Az L-[[metil-11C]]metionin hatóanyag-tartalmú radiogyógyszer minőségellenőrzése
Oktatási segédanyag a Radioaktív gyógyszerek előállítása és minőségellenőrzése (TKML0435) gyakorlathoz radiokémikus szakirányú vegyész MSc hallgatók számára
Összeállította:
Dr. Jószai István
Debreceni Egyetem Nukleáris Medicina Intézet Radiokémiai Központ
Debrecen 2014
Gyakorlati segédanyag: L-[[metil-11C]]metionin minőségellenőrzés
Tartalomjegyzék
1. A gyakorlat célja ................................................................................................................3 2. Elméleti áttekintés ..............................................................................................................3 2.1. Pozitronemissziós tomográfia (PET) ................................................................................3 2.2. L-[metil-11C]metionin ......................................................................................................4 2.2.1. Általános információ.....................................................................................................4 2.2.2. Előállítás ......................................................................................................................5 2.2.3. Minőségellenőrzés ........................................................................................................7 2.3. Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia.....................................................................11 2.4. Gázkromatográfia..........................................................................................................13 2.5. Félvezető detektoros gamma-spektrometria ...................................................................17 3. A gyakorlaton alkalmazott HPLC rendszer leírása ...........................................................18 4. A gyakorlaton alkalmazott Clarus 500 GC gázkromatográf leírása ..................................20 5. A gyakorlaton alkalmazott Canberra gamma spektrométer összetevői ..............................22 6. A gyakorlaton elvégzendő feladatok ..................................................................................24 7. Kérdések önálló felkészüléshez .........................................................................................24 8. Felhasznált és ajánlott irodalom .......................................................................................24
2
Gyakorlati segédanyag: L-[[metil-11C]]metionin minőségellenőrzés 1. A gyakorlat célja Az L-[metil-11C]metionin tartalmú radiogyógyszer részleges minőségellenőrzése. Az injekciós készítmény enantiomer tisztaságának vizsgálata radio-HPLC módszerrel. A készítmény etanol tartalmának meghatározása gázkromatográfiás eljárással. A gyógyszer minta radionuklidos azonosítása és tisztaság vizsgálata gamma spektrométer segítségével.
2. Elméleti áttekintés 2.1. Pozitronemissziós tomográfia (PET) A PET az egyik legmodernebb funkcionális képalkotó eljárás a gyógyászatban. Műtéti beavatkozást nem igénylő (non-invazív) eljárás, melynek segítségével háromdimenziós képet nyerhetünk a test egy adott területéről. A CT-vel kombinált PET berendezés jelenti ma a képalkotó diagnosztika egyik legfejlettebb technikáját. A PET és más hagyományos képalkotó eljárások (pl. fMRI, SPECT) sajátossága, hogy nem az anatómiai viszonyokat, hanem a szervek, szövetek különböző funkcionális jellemzőjét (pl. véráramlás, anyagcsere) jelenítik meg egy adott pillanatban. Mivel a betegség kialakulása először a szervek, szövetek funkcionális jellemzőiben okoz elváltozást, és ezt általában másodlagosan kíséri az anatómiai megváltozás, így érthető, hogy a funkcionális képalkotó eljárások jóval hamarabb, még az anatómiai elváltozások kialakulása előtt képesek jelezni a betegséget, azaz a betegség nagyon korai stádiumában nyújtanak hasznos információt. A pozitronemissziós tomográfia működése azon alapul, hogy pozitront sugárzó izotópokkal jelölt molekulák segítésével képes a szervezet biokémiai folyamatait ábrázolni. Ma már a PET-kamerát CT-készülékkel egybe is tudják építeni, így teremtve meg a lehetőségét annak, hogy a PET-tel nyert funkcionális képek és a CT morfológiai információkat azonos anatómiai „szeletekben”, egymásra tudják vetíteni. A PET/CT kombinációs technológia forradalmi változásokat hozott az onkológiai, kardiológiai és neurológiai diagnosztikában. Az eljárás lényege, hogy a vizsgált szervbe pozitron kibocsátással bomló radioaktív izotópot tartalmazó molekulát juttatnak (a leggyakrabban használt izotópok: 18F, 15O, 13N, 11C). A különböző radiofarmakonokkal különböző funkciók működése mérhető fel, attól függően, hogy az illető molekula a szervezeten belül milyen folyamatokban vesz részt. Elméletileg az élő szervezet anyagcseréjében résztvevő bármilyen szerves molekula jelölhető PET izotóppal, és a módszer segítségével szinte mindegyik biokémiai, élettani folyamat leképezhető, illetve aktivitása mérhető. A leggyakrabban használt radiofarmakon a [18F]FDG, ami a fokozott glükózmetabolizmusú sejtekben (agy, szívizomzat, rosszindulatú tumorok, aktivált granulociták és limfociták) halmozódik fel, s mivel nem metabolizálódik, ezért ugyanebben a formában a vesén keresztül a vizeletbe választódik ki (ellentétben a glükózzal). A szervezetbe juttatott marker szöveti eloszlását a PET kamera (egy gyűrű alakú detektor) segítségével lehet detektálni a pozitron-kibocsátást kísérő gamma sugárzás észlelésén keresztül. A vizsgálat során nyert adatokból számítógép segítségével történik a képek rekonstruálása. A vizsgálattal elsődlegesen a test hossztengelyére merőleges szeletek nyerhetők (a CT-hez hasonlóan), akár az egész testről. Később a szeletekből tetszőleges irányú, akár háromdimenziós képek állíthatók elő. A bejuttatott radiofarmakon szöveti eloszlása a különböző (fiziológiás, illetve kóros) funkcionális állapotokban egymástól jelentős mértékben eltér, így ennek alapján a kóros folyamatok felismerhetők és lokalizálhatók. A PET izotópok jellemzője, hogy fizikai felezési idejük nagyon rövid (2-110 perc), 90 perccel a
3
Gyakorlati segédanyag: L-[[metil-11C]]metionin minőségellenőrzés beadást követően az injektált aktivitás 40%-a már távozott a vizelettel, így alkalmazásuk a beteg számára kisebb sugárterheléssel jár. Emellett nagy hátránya az eljárásnak, hogy a használt radioaktív izotópok olyan gyorsan elbomlanak, hogy közvetlenül a vizsgálat előtt, a helyszínen kell őket előállítani, ami jelentősen növeli a berendezés árát. [1] Tipikus PET/CT kamera
PET felvétel az emberi agyról
2.2. L-[metil-11C]metionin 2.2.1. Általános információ Kémiai név: L-[metil-11C]metionin Struktúra:
Molekulaképlet: C5H11NO2S Molekulatömeg: 148,21 g/mol A [18F] radionuklid fizikai jellemzői: • felezési idő: 20,4 perc • a bomlás pozitron kibocsátásával (p+=97%) vagy elektronbefogással (ec=3%) megy végbe • A γ-sugárzás energiája: 511 keV (p+-részecske energiája: 635 keV)
4
Gyakorlati segédanyag: L-[[metil-11C]]metionin minőségellenőrzés 2.2.2. Előállítás A Nukleáris Medicina Intézet Radiokémiai Központjában rutinszerűen gyártott L-[metil-11C]metionin előállítási, tisztítási lépéseit, illetve a minőségellenőrzést az alábbiak tartalmazzák. 11
C radionuklid előállítása
A 11C radionuklid a GE PETtrace típusú ciklotron segítségével kapható nitrogén (6.0)/ oxigén (0,2%, 5.0) gázkeverék protonokkal történő besugárzásával. A 11C izotóp a 14N(p,α)11C magreakcióban keletkezik. A gázkeverékben lévő oxigén azt biztosítja, hogy a keletkező 11C 11 CO2 formában álljon elő a besugárzás végén. Az előállítás paramétereit az alábbi táblázat tartalmazza. Műveleti paraméterek: Ciklotron
PETTRACE 2132402
Nyaláb energia
16,4 MeV
Nyalábáram
30-60 µA
Besugárzási idő
20-40 perc
A besugárzandó nitrogén/oxigén gáz térfogata és 70 ml 10 bar nyomása
A céltárgy specifikációja: paraméter
GE C-11
Target térfogata
70 cm3
Targettest anyaga
alumínium
Targetablak összetétele
Havar fólia (25 µm)
A hatóanyag szintézise és tisztítása A besugárzott target gázból a MeI szintézis rendszer [11C]metiljodidot állít elő teljesen automatikusan. Az automatikus program a szintézist az alábbi fontosabb lépéseknek megfelelően hajtja végre: -
A targetből kiáramló gáz 11CO2 tartalmát molekuláris szűrő köti meg.
-
A megkötött 11CO2 hidrogén gáz hozzákeverése után nikkel katalizátor jelenlétében 360 oC-on 11CH4-ná alakul.
5
Gyakorlati segédanyag: L-[[metil-11C]]metionin minőségellenőrzés -
A következő lépésben a 11CH4 egy 720oC hőmérsékletű kemencében elemi jóddal reagál és [11C]metiljodid keletkezik, amely egy másik molekuláris szűrőn (Porapak N) kötődik meg. (A metán többször áthalad a jódos oszlopon a jobb konverzió érdekében)
-
A folyamat végén a MeI szintézis panel a molekuláris szűrő hevítésével felszabadítja a [11C]metiljodidot, ami bekerül a metionin panel 2,5 ml-es fecskendőjébe, amelyben a 2 mg prekurzor (L-homocisztein) 1 ml abszolút etanolos oldata és 20 mg alumínium- oxidra felvitt kálium-fluorid katalizátor van.
-
A [11C]metiljodid átbuborékol a prekurzor oldaton 2 perc alatt, majd további 1 perc várakozás után ezt az oldatot a 12 ml fiziológiás sóoldatot tartalmazó 20 ml-es fecskendőbe juttatjuk át.
-
Innen a tisztító oszlopokon át a terméket gyűjtő üvegedénybe juttatjuk.
N2 + 0,2% O2
GE PETtrace ciklotron
Besugárzás 14
N(p+,α)11C → 11CO
11
CO2 elválasztása a target gázból
H2
GE MeI Microlab Waste1
11
CO2 átalakítása CH4-ná
11
He, I2
A11CH4 konvertálása 11 CH3I-dá
He Waste2
He
A 11CH3I reagáltatása az L-homociszteinnel
Metionin panel Waste3
0,9 % NaCl oldat
He
A 11C-metionin tisztítása (Sep Pak patronok) He
A 11C-metionin steril szűrése és letöltése
Osztóberendezés
6
Gyakorlati segédanyag: L-[[metil-11C]]metionin minőségellenőrzés 2.2.3. Minőségellenőrzés Az injekciós készítmény enantiomer tisztaságának meghatározása radio-HPLC módszerrel Szükséges eszközök, anyagok • System-1 HPLC rendszer (Lásd a rendszer összetevőinek leírását a Minőségellenőrző laboratóriumban) • Eluens: 30 mM nátrium-acetát, 17 mM L-prolin, 8 mM réz(II)-acetát vizes oldata • Hulladéktároló edény ólomvédelem mögött • 10-100 µl-es digitális pipetta Kromatográfiás körülmények • Kolonna: Merck Lichrospher 100 RP-18, 5 um, 250x4 mm • Térfogat-áramlási sebesség: 2,0 ml/perc, izokratikus elúció • Kolonnatér hőmérséklete: szobahőmérséklet • Injektált térfogat: 20 µl • Detektorok: RA detektor • Vizsgálati idő: 15 perc Minta előkészítés A radiokémiai- és a kémiai tisztaság meghatározásához 20 µl mintát injektálunk az oszlopra. Kiértékelés Kromatográfiás vizsgálat adatgyűjtése és kiintegrálása ChromPass szoftverrel történik. A vizsgálat megkezdése előtt ki kell választani a megfelelő rendszert (System-1), majd a Enant.METH módszert kell megadni. A kromatográfiás mérés indításakor a mérési fájl nevet meg kell adni. A kromatogram kiintegrálásának alapértékei a kromatográfiás módszer részét képezik. Amennyiben az automatikus integrálás nem megfelelő, úgy azt manuálisan kell módosítani. (ChromPass Manual Set) A kromatográfiás módszer az L-[metil-11C]metionin hatóanyag és a D-[metil-11C]metionin szennyező forma kimutatására alkalmas. Az L-[metil-11C]metionint és a D-[metil11 C]metionint tartalmazó minta RA detektoron mért kromatogramját az alábbi ábra tartalmazza.
7
Gyakorlati segédanyag: L-[[metil-11C]]metionin minőségellenőrzés Tájékoztató retenciós idők:
D-[metil-11C]metionin L-[metil-11C]metionin
TR=5,5 perc TR=11 perc
Az enantiomer tisztaság meghatározásához a radioaktivitás detektoron kapott kromatogramot használjuk. A készítmény enantiomer tisztaságát az alábbi képlettel számítjuk ki:
%E =
100 × AL % AL + AD
ahol, E% a készítmény enantiomer tisztasága AL az L-[metil-11C]metionin hatóanyag csúcsához tartozó, a 11C bomlásával korrigált csúcsalatti terület AD a szennyező D-[metil-11C]metionin csúcsához tartozó csúcsalatti terület A készítmény enantiomer tisztasága megfelelő, ha %E ≥90%! Az injekciós készítmény etanol tartalmának meghatározása GC eljárással Szükséges eszközök, anyagok • Clarus 500 GC rendszer (Lásd a rendszer összetevőinek leírását a Minőségellenőrző laboratóriumban) • 5-50 µl-es Hamilton-fecskendő, adagolóval ellátva, amely lehetővé teszi 1 µl minta injektálását • Pipetta 40-200 µl és 0,5-10 µl • Sűrített levegő, égést tápláló gázként alkalmazzuk • H2 gáz, égést biztosító gáz • He gáz, vivőgázként használjuk • Metanol 30 mg/ml koncentrációjú vizes oldata (belső standard). Kromatográfiás körülmények • Kolonna: Porabond U., 25 m, belső átmérő: 0,32 mm, filmvastagság: 7 µm • Detektor: FID • Injektor hőmérséklete: 250°C • Detektor hőmérséklete: 250°C • Vivőgáz nyomása: 10 psi • Split arány: 250 • Levegő áramlási sebessége: 450 ml/perc • Hidrogén áramlási sebessége: 45 ml/perc • Injektált térfogat: 1 µl • Kolonnatér hőmérséklete: 150°C • Vizsgálati idő: 3 perc Minta előkészítés A kapott vizsgálati minta 50 µl térfogatához 50 µl belső standardot adunk, majd az új elegy 1 µl-nyi térfogatát injektáljuk a kapilláris kolonnára.
8
Gyakorlati segédanyag: L-[[metil-11C]]metionin minőségellenőrzés Kiértékelés Kromatográfiás vizsgálat adatgyűjtése és kiintegrálása TotalChrom szoftverrel történik. Az etanol tartalmat belső standard módszerrel határozzuk meg. Az oldószerek tájékoztató retenciós idői: Elúciós sorrend 1 2
Metanol
Retenciós idő (TR), (perc) 1,5
Etanol
2,0
Oldószer
Referencia kromatogram az alábbi ábrán látható:
A kromatográfiás szoftver a felvett kalibrációs görbéből automatikusan kiszámítják az etanol koncentrációt az etanol-ISTD terület arány ismeretében. Az elfogadott etanol koncentráció-tartomány 45-70 mg/ml!
Az injekciós készítmény radionuklidos azonosítása és radionuklidos tisztaságának, felezési idejének meghatározása gamma-spektrometriás eljárással Szükséges eszközök és anyagok • •
A Nukleáris Medicina Intézet Radiokémiai Központjának 001. laboratóriumaiban telepített Canberra gamma spektrométer 0,5-10,0 µl digitális pipetta, 9
Gyakorlati segédanyag: L-[[metil-11C]]metionin minőségellenőrzés radioaktív forrás készítéséhez szűrőpapír korong, 152 Eu hitelesítő sugárforrás.
• •
A minta radionuklidos azonosítása és radionuklidos tisztaságának meghatározása A vizsgálatot a 152Eu etalonforrás (10 kBq-100 kBq) spektrumának felvételével kezdjük. Mérési idő 600 sec (10 perc). A spektrum felvételét követően energiakalibrációt végzünk a 152Eu izotóp 1. táblázatban szereplő, legintenzívebb γ-vonalai alapján. A γ-vonalak azonosítása az egyes vonalakhoz tartozó energiák és intenzitások alapján végezhető. Az L-[metil-11C]metionin tartalmú minta spektrumának felvételéhez először a háttérspektrumot vesszük fel, mérési idő 600 sec (10 perc). Ezt követően a minőségellenőrzésre szánt ampullából 100 kBq-nek megfelelő térfogatú mintát veszünk és egy szűrőpapírkorong közepére cseppentjük. A mérést ugyanolyan geometriai elrendezés mellett végezzük, mint az etalonforrás esetében. A spektrum felvétele előtt a memóriát töröljük, de az energiakalibrációt meghagyjuk. A spektrum felvételének idejét 600 sec (10 perc) értékre állítjuk. A felvétel után csúcskeresést végzünk, majd az értékeket jelentés formájában kinyomtatjuk. 1. táblázat Izotóp 152
Eu
11
C
γ -energia, (keV)
γ -emittálási hatásfok, (%)
121,8*
30,72
244,7
7,74
344,3*
27,24
411,1
2,25
778,9*
12,75
964,1*
14,36
1085,8
10,11
1112,1*
13,43
1408,1*
20,77
511
97,0
Az energiakalibrációt a *-gal jelölt γ-vonalak alapján végezzük. A minta spektrumában 510-512 keV energiatartományban meg kell találjuk a 11C izotóp annihilációs γ -vonalát. Ezt követően szoftveresen kivonjuk a hátteret a felvett spektrumból. Amennyiben ezektől eltérő energiáknál is ismeretlen csúcsok találhatók, úgy a minta spektrumát ebben az esetben mennyiségileg is kiértékeljük, a fotocsúcsok ROI értékeit figyelembe véve. Követelmény: a 11C izotóphoz tartozó ROI százalékos terület aránya ≥99%!
10
Gyakorlati segédanyag: L-[[metil-11C]]metionin minőségellenőrzés Felezési idő mérése A felezési idő méréséhez hat alkalommal felvesszük az L-[metil-11C]metionin tartalmú minta gamma spektrumát 600 sec (10 perc) mérési idővel. A spektrumokból kapott fotocsúcsok ROI területeinek természetes alapú logaritmus értékeit és a mérések közötti idők percben kifejezett értékének függvényében grafikusan ábrázoljuk. A kapott pontokra egyenest illesztünk, amely meredekségéből az alábbi képlet segítségével meghatározzuk a csúcshoz tartozó radionuklid felezési idejét: T1/2 = ln2/Meredekség A mérés alapján számított felezési időnek 19,9 és 20,9 perc közé kell esnie! 2.3. Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia A műszeres analízis kromatográfiás módszereinek feladata, hogy a minta komponenseit legtöbbször szerves vegyületeket – egymástól elválassza. A módszer működésének alapja az, hogy a mozgófázisba (amely gáz vagy folyadék lehet) kevert mintaelegyet szoros kontaktusba hozzuk egy azzal nem elegyedő másik fázissal, amelyet állófázisnak hívunk (egy lapra felvitt, vagy cső belsejében rögzített folyadék vagy szilárd halmazállapotú anyag). A mozgófázist (eluens) állandóan mozgásban tartva a mintaelegy komponensei az állófázissal való kölcsönhatásuk különböző mértéke miatt megfelelő kontaktidő után elkülönülnek egymástól. Amennyiben a rendszerben egy detektort helyezünk el, amely a mintakomponenseket képes megkülönböztetni a minta oldószerétől, akkor a detektorjel idő függvényében való ábrázolásakor a mintakomponenseket reprezentáló csúcssorozatot fogunk észlelni. Ezt a grafikont hívjuk kromatogramnak, a berendezést pedig kromatográfnak. [2] A nagynyomású (vagy nagy teljesítményű/hatékonyságú) folyadékkromatográfiát, amely mintegy 30 éve ismert, a jelzett vegyületek tisztítása szempontjából az egyik legértékesebb elválasztási eljárásának tartjuk. Előnyei közé tartozik, hogy a méréseket szobahőmérsékleten vagy annak közelében végezhetjük, így akár termikusan érzékeny anyagok is vizsgálhatók vele, megfelelő szerkezeti anyagok felhasználásával pedig biológiai eredetű minták is közvetlenül analizálhatók. A kromatográfiás körülmények (kolonna töltetanyaga, eluens minősége, stb.) megfelelő megválasztásával szinte minden vegyületcsalád és minta vizsgálatára alkalmas, sőt esetenként összetett reakcióelegyek komponenseinek üzemi léptékű szétválasztására is alkalmazzák. Hozzáértő kromatográfus kezében a HPLC olyan eszköz, amellyel a gyógyszerekkel, szerves kémiai vagy biológiai eredetű mintákkal kapcsolatos legtöbb analitikai jellegű probléma nagy pontossággal és nagy megbízhatósággal megoldható. Előnyei mellett nem szabad megfeledkeznünk arról, hogy még alap kiépítettség mellett is egy HPLC készülék meglehetősen drága, folyamatos üzemeltetése pedig szintén nagy anyagi terheket jelent. A legutóbbi években elterjedőben vannak azok a nagyon kis belső átmérőjű kolonnák, amelyekkel a felhasznált eluens mennyisége – az analitikai felbontóképesség megtartása, sőt esetenként növekedése mellett – a korábbi mennyiség töredékére csökkenthető (gyors kromatográfia, Ultranagyhatékonyságú folyadékkromatográfia - UPLC). A legelterjedtebb, általános célokra szolgáló kolonnák mellett ma már számos, célzottan csak egy bizonyos vizsgálatra kifejlesztett kolonna is hozzáférhető, amelyekkel nagy számú mintát gyorsan elemezhetünk. [3]
11
Gyakorlati segédanyag: L-[[metil-11C]]metionin minőségellenőrzés A HPLC rendszer a következő alkotórészekből áll: a kromatográfiás töltetet (állófázist) tartalmazó oszlopból (kolonnából), a mobil fázist (mozgó fázist, eluenst) az oszlopon átnyomó pumpából valamint a molekulák retenciós (visszatartási) idejét jelző detektorból.
Kolonna
Szoftver
Injektor Eluens Pumpa
Detektor Hulladék
A HPLC technika nagy hatékonyságú és igen gyors analíziseket tesz lehetővé: akár tucatnyi komponens is elválasztható egy perc alatt. A hatékonyság növelését a speciális megosztófázisok alkalmazása mellett igen apró szemcseméretű – és így nagy fajlagos felületű – töltetek készítésével érték el. Az apró töltetszemcsék azonban igen tömören helyezkednek el a kolonnában, ami jelentősen megnöveli annak áramlási ellenállását. Ennek következtében a mozgófázis áramoltatása csak nagy (100-500 bar, vagyis 107 Pa nagyságrendű) nyomással, különleges szerkezeti anyagból készülő és kémiailag ellenálló, költséges dugattyús folyadékpumpákkal lehetséges. A kromatográfiás gyakorlatban nagyon sok fajta töltetanyaggal találkozhatunk. A legegyszerűbb szorbens a szokásos szilikagél (normál fázis), amelynek a felületét különböző reagensekkel reagáltatva hosszabb-rövidebb szénlánccal (fordított fázis), vagy funkciós csoportokkal szubsztituált szénlánccal borítják be. A kémiailag kötött bevonat a későbbiekben már nem távolítható el. A bevonat alapvetően megváltoztatja a szilikagél tulajdonságait, például alkilcsoportokkal (C8, C18) bevonva az addig erősen poláris felületű szilikagél felülete apolárissá válik, illetve poláris csoportokkal (CN, NH2) homogénebbé és kevésbé aktívvá változtatható a szilikagél felület. Megfelelően megválasztott felületi csoportokkal teljesen új tulajdonságú töltetanyagok állíthatók elő. Nemcsak a porózus felépítésű szilikagél lehet a hordozója a felületi rétegeknek, hanem mikroszkopikus méretű üveg- vagy műanyaggyöngyök is. A szilikagélen alapuló töltetanyagok csak olyan pH-n használhatók, ahol nem oldódik fel a hordozó szilikátváz, azaz az oldat nem lehet bázisos, sem pedig erősen savas. Véglezárással a pH-tartomány kissé kibővíthető, de semmiképpen sem lehet pH = 9 fölött dolgozni velük. A használható pH-tartomány problémáját úgy oldották meg, hogy a felületi rétegeket nem szilikagélhez, hanem mikroszkopikus üveggyöngyökhöz (nem porózus szerkezetű), kemény polisztirol-szemcsékhez, vagy más polimer hordozókhoz kötötték. A polimer hordozós töltetek a mechanikai igénybevételekkel szemben kevésbé ellenállóak, az oldószerváltás, pH-változás hatására duzzadhatnak vagy zsugorodhatnak, a hirtelen nyomásváltozásokat pedig nem viselik el, de izokratikus elúció esetén jól használhatónak bizonyultak. A HPLC kolonnák többnyire 1-4 mm belső átmérőjű, 10-30 cm hosszúságú acélcsövek, amelynek töltete apró szemcséjű (2-40 µm) porózus hordozóból és annak felületén kötött megosztófolyadékból áll. Azt, hogy az elkészült kolonna milyen komponensek hatékony elválasztására lesz alkalmas, a kapcsolt megosztófolyadék kémiai tulajdonságai döntik el: pl. fenilcsoportok aromás vegyületek elválasztására, királis funkciós csoportok az optikailag aktív komponensek elválasztására alkalmas különösen. Az igen elterjedt ún. C18 kolonnákban a hordozó felületéhez oktadecil-csoportok kapcsolódnak.
12
Gyakorlati segédanyag: L-[[metil-11C]]metionin minőségellenőrzés Természetesen az eluens összetétel is nagyban befolyásolja az elválasztás eredményességét (mozgófázis szelektivitás). Normálfázisú kromatográfiánál az állófázis poláros, míg a mozgófázis apoláros jellegű; ilyenkor a poláros komponensek jobban kötődnek az állófázishoz, vagyis nagyobb retenciós idejű csúcsokat fognak produkálni, ez az összeállítás tehát a poláros komponensek elválasztásának kedvez. Fordított fázisú kromatográfia esetében ez éppen fordítva van, az állófázis apoláros (pl. C18 csoportokat tartalmaz) és a mozgófázis poláros (pl. víz-metanol elegy); ilyen körülmények mellett az apoláros komponensek, pl. aromás szénhidrogének választhatók el jól. A nagy nyomáson való működés további követelményeket támaszt a felhasznált folyadékokkal és a mintaadagolóval szemben is. Az eluens és a minta sem oldott gázokat, sem apró szemcsés szennyeződéseket nem tartalmazhat; az előbbiek a detektorban felszabadulva a jel pulzálását idézhetik elő, míg az utóbbiak a töltetszemcsék közötti, mikrométernél kisebb járatokat eltömítik. Így az eluenseket és a mintát 0,2-0,45 µm-es pórusméretű szűrőn való vákuumszűréssel és az eluens esetében még ultrahangos kirázással szokás előkészíteni a használatra. A HPLC vizsgálatokhoz használt oldószereket nagyon gondosan meg kell szabadítani a bennük oldott gázoktól. Nagy gáztartalmú oldószert használva a kolonnában buborékok képződnek, amelyek eredményeképpen az elválasztás jelentősen romlik, a sávok kiszélesednek, alakjuk torzul, a kolonnán mérhető nyomás, az oldószeráramlás sebessége ingadozik. A detektorban keletkező nagyobb buborékok álcsúcsokat, a fotometriás detektorcella falára feltapadó, egyre növekvő méretű buborékok az alapvonal emelkedését. élesen kiugró „tüskéket” eredményeznek, természetesen ezen jelenségek egyike sem reprodukálható. Egy-egy álcsúcs adott esetben jelentősen megkeserítheti a kromatográfus életét, hiszen sok munkát kell arra fordítani, hogy bebizonyítsuk, az „ál”-ként azonosított csúcs valóban álcsúcs volt. A radioaktív izotópokat tartalmazó vegyületek HPLC elválasztása során megfelelő típusú radioaktivitás detektorokat alkalmaznak. Ezek általában átfolyós detektoroknak tekinthetők, amelyek tulajdonképpen egy ólomárnyékolással ellátott a megfelelő ionizáló részecskékre érzékeny detektor (mérő) fejből és a hozzá csatlakoztatott elektronikai kiszolgáló egységekből áll. A kromatográfiás oszlopról távozó un. aktív komponensek pedig a mérőfej előtt elhaladó csőszakaszba jutva kerülnek a detektor látómezejébe. A detektorjel nagysága értelemszerűen függ a minta radioaktivitásának nagyságától. A mérőfej általában olyan vegyületet rejt, amely érzékeny az adott ionizáló részecskére. A kölcsönhatás eredményeképpen fotonok keletkeznek, amit az elektronikai kiszolgáló egységek jelként értelmeznek és továbbítanak az adatgyűjtő szoftver felé. 2.4. Gázkromatográfia A gázkromatográfia mozgófázisa gáz, az állófázisa vagy felületen (legtöbbször kolonna belső felületén) kötött folyadék vagy szilárd anyag. A mintát, amely lehet bármilyen halmazállapotú, de leggyakrabban gáz vagy folyadék, gáz halmazállapotban juttatjuk a kolonnára — a folyadék vagy szilárd halmazállapotú mintákat tehát a mintabevitel során el kell párologtatni. Ebből következik, hogy a kolonnát és a detektort is olyan hőmérsékleten kell tartanunk (100-500°C), hogy a minta az analízis egész ideje alatt gáz halmazállapotú legyen. A gázkromatográfia tehát bomlás nélkül gázzá alakítható vegyületek elválasztására alkalmas. Megfelelő állófázis megválasztásával gyors, hatékony elválasztást biztosít
13
Gyakorlati segédanyag: L-[ L [metil-11C]]metionin minőségellenő őségellenőrzés mindazon vegyületek esetében, amelyek megfelelnek az előbbi előbbi feltételnek. gázkromatográfok felépítésének általános sémáját az a alábbi ábra mutatja. [2]
A
Az eluenst, amelyet itt vivőgáznak őgáznak nevezünk, rendszerint egy nagynyomású gázpalackból vesszük. A vivőgáz gáz megválasztása leginkább a detektor függvénye: lángionizációs detektorhoz nitrogén vagy argon, hhővezetőképességi detektorhoz leginkább hidrogén hidrogén- vagy héliumgáz használatos. A gáz nyomáscsökkent nyomáscsökkentő után, az áramlási sebesség folyamatos mérése mellett jut a kolonnára. A viv vivőgáz általában: H2, He, (N2, Ar). A vivőgáz gáz oxigén, vízvíz és szénhidrogénmentes legyen, 99,999% vagy annál nagyobb tisztaságú. A hidrogén gőz és robbanásveszélyes, palackból csak indokolt esetben célszer célszerű használni, ma már a hélium az általánosan elterjedt vivőgáz. A gázok hagyományos gázpalackokból, vagy azok egy részének kiváltására szolgáló gázgenerátorokból vehetők vehet ki. (bemeneti nyomások: kb. 4-66 bar). ő és ffűthető, tipikusan 30-450 °C tartományban m működő A kolonnatér egy hűthető légtermosztát, a hőmérséklet mérséklet változtatása általában 3-77 lépésben programozható. Nagy stabilitás, gyors működés ködés a követelmény, maximális felfűtési felf sebesség kb. 30-50 50 °C/perc. [3] A mintaadagolás több okból is kritikus pontja a gázkromatográfiának. Egyfelől Egyfel nem könnyű megoldani, hogy a minta elpárologtatása pillanatszerűen pillanatszer játszódjék le – márpedig a hatékony elválasztás lválasztás alapfeltétele, hogy a minta egyszerre, minél gyorsabban kerüljön be az eluens áramlásba. Másfelőll a kis térfogatú minták kezelése, reprodukálható adagolása is nagy körültekintést igényel. Ennek megfelel megfelelően en többféle mintaadagoló rendszert is kido kidolgoztak. Ezek közül a legegyszerűbb űbb megoldást aaz alábbi ábra mutatja be.
Gyakorlati segédanyag: L-[ L [metil-11C]]metionin minőségellenő őségellenőrzés
Itt a minta beadagolása közvetlenül a kolonna bemenetére szerelt, fűtött fűtött mintakamrába történik oly módon, hogy a kamra tetejét lezáró, gumiból készült zárókupakot (szeptum) (szeptum átszúrjuk a precíziós, teflon dugattyús mintaadagoló fecskendővel. fecskend vel. A szeptum feladata a fecskendő kihúzásakor újból lezárni a kamrát. Az elválasztást végző kolonna acél acél- vagy üvegcsőből készül. Külső megjelenését tekintve kétféle lehet: 2-6 mm belsőő átmérőjű, átm , töltetet tartalmazó ún. töltetes kolonna, vagy 0,2-0,5 mm átmérőjű,, a megosztó fázist belső bels falán vékony filmként felhordottan tartalmazó kapilláris kolonna. A töltetes oszlopok hordozó töltete megfelelő mechanikai szilárdságú, nagy fajlagos felületű és kémiailag inert anyag (diatómaföld, polimerek, stb.), amelynek a felületén egyenletes filmet képezve jól tapad a megosztófolyadék. A megosztófolyadékot alkalmas oldószerben feloldják, az oldatba belekeverik a szilárd hordozót, majd lassan elpárologtatják ják az oldószert. Az ily módon előkészített el készített állófázissal töltik meg a kolonnát. Készíthető még töltetes kolonna szilárd adszorbenssel (pl. aktív szén, alumínium alumínium-oxid, szilikagél) való megtöltés útján is. A töltetes kolonnák az előállítás el állítás nehézkessége miatt viszonylag rövidek (1-55 m), ellenállásuk a viv vivőgázáramlással gázáramlással szemben viszonylag nagy, azonban kapacitásuk nagy, ezért nagyobb (pár µL) L) mintamennyiséggel dolgozhatunk velük. A kapilláris kolonnákban ban nincs hordozó, a megosztófolyadékot közvetlenül a cső cs belső falára viszik fel. Az egyszerűbb, űbb, bb, de kevésbé tartós eljárás során a folyadékot oldószerben oldják, majd nyomás alatt átpréselik a 15-60 15 60 m hosszú kapillárison. A modern kapilláris kolonnákban a megosztófolyadékot valamilyen kémiai kötéssel (gyakran szilanizálással) szilanizálással) rögzítik a cs cső belső falához, ezzel megakadályozva annak „lehordását” (a vivőgázzal viv gázzal való lassú kiürülését), ami a kolonna élettartamát megrövidítené. A kapilláris kolonnák hosszúsága nagy, így elméleti tányérszámuk k kimagasló, 50000 50000-100000 is lehet. Használatukat megnehezíti azonban, hogy kapacitásuk kicsi, ezért igen kis mintamennyiség (a µL L törtrésze) adagolható rájuk.
Kapilláris kolonnák: 0,10 – 0,53 mm külső küls átmérő, 5-100 100 m hosszúság, 0,1 0,1-5 mikron filmbevonat. Töltött kolonnák: 2-6 mm külső átmérő, átmér 0,02-33 mm szemcseméret, vastagabb film bevonat bevonat.
Előnyök és hátrányok: Kapilláris: nagy csúcsfelbontás, kis terhelhetőség, terhelhet ség, nagyobb kémiai érzékenység, kis gázáram, bő méretbeli és fázisválaszték, néhány detektorhoz nem előnyös. el
Gyakorlati segédanyag: L-[ L [metil-11C]]metionin minőségellenő őségellenőrzés Töltött: kis csúcsfelbontás, súcsfelbontás, nagy terhelhetőség, terhelhet ség, nagy gázfogyasztás, házilag tölthet tölthető, a fázis házilag módosítható, nagy érzékenységű érzékenység detektorokhoz csak gázszétosztással csatlakoztatható. A megosztó folyadékot az elválasztó komponensek anyagi minőségi, min ségi, kémiai jellemz jellemzői alapján választjuk meg. Poláros mintakomponensekhez pl. szintén poláros polietilén polietilén-glikolok (Carbowax, DB-WAX, WAX, stb.), míg apoláris komponensekhez pl. polipropilén használható. Fontos szempont kiválasztásukkor, hogy az analízis során szükséges kolonna hőmérsékleten hő kevéssé párologjanak. A kolonnán elválasztott komponenseket a viv vivőgáz a detektorba juttatja, amely a komponensek vivőgázbeli gázbeli koncentrációjával arányos elektromos jelet ad. Sokféle, a mintakomponensek különböző kémiai és fizikai jellemz jellemzőjének mérésén alapuló detektort fejlesztettek ki – ezek közül az alábbiakban csak a két legelterjedtebbről legelterjedtebbr lesz szó. A hővezetőképességi őképességi detektor (TCD, katarométer) érzékelője ője egy kis térfogatú cellában elhelyezett, elektromosan fűtött f fémszál.
hő arányos, hőmérséklete mérséklete azonban a körülötte A fűtött fémszál ellenállása hőmérsékletével áramló gáz hővezetőképességétő képességétől függ. Tiszta vivőgáz gáz (hidrogén vagy hélium) áramlásakor, az analízis kezdetén egy adott ellenállásértéket mér a hozzákapcsolt elektromos m műszer, azonban rosszabb hővezetőképesség őképességű gáz – vagyis a mintakomponensek ggőzének – detektorba jutásakor a szál kevésbé hűl h le, így ellenállása nő. A hővezetőképességi őképességi detektor univerzális, a vivőgázon kívül mindent mérni képes detektor (vagyis nem szelektív), amely 3-5 koncentráció nagyságrenden keresztül lineáris válaszjelet ad. Kimutatási képessége ugyanakkor nem kiemelkedő; ő; kb. 1 µg. A lángionizációs detektor egy másik, igen elterjedten alkalmazott gázkromatográfiás detektortípus. Ez tulajdonképpen egy kisméretű kisméret hidrogén/levegő gázeleggyel táplált láng, amely fölé elektródpárt helyeznek el. Ezen két elektród közé olyan feszültséget kapcsolnak, amelyen még nem keletkezik szikrakisülés az igen nehezen ionizálható vivőgá vivőgázáramlásban (nitrogén vagy argon). A kolonnát elhagyó szerves komponensek a lángban oxigén közreműködésével ködésével ionizálódnak. Az ionok képződése képz dése hatására a két elektród között gyenge áram folyik, amely erősítés ősítés után mérhet mérhető,, és a mintakompoens koncentrációjával koncentrációjáva arányos nagyságú lesz. Ez a detektor igen érzékeny, mintegy 10-11 10 11 g anyag kimutatására alkalmas, linearitása valamivel jobb, mint a hővezetőképességi hő detektoré.
Gyakorlati segédanyag: L-[[metil-11C]]metionin minőségellenőrzés 2.5. Félvezető detektoros gamma-spektrometria A gamma-sugárzó nuklidok kimutatásához a legérzékenyebb módszer a félvezetős gammaspektrometria. A gamma-sugárzás energiája meghatározott érték (a spektruma tehát vonalas), jellemző az őt kibocsátó atommagra – a gamma-sugárzás tehát nuklid specifikus. A gamma-spektrometria a gamma-sugárzó nuklidok gamma-energiájának meghatározása alapján a nuklid minőségi meghatározását teszi lehetővé megfelelő nuklidkönyvtár segítségével. A minőségi analízis mellett a gamma-sektrum teljesenergia csúcsainak intenzitásaiból (csúcs alatti terület) megfelelő hatásfok ismeretében az aktivitás, a radioizotóp mennyisége határozható meg. A félvezetőkben a sugárzásból elnyelt energia hatására elektron-lyuk párok jönnek létre. Geban egy elektron-lyuk pár létrehozásához szükséges energia viszonylag kicsi (2.9 eV 77 K hőmérsékleten). Ez az érték kb. 100-szor kisebb, mint pl. a NaI (Tl) szcintillációs detektorok megfelelő jellemzője, az egy fotoelektron létrehozásához szükséges energia. Azonos energialeadás esetén tehát két nagyságrenddel több töltéshordozó keletkezik Ge-ban, mint a szcintillációs detektorban. A töltéshordozók számának relatív statisztikus ingadozása így lényegesen kisebb lesz, ami a detektor sokkal jobb energiafelbontását eredményezi. A töltéshordozók száma arányos a leadott energiával (azaz teljes energialeadás esetén a gammafoton energiájával). Ez a kapcsolat lineáris az egész energiatartományban. Az összegyűjtött töltésnek megfelelő feszültségimpulzus amplitúdója arányos a gamma-sugárzásból elnyelt energiával. Az energiaszelektív detektor jeleinek feldolgozásához sokcsatornás analizátor szükséges. Működésének az a lényege, hogy az elnyelt energiával arányos feszültségimpulzusok szétválogatásához és megszámlálásához a vizsgálandó impulzusmagasság tartomány a csatornaszámnak megfelelő részre van osztva. Az erősítőből érkező impulzusok nagyságát megfelelő elektronika értékeli ki és az adott impulzusmagasságnak megfelelő csatorna tartalma minden analizált impulzussal, eggyel nő. A detektort folyamatosan cseppfolyós nitrogénnel kell hűteni. A felvett spektrumok kiértékeléséhez az energia és hatásfok kalibráció szükséges. A kalibrációkhoz olyan ismert összetételű sugárforrásra van szükség, amely legalább 3, egymástól jól elkülönülő gamma-vonalat ad és amelyeknek pontosan ismerjük az aktivitásait. Az energiakalibrációhoz leggyakrabban használt radioizotópok: Co-60
1173.2 és 1332.4 keV
Cs-137
661.6 keV
Na-22
1274.6 és 511 keV
K-40
1462 keV
Cs-134
604.6 és 795.9 keV
Ba-133
356 keV
Y-88
898 és 1836.1 keV
Az energia-kalibráció lényege, hogy a csatornákhoz (feszültségtartományokhoz) energiákat rendelünk adott nagyfeszültségnél és erősítésnél. Az energia-kalibrációnak azt az energiatartományt kell lefednie, amelyben a vizsgálandó radioizotópok előfordulhatnak. Az
17
Gyakorlati segédanyag: L-[[metil-11C]]metionin minőségellenőrzés energia-kalibráció lineáris. Ha van energia-kalibrációnk, segítségével a mintánkban levő radioizotópokat tudjuk meghatározni. Ha ezek mennyiségét is tudni szeretnénk, hatásfokkalibrációt is kell végeznünk. A hatásfok-kalibráció függ a környezeti minta mérésénél alkalmazott geometriától: a minta lehet szilárd (pl. talaj, kőzet stb.) vagy folyadék (pl. ivóvíz, folyóvíz, tej stb.), a minták tömege különböző adott halmazállapotnál is (pl. néhány grammos porminta, nagyobb darab kőzetminta, vagy a vízminta lehet 50 ml, vagy 250 ml stb.). Tehát az adott energiakalibráció mellett minden alkalmazott geometriánál el kell végezni a hatásfok- kalibrációt, amennyiben a mintában a radionuklid aktivitását is meg akarjuk határozni. Ehhez a környezeti minta mérésénél alkalmazott geometriájú, ismert összetételű és aktivitású sugárforrásra van szükség. Fordítva: amilyen geometriájú kalibrációt tudunk elvégezni, olyan geometriában mérhetjük a mintáinkat!
3. A gyakorlaton alkalmazott System-1 HPLC rendszer leírása A HPLC rendszer jellemzése A System-1 HPLC rendszer a Nukleáris Medicina Intézet Radiokémiai Központjának Minőségellenőrző laboratóriumában van elhelyezve (25. szoba). A rendszer egységeit és tartozékait az alábbi táblázat és ábra mutatja be. Egység
Típus
Gyártó
Forgalmazó
Szériaszám Funkció
HPLC pumpa
PU-2080 (Intelligent HPLC pump)
JASCO
ABL&E-JASCO Magyarország Kft.
B034960962 Eluens szállítás
Gázmentesít DG-2080-54 ő egység (4-line degasser)
JASCO
ABL&E-JASCO Magyarország Kft.
B017460885
Eluens gázmentesítés
Kvaterner szelep rendszer
LG-2080-04 (Quaternary gradient unit)
JASCO
ABL&E-JASCO Magyarország Kft.
C016560882
Euens kiválasztás
Drain
AD-950-02 (Auto drain unit)
JASCO
ABL&E-JASCO Magyarország Kft.
A730096
Injektor hulladék elszívás
Injektor
AS-950-10(Intelligent JASCO sampler)
ABL&E-JASCO Magyarország Kft.
D3471961
Mintaadagolás
Switching valve 1 (váltószelep)
Knauer
LAB-COMP Kft.
67480
Switching valve 2 (váltószelep)
Knauer
Kolonna kiválasztás
Oszlopváltó LAB-COMP Kft.
67481
18
Gyakorlati segédanyag: L-[[metil-11C]]metionin minőségellenőrzés Egység
Típus
Gyártó
Forgalmazó
Photosensor module Radioaktivit with PMT tube Hamamatsu Hamamatsu plasztik ás (RA) szcintillátorral detektor Tápegység
NMI
NMI
Szériaszám
Funkció
13160004
Radioaktív anyagok detektálása
TE-1
UV/VIS detektor
UV-2077 (4-λ Intelligent UV/VIS detector)
JASCO
ABL&E-JASCO UV aktív Magyarország B012960868 anyagok Kft. detektálása
Interfész
LC-Net II/ADC
JASCO
ABL&E-JASCO Adatgyűjtésés Magyarország B233061067 adattovábbítás Kft.
Szoftver
ChromPass Ver. 1.7.403.
JASCO
ABL&E-JASCO 03-950023Magyarország 01 Kft.
Dell Inc.
Dell Inc.
GW2SV4J
Hewlett-Packard
CND8832R5 Nyomtatás S
Számítógép DELL
Nyomtató
HP Laserjet M1120n HewlettMFP Packard
LCNet
Vezérlő- és kiértékelő szoftver Rendszervezérlés
PC HP
Elektromos csatlakozások Eluens csatlakozások
Degasser
Eluens tartály
Gradient unit
Pumpa
Injektor
Drain
Oszlop váltó
UV/Vis
RA
Hulladék tároló
19
Gyakorlati segédanyag: L-[[metil-11C]]metionin minőségellenőrzés A készülék működtetése Ellenőrizzük, hogy az eluenstartályban van-e elegendő eluens, és a megfelelő csővel van-e a szivattyúhoz csatlakoztatva. Győződjünk meg róla, hogy az adott vizsgálathoz szükséges oszlop van-e kiválasztva az oszlopváltón: a 3 pozícióban lévő kolonna használatos; a 6 pozíció a mosóág. Az utolsó detektor kimenetéhez tegyünk ólomárnyékolással ellátott hulladékgyűjtő edényt. A mérések végeztével a rendszert vízzel mossuk át! A pumpát a főkapcsoló bekapcsolása után a rajta lévő `PUMP` gomb megnyomásával lehet elindítani. Az áramlási sebességet a `FLOW` gombbal tudjuk szabályozni úgy, hogy a pumpa kijelzőjén aktiválódott sebességet a kívánt értékre állítjuk. A `PUMP` gomb ismételt megnyomásával pedig az áramlást tudjuk megállítani. A maximum és minimum nyomásokat értelemszerűen megadható a megfelelő `P. max` és a `P. min` gombok megnyomásával. A pumpa folyamatos működtetése közben figyeljük meg, buborékmentes-e az eluensáram a csövekben, illetve nem ingadozik-e a rendszer nyomása nagymértékben (>0,3-0,5MPa). Szükség esetén nyissuk ki a `PURGE` szelepet, és addig engedjük ki az oldószert, míg a buborékolás megszűnik. Ezután zárjuk a szelepet. A PU-2080 HPLC pumpa működésével kapcsolatos további adatok a MODEL PU-2080 Intelligent HPLC Pump Operator`s Manual, P/N 0302-0548B kezelési útmutatóban találhatók meg.
4. A gyakorlaton alkalmazott Clarus 500 GC gázkromatográf leírása A Clarus 500 gázkromatográf a Nukleáris Medicina Intézet Radiokémiai Központjának Minőségellenőrző laboratóriumában van elhelyezve (25. szoba), melynek egységeit és tartozékait az alábbi táblázat foglalja össze: Egység
Típus
Gyártó
Szériaszám
GC
Clarus 500, Firmware Rev 2.02
Perkin Elmer, Inc.
650N3091601
Interfész
NCI 901
Perkin Elmer, Inc.
3230280001
Szoftver
TCWS, Version 6.2.1
Perkin Elmer, Inc.
0903-WS0017
Számítógép
Optiplex 780
Dell, Inc.
4C3605J
Funkció Kromatografálás, detektálás Adatgyűjtés és adattovábbítás Vezérlő- és kiértékelő szoftver Rendszervezérlés
20
Gyakorlati segédanyag: L-[[metil-11C]]metionin minőségellenőrzés A Clarus 500 GC kétcsatornás, hőmérséklet programozható gázkromatográf, amely manuális injektálási módban használatos, valamint kapilláris kolonna injektorral (split/splitless mód), FID és TCD detektorral van ellátva. A detektorok analóg kimenettel rendelkeznek, az általuk kibocsátott jelet az NCI 901 interfész fogadja és továbbítja a vezérlő egység felé. A műszerhez kapilláris kolonna installálható. A rendszer működtetése A gázkromatográf elindítása előtt ellenőrizzük, hogy a hélium (vivőgáz), a sűrített levegő (égést tápláló gáz) és a hidrogén (égést biztosító gáz) vezetékek csapjai nyitott állapotban vannak. Ezt követően a Clarus 500 GC-t a jobb oldalán lévő főkapcsolóval lehet bekapcsolni. Önellenőrzés után a műszer kijelzőjén a ’Log in’ felirat jelenik meg, mely megérintésével beléphetünk a rendszerbe, ahol a megfelelő ikonok érintésével navigálhatunk az egyes menüpontok között. Az ’Oven’ menüben a kolonnatér paraméterei követhetőek: a hőmérséklet és a kromatográfiás módszerek által alkalmazott hőmérsékletprogramok alakulása. A ’Cap’ az injektor hőmérsékletét, a vivőgáz áramlási-sebességét és a Split arányt jelzi ki. A ’FID’ menüben a lángionizációs detektor hőmérséklete, a hidrogén és a levegő áramlási-sebessége olvasható le többek között. A ’TCD’ menüben a hővezető-képességi detektor hőmérséklete, a referencia gáz áramlási-sebessége figyelhető meg. A kromatográfiás mérés alatt a kromatogram alakulása a ’Signal’ menüpontban követhető nyomon a megfelelő nagyítás mellett. A mérés indítására a ’Run’ menüpontba való belépéssel van lehetőség. A továbbiakban indítsuk el a számítógépen az adatgyűjtő és vezérlő programot: klikkeljünk a ’TCNav’ ikonra. A belépéshez meg kell adnunk egy felhasználónevet és a hozzá tartozó jelszót, amellyel csak a gázkromatográfot jogosultan használó személy rendelkezik. Sikeres belépés után a ’TotalChrom Navigator-Clarus 500 GC’ felület jelenik meg. Abban az esetben, ha a FID detektort szeretnénk használni, akkor az ’Instruments’ közül a ’Clarus 500 GC’ fület kell aktiválni, viszont ha a TCD detektorral mérünk, az ’NCI900’ opciót kell választani. Az ’Instruments’-ek állapotát a ’Status’ fülön lehet nyomon követni. Abban az esetben, ha zöld színben jelenik meg a felirat, a műszer kész a mérés indítására, ha kék színű a kiírás, akkor az interfész aktív állapotban van (mérés megy vagy az interfész éppen feltölti a TotalChrom-ra az adatokat), piros szín esetén a műszer nem kész az adatok gyűjtésére, mivel nincs kapcsolatban az interfésszel, vagy nincs aktiválva a módszer, illetve szüneteltetve van a műszer használata. Egyszeri mérés indításához be kell lépni a ’Setup’ menüpontba, ahol a ’Method’ opció kijelölésével behívhatjuk a használni kívánt módszert, és megadhatjuk a fájl azonosítóját, valamint a fájl mentési helyét. Sorozatos mérések indításához a ’Setup’ menüpontban a ’Sequence’ opciót kell kiválasztani. Ezután behívjuk az előzetesen megszerkesztett seq kiterjesztésű fájlt, amely tartalmazza a mérések számát, a mérési fájlok nevét, mentési helyét, az alkalmazott kromatográfiás módszereket, jelentéseket. Mindkét méréstípus esetén a beállított adatokat ’OK’– val fogadtatjuk el, miután beállnak és stabilizálódnak a kívánt paraméterek (többek között a vivőgáz áramlási-sebessége, az injektor, a detektor és a kolonnatér hőmérséklete, split arány), amit a GC kijelzőjén is nyomon követhetünk. A mérés indításának lehetőségét a gázkromatográf kijelzőjén a ’Run’ menüpontban az ’Equilibrating’ és a ’Pre-Run’ lefutása után a ’Ready’ felirat jelzi. Az injektálást a ’Start’ jelzés megérintését követően 5 másodperc után a hosszú sípszó után kell elvégezni. Mérés közben a ’Real-Time plot’-tal követhető az aktuális kromatogram alakulása. Az egyszeri mérés végeztével a műszer visszaáll az alkalmazott módszer kezdeti paramétereire. Több mérésre nincs lehetőség, ehhez a ’Setup’ menüpontban kell kezdeményezni az újabb mérést.
21
Gyakorlati segédanyag: L-[[metil-11C]]metionin minőségellenőrzés Sorozatos mérés esetén a rendszer felajánlja az ’Equilibrating’ és a ’Pre-Run’ műveletek után a soron következő mérés indításának lehetőségét anélkül, hogy a ’Setup’ menüpontban kezdeményeznénk azt. (TotalChrom Workstation User’s Guide) Tekintettel arra, hogy a gázkromatográfiás mérések során egészségre káros radioaktív és/vagy szerves gázok, gőzök keletkezhetnek mérés közben az elszívókar használata kötelező! A vizsgálatok alatt az elszívókart bekapcsolt állapotban kell az injektor és a ’Vent’ cső felé helyezni! A mérés végeztével a kiértékelő szoftver az alkalmazott módszer beállításai alapján meghatározza a csúcsok integrálásához szükséges pontokat, meghúzza az alapvonalakat és elvégzi a megfelelő számításokat (koncentráció-meghatározás, területarányok számítása stb.). Az eredmények értékelése, a csúcsok esetleges újra integrálása és azonosítása a főmenü ’Results’ menüjében végezhető el, az értékelni kívánt rst kiterjesztésű fájl behívása után. A kromatogramok manuális kiértékelésekor a ’Manual Integration’ parancsot kell aktiválni, majd a kijelölendő csúcs kezdetére klikkelve folyamatosan húzva az alapvonalat a csúcs végénél elengedjük a bal egér gombot. A csúcs azonosításához a ’Manual Identification’ parancsot kell aktiválni, majd ráklikkelve az azonosítandó csúcsra a legördülő ablakból kell kiválasztani a megfelelő anyagnevet és a ’Reassign’ paranccsal elfogadtatni a változtatást. A mérési eredményt jelentés formájában kinyomtathatjuk, ha a ’Print report’ parancsra klikkelünk. Kromatográfiás módszereket, ezen belül kalibrálási fájlokat, jelentési fájlokat csak adminisztrátori jogosultsággal rendelkező felhasználók hozhatnak létre. Ezek a műveletek a TotalChrom Workstation User’s Guide utasításai alapján végezhetők el. A gázkromatográf kikapcsolását az alábbiak szerint végezzük el. A ’Run’ menüpontban ráklikkelünk a ’Release control’ opcióra, és a GC kijelzőjén a kolonnateret 30ºC-ra hűtjük le, majd kilépünk az adatgyűjtő programból, illetve a kromatográf paneljén kiválasztható ’Log Out’ ikon megérintésével a főmenüből. A kolonnateret az ajtó megnyitásával hűteni szigorúan tilos, különben a kapilláris kolonna a hirtelen hőmérsékletesés következtében károsodhat! Ezt követően a GC főkapcsolójával kikapcsolhatjuk a műszert. Végezetül elzárjuk a gázvezetékek csapjait. (Clarus 500 GC User’s Guide) 5. A gyakorlaton alkalmazott Canberra gamma spektrométer összetevői A Nukleáris Medicina Intézet Radiokémiai Központjának 003. sz. helyiségében telepített Canberra gamma spektrométer összetevői: Egységek
Gyártó
Típus
Széria szám
Ge félvezető detektor Cryostat Preamp
Canberra
GC 1020 7500SL 2002CSL
b 06345
Spektrum analizátor
Canberra
DSA-1000
00000847
Kiértékelő szoftver
Canberra
Genie 2000
C37535/S500
Személyi számítógép
Dell
Optiplex 780
GB3605J
Nyomtató
Hewlett-Packard
Deskjet 3845
TH4BP1511Q
22
Gyakorlati segédanyag: L-[[metil-11C]]metionin minőségellenőrzés A gamma spektrométer elektromos csatlakozásai: A gamma spektrométer helyes működésének feltétele a mérőműszer egységei közötti megfelelő elektromos csatlakozások megléte. Ennek biztosítása végett a műszer használata előtt ellenőrizzük az alábbi táblázatban megadott egységek közötti kapcsolatok meglétét. Gamma spektrométer
Gamma spektrométer
Kapcsolódási mód
egység
egység
Személyi számítógép
Hardverkulcs (SCT 11912)
USB HUB
Személyi számítógép
DSA-1000
Kábel: 79102
spektrum analizátor Ge félvezető detektor (Canberra)
DSA-1000, HV bemenet
Kábel: C123-10
Ge félvezető detektor,
DSA-1000, HV INH. bemenet
Kábel: C120-10
DSA-1000, AMP IN. bemenet
Kábel: C120-10
DSA-1000, PREAMP bemenet
Kábel: 96A21652
HV inhibit kimenet Ge félvezető detektor, ENERGY kimenet Ge félvezető detektor, C140710-10 kimenet
A gamma spektrum felvétele: A gamma spektrumok felvételét az alábbiak szerint valósítjuk meg. Miután meggyőződtünk arról, hogy a spektrométer egységei között megfelelő az elektromos csatlakozás, illetve a detektorrendszer cseppfolyós nitrogénnel fel van töltve, bekapcsoljuk a számítógépet és elindítjuk a Genie2000 programot: Gamma Acquisition&Analysis. Ezt követően az MCA menüben kiválasztjuk az Adjust opciót. A megjelenő felületen bejelöljük a HVPS-t a Statust pedig ON-ra állítjuk. Ezzel a DSA-1000 beállítja a megfelelő feszültség értéket. A spektrum felvétel indításához az Analyze menübe lépünk és kiválasztjuk az Acquisition majd az Acquire parancsokat. A mérés indítása előtt megadhatjuk a fájl nevét, a mérési időt, a mentés helyét, stb. Abban az esetben, ha sorozatmérést akarunk kivitelezni, szekvencia fájlt kell létrehozni. Ehhez az Edit menüben az Analysis sequence parancsot kell választani. A feljövő ablakban meg lehet adni a mérések számát, kiértékelés módját, az eredmények nyomtatását, stb. A sorozatmérés elindításához az Analyze menüben az Execute sequence opciót kell kiválasztani, majd megadni a megfelelő szekvencia fájlt. A vizsgálati jelentéseket PDF formátumban is elmenthetjük, ehhez a File menüben az Export report to PDF opciót kell választani. A mérés végeztével a nagyfeszültséget nullára csökkentjük: az MCA menüben kiválasztjuk az Adjust opciót, a megjelenő felületen bejelöljük a HVPS-t a Status-t pedig OFF-ra állítjuk. Ezt követően kilépünk a Genie2000 programból. A Genie2000 szoftverrel kapcsolatos további információ a Genie2000 Operational Manual útmutatóban található.
23
Gyakorlati segédanyag: L-[[metil-11C]]metionin minőségellenőrzés 6. A gyakorlaton elvégzendő feladatok A gyakorlat alkalmával el kell végezni a kiadott L-[metil-11C]metionin tartalmú minta részleges minőségellenőrzését. Ennek keretében a 2.2.3. Minőségellenőrzés pontban részletezett eljárások alapján az alábbi feladatokat kell elvégezni: • •
•
Enantiomer tisztaság vizsgálat: eluens készítés és a kiadott minta enantiomer tisztaságának meghatározása Etanol tartalmom meghatározás: belső standard oldat, 60 mg/ml etanol vizes oldatának készítése illetve a standard etanol oldat (rendszeralkalmasság) és a kiadott minta gázkromatográfiás vizsgálata. Gamma spektrometriás vizsgálat: energiakalibráció, a minta radionuklidos azonosítása és felezési idő mérés.
A kapott eredményeket és tapasztalatokat jegyzőkönyv formájában szükséges leadni a gyakorlat végéig.
7. Kérdések önálló felkészüléshez • • • •
A PET elve A L-[metil-11C]metionin szintézise és minőségellenőrzése a Nukleáris Medicina Intézetben HPLC és GC alapjai Gamma spektrometria
8. Felhasznált és ajánlott irodalom [1] [2] [3]
http://en.wikipedia.org/wiki/PET. Megtekintve: 2014.02.17. Galbács Gábor, Galbács Zoltán, Sipos Pál: Műszeres analitikai kémiai gyakorlatok, JATEPress, 2008. Dr. Lázár István: Nagynyomású folyadékkromatográfia (Elválasztástechnika segédanyag).
24
