Bab III Metodologi
III.1 Bahan dan Peralatan III.1.1 Bahan Penelitian Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini adalah akar nanas yang tertanam dalam tanah di daerah perkebunan nanas di kota Subang Jawa Barat dan akar nanas yang berasal dari proses pertumbuhan tunas akar dari mahkota nanas dalam medium air (hidroponik). Sedangkan kelapa yang dipakai merupakan kelapa tua yang dibeli dari pasar Balubur, Bandung. Krim santan yang digunakan adalah krim santan tidak murni dan krim santan murni. Krim santan tidak murni merupakan krim santan yang diperoleh dari campuran perasan parutan daging kelapa ditambah dengan sejumlah volume tertentu air. Sedangkan krim santan murni adalah krim santan yang asli, hanya berasal dari perasan parutan daging kelapa saja, tidak ditambahkan air pada saat memerasnya. Krim itu sendiri berupa lapisan bagian paling atas dari santan.
III.1.2 Bahan Kimia Semua bahan yang digunakan memiliki kapasitas p.a (pro analysis) yaitu : - Bahan untuk membuat buffer fosfat terdiri dari dinatrium hidrogen fosfat (Na2HPO4) (Merck) dan natrium dihidrogen fosfat (NaH2PO4) (Merck). - Bahan untuk membuat larutan buffer tris-Cl terdiri dari tris base (Merck), dan asam klorida (HCl) (Merck). - Bahan untuk penentuan kadar air terdiri dari pasir laut halus dan murni serta serbuk asbes. - Bahan untuk menentukan bilangan asam terdiri dari kalium hidroksida (KOH) (Merck), alkohol 95 % (Merck), indikator fenolftalin (Merck) dan asam oksalat (H2C2O4.2H2O) (Merck). - Bahan untuk menentukan bilangan iodium yaitu kalium iodida (KI) (Merck), natrium tiosulfat (Na2S2O3) (Merck), kalium bikromat (K2Cr2O7) (Merck), asam klorida (HCl) (Merck), kanji sebagai indikator, iodium (I2) (Merck), asam asetat glasial (Merck) dan bromin.
- Bahan - bahan untk menentukan kandungan asam lemak adalah isooktan (Merck), kalium hidroksida (KOH) (Merck), metanol (Merck), boron trifluorida (BF3) (Merck), natrium klorida (NaCl) (Merck), petroleum benzene (Merck), kertas lakmus universal sebagai indikator, natrium sulfat (Na2SO4) (Merck), gas nitrogen, larutan standar campuran metil laurat (Merck), metil miristat (Merck) dan metil palmitat (Merck). - Bahan untuk dialisis berupa selovan, natrium bikarbonat (Merck), Na2EDTA (Merck) dan barium klorida (BaCl2) (Merck). - Bahan untuk fraksinasi protein adalah amonium sulfat (Merck). - Bahan untuk menentukan kadar protein terdiri dari natrium karbonat (Merck), natrium hidroksida (Merck), kuprisulfat (Merck), kalium natrium tartrat (Merck), folin ciocalteu (Merck) dan bovin serum albumin (BSA) (Merck). - Bahan untuk menentukan aktivitas enzim terdiri dari kasein (Merck), asam trikloroasetat (TCA) (Merck), natrium asetat (Merck), asam asetat (Merck) dan tirosyn (Merck). - Bahan untuk menentukan golongan enzim fenil metil sulfonil flourida (PMSF) (Sigma), CaCl2 (Merck) dan EDTA (etilen diamin tetra asetat) (Merck). - Bahan untuk elektroforesis gel poliakrilamid terdiri dari sodium dodesil sulfat (SDS) (Merck), N, N, N`, N`– tetrametiletilen diamida (TEMED) (Merck), 2 merkaptoetanol
(Merck), glisin (Merck), comassie blue (Merck), metanol
(Merck), asam asetat glasial (Merck), asam klorida (HCl), akrilamida (Merck), bis - akrilamida (Merck), amonium persulfat (APS) (Merck), tris base (Merck), gliserol (Merck) dan brom fenol biru (Merck). III.1.3 Pembuatan Larutan
Buffer fosfat -
Natrium dihydrogen fosfat (NaH2PO4) 0,2 M dibuat dengan melarutkan 27,8 gram natrium dihidrogen fosfat dalam aquades sampai volume larutan 1 L , dalam labu takar.
27
-
Dinatrium hidrogen fosfat (Na2HPO4) 0,2 M dibuat dengan melarutkan 53,65 gram Na2HPO4 dalam aquades sampai volume larutan 1 L, dalam labu takar.
Buffer Tris-Cl -
Larutan tris (hydroximethyl) aminomethane 0,2 M dibuat dengan melarutkan 24,2 gram tris (hydroxymethyl) aminomethane dalam aquades hingga volume larutan 1 L, dalam labu takar.
-
HCl 0,2 M dibuat dengan cara mengambil 16,67 ml HCl
2 M dan
diencerkan dengan aquades hingga volume larutan mencapai 1 L, dalam labu takar. Larutan untuk menentukan bilangan asam. - KOH 0,05 M dibuat dengan cara mengencerkan 25 ml KOH 1,0 N sampai volume larutan 500 ml. - Larutan KOH 1,0 N dibuat dengan cara mereaksikan 5,61 gram KOH dalam aquades hingga volume larutan 100 ml, dalam labu takar. - Larutan asam oksalat ( C2H2O4.2H2O ) 0,05 M dibuat dengan cara mengencerkan 10 ml asam oksalat 0,5 M sampai volume larutan 100 ml. - Larutan asam oksalat 0,5 M dibuat dengan cara melarutkan 126,07 gram asam oksalat dalam aquades sampai volume larutan 250 ml, dalam labu takar. -
Larutan indikator fenolftalin dibuat dengan cara melarutkan 1 gram fenolfthalein dalam 100 ml alkohol 95 %.
Larutan untuk menentukan bilangan Iodium. -
Larutan standar kalium bikromat (K2Cr2O7) 0,0167 M dibuat dengan cara melarutkan 0,123 gram K2Cr2O7 dalam aquades sampai volume 250 ml, dalam labu takar.
-
Larutan KI dibuat dengan cara melarutkan 15 gram KI dalam aquades sampai volume 100 ml, dalam labu takar.
28
-
Larutan natrium tiosulfat (Na2S2O3) 0,1 M dibuat dengan cara melarutkan 24,82 gram Na2S2O3 dalam aquades matang yang telah dingin sampai volume 1 L, dalam labu takar.
-
Amilum 1 % dibuat dengan cara melarutkan 1 gram amilum dalam 100 gram aquades, kemudian dipanaskan sampai jernih.
-
Larutan Hanus Iodin dibuat dengan cara menambahkan 13,2 gram iod ke dalam 1 L larutan asam asetat glasial, kemudian ditambahkan 3 ml bromin.
Larutan untuk penentuan kandungan asam lemak. -
Larutan kalium hidroksida dalam metanol 0,5 N dibuat dengan cara melarutkan 2,8 gram KOH ke dalam metanol sampai volume 100 ml, dikocok sampai homogen.
-
Boron trifluorida (BF3) 14 % dalam metanol dibuat dengan cara mencampurkan 175 ml BF3 20 % dengan metanol sampai volumenya menjadi 250 ml, kemudian diaduk sampai homogen.
-
Natrium klorida jenuh dibuat dengan cara melarutkan 20 gram NaCl ke dalam 100 ml aquades sampai NaCl tidak melarut kembali (pelarutan dapat dipercepat dengan sedikit pemanasan).
Larutan untuk uji aktivitas protease. -
Larutan kasein 1 % (b/v) dibuat dengan cara melarutkan 1 gram kasein ke dalam 100 ml buffer fosfat 0,05 M pH 7 dalam penangas air mendidih. pH dijaga tetap 7. Volume akhir adalah 100 ml.
-
Larutan campuran TCA (trichloroaceticacid) dibuat dengan cara mencampurkan 17,985 gram TCA, 18,04 gram natrium asetat dan 19 ml asam asetat 17 M, dalam aquades hingga volume 1 L, dalam labu takar.
-
Buffer fosfat 0,05 M pH 5 dibuat dengan cara mencampurkan 93,5 ml larutan natrium dihidrogen fosfat 0,2 M ditambah dengan larutan dinatrium hidrogen fosfat 0,2 M sampai pH mencapai 5 dan diencerkan dengan aquades sampai konsentrasinya menjadi 0,05 M.
29
-
Buffer fosfat 0,05 M pH 6 dibuat dengan cara mencampurkan 87,7 ml larutan natrium dihidrogen fosfat 0,2 M ditambah dengan larutan dinatrium hidrogen fosfat 0,2 M sampai pH mencapai 6 dan diencerkan dengan aquades sampai konsentrasinya menjadi 0,05 M.
-
Buffer fosfat 0,05 M pH 7 dibuat dengan cara mencampurkan 39,0 ml larutan natrium dihidrogen fosfat 0,2 M ditambah dengan larutan dinatrium hidrogen fosfat 0,2 M sampai pH mencapai 7 dan diencerkan dengan aquades sampai konsentrasinya menjadi 0,05 M.
-
Buffer fosfat 0,05 M pH 8 dibuat dengan cara mencampurkan 94,7 ml larutan natrium dihidrogen fosfat 0,2 M ditambah dengan larutan dinatrium hidrogen fosfat 0,2 M sampai pH mencapai 8 dan diencerkan dengan aquades sampai konsentrasinya menjadi 0,05 M.
-
Buffer fosfat 0,05 M pH 4 dibuat dengan cara mencampurkan beberapa tetes HCl 0,1 N ke dalam buffer fosfat 0,05 M pH 5.
-
Buffer phosfat 0,05 M pH 9 dibuat dengan cara mencampurkan beberapa tetes NaOH 0,1 N ke dalam bufer fosfat 0,05 M pH 8.
-
Larutan standar tirosin 3 mg/ml dibuat dengan cara melarutkan 30 gram tirosin ke dalam HCl 0,1 M sampai volume 10 ml dalam labu takar.
Larutan untuk menentukan kadar protein -
Pereaksi A dibuat dengan cara melarutkan 2 gram Na2CO3 dalam NaOH 0,1 N hingga volume 100 ml.
-
Pereaksi B dibuat dengan cara melarutkan 0,5 gram CuSO4 dalam K Na Tartrat 1 % (b/v) hingga volume 100 ml.
-
Pereaksi C yaitu larutan alkalin atau biuret dibuat dengan cara mencampurkan 50 ml pereaksi A dan 1 ml pereaksi B (larutan dibuat dalam keadaan segar sebelum digunakan).
-
Pereaksi D dibuat dengan cara mencampurkan 10 ml larutan folin ciocalteu 2 N dengan 10 ml aquades.
-
Larutan standar BSA 200 μg/ml dibuat dengan cara melarutkan 2 mg BSA dalam aquades sampai volume campuran 10 ml dalam labu takar.
30
Larutan untuk elektroforesis gel poliakrilamid. -
SDS 10 % (b/v) dibuat dengan melarutkan 10 gram SDS dalam aquades hingga volume 100 ml.
-
Gliserol 50 % (b/v) dibuat dengan melarutkan 50 gram gliserol dalam aquades hingga volume 100 ml.
-
Larutan A dibuat dengan melarutkan 29,2 gram akrilamida dan 0,8 gram bis akrilamida dalam aquades hingga volume 100 ml.
-
Larutan B dibuat dengan menambahkan 4 ml SDS 10 % (b/v) ke dalam 75 ml buffer tris-Cl 2 M pH 8,8. Kemudian diencerkan dengan aquades hingga volume mencapai 100 ml.
-
Larutan C dibuat dengan menambahkan 4 ml SDS 10 % ke dalam 50 ml buffer tris-Cl 1 M pH 6,8 kemudian diencerkan dengan aquades hingga volume mencapai 100 ml.
-
Amonium persulfat 10 % (b/v) dibuat dengan melarutkan 0,5 gram amonium persulfat dalam aquades hingga volume 5 ml.
-
Buffer elektroforesis (running buffer) dibuat dengan cara mencampurkan 3 gram tris base, 14,4 gram glisin, 1 gram SDS dalam aquades hingga volume 1 L.
-
Loading buffer 5x dibuat dengan cara mencampurkan 0,6 ml buffer tris-Cl 1 M pH 6,8, 5 ml gliserol 50 % (b/v), 2 ml SDS 10 % (b/v), 0,5 ml 2merkaptoetanol, 1 ml bromfenol biru dan 0,9 ml aquades.
-
Separating gel 12 % dibuat dengan cara mencampurkan aquabides 3,3 ml dengan 4 ml larutan A, 2,5 ml larutan B, 0,1 ml SDS 10 %, 0,1 ml amonium persulfat 10 % dan 0,004 ml TEMED. Total volume adalah 10 ml.
-
Stacking gel 5 % dibuat dengan cara mencampurkan aquabides 2,7 ml dengan 0,67 ml larutan A, 0,5 ml larutan C, 0,04 ml SDS 10 %, 0,04 ml amonium persulfat 10 % dan 0,004 TEMED. Total volume adalah 4 ml.
-
Larutan buffer tris-Cl 0,05 M pH 6,8 dibuat dengan cara mencampurkan sejumlah volume tertentu larutan HCl 0,2 M ke dalam 50 ml larutan tris
31
0,2 M hingga mencapai pH 6,8 kemudian larutan diencerkan dengan aquades sampai volume 400 ml. -
Larutan buffer tris-Cl 0,05 M pH 8,8 dibuat dengan cara mencampurkan sejumlah volume tertentu larutan HCl 0,2 M ke dalam 50 ml larutan tris 0,2 M hingga mencapai pH 8,8 kemudian larutan diencerkan dengan aquades sampai volume 400 ml.
-
Larutan untuk pewarnaan elektroforesis (staining) dibuat dengan mencampurkan 0,1 ml comassie blue R-250 dengan 40 ml metanol dan 10 ml asam asetat dalam 49 ml aquades.
-
Destaining solution (larutan pencuci) dibuat dengan cara mencampurkan 250 ml metanol, 10 ml asam asetat glasial dan 65 ml aquades.
Larutan untuk penentuan golongan protease -
Larutan PMSF 0,1 M dibuat dengan melarutkan 174,2 mg PMSF dalam 2propanol anhidrus hingga volume total mencapai 10 ml.
-
Larutan EDTA 0,1 M dibuat dengan melarutkan 375,2 mg garam NaEDTA dalam buffer tris-Cl 0,05 M pH 8,0 hingga volume total mencapai 10 ml.
-
Larutan CaCl2 0,1 M dibuat dengan melarutkan 115,0 mg CaCl2 dalam air suling hingga volume mencapai 10 ml.
III.2 Peralatan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian adalah alat-alat yang berada di Laboratorium Penelitian Biokimia Program Studi Kimia FMIPA – ITB, yaitu : -
Neraca analitis digunakan dalam penimbangan berbagai pereaksi terutama untuk pereaksi yang berupa zat padat.
-
Alat-alat gelas seperti gelas kimia, batang pengaduk, kaca arloji, buret, pipet tetes, gelas ukur, labu Erlenmeyer, corong kaca, tabung reaksi, tabung sentrifuga, pipet mikro eppendorf, tabung mikro, tip biru, tip putih dan tip kuning serta alat – alat lainnya yang mendukung percobaan.
-
pH meter digital untuk mengukur pH larutan buffer yang digunakan.
32
-
Shaker untuk ekstraksi protease.
-
Sentrifuga untuk memisahkan endapan.
-
Vortex untuk menghomogenkan larutan.
-
Membran selofan untuk proses dialisis.
-
Spektrofotometer UV untuk mengukur serapan larutan protein pada λ 280 nm dan pengukuran aktivitas enzim.
-
Spektronic 20 pada λ 750 nm untuk menentukan kadar protein.
-
Inkubator untuk inkubasi reaksi enzim pada suhu tertentu selama pengukuran aktivitas enzim.
-
Freezedryer untuk memekatkan larutan enzim melalui pemvakuman pada suhu rendah.
-
Seperangkat alat untuk elektroforesis.
III.3 Diagram Alir
Penelitian ini meliputi beberapa aspek pengerjaan yaitu pembuatan VCO dengan karakterisasinya yaitu aroma, warna, kadar air, bilangan asam, bilangan iodium dan kandungan asam lemaknya dan mengisolasi protease dari akar nanas, fraksinasi, dialisis,
karakterisasi proteasenya meliputi pengujian aktivitas,
penentuan konsentrasi protein, penentuan jenis protease serta penentuan berat molekulnya. Berikut ini ditampilkan diagram alir yang menggambarkan serangkaian proses-proses yang dikerjakan dalam penelitian ini yaitu :
33
III.3.1 Garis Besar Pembuatan VCO, Isolasi Protease dan Karakterisasinya Akar nanas segar dikeringkan Akar nanas kering digiling Serbuk akar nanas
+ krim santan,diinkubasi 20 jam (diujicobakan untuk membuat VCO)
diekstraksi dengan buffer posfat 0,05 M pH 7
Ekstrak kasar serbuk akar nanas (crude) fraksinasi dengan (NH4)2SO4 Fraksi 1 VCO
Fraksi 3
Fraksi 4
Fraksi 5
didialisis dengan selofan menggunakan buffer fosfat 0,01 M, pH 7 ditentukan konsentrasi protein (Lowry) karakterisasi protease (Horikoshi) : - uji aktivitas - optimasi pH - optimasi suhu - optimasi konsentrasi substrat - ditentukan jenis protease ditentukan berat molekul (SDS PAGE)
karakterisasi
Sifat Fisik
Fraksi 2
Sifat Kimia Data
34
III.3.2 Pembuatan VCO dan Karakterisasinya Kelapa
diparut + air diremas-remas, dibiarkan 15 menit diperas untuk menghasilkan santan disaring Santan
dibiarkan selama 1-3 jam sehingga terbentuk 2 lapisan skim (lapisan bawah) krim (lapisan bagian atas)
+ protease akar nanas dibiarkan 20 jam penyaringan Blondo
VCO
Identifikasi
Sifat Fisik
Sifat Kimia
warna
bilangan iodium (titrasi)
aroma
bilangan asam (titrasi)
kadar air
penentuan jenis asam lemak dan kadar asam laurat (GC / GCMS)
35
III.3.3 Penentuan Kadar Air Botol timbang diisi dengan 10 – 15 gram pasir laut halus dan murni (serbuk asbes) dan pengaduk pendek ditimbang dikeringkan 1 jam pada suhu 105 0C didinginkan ditimbang lagi Berat botol kosong dimasukkan 5 gram VCO diaduk hingga homogen dikeringkan pada suhu 105 0C selama setengah jam didinginkan ditimbang Berat botol dengan VCO diselisihkan berat isi dan berat kosong Data kehilangan bobot (berat air yang hilang)
III.3.4 Penentuan Bilangan Asam 1 gram minyak (VCO)
+ 5 ml alkohol 95 % dipanaskan 10 menit dalam penangas air + indikator fenolftalin Campuran
dititrasi dengan KOH 0,05 N sampai berwarna merah muda Data volume KOH
Catatan: Untuk blanko diperlakukan sama tetapi tanpa menggunakan sampel VCO.
36
Sebelumnya dilakukan standarisasi KOH menggunakan asam oksalat dengan cara titrasi.
III.3.5 Penentuan Bilangan Iodium 0,1 gram minyak (VCO) + 4 ml kloroform + 10 ml Hanus Iodin dibiarkan selama 30 menit di tempat gelap sambil dikocok sesekali Campuran + 10 ml KI 15 % dikocok + 10 ml air panas 70 oC dititrasi dengan Na2S2O3 0,157 M sampai warna coklat berubah jadi kuning + 3 ml kanji / amilum 1 %, titrasi dilanjutkan sambil dikocok sampai warna biru hilang Data volume Na2S2O3 0,157 M Catatan: Untuk blanko diperlakukan sama tetapi tanpa menggunakan sampel VCO. Sebelumnya dilakukan standarisasi Na2S2O3 menggunakan K2Cr2O7 0,0167 M dengan cara titrasi.
37
III.3.6 Penentuan Kandungan Asam Lemak 0,6 gram VCO + KOH dalam 5 ml metanol + batu didih direfluks selama 5-10 menit Asam lemak bebas + 5 ml BF3 14 % didihkan 2 menit + 3 ml isooktan didihkan 1 menit didinginkan pada suhu kamar Campuran + 15 ml NaCl jenuh dikocok-kocok sambil dipanaskan Larutan bagian atas
Larutan bagian bawah
diekstraksi dengan 25 ml petroleum benzena, pada suhu 40-60 0C (2 x) Larutan petroleum benzena dipisahkan dicuci dengan aquades sampai bebas asam, (dicek menggunakan indikator lakmus universal) + Na2SO4 disaring dalam labu evaporator dikeringkan sambil dialiri gas N2 Metil ester dilarutkan dalam isooktan sampai konsentrasi 5-10 % dianalisa dengan GC dan GCMS yang telah diatur pemisahannya menggunakan standar metil laurat, metil miristat dan metil palmitat Data kromatogram
38
III.3.7 Isolasi Protease dan Karakterisasinya Akar nanas segar dikeringkan Akar nanas kering digiling 20 gram serbuk akar nanas diekstraksi dengan 100 ml buffer fosfat 0,05 M pH 7 Ekstrak kasar serbuk akar nanas (crude) 20 % fraksinasi dengan (NH4)2SO4 Fraksi 1
Fraksi 2
Fraksi 3
Fraksi 4
Fraksi 5
didialisis dengan selofan menggunakan buffer fosfat 0,01 M, pH 7 ditentukan konsentrasi protein (Lowry) karakterisasi protease (Horikoshi) : - uji aktivitas - optimasi pH - optimasi suhu - optimasi konsentrasi substrat ditentukan jenis protease, ditentukan berat molekul (SDS PAGE) Data
39
III.3.8 Fraksinasi Protease 40 ml enzim hasil ekstraksi
+ 4,24 g (NH4)2SO4 dalam penangas es, suhu 0 0C Sambil diaduk stirer +- 1 jam, biarkan beberapa jam Sentrifuga, kecepatan 12.000 rpm, suhu 4 0C, 15 menit
Endapan enzim Fraksi 20 %
Supernatan 20 % volume diukur + garam (NH4)2SO4 20 – 40 % (4,52 g) Diaduk stirer 1 jam dalam penangas es, 0 0C biarkan beberapa jam sentrifuga, kecepatan 12.000 rpm, suhu 4 0C, 15 menit
Endapan enzim fraksi 40 %
Supernatan 40 %
Endapan enzim fraksi 60 %
Supernatan 60 %
Endapan enzim fraksi 80 %
Supernatan 80 %
Endapan enzim fraksi 100 %
40
volume diukur + garam (NH4)2SO4 40 – 60 % (4,80 g) diaduk stirer 1 jam dalam penangas es, 0 0C biarkan beberapa jam sentrifuga, kecepatan 12.000 rpm, suhu 4 0C, 15 menit
volume diukur + garam (NH4)2SO4 60 – 80 % ( 5,16 g) diaduk stirer 1 jam dalam penangas es, 0 0C biarkan beberapa jam sentrifuga, kecepatan 12.000 rpm, suhu 4 0C, 15 menit
volume diukur + garam (NH4)2SO4 80 - 100 % ( 5,56 g) diaduk stirer 1 jam dalam penangas es, 0 0C sentrifuga12.000, 40C, 15 menit Supernatan 100 % (dibuang)
masing – masing endapan fraksi ditimbang massanya + 2 ml buffer fosfat 0,05 M, pH 7 sampai larut (bila enzim tidak mengendap lakukan freezzdryer) Enzim dalam larutan simpan sementara pada suhu – 4 0C (sambil menunggu fraksi - fraksi lainnya) Didialisis dengan buffer fosfat 0,01 M, pH 7 Enzim hasil dialisis penentuan konsentrasi enzim, untuk 5 fraksi dan crude(Lowry) uji aktivitas, untuk 5 fraksi dan crude (Horikoshi) Data
Catatan : Fraksi enzim disimpan sementara di suhu – 4 0 C Fraksi enzim disimpan lama di suhu – 20 0 C (untuk stok)
41
III.3.9 Penentuan Konsentrasi Protein (Lowry) Standar BSA 200 μg/ml dibuat berbagai konsentrasi dengan rentang 20 – 200 μg/ml. Tabung 1 Blanko BSA 0 Air 1 ml Biuret 5 ml diaduk rata diinkubasi selama 10 menit (harus tepat), pada suhu kamar setiap 30 detik kemudian untuk setiap tabung secara estafet BSA 200 μg/ml
Air
Tab 2 0,1 ml 0,9 ml
ditambahkan Biuret 5 ml
Tab 3 0,2 ml 0,8 ml
Tab 4 0,4 ml 0,6 ml
Tab 5 0,6 ml 0,4 ml
Tab 6 0,8 ml 0,2 ml
Tab 7 1,0 ml 0
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
Sampel = x Tab8-13 0 (1-X) ml
5 ml
Masing – masing campuran dalam setiap tabung diaduk rata diinkubasi selama 10 menit (harus tepat), suhu kamar Masing – masing campuran hasil inkubasi + folin ciocalteu 0,5 ml diaduk rata, segera diinkubasi 30 menit, pada suhu kamar diukur absorbansinya pada λ 750 nm Data absorbansi Kurva
Catatan : Untuk menghitung waktu, digunakan stop watch.
42
III.3.10 Penentuan Aktivitas Protease (Horikoshi)
KONTROL
0,1 ml Larutan enzim
0,1 ml larutan enzim
+ 0,2 ml kasein 1 % M pH 8 + 0,2 ml buffer phospat 0,05 M pH 8 prainkubasi 37 0 C selama 20 menit Campuran
+ 1,5 ml campuran TCA divorteks diinkubasi 37 0 C selama 15 menit disentrifugasi kecepatan 3500 rpm Supernatan
+ 0,2 ml buffer phosfat 0,05 + 1,5 ml campuran TCA campuran + 0,2 ml kasein 1 % (b/v) divorteks diinkubasi 37 0 C , 15 menit disentrifugasi 3500 rpm Supernatan
absorban diukur pada λ 275 nm standar tyrosin 0 ; 0,3 ; 0,6 ; 0,9 ;1,2 ; 1,5 ; 1,8 ; 2,1 ; 2,4 ; 2,7 ; 3,0 mg/ml Data absorbansi Kurva
43
III.4 Metoda Penelitian III.4.1 Perlakuan Terhadap Akar Nanas. Sampel protease yang disiapkan berupa akar nanas yang tertanam dalam tanah dan akar nanas hidroponik. Akar nanas yang tertanam dalam tanah diambil dari kebun nanas di daerah Jalan Cagak, Subang, Jawa Barat. Sedangkan akar hidroponik disiapkan di rumah menggunakan mahkota daun nanas dengan media air yang disimpan dalam wadah stoples kaca transparan. Penyimpanan dilakukan pada tempat yang cukup sinar matahari. Dalam jangka waktu 3 minggu akar mulai tumbuh. Akar nanas segar yang tertanam dalam tanah dibersihkan. Pengeringan akar nanas dilakukan dengan cara menjemur dibawah sinar matahari. Penggilingan akar nanas agar menjadi serbuk dilakukan di Fakultas Farmasi ITB. Serbuk yang mengandung protease ini langsung dipakai dalam pembuatan VCO. Selain itu akar hidroponik diuji cobakan pula untuk proses pembuatan VCO
III.4.2 Penyiapan Krim Santan Krim santan yang digunakan sebagai bahan pembuatan VCO berasal dari daging kelapa tua segar yang diparut dan dicampur air dengan perbandingan tertentu sehingga didapat santan yang memungkinkan untuk terekstraksi oleh protease akar nanas. Pertama – tama campuran kelapa dan air ini diremas – remas selama 15 – 20 menit untuk menghasilkan santan. Setelah itu disaring dan dibiarkan selama 1 – 2 jam sehingga terbentuk 2 lapisan yaitu krim pada bagian atas dan skim pada bagian bawah. Lapisan ataslah yang kemudian dipakai pada pembuatan VCO. Selain itu dicobakan pula krim santan murni, tanpa air.
III.4.3 Pembuatan VCO Krim santan dicampurkan dengan protease serbuk nanas kering atau akar nanas hidroponik dalam suatu wadah tertutup tetapi tidak terlalu rapat, dibiarkan selama 20 jam.
44
III.4.3.1 Pembuatan VCO dengan Akar Kering Pada percobaan 1, akar nanas kering yang dipakai ditimbang dalam dua variasi massa yaitu 1 gram dan 3 gram begitu pun dengan volume santan (tidak murni) yaitu 100 ml dan 150 ml, yang diperoleh dari 750 gram kelapa parut dalam 400 ml air, sehingga diperoleh perbandingan antara kelapa dan air 15 : 8. Sedangkan perbandingan massa akar dan volume krim santan (tidak murni) sebesar 1 : 150 ; 1 : 100 ; 1 : 50. Setelah 20 jam, dilakukan pemisahan antara VCO, blondo dan akarnya dengan cara dekantasi. VCO diambil menggunakan pipet. Selanjutnya dilakukan penambahan zeolit untuk menarik air dari VCO dan dilakukan penyaringan. VCO yang dihasilkan disimpan dalam botol kaca tertutup. Pembuatan VCO kembali diulang pada percobaan 2, menggunakan serbuk akar kering yaitu 1 gram, 2 gram dan 3 gram dengan volume krim santan (tidak murni) yang sama untuk setiap variasi massa serbuk akar yaitu 100 ml. Krim santan diperoleh dari 750 gram kelapa parut dalam 450 ml air, sehingga diperoleh krim santan kurang lebih sebanyak 400 ml. Perbandingan massa serbuk akar terhadap volume krim santan (tidak murni) adalah 1 : 100 ; 2 : 100 ; dan 3 : 100. Pada percobaan 3 pengulangan pembuatan VCO dilakukan dengan variasi massa akar kering 1 g, 2 g, 3 g, 4 g dan 5 g dengan volume krim santan (tidak murni) yang sama yaitu 300 ml. Berikutnya pada percobaan 4, diujicobakan variasi serbuk akar berturut-turut 1 g, 2 g, 3 g, 4 g, 5 g dengan volume krim santan murni yang sama yaitu 100 ml, sehingga diperoleh perbandingan massa serbuk akar terhadap volume krim santan murni masing-masing adalah 1 : 100 ; 2 : 100 ; 3 : 100 ; 4 : 100 dan 5 : 100.
III.4.3.2 Pembuatan VCO dengan Akar Hidroponik Akar hidroponik dibersihkan, kemudian ditumbuk menggunakan mortar dan alu. Sama halnya seperti pada serbuk akar kering, pembuatan VCO dengan akar hidroponik dilakukan dengan menimbang akar hidroponik dalam variasi massa
45
yaitu 1 gram, 2 gram, 3 gram, 4 gram dan 5 gram, dan dicampurkan dengan krim santan (tidak murni) masing-masing sebanyak 20 ml (percobaan 5). Pada percobaan 6, pengulangan pembuatan VCO dengan akar hidroponik kembali dilakukan dengan massa akar hidroponik yang sama yaitu 1 gram dengan variasi volume krim santan (tidak murni) berturut – turut 50 ml , 100 ml, 150 ml, 200 ml dan 250 ml.
III.4.3.3 Penentuan Randemen VCO Randemen minyak diukur dengan cara mengukur volume minyak yang diperoleh dan membandingkannya dengan volume krim santan yang digunakan.
Randemen VCO = Volume minyak yang dihasilkan x 100 % Volume krim yang digunakan
III.4.4 Kararakterisasi VCO VCO yang diperoleh diuji sifat fisik dan kimianya. Untuk sifat fisik dilihat warna, bau dan kadar airnya. Untuk sifat kimia ditentukan bilangan asam dan bilangan iodium, dengan metoda titrasi. Untuk mengetahui kandungan asam lemaknya dilakukan analisa dengan kromatografi gas.
III.4.4.1 Warna dan Aroma Secara kualitatif warna dan aroma VCO yang dihasilkan dapat dilihat dan dirasakan secara kasat mata melalui pengamatan indera.
III.4.4.2 Kadar Air Sebuah botol timbang diisi dengan kurang lebih 10 gram pasir laut halus (dan murni), berikut sebuah pengaduk pendek. Botol timbang beserta isinya dikeringkan selama 1 jam pada suhu 105 0C. Lalu didinginkan di dalam desikator dan ditimbang. Ke dalam botol timbang tersebut dimasukkan kurang lebih 5 gram
46
contoh dan diaduk hingga serba sama. Akhirnya dikeringkan pada suhu 105 0C selama ½ jam didinginkan dan ditimbang hingga bobotnya tetap.
Kadar air = Kehilangan bobot x 100 % g contoh
III.4.4.3 Bilangan Asam Sebelumnya dilakukan terlebih dahulu standarisasi terhadap larutan KOH dengan larutan baku primer asam oksalat melalui titrasi asam basa. Bilangan asam ditentukan dengan menambahkan 1 gram minyak dan 5 ml alkohol 95 % ke dalam labu erlenmeyer 100 ml. Campuran dipanaskan selama 10 menit dalam penangas air kemudian dititrasi dengan KOH 0,05 N menggunakan indikator fenolpthalein 1 % dalam alkohol sampai larutan berwarna merah muda. Sebagai blanko ditambahkan semua pereaksi dan diberlakukan sama dengan sampel tetapi sampel tidak dimasukkan. Bilangan asam ditentukan dengan cara :
A
= A × N × 56,1 G = Volume KOH untuk titrasi ( blanko – sampel )
N
= Normalitas KOH
G
= Sampel (gram )
56,1
= Mr KOH
Bilangan asam
III.4.4.4 Bilangan Iodium Penentuan bilangan iodium dilakukan dengan cara menambahkan 0,1 gram minyak ke dalam 250 ml Erlenmeyer tertutup. Ke dalamnya ditambahkan 4 ml kloroform dan 10 ml reagen Hanus Iodin. Campuran didiamkan selama 30 menit dalam tempat yang gelap sambil dikocok sesekali. Ke dalam hasil reaksi ditambahkan 10 ml KI 15 % dan dikocok dengan kuat lalu ditambahkan 10 ml air panas suhu 70 0C. Kemudian larutan dititrasi menggunakan Na2S2O3 1 N sampai warna coklat jadi kuning, lalu ditambahkan amilum 1 % sampai titik akhir titrasi
47
hampir tercapai yang ditandai dengan berubahnya warna larutan kuning pucat menjadi bening. Erlenmeyer ditutup dan dikocok kuat – kuat , titrasi dilanjutkan sampai menjadi tepat bening. Sebagai blanko ditambahkan semua pereaksi dan diberlakukan hal yang sama dengan sampel, tetapi sampel tidak dimasukkan. Penentuan bilangan iodium : Bilangan Iodium
= ( B – S ) × N × 12,69 G
N
= Normalitas Na2S2O3
G
= Berat sampel (gram)
B
= Volume Na2S2O3 untuk titrasi blanko
S
= Volume Na2S2O3 untuk titrasi sampel
12,69 = 1 / 10 . Mr I
III.4.4.5 Kandungan Asam Lemak Kandungan asam lemak dalam VCO ditentukan dengan cara kromatografi gas (GC/GCMS). Proses yang dilakukan adalah menimbang sampel sebanyak 0,6 gram dalam labu didih 50 ml. Kemudian ditambahkan KOH dalam metanol 5 ml dan beberapa butir batu didih, direfluks selama 5 – 10 menit sampai terbentuk asam lemak bebas. Ke dalam campuran, ditambahkan 5 ml BF3 14 % melalui dinding kondensor dengan memakai corong, dididihkan kembali selama 2 menit. Selanjutnya ditambahkan 3 ml isooktan melalui corong dan dididihkan kembali selama 1 menit, didinginkan pada suhu kamar lalu ditambahkan NaCl jenuh 15 ml melalui leher labu didih, dikocok – kocok dan sedikit dipanaskan. Larutan bagian atas diambil, kemudian diekstraksi dengan petroleum benzene (40 – 60 ) 0C 25 ml sebanyak 2 kali dalam corong pisah 100 ml. Larutan petroleum benzene yang telah dipisahkan, dicuci dengan aquades sampai bebas asam, dilihat dengan kertas lakmus universal. Pada fasa petroleum benzene tersebut ditambahkan Na2SO4 bebas air, disaring ke dalam labu evaporator. Setelah itu diuapkan pelarutnya dan dikeringkan sambil dialiri gas nitrogen. Metil ester yang dihasilkan dianalisis
48
dengan cara melarutkannya terlebih dahulu ke dalam isooktan sampai konsentrasi 5 - 10 %. Alat injeksi disiapkan, sebelum digunakan dibilas tiga kali dengan larutan standar campuran metil ester. Larutan standar tersebut diinjeksikan ke dalam alat kromatografi gas yang telah diatur kondisi pemisahannya. Analisis ini dilakukan di LIPI Bandung.
III.4.5. Isolasi Protease Akar Nanas. Isolasi protease dari serbuk akar nanas kering dilakukan dengan cara ekstraksi menggunakan bufer fosfat 0,05 M pH 7. Massa serbuk akar nanas kering ditimbang sebanyak 20 gram, disuspensikan ke dalam 100 ml bufer fosfat 0,05 M pH 7 ( 1 : 5 = larutan enzim 20 % ) selama 3 jam, kemudian dilakukan ekstraksi dengan cara shaking selama 2 jam, dilanjutkan dengan sentrifugasi ( JA14 ) dengan kecepatan 5000 rpm, selama 15 menit. Hasil sentrifugasi berupa endapan dan supernatan. Endapannya dibuang dan supernatan diambil (ekstrak kasar = crude), disaring dengan kertas saring untuk kemudian dilakukan fraksinasi.
III.4.6 Fraksinasi Proses fraksinasi dilakukan menggunakan amonium sulfat terhadap crude enzim yang sudah diperoleh. Fraksinasi dilakukan dalam 5 rentang yaitu fraksi 1 (0 - 20 %), fraksi 2 (20 - 40 %), fraksi 3 (40 - 60 %), fraksi 4 (60 – 80 %) dan fraksi 5 (80 - 100 %). Fraksinasi dilakukan terhadap 40 ml crude, sehingga jumlah amonium sulfat yang ditambahkan dihitung berdasarkan tabel standar yang didasarkan pada suhu 0 0C untuk 1 liter larutan enzim (crude). Perhitungannya adalah sebagai berikut : Fraksi 1 ( 0 - 20 %)
= 106 g / 1000 ml x 40 ml = 4,24 g
Fraksi 2 ( 20 - 40 %)
= 113 g/ 1000 ml x 40 ml = 4,52 g
Fraksi 3 ( 40 - 60 % )
= 120 g / 1000 ml x 40 ml = 4,80 g
Fraksi 4 ( 60 - 80 %)
= 129 g / 1000 ml x 40 ml = 5,16 g
Fraksi 5 ( 80 – 100% ) = 139 g / 1000 ml x 40 ml = 5,56 g
49
Fraksinasi dilakukan dalam kamar pendingin dengan suhu 4 0C, pengadukan dilakukan menggunakan stirer untuk mempercepat pelarutan garam amonium sulfat dalam crude. Setelah 4,24 g garam larut (untuk mendapatkan fraksi 1), campuran dibiarkan kurang lebih satu jam untuk memberikan kesempatan agar protein pada crude mengendap. Setelah itu dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm, suhu 4 0C selama 15 menit. Hasil yang diperoleh berupa endapan enzim (fraksi 1) dan supernatan 20 %. Endapan enzim untuk sementara disimpan dalam pendingin suhu 4 0C sambil menunggu fraksi - fraksi yang lainnya. Ke dalam supernatan 20 %, ditambahkan lagi amonium sulfat yang kedua sebanyak 4,52 g (untuk mendapatkan fraksi 2), diaduk kembali dengan stirer dan perlakuan selanjutnya sama seperti yang sudah dilakukan sebelumnya. Demikian seterusnya untuk fraksi – fraksi yang lainnya sampai diperoleh 5 fraksi. Masingmasing fraksi yang diperoleh berupa suatu protein yang terendapkan dan masing masing dilarutkan kembali dalam 2 ml bufer fosfat 0,05 M pH 7. Fraksinasi dilakukan duplo.
III.4.7 Dialisis Dialisis dilakukan menggunakan membran selofan semi permiable, menggunakan pelarut bufer posfat 0,01 M pH 7. Membran selovan yang sudah dipotong – potong sesuai kebutuhan (12 cm) dicuci dengan aquades sampai terbuka kedua ujungnya. Setelah itu membran selovan direndam dalam campuran NaHCO3 (2 % b/v) dan 1 mM EDTA (pH 8), lalu dididihkan selama 10 menit kemudian dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Sebelum digunakan, bagian luar dan dalam selovan dicuci lagi dengan aquades. Dialisis dilakukan dalam 3 perioda. Perioda pertama dialisis dilakukan selama 1 jam, setelah itu bufer hasil dialisis diuji menggunakan BaCl2 untuk mengetahui masih ada atau tidak garam amonium sulfat pada setiap fraksi yang didialisis. Bila diuji dengan BaCl2, bufer masih membentuk endapan putih berarti garam amonium sulfat masih banyak terdapat pada fraksi, sehingga dialisis dilakukan kembali sampai hasil pengujian tidak menunjukkan adanya endapan putih28 dan warna pelarut dialisa sama dengan
50
warna pelarut bufer yang pertama kali digunakan. Proses dialisis pada perioda kedua dan ketiga masing – masing dilakukan selama 2 jam.
III.4.8 Karakterisasi Protease III.4.8.1 Penentuan Konsentrasi Protein Konsentrasi larutan protein hasil isolasi, ditentukan berdasarkan metoda Lowry4 dengan kurva standar bovin serum albumin (BSA) dengan variasi konsentrasi pada rentang 0 μg/ml, 20 μg/ml, 40 μg/ml, 80 μg/ml, 120 μg/ml, 160 μg/ml, 200 μg/ml. Absorban larutan standar dan sampel fraksi – fraksi protease diukur menggunakan spektronic 20 pada λ 750 nm.26 Langkah pengerjaan yang dilakukan yaitu ke dalam 7 tabung reaksi yang terpisah, dimasukkan sejumlah volume larutan protein standar (BSA) 200 μg/ml masing – masing berturut – turut 0 ml, 0,1 ml, 0,2 ml, 0,4 ml, 0,6 ml, 0,8 ml, 1,0 ml. Kemudian ke dalamnya masing – masing
secara terpisah dan berurutan
dimasukkan air 1 ml, 0,9 ml, 0,8 ml, 0,6 ml, 0,4 ml, 0,2 ml dan 0 ml, sehingga diperoleh variasi konsentrasi larutan standar (BSA) 0 μg/ml, 20 μg/ml, 40 μg/ml, 80 μg/ml, 120 μg/ml, 160 μg/ml, 200 μg/ml. Ke dalam masing – masing tabung ditambahkan 5 ml larutan alkalin dan campuran ini diinkubasi tepat 10 menit pada suhu kamar. Selang waktu ini amat kritis. Stopwatch dinyalakan ketika menambahkan larutan biuret pada tabung 1, hingga selang waktu tertentu (minimal 30 detik) sebelum menambahkan larutan alkalin pada tabung 2 dan seterusnya. Setelah 10 menit, ke dalam masing – masing campuran ditambahkan 0,5 ml reagen Folin Ciocalteu dan segera dikocok kuat dengan vorteks atau pengadukan. Kemudiann diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. Waktu inkubasi dapat dimulai setelah penambahan atau pencampuran reagen Folin Ciocalteu ke dalam tabung terakhir. Lalu absorbansinya ditentukan pada λ 750 nm dengan spektrofotometer, dengan menggunakan larutan dalam tabung 1 sebagai blanko. Sementara itu pada tabung berikutnya yaitu tabung 8, 9, 10, 11, 12, dan 13 dimasukkan masing – masing sampel protein (protease) secara terpisah yaitu protease hasil isolasi (crude), fraksi 1 (F1), fraksi 2 ( F2), fraksi 3 (F3), fraksi 4 (F4) dan fraksi 5 (F5), masing – masing sebanyak 0,1 ml. Ke dalam masing –
51
masing sampel ini dilakukan pengenceran dengan menambahkan air sebanyak 0,9 ml (sampel = (1-x) ml ). Selanjutnya dilakukan penambahan larutan Biuret dan Folin Ciocalteu seperti pada larutan standar sehingga diperoleh data absorbansi untuk setiap sampel. Penentuan kadar setiap konsentrasi protein ditentukan berdasarkan kurva standar BSA.
III.4.8.2 Uji Aktivitas Protease Uji aktivitas protease dilakukan dengan metode Horikoshi pada λ 275 nm,5 terhadap crude dan lima fraksi protease, beserta kontrol protease dengan standar baku tirosin dalam berbagai konsentrasi (0 mg/ml, 0,05 mg/ml 0,10 mg/ml, 0,15 mg/ml, 0,20 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,30 mg/ml). Larutan standar ini diperoleh melalui pengenceran larutan standar tirosin 3 mg/ml dengan pelarut HCl 0,1 M. Pengerjaannya dilakukan duplo, baik untuk pengukuran kurva standar tirosin dan uji aktivitas semua fraksi protease. Adapun langkah – langkah yang dilakukan yaitu 0,1 ml larutan enzim (protease) hasil isolasi dan fraksinasi masing – masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 0,2 ml kasein 1 % (b/v) dan 0,2 ml buffer fosfat 0,05 M pH 8. Campuran diinkubasi pada suhu 37 0C selama 20 menit. Setelah itu ditambahkan ke dalamnya 1,5 ml larutan campuran TCA dan dihomogenkan menggunakan vorteks. Inkubasi dilanjutkan pada suhu 37 0C selama 15 menit. Larutan lalu disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan yang diperoleh diukur absorbansinya pada λ 275 nm.5 Kontrol dilakukan dengan cara memasukkan 0,1 ml larutan protease ke dalam tabung reaksi dan ditambah 0,2 ml bufer fosfat 0,05 M pH 8. Setelah itu ditambah 1,5 ml larutan campuran TCA, lalu diinkubasi pada suhu 37 0C selama 20 menit. Ke dalamnya ditambah 0,2 ml larutan kasein 1 % (b/v). Larutan kemudian divorteks dan diinkubasi pada suhu 37 0C selama 15 menit, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan yang diperoleh diukur absorbansinya pada λ 275 nm.5
52
III.4.8.3 Optimasi pH Optimasi pH dilakukan pada pH optimum bromelain yaitu pH 5 – 8,29 dengan penambahan 2 rentang pH yaitu pH 4 dan 9 menggunakan buffer fosfat 0,05 M pada suhu inkubasi 37 0C. Pengerjaannya sama seperti langkah yang dilakukan pada uji aktivitas melalui metode Horikoshi.5 Pengaturan pH dilakukan dengan pengukuran menggunakan pH meter.
III.4.8.4 Optimasi Suhu Optimasi suhu dilakukan pada rentang suhu 25 0C, 37 0C , 49 0C dan 61 0C dengan menggunakan water bath yang dapat diatur suhunya sesuai kebutuhan. Pada optimasi suhu ini, nilai pH bufer fosfat yang digunakan adalah bufer fosfat 0,05 M dari hasil optimasi pH sebelumnya yaitu pH 8. Pengerjaannya sama seperti langkah yang dilakukan pada uji aktivitas melalui metode Horikoshi.
III.4.8.5 Optimasi Konsentrasi Substrat Optimasi konsentrasi substrat dilakukan dengan cara membuat variasi rentang konsentrasi kasein 0,25 %, 0,5 %, 1 %, 1,5 % dan 2 %. Sedangkan pH buffer fosfat yang digunakan adalah buffer fosfat 0,05 M pH 8 (hasil optimasi pH) dengan suhu optimum 37 0C. Pengerjaannya sama seperti langkah yang dilakukan pada uji aktivitas melalui metode Horikoshi.
III.4.8.6 Penentuan Jenis Protease Penentuan jenis protease didasarkan pada uji aktivitas dengan penambahan aktivator atau inhibitor tertentu, sehingga diketahui pengaruhnya terhadap aktivitas protease. Penggolongan protease ditentukan berdasarkan posisi pemotongan rantai polipeptida, pH optimum, aktivitas cincin dan jenis residu asam amino yang terdapat pada pusat aktif. Untuk mengetahui jenis gugus yang terdapat pada sisi aktif enzim, digunakan reaksi spesifik dengan EDTA sebagai inhibitor protease logam, phenyl methyl sulfonil flourida (PMSF) sebagai inhibitor protease serin dan CaCl2 sebagai aktivator protease logam.
53
Penentuan golongan protease dilakukan dengan cara mereaksikan 0,02 ml senyawa inhibitor / aktivator 0,1 M dengan 0,38 ml buffer tris-Cl 0,05 M pH 8, 0,1 ml protease dan 1,5 ml kasein 1 % (b/v). Konsentrasi akhir senyawa inhibitor / aktivator masing – masing 1 mμ.24 Pengerjaannya sama seperti langkah yang dilakukan pada uji aktivitas melalui metode Horikoshi.
III.4.8.7 Penentuan Berat Molekul Protein Protein dapat ditentukan berat molekulnya melalui proses elektroforesis menggunakan gel poliakrilamid. Pemisahan molekul protein terjadi karena adanya perbedaan berat molekul dan penyaringan molekul melalui pori - pori gel. Pembuatan gel bawah (separating gel) Pelat kaca gel yang bersih dan kering disusun ke dalam penyangga sesuai petunjuk. Dalam suatu gelas kimia berukuran 25 ml dicampurkan berturut-turut bahan-bahan untuk membuat gel bawah. Lalu dengan bantuan mikropipet dimasukkan 3,8 ml campuran secara hati-hati ke dalam rangkaian kaca penopang gel dan bagian atasnya dilapisi dengan 400 μL aquades. Campuran dibiarkan berpolimerisasi selama 30 - 60 menit. Pembuatan gel atas (stacking Gel) Ruangan di atas gel dikeringkan dengan kertas saring. Dalam gelas kimia ukuran 15 ml, bahan-bahan untuk gel atas dicampurkan secara berurutan. Lalu dengan bantuan mikropipet dimasukkan 1,4 ml campuran secara hati-hati ke dalam ruangan di atas gel bawah dan pasanglah sisir pencetak sumur (well) sampel. Rangkaian kaca penopang gel dilapisi bagian atasnya dengan 400 μL aquades. Biarkan campuran berpolimerisasi selama 30 menit.
54
Penyiapan sampel Ke dalam tabung mikro dicampurkan sampel crude sebanyak 0,1 ml dengan 100 μl 5 × sampel bufer, kemudian dikocok secara lembut dan dispin 5 detik. Sampel siap untuk dimasukkan ke dalam gel elektroforesis. Hal yang sama dilakukan terhadap fraksi 3 (F3). Proses Elektroforesis Gel poliakrilamid yang telah dibuat diletakkan ke dalam kerangka elektroda, lalu kerangka elektroda tersebut dimasukkan ke dalam cangkangnya dan dikunci dengan baik. Cangkang elektroda dimasukkan ke dalam bilik elektroforesis (chamber). Bagian ruang dalam cangkang elektroda dan bilik elektroforesis diisi dengan buffer elektroforesis. Selanjutnya sampel protein dimasukkan ke dalam sumur gel atas secara perlahanlahan melalui dinding kaca gel. Bilik elektroforesis ditutup lalu dihubungkan dengan elektroda pada sumber arus searah (DC) tegangan 150 volt (konstan) selama 1 jam. Setelah itu hubungannya dengan sumber arus diputuskan. Tutup bilik dibuka dan gel poliakrilamidnya dilepaskan dari kaca penopang. Terhadap satu gel dilakukan pewarnaan dengan larutan pewarna comasi blue. Selanjutnya gel dicuci dengan aquades sampai bersih, lalu diwarnai dengan larutan pewarna. Untuk menghilangkan sisa - sisa comasie blue, gel dicuci dengan larutan pencuci (destaining) berulang-ulang setiap 20-30 menit sampai latar belakangnya bersih.
55
