil analisis dengan enzim restriksi untuk individu yang termasuk ke dalam empat haplogroup diperlihatkan pada Gambar IV.8. Sebagian terdapat di lampiran dan sisanya terdapat di Compact Disc (CD) di dalam tesis ini.
Gambar IV.8 Hasil analisis dengan enzim restriksi untuk individu yang memiliki empat haplogroup. Individu dengan kode AY255172, jumlah basa 16568 pb yang memiliki empat haplogroup yaitu haplogroup AHEL, yang ditandai dengan adanya enzim HaeIII di posisi a663g untuk haplogroup A, AluI di posisi C7028T untuk haplogroup H, AluI di posisi C10400T untuk haplogroup E dan RsaI di posisi t16311c untuk haplogroup L.
Untuk haplogroup FHJT, semuanya sesuai dengan haplogroup RFLP, kecuali F. Individu yang memiliki haplogroup HJLT juga sama dengan haplogroup RFLP, kecuali haplogroup L, sedangkan untuk haplogroup EHJT, yang sama dengan RFLP hanya E, haplogroup AEHL hanya AE yang sama dengan RFLP dan untuk FHIL yang sama dengan RFLP adalah F. Sejumlah individu yang memiliki empat haplogroup beserta kode sampelnya dapat dilihat pada Tabel IV.5 dan sisanya terdapat di lampiran. Tabel IV.5 Individu yang memiliki empat haplogroup. Terdapat dua puluh satu individu yang termasuk ke dalam haplogroup FHJT, empat individu termasuk ke dalam haplogroup HJLT, tiga individu termasuk ke haplogroup EHIL. EHJT, HIJT, AEHL dan FHIL masing-masing satu individu No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 1 2 3 4 1 2 3
Sampel AY495267 AY495268 AY495269 AY495270 AY495271 AY495272 AY495273 AY495274 AY495275 AY495276 AY495277 AY495278 AY495279 AY495280 AY495281 AY495282 AY495283 AY495284 AY495287 AY195745 AY195767 AY339587 AY495256 AY339589 AY339590 AF346965 AY255150 AY255178
A 1
B 2
C
D
E
G
3
4
5
6
F 7 F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F
E E E
Haplogroup H I J K 8 9 10 11 H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H
J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J/J J J/J J/J I I I
L 12
L L L L L/L L/L L/L
U 13
T 14 T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T T T T T T T
V 15
W 16
X 17
Terdapat 97 individu yang tidak termasuk ke dalam haplogroup manapun, sedangkan sisanya 74 individu belum diketahui suku bangsanya. Hasil analisis berdasarkan posisi mutasi urutan nukleotida lengkap secara in silico, ternyata metode RFLP hanya berlaku untuk 133 individu yaitu satu individu memiliki satu haplogroup, individu tersebut adalah yang termasuk ke haplogroup H, 95 individu dan F, 38 individu, sedangkan sisanya sebanyak 541 individu tidak mempunyai sesuatu yang spesifik untuk dapat digolongkan ke dalam group tertentu. Contoh 48 individu dapat digolongkan baik sebagai haplogroup E maupun haplogroup H. Jumlah haplogroup yang sesuai dan tidak sesuai dengan haplogroup RFLP dapat dilihat pada Table IV.6
Tabel IV.6 Jumlah haplogroup yang sesuai dan tidak sesuai dengan haplogroup RFLP. Jumlah Individu yang termasuk ke dalam satu halogroup 133 individu yang sesuai dengan haplogroup RFLP 95 individu, yang tidak sesuai 38 individu. Individu yang memiliki dua haplogroup berjumlah 129 individu, yang sesuai dengan Haplogroup RFLP 107 individu dan yang tidak sesuai 22 individu. Individu yang termasuk ke dalam 3 haplogroup berjumlah 119 individu, yang sesuai dengan haplogroup RFLP 113 individu, 6 individu tidak sesuai. Untuk individu yang memiliki empat haplogroup berjumlah 32 individu, semuanya sesuai dengan haplogroup RFLP Jumlah Haplogroup
Jenis haplogroup
Jumlah individu
Sama dengan RFLP
Tidak sama dengan RFLP
Satu haplogroup
H dan F
133
95
38
Dua haplogroup
EH, HL, HV, HI, HU, HX, FH, DE
129
107
22
Tiga haplogroup
HJT, HIL, EHL, DEH, CEH FHI,
119
113
6
Empat haplogroup
FHJT, HJLT, EHIL
32
32
-
Ketidaksesuaian jumlah haplogroup RFLP dengan haplogroup yang ditentukan atas dasar urutan nukleotida lengkap dikarenakan metode RFLP tidak menggunakan urutan nukleotida lengkap dalam menentukan haplogroup suku-suku bangsa di dunia tetapi hanya menggunakan daerah-daerah tertentu saja dari mtDNA manusia. Metode RFLP juga menggunakan enzim restriksi endonuklease untuk menentukan haplogroup sehingga hanya bagian-bagian tertentu saja yang dapat dianalisis dari urutan nukleotida sesuai dengan sisi pengenalan (recognition site) dari enzim yang digunakan. Untuk individu yang tidak termasuk ke haplogroup manapun, kemungkinan dapat dibuat haplogroup baru berdasarkan sisi pemotongan dari enzim restriksi atau berdasarkan posisi mutasi yang spesifik dari urutan nukleotida tersebut. Untuk individu yang tidak termasuk ke haplogroup manapun, kemungkinan diperoleh sisi restriksi baru yaitu sisi restriksi dari enzim HaeIII, dengan sisi pemotongan 16517, setelah dibandingkan dengan CRS terdapat mutasi pada posisi T16519C, dan posisi ini terdapat pada kelompok individu yang tidak termasuk ke haplogroup manapun.
