ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
BAB I PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang Masalah Tumbuhan merupakan tonggak dari sebagian besar ekosistem terrestrial. Ketergantungan manusia pada tumbuhan tampak dari papan dan kayu, pakaian, kertas, obat-obatan dan makanan. Sejauh ini, hanya produk utama tanaman yang dimanfaatkan sementara bagian lain dari tanaman tersebut menjadi limbah. Tanaman pertanian misalnya, secara global menghasilkan 140 juta ton biomassa berupa jerami, akar, daun, tangkai dan kulit buah. Biomassa ini tersedia dalam jumlah besar, dapat diperbaharui dan memiliki nilai ekonomis yang rendah. Pemanfaatan biomassa limbah pertanian global yang tersedia, contohnya untuk dikonversi sebagai energi, dapat menghasilkan energi setara dengan 50 juta ton minyak dan bahan bakar (UNEP, 2009). Biomassa tanaman mengandung lignoselulosa sebagai penyusun dinding sel. Lignoselulosa merupakan polisakarida paling melimpah di biosfer dan tersusun atas 40-50% selulosa, 20-30% hemiselulosa dan 20-30% lignin dalam berat kering. Hemiselulosa terbagi menjadi dua kelompok utama yaitu xilan dan mannan (Salma, 2008), tersedia dalam jumlah besar dan dapat diperbaharui sehingga memiliki potensi untuk diuraikan menjadi produk akhir yang berguna. Xilan, komponen utama hemiselulosa merupakan polimer dari β-1,4-Dxilosa. Pada kebanyakan tanaman, tulang punggung xilan tersubstitusi dengan beragam rantai samping antara lain L-arabinosa, D-galaktosa, dan residu glukuronat (Numan dan Bhosle, 2006). Penguraian xilan secara cepat dan
1 Tesis
KARAKTERISASI SIFAT BIOKIMIA .....
RATNA MELINDA
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
2
sempurna membutuhkan sejumlah enzim hidrolitik antara lain endo-1,4-βxilanase,
β-xilosidase,
α-glukuronidase,
α-L-arabinofuranosidase
dan
asetilesterase (Subramaniyan dan Prema, 2002). Enzim α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) menghidrolisis ikatan α-1,2 dan α-1,3
L-arabinofuranosidik
pada hemiselulosa seperti
arabinoxilan,
L-arabinan dan polisakarida lain yang mengandung arabinosa. Enzim α-Larabinofuranosidase merupakan salah satu enzim pembatas dalam degradasi xilan. Struktur L-arabinofuranosida yang cukup besar akan menjadi halangan ruang bagi aktivitas endo-xilanase dan xilosidase (Debeche et al., 2002; Shallom et al., 2002). Enzim ini mendapatkan perhatian karena aplikasinya yang luas. Aplikasi enzim ini antara lain untuk peningkatan kualitas wine, klarifikasi jus, produksi arabinosa sebagai agen antiglikemik, peningkatan kualitas pakan ternak, produksi bioetanol dan biobleaching pulp (Saha, 2001; Numan dan Bhosle, 2006). Aplikasi α-L-arabinofuranosidase dalam industri pulp dan kertas cukup menarik karena dapat mengurangi agen pemutih seperti klorin dalam proses pulp bleaching. Namun demikian, meski banyak enzim dengan aktivitas xilanolitik, hanya sedikit yang dapat diaplikasikan di industri pulp dan kertas. Penggunaan enzim dalam degradasi hemiselulosa pada industri pulp dan kertas dilakukan pada suhu dan pH tinggi sehingga dibutuhkan enzim dengan stabilitas terhadap alkali dan suhu tinggi (Vieille dan Zeikos, 2001). Enzim α-L-arabinofuranosidase berhasil dimurnikan dari sejumlah bakteri, fungi dan tanaman antara lain Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Bacillus stearothermophilus, Bacillus pumilus (Numan dan Bhosle, 2006; Saha, 2000;
Tesis
KARAKTERISASI SIFAT BIOKIMIA .....
RATNA MELINDA
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
3
Degrassi et al., 2002). Setiap α-L-arabinofuranosidase mikroba memiliki karakteristik yang beragam namun secara umum aktivitas optimal terjadi antara pH 3,0-6,9 dan 40-750C. Geobacillus thermoleovorans IT-08 yang diisolasi dari kawah Gunung Pancar, Bogor, Jawa Barat, Indonesia merupakan salah satu penghasil α-L-arabinofuranosidase (AbfA). Gen pengkodenya, abfa, telah berhasil diklon ke phagemid pBluescript dan dinamakan pTP510. Phagemid tersebut telah diekspresikan di sel inang E. coli DH5α. Baik AbfA ekstraseluler dari Geobacillus thermoleovorans IT-08 maupun yang terekspresi intraseluler di E. coli DH5α/pTP510 rekombinan memiliki aktivitas optimum pada temperatur 70 °C. Overekspresi gen penyandi AbfA telah dilakukan dalam sistem pET101/D-TOPO dalam sel inang E. coli BL21star menghasilkan enzim intraseluler dengan karakteristik sama seperti yang terekspresi di E. coli DH5α/pTP510 dan pH optimum tertinggi adalah 7 (Puspaningsih et al., 2004; Puspaningsih et al., 2005). Penelitian terkait AbfA dari Geobacillus thermoleovorans IT-08 dilanjutkan oleh Yamani (2011), untuk mensekresikan AbfA secara ekstraseluler dengan melakukan kloning gen abfa ke dalam sistem plasmid M5 (excretory expression system) di sel inang E. coli BL21(DE3). Enzim yang dihasilkan menunjukkan aktivitas optimum pada suhu 700 C dan pH 8 tetapi aktivitasnya menurun drastis pada pH 9. Sebagai upaya untuk meningkatkan aktivitas AbfA ekstraseluler pada kondisi basa, Yamani (2011) melakukan directed evolution pada gen abfa dengan metode PCR-Errorprone dilanjutkan kloning gen abfa hasil PCR-Errorprone ke dalam plasmid M5 dan transformasi ke dalam E. coli BL21(DE3). Skrining varian AbfA secara semi kuantitatif menggunakan substrat Methylumberilferil-Arabinofuranosida
Tesis
KARAKTERISASI SIFAT BIOKIMIA .....
RATNA MELINDA
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
(MuA)
dan
skrining
kuantitatif
menggunakan
4
substrat
para-nitrofenil-
arabinofuranosida (pNPA) menunjukkan adanya 3 koloni dengan aktivitas paling tinggi pada pH 9 yaitu A6, A9 dan A12 (Yamani, 2011). Uji aktivitas AbfA ekstraseluler varian A6, A9 dan A12 terhadap substrat pNPA menunjukkan bahwa AbfA A9 memiliki aktivitas arabinofuranosidase pada pH 9 yang lebih baik dibandingkan kedua varian lain. Perubahan nukleotida yang terjadi pada varian tersebut serta pengaruhnya terhadap struktur protein yang diekspresikan belum diketahui karena mutasi yang bersifat acak. Adanya mutasi pada satu asam amino dapat mempengaruhi interaksiinteraksi yang terjadi pada protein sehingga menyebabkan terjadinya perubahan struktur protein yang berakibat pada perubahan fungsi protein. Perubahan aktivitas protein pasca mutasi dapat dipelajari melalui struktur proteinnya. Akan tetapi, penentuan struktur protein dengan kristalografi sinar X atau Nuclear Magnetic Resonance (NMR) sulit untuk dilakukan sehingga prediksi struktur protein secara komputasi banyak digunakan. Pengaruh mutasi terhadap aktivitas dapat diketahui melalui eksperimen seperti penentuan sifat biokimia mutan dan studi kinetika enzim mutan. Sifat biokimia mutan dapat menggambarkan bagaimana mutasi mempengaruhi aktivitas. Akan tetapi, tanpa adanya informasi struktural, akan sulit menjelaskan mekanisme yang menyebabkan terjadinya perubahan aktivitas (Berrondo, 2010; Dodson, 2007). Hubungan antara efek mutasi, fungsi dan stabilitas protein penting untuk dipahami sebagai landasan untuk desain, rekayasa dan pengembangan enzim baru (Tokuriki, 2008).
Tesis
KARAKTERISASI SIFAT BIOKIMIA .....
RATNA MELINDA
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
5
Belum dilaporkan mengenai perubahan nukleotida yang terjadi pada gen abfa hasil PCR-Errorprone. Demikian pula dengan karakter enzim hasil mutasi pada gen pengkode abfa dan perubahan model struktur proteinnya. Dalam rangka mempelajari pengaruh perubahan nukleotida tertentu pada gen abfa terhadap aktivitas, dilakukan karakterisasi sifat biokimia enzim AbfA meliputi suhu dan pH optimum, stabilitas pH serta termostabilitas. Selain itu, dilakukan penentuan struktur protein melalui pemodelan struktur tersier untuk menentukan pengaruh mutasi pada gen abfa terhadap struktur protein yang disintesis sekaligus mempelajari keterkaitan antara perubahan sifat biokimia yang terjadi dengan perubahan pada model struktur AbfA. 1.2. Rumusan Masalah 1. Bagaimanakah perubahan urutan nukleotida pada gen abfa varian A9? 2. Bagaimanakah sifat biokimia dan model struktur tersier AbfA yang disintesis dari gen tersebut? 3. Bagaimanakah keterkaitan perubahan sifat biokimia AbfA varian A9 dengan perubahan model struktur tersier yang terjadi? 1.3. Tujuan Penelitian 1.
Menentukan perubahan urutan nukleotida pada gen abfa varian A9.
2.
Menentukan sifat biokimia dan model struktur tersier AbfA varian A9.
3.
Mengidentifikasi keterkaitan antara perubahan sifat biokimia AbfA varian A9 dengan perubahan pada model struktur tersiernya.
Tesis
KARAKTERISASI SIFAT BIOKIMIA .....
RATNA MELINDA
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
6
1.4. Manfaat Penelitian Dari penelitian ini diharapkan dapat diketahui pengaruh mutasi yang terjadi terhadap sifat biokimia dan struktur tersier AbfA serta keterkaitan antara perubahan sifat biokimia dengan perubahan pada struktur AbfA. Informasi tersebut dapat digunakan sebagai salah satu acuan dalam upaya pengembangan lebih lanjut dari enzim ini maupun desain dan pengembangan enzim baru.
Tesis
KARAKTERISASI SIFAT BIOKIMIA .....
RATNA MELINDA
