TÁMOP 4.1.2.B.2-13/1-2013-0007 „ORSZÁGOS KOORDINÁCIÓVAL A PEDAGÓGUSKÉPZÉS MEGÚJÍTÁSÁÉRT”
MEGHÍVÓ AZ ÖNEMÉSZTÉS, SEJTPUSZTULÁS ÉS MEGÚJULÁS MOLEKULÁRIS SEJTBIOLÓGIÁJA 15 ÓRÁS INGYENES SZAKMAI TOVÁBBKÉPZÉS
Előadók: Lőw Péter, Kovács Attila és László Lajos az ELTE TTK Anatómai, Sejt- és Fejlődéstani Tanszékének docensei Időpontok: 6 héten át, szerdánként, du. 4-6-ig (2015. április 8-tól május 13-ig). Helyszín: Az ELTE lágymányosi déli épületében (Budapest, Pázmány Péter sétány 1/C.), a 6-103-as gyakorlóban. Követelmény: A tárgy teljesítéséhez egy 2-3 oldalas házi dolgozatot vagy óravázlatot várunk a résztvevő tanároktól az anyag egy-egy témájában. TEMATIKA: A kurzuson ismertetjük az az autofágiának, a proteaszóma rendszernek, és az apoptózis folyamatának főbb lépéseit, szabályozását, sok köznapi példával, a folyamatok hibái által okozott közismert betegségek bemutatásával és közben a kutatási módszerek felvillantásával. A belső lebontó folyamatok teljesen ismeretlen területét jelentették a kutató munkának; ebből származtak a kezdeti, főleg módszertani nehézségek, a lassú haladás a sok-sok ellenmondás, amit azonban kárpótoltak a meglepő, különleges, új eredmények. Ezek ma már alapvető, és ezért nélkülözhetetlen részei a modern biológiai szemléletnek és ismereteknek. Emiatt nagyon időszerű és fontos, hogy az általános és középiskolai oktatásban is megjelenjenek. Jelentkezni lehet Emailben, név, iskola és a kívánt tanfolyam megnevezésével Karkus Zsolt egyetemi adjunktusnál:
[email protected] Határidő: 2015 március 30., de kérjük minél előbb tegye meg jelentkezését, mert a férőhelyek korlátozottak! A tanfolyam részletesebb tematikája a következő oldalon!
Az önemésztés, sejtpusztulás és megújulás molekuláris sejtbiológiája
Bevezetés
A 20. század negyvenes éveiig egyszerű volt a felfogásunk a szervezetben történő emésztésről. Mindenki számára jól ismert volt, hogy a felvett táplálékot a bélben emésztő enzimek bontják le, az így keletkezett kis molekulákból a felszívódás után energia keletkezik, és emellett építőkövekként pótolják a szervezetből kikerülő testanyagokat, például az emésztő enzimeket és lelökődött hámsejteket a bélben, a külső elválasztású mirigyek váladékát, a bőr külső szarurétegét, a hajat és a körmöt. A 20. század elején a magyar származású Nobel-díjas Hevesy György munkája tette lehetővé az izotópoknak biológiai nyomjelzőként való használatát. Ennek a módszernek a segítségével a német Rudolf Schönheimer az 1930-as években olyan jelentős felfedezést tett, ami alapjaiban változtatta meg az élő szervezet működéséről alkotott képünket. Kimutatta, hogy a nem növekvő szervezetben is sokkal több építőkő molekula használódik fel és épül be a megemésztett táplálékból a sejtjeinkbe, mint amit az energiatermelés, és az elvesztett anyagok pótlása igényel. Ebből az a kézenfekvő, de mégis meglepő következtetés adódott, hogy mivel a nagyobb beépülés nem okoz testtömeg növekedést, lebomlásnak kell azt ellensúlyoznia. A szervezetünkben tehát nem csak a felvett táplálék lebontása történik, hanem belső lebontó folyamatok révén saját testünk anyagait is állandóan lebontjuk. Mivel a test összetétele alapvetően nem változik, hiszen az életfunkciókat csak így tudja folyamatosan ellátni, a lebontott régi anyagokat a szervezetünknek újra létre kell hoznia. Egyszerűen fogalmazva testünk anyagai, mindenekelőtt a fehérjéink, nem stabilak, hanem dinamikus egyensúlyi állapotban vannak, állandóan lebomlanak és ugyanakkor újra szintetizálódnak. Ezt az állapotot jól lehet illusztrálni az áruk sorsával egy szupermarketben. Ott a polcokon a legkülönfélébb áruk adott mennyiségben találhatók meg. A vásárlók elviszik ezeket árukat, az árufeltöltők pedig pótolják őket. Ha feltételezzük, hogy ez a folyamat tökéletesen működik, akkor adott áruból mindig azonos mennyiségű található a polcokon, miközben a régiek újakra cserélődnek. Azt is világosan láthatjuk, hogy
a különböző áruk fogyásának és pótlásának, tehát kicserélődésének (turnoverének) a sebessége változó. Lényegében ugyanilyen módon cserélődnek testünk anyagai, fehérjéink, sejtalkotóink, és sejtjeink is. Miközben tehát lebomlanak („elpusztulnak”) meg is újulnak, aminek a révén mi magunk is állandóan megújulunk. Ahogyan azt a mellékelt ábra a fehérjéinkre vonatkozóan mutatja, mindez hierarchikus módon, a test szerveződés összes szintjén érvényesül (1. ábra).
1. ábra A fehérje egyensúly szintjei soksejtű szervezetekben. A fehérje egyensúly megteremtése a soksejtű szervezetekben a különböző szerveződési szintek hierarchikus egymásra épülésének megfelelően történik.
A hierarchikusan jelentkező dinamikus egyensúlyi viszonyok az organellumokra és a sejtekre egyaránt érvényesek, tehát pl. a sejtpusztulással az elhaltakéval megegyező számú sejt keletkezése tart egyensúlyt. Ennek alapján nem meglepő, hogy a belső emésztés nem egyetlen folyamat, hanem egymásra épülő, egymással együttműködő és összehangolt mechanizmusok hálózata. A testalkotók dinamikus állapotáról alkotott fenti felfogás az 1960-as évekre vált általánosan elfogadottá, és alapjaiban változtatta meg az élő szervezetek működéséről való gondolkodásunkat. A mai ismereteink alapján a belső lebontó a mechanizmusok hálózatának három szintjét célszerű megkülönböztetni, a makromolekulák, az organellumok és a sejtek szintjeit.
Előadásaink ezt a hármas felosztást a kutatás logikája szerint, nagyrészt a felfedezések időrendjében követik. Elsőként az organelláris lebontással: az autofágiával; ezután a molekuláris lebontással: az ubiquitin-proteaszóma rendszerrel; majd a szintén lebontással végződő sejtpusztulással foglalkozunk.
Az autofágia A korai kutatások első kiemelkedő eredménye a belső emésztés fontos központi szereplőjének, a lizoszómának a fölfedezése volt, amiért Christian de Duve 1974-ben élettani (orvosi) Nobel-díjat kapott. Az ötvenes évek közepén leírt lizoszóma ma már iskolai tananyag. Bár fölfedezése váratlan volt, hamar világossá vált, hogy ennek sejt szervecskének köszönhető a fagocitózissal felvett anyagok úgynevezett heterofág emésztése pl. olyan sejtekben, mint az amőba, vagy a fehér vérsejtek. Az 1960-as évek elején kiderült, hogy a lizoszómák nem csak a kívülről felvett anyagokat, hanem a sejt saját citoplazmájának nagyjából mitokondrium méretű csomagjait is képesek megemészteni. Ezt a folyamatot nevezték el autofágiának. Az autofágia több lépésből álló folyamat. Elsőként egy speciális membrán ciszterna körbeveszi, mintegy bekebelezi a citoplazma egy részét. Az így keletkezett autofagoszóma lizoszómával fuzionál, ezáltal autolizoszóma lesz belőle, majd a beltartalma megemésztődik (2. ábra).
2. ábra Az autofágia folyamata Az autofágia kutatása igazán az új évezredben lendült fel, és mára divatos témává vált. Az előadások során felvázoljuk az autofágia kutatás fő szakaszait, módszereit és eredményeit, egészen a mai napig, amikor már kapcsolatot látunk az élethosszal, az öregedéssel, az egészséges táplálkozással és életmóddal, a normális és kóros fejlődéssel, hibásan működő sejtalkotók megemésztésével, különböző, például neurodegenerációs és daganatos betegségekkel. Az ubiquitin-proteaszóma rendszer Az 1970-es évek során, a sejten belüli fehérjék lebontásáról kapott kísérleti eredmények egyre feszítőbb ellentmondásokhoz vezettek. Kiderült, hogy a lizoszómák mellett a citoszólban valamilyen más mechanizmussal működő enzimatikus fehérjebontó rendszer is működik. Nagy szenzációt jelentett amikor kiderült, hogy ennek a proteolitikus apparátusnak a bélben zajló proteolízissel szemben, ATP-re van szüksége; másik különlegessége pedig az, hogy szelektív, tehát válogat a lebontandó fehérjék között. Az új intracelluláris fehérjebontó apparátus két fő komponense alapján az ubiquitin-proteaszóma rendszer nevet kapta. Az 1980-90-es években végzett kutatások kiderítették, hogy
a felfedezés óriási jelentőségű. Ennek elismeréséül itélték oda 2004-ben a téma három kiemelkedő kutatójának a magyar származású biokémikus, Avram Hershko-nak munkatársainak, Aaron Ciechanovernek és Irwin Rosenak a megosztott kémiai Nobel-díjat Az ubiquitin (sőt többszörös úgynevezett poliubiquitin), amely maga is fehérje természetű, jelként egy másik fehérjéhez kapcsolódik és ezzel a lebontó szerkezetbe, a proteaszómába irányítja azt. Olyan ez, mint az erdész által a fákra rajzolt kréta kereszt, mely megmutatja a favágónak, hogy melyik fát kell kivágnia. Az ubiquitin felkerülése a célfehérjére többlépcsős folyamat, melyhez három enzim egymást követő működése szükséges. A kezdő, aktiválási lépésben tioészter kötés alakul ki az ubiquitin és az ubiquitin aktiváló enzim (E1) között. Az aktivált ubiquitin ezután egy ubiquitin-konjugáló enzimre (E2) kerül át. A végső lépésben az ubiquitin az E2-ről a célfehérjére kerül; az ubiquitin C-terminálisán át izopeptid kötést formál a célfehérje egy lizin oldalláncának ε-amino csoportjával. Mivel az ubiquitinben is van lizin, a fehérjére felkerült ubiquitin maga is ubiquitinilálódhat és mivel a folyamat többször ismétlődik a lebontandó fehérjén kialakul a poliubiquitin jel. Az ubiquitin ligázok (E3) az E2 enzimmel és a szubsztráttal egyaránt kapcsolatba lépnek, és így segítik az ubiquitin-protein konjugációt. A megfelelő E3 enzimek ismerik fel a lebontandó több ezerféle célfehérjét, így ezek felelősek az ubiquitin-célfehérje kapcsolódás, és ennek következtében a fehérjebontás specifikusságáért. Mióta a deubiquitiniláló enzimek (DUB) családját felfedezték, nyilvánvalóvá vált, hogy az ubiquitin konjugáció részben megfordítható. A folyamat hasonló a kinázok és foszfatázok által katalizált megfordítható fehérje foszforilációhoz. A deubiquitiniláció megmenthet egyes multiubiquitinilált fehérjéket a proteaszomális lebontástól, illetve a lebontandó fehérjéről lekerülő poliubiquitin láncot darabolja fel és teszi újrafelhasználhatóvá. A proteaszóma az eddig ismert legösszetettebb fehérjebontó enzim komplexum. Labilis szerkezet, mely magrészecskére és szabályozó részecskékre válhat szét. A proteaszóma proteolitikusan aktív részei a magrészecskében vannak, jól elkülönítve e henger alakú szerkezet belsejében. A lebontandó fehérjék a henger két végén lévő csatornákon léphetnek be a részecskébe (3. ábra).
3. ábra Az ubiquitin-proteaszóma rendszer
Az utóbbi néhány évben jelentős ismeretanyag halmozódott fel az ubiquitin-proteaszóma rendszernek az alapvető biológiai folyamatokban betöltött szerepéről. A sejtosztódást szabályozó fehérjék szelektív és programozott lebontása e rendszer által nélkülözhetetlen lépések a sejtciklus előrevitelében. Szintén a sejt növekedését és szaporodását szabályozza a tumor szupresszorok, proto-onkogének és a jelátviteli rendszerek tagjainak ubiquitin közvetített degradációja. Számtalan a gének átírását (transzkripciót) szabályozó molekula gyors lebontása része egy sereg jelátviteli folyamatnak és környezeti hatásokra adott válasznak. Az ubiquitin rendszer bizonyítottan részt vesz az endocitózisban, a receptorok és szállító molekulák számának csökkentésében, ugyanúgy, mint az endoplazmatikus retikulum állandó vagy rendellenes fehérjéinek lebontásában. Vannak már bizonyítékok az ubiquitin rendszernek az egyedfejlődésben (ontogenezisben) és a programozott sejthalálban (apoptózisban) betöltött szerepére is, bár az érintett célfehérjéket még nem azonosították ezekben az esetekben. Sok ubiquitin-közvetített folyamatban előforduló működési hiba betegséget okoz, akár még a rosszindulatú daganatos elváltozást (malignus transzformációt) is beleértve.
A sejtpusztulás
A fagocitálásra specializálódott sejtek (pl. fehér vérsejtek) jól ismertek voltak arról, hogy szerepelnek a szervezetbe hatoló kórokozók bekebelezésében és lizoszomális emésztésében éppúgy, mint pl. a gyulladásos folyamatokban elpusztult és szétesett sejtek maradványainak „eltakarításában”. Nagy meglepetést okozott az a felfedezés, hogy a sejtek nem csak külső káros hatások révén pusztulhatnak el, hanem öngyilkosságra is képesek. Az ilyen sejthullákat nem csak a fagocitózisra specializálódott sejtek, hanem a szövetben lévő szomszédos sejtek is képesek bekebelezni, majd lizoszomálisan megemészteni. A biológiai halál meghatározását alapul véve azt mondhatjuk, hogy a sejthalál az az állapot, amikor a sejt már alapvető életjelenségeket (mozgás, anyagcsere és transzport folyamatok, ingerelhetőség, osztódás) nem mutat. A sejthalál, bármilyen okból is következik be, egy folyamat eredménye. Ebben az eseménysorban nem könnyű feladat meghatározni azt a pontot, amelytől a sejtet már nem tekinthetjük élőnek. A legcélszerűbb talán azt a pontot kijelölni, amelytől kezdve a folyamat visszafordíthatatlan, még akkor is, ha a pusztulást kiváltó ok esetleg közben meg is szűnik. Mechanizmusa alapján alapvetően két sejthalál típust különíthetünk el: ezek a passzív és az aktív forma. A passzív sejthalál esetében a sejt halálát az okozza, hogy hirtelen az élettel teljesen összeegyeztethetetlen körülmények közé kerül, s az őt ért hatásokra nincs is ideje reagálni. Az intracelluláris
stresszválasz
mechanizmusok
mozgósításához
és
a
génexpressziós
mintázat
megváltoztatásához, a fehérjék átírásához ugyanis idő kell. A passzív sejthalál tipikus példája a nekrózis. Ilyen folyamat például súlyos égési sérülésekkor a hipertermia következtében fellépő tömeges és fokális szöveti sejtpusztulás, de így pusztul el egy tengeri egysejtű is, ha édesvízbe helyezzük. Az aktív sejthalál ezzel szemben egy olyan sejtélettani válaszreakció, amely a – halmozódó szubnekrotikus, sejtkárosító stimulusok hatására aktiválódott, finoman összehangolt – citoprotektív folyamatok legvégső „öngyilkos” stációja, ahonnan nincs visszaút. Az irreverzibilitást a sejt működése szempontjából nélkülözhetetlen fehérjék tömeges proteolízise és a DNS fragmentációja okozza. Az aktív sejthalál nélkül a többsejtű szervezetek egyedfejlődése és élete elképzelhetetlen. (Egy egészséges emberi szervezetben például normális körülmények között
másodpercenként 200-300.000 sejt keletkezik és körülbelül ugyanennyi el is pusztul.) A Clarke-féle tradicionális, morfológiai kritériumok alapján felállított csoportosítás szerint 3 alapvető sejthalál folyamatot különböztetünk meg: az I típusú sejthalál az apoptózis, a II. az autofágia (ami egyúttal az egyik legfontosabb sejten belüli stressz-válasz mechanizmus) és a III. típus a nekrózis. A valóságban az egyes formák között nehéz egyértelmű határvonalat húzni, és több példa is van a kevert előfordulásra, illetve az úgynevezett „átmeneti” formákra. A nekrózis és az apoptózis kevert morfológiai bélyegeivel és átfedő molekuláris lépéseivel jellemezhető sejthalál folyamatot például ezért hívják ma már „nekroptózis”-nak vagy „aponekrózis”-nak. De az autofágia és az apoptózis együttes előfordulását is megfigyelhetjük, például a rovarok egyedfejlődése során. A nekrózist korábban a passzív sejtpusztulás tipikus példájának tekintették, mai definíciója azonban: az a sejthalál típus, amelyből hiányoznak az apoptózis és az autofágia jellemző molekuláris és morfológiai ismérvei. Az aktív sejtelhalás morfológiailag is jól jellemzett és a molekuláris mechanizmusát tekintve legjobban felderített klasszikus példája az apoptózis. A két folyamat között a mai ismereteink szerint is több átmeneti forma létezik, amelyeknek száma feltehetően csak gyarapodni fog. (4. ábra). A nekrózis felől az apoptózis irányába közelítve egyre inkább beszélnünk kell azokról a sejthalál kivitelezésében szerepet játszó molekuláris mechanizmusokról, amelyek meg kell előzzék azt az állapotot, amelyről kijelenthetjük, hogy a sejt életjelenségeket már semmilyen formában sem mutat.
4. ábra. A sejthalál fő típusai
A kurzuson ismertetjük az az autofágiának, a proteaszóma rendszernek, és az apoptózis folyamatának főbb lépéseit, szabályozását, sok köznapi példával, a folyamatok hibái által okozott közismert betegségek bemutatásával és közben a kutatási módszerek felvillantásával. A belső lebontó folyamatok teljesen ismeretlen területét jelentették a kutató munkának; ebből származtak a kezdeti, főleg módszertani nehézségek, a lassú haladás a sok-sok ellenmondás, amit azonban kárpótoltak a meglepő, különleges, új eredmények. Ezek ma már alapvető, és ezért nélkülözhetetlen részei a modern biológiai szemléletnek és ismereteknek. Emiatt nagyon időszerű és fontos, hogy az általános és középiskolai oktatásban is megjelenjenek.
