Az immunológiai vizsgálatok helye a laboratóriumi medicinában

Az immunológiai vizsgálatok helye a laboratóriumi medicinában

Dr. Prohászka Zoltán Semmelweis Egyetem III. Sz. Belgyógyászati Klinika Kutatólaboratórium 2010-10-14 [email protected]

•

Mi az egészséges immunrendszer működésének két alapvető jellemzője? – A veszélyes idegentől védj meg • Fertőzések ne alakuljanak ki • A saját flóra tolerálása

– Az ártalmatlan sajátot ne bántsd • Autoimmunitás ne alakuljon ki • A károsodott saját kerüljön eltakarításra

2010. 10. 14. Laboratóriumi Medicina, Prohászka Zoltán ([email protected])

A klinikai immunológiai vizsgálatok célja •

A beteg immunrendszerének vizsgálata – Jól működik az immunrendszer? • Immundeficiencia gyanú, fokozott infekció hajlam valamely jól jellemezhető tényező hiánya miatt • Megfigyelhető valamely fertőzés vagy oltás hatására kialakult immunválasz? • A károsodott saját eltakarításra kerül?

– Kóros az immunrendszer működése? • Tolerancia vesztés, autoimmunitás • A „megváltozott sajátra” adott helytelen válasz • Kóros sejtszaporulat vagy kóros szekréciós tevékenység

•

Immunológiai módszerek felhasználása egyéb betegségek vizsgálatában – Az immunrendszer elemeinek felhasználása diagnosztikai célból, legtöbbször antitest alapú mérések – Akut fázis reakció és a gyulladás mértékének mérése


Akkor mit is csinálnak egy immunológiai laborban…? Antitestet mérnek vagy antitesttel mérnek

• A beteg immunrendszerének vizsgálata – Jól működik az immunrendszer? • Immundeficiencia gyanú, fokozott infekció hajlam valamely jól jellemezhető tényező hiánya miatt • Megfigyelhető valamely fertőzés vagy oltás hatására kialakult immunválasz?

• • • • • • • • •

Immunglobulin szint meghatározás Infekciós szerológia Autoantitest meghatározás Akut-fázis fehérje meghatározás, szérum elektroforézis Komplement fehérje meghatározás Limfocita-transzformció, sejtes vizsgálatok Sejtfelszíni markeranalízis Kóros fehérje meghatározás, immunelektroforézis Immun(hiszto)kémia, immunassay-k

– Kóros az immunrendszer működése? • Tolerancia vesztés, autoimmunitás


Az előadás célja • •

Típusos esetek bemutatása az immunológiai laboratóriumban gyakran felmerülő klinikai problémák megvilágítására A gyakori problémák megoldása során használt módszerek áttekintése – Antitestek általános és analitikai tulajdonságai – Antitest meghatározás a klinikai diagnosztikában • Autoantitestek • Infektív szerológia • Funkcionális vizsgálatok

– Antitest alapú mérések klinikai-diagnosztikai felhasználása, • Gyulladás, akut fázis reakció • Molekuláris medicina, biomarkerek • Sejtfelszíni markeranalízis

•

Nem célja az előadásnak az összes módszer áttekintése és az egyes mérések elvének részletes bemutatása, valamint az immunológiai betegségek részletes áttekintése és laboratóriumi jeleik összefoglalása


Az antitestek alaptulajdonságai Két könnyűlánc (kappa vagy lambda)

Antigénkötés (Fab) Variábilis és hipervariábilis régiók

Biológiai funkciók (Fc) Osztály (izotípus) és alosztály Féléletidő Receptorkötés (FcR) Komplementaktiváió Két nehézlánc (gamma, mű, alfa, epszilon vagy delta) (izotípusok, vagy osztályok) 2010. 10. 14. Laboratóriumi Medicina, Prohászka Zoltán ([email protected])

Az antitestek alaptulajdonságai

Image provided by Wellcome Library, London

Illustration of Paul Ehrlich’s lecture "On Immunity with Special Reference to Cell Life", which he gave to the Royal Society on 22 March 1900.


Mi a közös a 4 betegben? •

Beteg 1 – 2003-ban született fiú, 2 éves korától beteges (évi kb. 10 alsó- és felső légúti infekció, 5-6 antibiotikum kúra/év). Ambuláns vizsgálat.

•

Beteg 2 – 1978-ban született nő, 20 éves kora óta van szem- és szájszárazsága, izületi panaszai, bőrtünetei, gyorsult süllyedése, vashiányos anémiája. 2 hete hőemelkedése és szúró mellkasi fájdalma is van, sürgős kórházi felvétel.

•

Beteg 3 – 1951-ben született férfi, 46 éves korában intermittáló láz, hepato-splenomegalia miatt kórházi kezelés. Hepatitis B és C szerológia negatív, EBV szerológia negatív, ennek ellenére Mononucleosis diagnózissal bocsátották el. 1 évvel később ismét lázas, jó étvágy mellett fogyott, éjszakai izzadása és hőemelkedése tartós. Néhány hónappal később elhúzódó panaszok és nyirokcsomó duzzanat miatt kórházi felvétel kivizsgálás céljából.

•

Beteg 4 – 1988-ban született nő, korábban lényeges betegsége nem volt, 5 napja gyenge, palpitáció érzése van, feje fáj. Láztalan,, enyhén icterusos, sápadt, vérzés nincs. Sürgős kórházi felvétel.


Beteg 1, általános kivizsgálás •

•

2003-ban született fiú, 2 éves korától beteges (évi kb. 10 alsó- és felső légúti infekció, 5-6 antibiotikum kúra/év). Ambuláns vizsgálat. Fennáll-e krónikus betegség (szekunder immundeficiencia)? –

•

Vérkép, máj- és vesefunkció, gyulladástápláltság, vasanyagcsere

Jó általános állapotú, jól fejlett, kissé obes fiú. Status: neg.

•

Vérkép – – – –

•

Máj és vesefunkció, gyulladás – –

•

Vvt 5 T/L, Hgb 132 g/L, HCT 0,375, MCV 75 fL Vas 15 umol/L, TVK 65 umol/L WBC 5,16 G/L, Neut 53%, Ly 33% PLT 329 G/L sGOT 31 U/L, sGPT 15 U/L, Kreatinin 67 umol/L, C-reaktív fehérje 2 mg/L

Megalapozott a gyanú, hogy primer immundeficiencia áll a háttérben


Beteg 1, immunológiai kivizsgálás •

Immundeficiencia gyanú miatti kivizsgálás – – – – –

Immunglobulin szintek, (alosztályok) Komplement aktivitás Fagocita funkció Limfocita populációk vizsgálata (citometria) Aktív immunizálás hatásának lemérése

•

Immunglobulin szintek –

•

Komplement funkcionális szűrőtesztek – – –

•

IgG 11,3 g/L, IgA 0 g/L, IgM 0,4 g/L Klasszikus reakcióút aktivitás 67% Alternatív reakciót aktivitás 93% Lektin reakcióút aktivitás 4%

Komplement fehérje meghatározás – –

Komplement C3 1,28 g/L Komplement C4 0,38 g/L


Immunológiai méréstechnikák 1: az antigén-antitest reakció detektálása folyadék fázisban Turbidimetria: A koncentrációval arányos fényintenzitás csökkenését méri.

Nefelometria: A koncentrációval arányos szórt fény intenzitását méri • • •

Ezek az eljárások kifejezetten alkalmasak egy nagyobb, fehérje természetű molekula mennyiségének meghatározására Feltétele, hogy rendelkezzünk a mérendő molekula ellen antitesttel (agglutináljon vagy precipitáljon) Az 1-es beteg kivizsgálása során ilyen módszerrel történt az immunglobulinok, a C-reaktív fehérje, a C3 vagy a C4 koncentráció mérése.


•

A precipitáció – Érzékeny az antigén és antitest mennyiségére, pontos beállítást igényel, lényege az antitest-antigén kapcsolódási reakció után keletkező komplex (csapadék) – Lehet kvalitatív vagy kvantitatív – Megfelelő diffúziós közeg megválasztása után egyes esetekben szabad szemmel is látható a precipitin (Ouchterlony analízis) – Fehérje festéssel, egyéb detektálási módszerekkel, standardok alkalmazásával érzékenysége növelhető: immunprecipitáció – Elektroforézissel kombinálható (Immun-elfo, rakéta immunelfo, keresztezett immunelfo) – A precipitáció elvén működnek a folyadék fázisú immunassay-k, melyek antigénmeghatározási módszerek: nefelometria, turbidimetria, particleenhanced-immunoturbidimetry


Immunglobulinok mennyisége g/L

Az immunglobulinok mennyiségének változása az életkor függvényében (g/L) Felnőtt: 5-17 IgG 2-8 0,02-0,2

3-11

0,2-0,7 0,2-1

IgM IgA

0,01-0,08

életkor 2010. 10. 14. Laboratóriumi Medicina, Prohászka Zoltán ([email protected])

6-16 0,8-4 0,5-2

A komplementrendszer működésének vizsgálata funkcionális szűrőtesztekkel •

Birka-vörösvértest lízis mérésén alapuló eljárások – CH50/ml = a beteg 1 mL szérumának azzal a részével, amely 1 mL 2%-os szenzibilizált birka vörösvérsejt szuszpenzió 50%-os hemolízisét hozza létre (72 CH50/mL= 1/72 mL szérum okozza az 50%-os lízist)

•

Szilárdfázisú technikán alapuló eljárások (Wielisa rendszer)

A csökkent működésű, vagy hiányzó komponensek C1q, C1r, C1s C4, C2 MBL, MASP2 B, D, P C3, C5, C6, C7, C8, C9

A funkcionális tesztben mért aktivitás Klasszikus Lektin Alternatív Alacsony Normál Normál Alacsony Alacsony Normál Normál Alacsony Normál Normál Normál Alacsony Alacsony Alacsony Alacsony


A Beteg 1 kivizsgálásának összefoglalása • • • • •

Jó általános állapot, megfelelő tápláltság Krónikus betegség hiánya Gyakori infekcióhajlam Primer immundeficiencia gyanú majd kivizsgálás Diagnózis: szelektív IgA hiány és komplement lektin-út (MBL) hiány – Közönséges variábilis immundeficiencia (<4 g/L immunglobulin) – http://www.emki-minosegfejlesztes.hu/site/conf/upload/dokumentum_4_66.pdf

•

További kivizsgálási lehetőségek primér immundeficiencia gyanú esetén – Fagocita funkció vizsgálata (jelzett mikróbával vagy oxidative-burst detektálással) – Limfocita populációk vizsgálata citofluorimetriával, blasztos transzformáció vizsgálata mitogénekkel vagy spec. antigénekkel) – NK-sejt aktivitás vizsgálata – Kemotaxis vizsgálata – Oltásra (pl. pneumococcus) adott antitestválasz vizsgálata


2. beteg: általános kivizsgálás – 1978-ban született nő, 20 éves kora óta van szem- és szájszárazsága, izületi panaszai, bőrtünetei, gyorsult süllyedése, vashiányos anémiája. 2 hete hőemelkedése és szúró mellkasi fájdalma is van, sürgős kórházi felvétel. • •

Differenciáldiagnosztika, gyors orientálódás Sovány, sápadt, arcon bőrpír, egyéb lényeges kóros fizikális eltérés nélkül.

•

Vérkép – – –

•


•

proteinuria (1,7 g/24 óra) 10-15 kilúgozott vvt

Infekció –

•

Prothrombin 66% (INR 1,3) Fibrin-degradációs termék (D-dimer) 10,16 ug/ml

Vizeletvizsgálat – –

•

sGOT 38 U/L, sGPT 48 U/L, Kreatinin 76 umol/L, C-reaktív fehérje 19,6 mg/L

Véralvadás – –

•

Vvt 3,1 T/L, Hgb 86 g/L, HCT 0,27 WBC 5,9 G/L, Neut 69%, Ly 28% PLT 280 G/L

Hemokultúra negatív

Megalapozott a gyanú, hogy autoimmun betegség áll a háttérben


Beteg 2: immunológiai kivizsgálás (kivonat) •

Immunológiai kivizsgálás poliszisztémás autoimmun betegség gyanúja esetén – Szérum elektroforézis (és immun elektroforézis) – Immunglobulin szintek – Autoantitestek – Akut fázis fehérjék – Komplement

• •

•

Összfehérje 80 g/L, alb. 30 g/L, gamma globulin 34 g/L Immunelfo: kóros fehérje nem mutatható ki, poliklonális immunglobulin szaporulat IgG 32,4, IgA 4,55, IgM 3,17 g/L


Szérum elektroforézis

-

Paraprotein (kóros immunglobulin) elektroforetikus képe

Denzitás

+

A szérum összfehérje tartalma és az egyes frakciók egymáshoz viszonyított aránya alapján kiszámolható az ALB-α1−α2−β−γ frakció mennyisége.


Immun-elektroforézis Szemikvantitatív változat (leolvasás szemmel):

Kvantitatív változat (leolvasás denzitométerrel):

Betegek szérumai (elfo) +

G

Elfo

A

M

κ

λ

Anti-humán szérum

Anti-humán IgG (IgG-kappa monoklonális komponens)

Anti-humán IgM

Korszerű eljárás: a szabad könnyűés nehézlánc meghatározása nefelometriával

Anti-humán IgD


Beteg 2: immunológiai kivizsgálás (kivonat) •

Immunológiai kivizsgálás poliszisztémás autoimmun betegség gyanúja esetén – Szérum elektroforézis és immun elektroforézis – Immunglobulin szintek – Autoantitestek – Akut fázis fehérjék – Komplement

• • • • • • • •

Összfehérje 80 g/L, alb. 30 g/L, gamma globulin 34 g/L Immunelfo: kóros fehérje nem mutatható ki, poliklonális immunglobulin szaporulat IgG 32,4, IgA 4,55, IgM 3,17 g/L anti-nukleáris antigén (ANA) 1:160 erősen poz (homogén) Pozitív: Anti-kromatin, anti-hiszton, anti-SSB, anti-DNS, anti-nucleosoma Anti-kardiolipin (ACLA), anti-beta2gpI pozitív Anti-C1q pozitív Negatív: anti-centromer, SSA, Scl70, Jo, Sm, RNP, ANCA


Autoantitest kimutatás: Immunfluoreszcencia •

Anti-nukleáris antitestek, anti-neutrofil citoplazma antitestek…stb kimutatása mikroszkópos technikával

ANA (Hep2G) • • •

cANCA

pANCA

(granuláris, citoplazmatikus)

(homogén, perinukleáris)

Ez az eljárás kifejezetten alkalmas olyan autoantitestek meghatározására, amelyek egy jól meghatározható helyű/fajta sejtantigénnel reagálnak, a festődés mintázata lényeges információt hordoz. A mérés/leolvasás munkaigényes, nehezen standardizálható. Feltétele, hogy rendelkezzünk az autoantigént kifejező sejttel/szövettel és fluoreszcens jelölésű anti-humán IgG/IgA/IgM antitesttel A 2-es beteg kivizsgálása során ilyen módszerrel történt az ANA és ANCA meghatározás


Antitest kimutatási technikák 2: szilárd fázisú technikák ag

beteg szérum

jelölt anti-humán antitest

•

•

•


Ez az eljárás kifejezetten alkalmas olyan autoantitestek meghatározására, melyek egy könnyen előállítható antigénnel reagálnak, a mérés kevéssé munkaigényes, jól standardizálható Feltétele, hogy rendelkezzünk a tiszta autoantigénnel és jelölt antihumán IgG/IgA/IgM antitesttel A 2-es beteg kivizsgálása során ilyen módszerrel történt az ANA és ANCA meghatározás kivételével az összes autoantitest meghatározás.

Titrálás, titer •

•

Titer: a koncentráció mérőszáma. Olyan esetekben kerül sor alkalmazására, ahol a mérendő anyag mennyisége nem fejezhető ki egyértelmű analitikai egységekben, pl. vírusmennyiség, antitest. A titer annak a legmagasabb hígítási foknak felel meg, amelyben egy reakció még pozitív. Ha a 8. lépésben pozitív utoljára a reakció, akkor a minta titere 1:256 (2-8). Mikrotiter lemez Optikai denzitás (read-out)

3

2

1

16384

8192

4096

2048

512

1024

256

128

64

32

8

16

4

2

0

Titer


3

Sok antitest, titere 1:512 Kevés antitest, titere 1:16

2

1

pozitív negatív 10 2 2 20 4 4 40 8 9 81 6 16 92 38 4

6

51

8

25

12

64

32

16

8

4

0 2

Optikai denzitás (490nm)

Titrálási görbék, direkt antitest ELISA (pl. anti-HBsAg-IgG)

Titer


Szilárd fázisú immunasssay típusok: felosztás jelölés alapján • • • • • •

RIA: Radio (γ); a jelölés izotóp. Előnye elsősorban analitikai, hátránya a sugárzással járó veszély. Egyre inkább visszaszorul ELISA: Enzim; előnye az egyszerűség és olcsóság, hátránya elsősorban analitikai (méréshatár). FIA: Fluorochrome; Előnye analitikai, hátránya a különleges detektáló műszer és az ár. Chemiluminescens: Előnye analitikai, hátránya a luminométer szükséglet, és az ár. (Bioszenzor technológia) (Macro- és microarray technológia)


A 2. beteg kivizsgálásának összefoglalása • •

Fiatal nőbeteg több hónapos típusos panaszokkal Tájékozódó vizsgálattal több, lényeges eltérésre derült fény – – – –

• •

Tüdőembólia gyanú (Glomerulo)nefritisz Anémia Gyulladásos válaszreakció, poliklonális immunglobulin szaporulat

A megalapozott klinikai gyanú alapján részleges kivizsgálás történt szisztémás autoimmun betegség vonatkozásában: „Immunpanel” Diagnózis (típusos autoantitestek): Szisztémás lupus erythematodes (ANA, anti-DNS), szekunder Sjögren sy (SSB), szekunder anti-foszfolipid sy (ACLA, anti-B2GPI), lupus nephritis (anti-C1q)


3. beteg: részletes kivizsgálás •

•

1951-ben született férfi, 46 éves korában intermittáló láz, hepato-splenomegalia miatt kórházi kezelés. Hepatitis B és C szerológia negatív, EBV szerológia negatív, ennek ellenére Mononucleosis diagnózissal bocsátották el. 1 évvel később ismét lázas, jó étvágy mellett fogyott, éjszakai izzadása és hőemelkedése tartós. Néhány hónappal később elhúzódó panaszok és nyirokcsomó duzzanat miatt kórházi felvétel

Kp. fejlett és táplált. Arcon és hajas fejbőrön seborrhoeás dermatitis. Testszerte összefolyó urticák. A nyak bo-án, supraclavicularisan, axillarisan, inguinalisan több kisebb fájdalmatlan, mobilis nycs., hepar elérhető, lien 1 hu majus.

•

Vérkép – – –

•


•

Megalapozott a gyanú, hogy malignus hematológiai kórkép (limfóma?) áll a háttérben

– –

•

neg

Szérum elektroforézis és immunelfó –

•

Prothrombin 97% (INR 1,1)

Vizeletvizsgálat –

•

sGOT 150 U/L, sGPT 195 U/L, Kreatinin 123 umol/L, C-reaktív fehérje 21 mg/L, We 80 mm/ó

Véralvadás –

•

Vvt 4,1 T/L, Hgb 115 g/L, HCT 0,38 WBC 3,1 G/L, Neut 68%, Ly 21% PLT 188 G/L

Összfehérje 84 g/L, alb 42 g/L, gamma globulin 21 g/L IgG 22,3 IgA 5,06, IgM 3,05 g/L Monoklonális fehérje nem mutatható ki

Infekció – – –

Hemokultúra, HBsAg, anti-HCV negatív Epe üledék tenyésztés: Streptococcus Köpet tenyésztés: E. coli és gomba


Beteg 3: hematológiai kivizsgálás •

Kivizsgálás hematológiai malignóma irányában

• •

Perifériás vér sejtfelszíni markeranalízis Nyirokcsomó biopszia


Immunológiai méréstechnikák 3: Az antigén-antitest reakció detektálása a sejtfelszínen Áramlásos citofluorimetria, FACS analízis

•

•

•


A mérés kifejezetten alkalmas a perifériás vér sejtes összetevőinek vizsgálatára, alcsoportjaik számának, aktiváltságának meghatározására A méréshez rendelkezni kell a meghatározott sejtfelszíni antigénekkel (CD) reagáló, fluoreszcens festékkel jelzett antitestekkel Előnye hogy gyors és részletgazdag képet ad, hátránya, hogy csak suspensióba vihető sejteket lehet vizsgálni

3. beteg: Sejtfelszíni markeranalízis, perifériás vér, limfocita kapu CD3+: 84.2% (T sejtek) CD 19+: 3.8% (B sejtek) CD5+: 79.5% CD10+/CD19+: 0.1% CD5+/CD19+: 2.3% κ+/CD 19+: 1.37% CD3+/CD4+: 2.83% (Th sejtek) λ+/CD 19+ 0. 46 % CD3+/CD8+: 78.9% (Tc sejtek) CD3+/CD16+: 3.92% (aktivált T sejtek) CD3-/CD16+/CD56+: 14% (NK sejtek) CD3+/CD7+: 42% CD45+: 98.7% (pan leukocyta marker)

Vélemény: A kórfolyamat T sejtes eredete igazolható. A CD3+/CD8+ kettős poz. sejtek magas aránya az LGL T sejtes lymphoma fennállását valószínűsíti. 2010. 10. 14. Laboratóriumi Medicina, Prohászka Zoltán ([email protected])

CD4-FITC

3. beteg kivizsgálása: a nem várt fordulat •

• • •

A beteg abszolút T-helper száma: – WBC x limfocita x CD4+/CD8– 3,1 G/L x0,21 x 0,028=0,018 azaz 18/mikroliter Lymphadenopathia, T-helper sejtek alacsony száma, gomba a köpetben… LAV (1983), avagy miről „egyeztetettek” Franciaország és az Egyesült Államok elnökei (1987)? Orvosi Nobel díj, 2008: Francoise Barré-Sinoussi, Luc Montagnier


3. beteg kivizsgálása: a nem várt fordulat • •

A beteg abszolút T-helper száma: – WBC x limfocita x CD4+/CD8– 3,1 G/L x0,21 x 0,028=0,018 azaz 18/mikroliter Lymphadenopathia, T-helper sejtek alacsony száma, gomba a köpetben…

• • •

Anti-HIV 1, 2 antitest pozitív (ELISA) (szenzitív szűrőteszt) Anti-HIV 1, 2 antitest pozitív (Western blot) (specifikus verifikáló teszt) Szérumban HIV gp24 core antigén pozitív (viraemia)


3. beteg kivizsgálása: a nem várt fordulat • •

A beteg abszolút T-helper száma: – WBC x limfocita x CD4+/CD8– 3,1 G/L x0,21 x 0,028=0,018 azaz 18/mikroliter Lymphadenopathia, T-helper sejtek alacsony száma, gomba a köpetben…

• • •

Anti-HIV 1, 2 antitest pozitív (ELISA) (szenzitív szűrőteszt) Anti-HIV 1, 2 antitest pozitív (Western blot) (specifikus verifikáló teszt) Szérumban HIV gp24 core antigén pozitív (viraemia)

• Nyirokcsomó szövettan: – HIV-asszociált lymphadenopathia, kevert follicularis hyperplasia/follicularis involutiós típus (follicularis involutió dominál). Mindezek mellett paracorticalis hyperplasia figyelhető meg, kifejezett polyclonalis plasmasejtes reakcióval, feltehetően bakteriális infekcióra adott válaszreakcióként. 2010. 10. 14. Laboratóriumi Medicina, Prohászka Zoltán ([email protected])

Antitest kimutatási technikák 4: Infektív szerológia, Western-blot technika • • • •

•


Antigének szétválasztása elektroforézissel Transzfer nylon membránra Antigén+jelölt antitest reakció Kifejezetten alkalmas infekciós szerológiai vizsgálatokra, rendelkezni kell a kórokozó antigénjeivel A 3-as beteg esetében a HIV antitest teszt megerősítő vizsgálata történt ezzel a módszerrel

Az infektív szerológia során meghatározott izotípus (osztály) megoszlás klinikai haszna •

Az antitestek izotípus-megoszlásának értéke a Chlamydia pneumoniae fertőzés dinamikája példáján (vizsgálat savópárból) – – –

Akut infekció: IgM pozitivitás, IgA, IgG negatív Perzisztáló infekció: IgA, pozitív és IgG pozitív, IgM negatív, vagy ha >1:128, IgG titernövekedés lép fel Reinfekció: IgM+IgG pozitív

IgM

IgG

IgA

Akut (első)

+

-

-

Akut (reinfekció)

+

+

-

Lezajlott infekció

-

+

-

Perzisztáló infekció

-

+

+


A 3. beteg kórtörténetének összefoglalása • Több hónapos anamnézis, ismeretlen eredetű láz • Fizikális és laboratóriumi jelek „gócbetegségre” utaltak – Részletes kivizsgálás több potenciális gócot (prostat, epehólyag) tárt fel

• Nyirokcsomó duzzanat és „B” tünetek miatt hematológiai malignitás gyanú, sejtfelszíni markeranalízis, szövettan – Klonalitás nem igazolódott – Többszörös lezajlott bakteriális infekciók jele látszódott (szekunder immundeficiencia)

• „Véletlen lelet”, csökkent T-helper sejtszám • Verifikált HIV-fertőzés (AIDS)


4. beteg, szül: 1988 • • • •

Családi és saját anamnézis negatív, gyógyszert nem szed. 5 napja gyenge, palpitáció, fejfájás. Láztalan. Vérzés nincs. Sápadt, halvány nyh., enyhe icterus, P 100/min, bőrön suffusiok. Tájékozódó vizsgálat leukémia irányában Vérkép

•WBC 7,16 G/L (12% Mo) •RBC 1,64 T/L •HGB 53 g/L •HCT 0,16 •MCV 95 fL •MCH 32 pg •MCHC 338 g/L •PLT 23 G/L •RDW-CV 23,2%

Csv. működés? •Retikulocita 296 G/L •Hct-re és érési gátlásra korrigált reti. index

Kémia •Össz bilirubin 33,7 umol/L •Indirekt bi 8,6 •Crea 60 umol/L •GOT 56 U/L •GPT 142 U/L •LDH 1714 U/L •Hapltoglobin 1,1 mg/dL •Perif kenet: fragmentocyta •d. Coombs: neg.

Klinikai gyanú: hányás, hasmenés, anaemia, thrombocytopaenia, veseelégtelenség, neurológiai tünetek

Klinikai diagnózis: Thrombotycus microangiopathia (TMA) •

Haemolyticus anaemia (Htk<30%) – – – – – – – –

• • • •

LDH↑ (>450 U/l) indirekt Bi ↑, vizelet ubg ↑ haptoglobin↓ szabad haemoglobin ↑ fragmentocyták, schistocyták reticulocytosis d. Coombs negatív Egyéb okok kizárása

Thrombocyta szám ↓ (<150 109/l) Veseelégtelenség esetén : Hemolitikus urémiás szindróma (HUS) Neurológiai tünetek esetén: Trombotikus thrombocytopéniás purpura (TTP)

www.med-ed.virginia.edu/courses/path/innes/images/rcdjpegs/rcd Slide thanks to Dr. Kline Bolton, UVA.

Thromboticus microangiopathia (TMA): –

Olyan veselaesio, amelyben a glomerulusokban és a kis arteriolákban hyalin thrombusok vannak

Curtesy of Diana Krapman

A TTP keletkezésének molekuláris oka az endothel felszín prokoaguláns átalakulása az éretlen vWF megjelenése miatt, ugyanis gátló autoantitestek keletkeznek a vWF-hasító proteáz (ADAMTS13) ellen

Endothel sejt


Endothel sejt

Az antitestek kimutatása 5: Specifikus funkció gátlás •

Feltétele az antigén jól mérhető funkciója (pl. enzimfunkció, kofaktor aktivitás, receptor-jelátviteli aktivitás, lízis) – Véralvadási ko-faktor: fibrin dugó (pl. szerzett, autoantitestesVIII-as faktor hemofília) – Enzim: reakciósebesség, végtermék (pl. trombotikus trombocitopéniás purpura, TTP, ADAMTS13) – Komplement fehérje: molekuláris komplex kialakulása, neo-epitóp megjelenése vagy lízis (pl. herediter angioneurotikus ödéma, HANO, vagy hemolitikus urémiás szindróma, HUS) – Receptor aktiválás (pl. Basedow kór, TSH receptor antitest) vagy blokkolás (Myasthenia gravis, Acetil-kolin receptor antitest)

•

A kimutatás módja a – keveréses, funkcionális vizsgálat (a beteg mintájában található antitest gátolja az egészséges minta aktivitását) – Sejtes (riporter) assay – Direkt vizsgálat (antigén-antitest reakció kimutatása immunassay-vel)

•

Titrálással meghatározható az 50%-os gátlást okozó koncentráció (hagyományosan 1 Bethesda egység)


ADAMTS13 aktivitás mérés a 4. beteg mintájában • •

A beteg plazmájában több plazmaferezis után is 0%-os aktivitást találtunk A keveréses vizsgálat anti-ADAMTS13 gátló antitestek jelenlétét igazolta (14 Bethesda egység) Jelfogó

Festék

Jelfogó

Festék

Van ADAMTS13 aktivitás Nincs ADAMTS13 aktivitás

Elhasított vWF mennyisége

(FRETS-vWF-73 fluoreszcencia unit 340nm/460nm)

ADAMTS-13 aktivitás mérés Normál plazma (100%)

950000 850000 750000 650000

Kevert minta (NP+4. beteg, 1:1)

550000

4. beteg

450000 350000

0

10

20

30

40

50

60

idő (perc)


A 4. beteg kórtörténetének összefoglalása • •

Fiatal nőbeteg akut, sürgősségi felvételt indokoló tünetekkel Hematológiai vizsgálat – Kóros sejteket nem talált a periférián és ép csontvelőműködésre utalt – Súlyos normociter anémia és fragmentociták mellett LDH emelkedés, indirekt bilirubinémia mutatkozott (hemolízis, direkt Coombs negatív) – Alacsony trombocitaszám

• •

Megalapozott gyanú merült fel trombotikus mikroangiopátiára A megerősítő, specifikus, funkcionális vizsgálattal anti-ADAMTS13 autoantitesteket lehetett kimutatni, vagyis megszületett a thrombotikus trombocitopéniás purpura (TTP, Moschcowitz szindróma) diagnózis.


Az előadás során bemutatott eljárások összefoglalása •

Turbidimetria, nefelometria, folyadékfázisú immunassayk (immunkémia), akut fázis reakció, elektroforézis, immun-elektroforézis – CRP, (PCT, TnT), C3, C4, Ig

•

Mikroszkópos autoantitestkimutatás, immuhisztokémia – Anti-nukleáris faktor, anti-neutrofil citolplazma antitest

•

Szilárd fázisú immunassay-k – Autoantitest meghatározások (pl. anti-DNA)

•

Sejtfelszíni antigénkimutatás, flow-cytometria – Perifériás sejtpopulációk (CD4/CD8), kóros sejtek vizsgálata

•

Infektív szerológia (szilárd fázisú mérések, Western-blot), immunglobulin osztályok megoszlása – HIV, EBV, HBsAg, HCV szerológia

•

Funkcionális autoantitest meghatározások – ADAMTS13 gátló antitest meghatározás


Antitestekkel kapcsolatos Nobel díjak 1901 Emil Adolf von Behring – szérum terápia 1908 Ilya Ilyich Mechnikov, Paul Ehrlich – immunológiai felismerés 1913 Charles Robert Richet – anafilaxiás reakció 1919 Jules Bordet – immunológiával kapcsolatos felfedezések 1930 Karl Landsteiner Tom, a diftéria toxinnal elsők között immunizált ló – ABO vércsoport 1972 Gerald M Edelman, Rodney R Porter – az ellenanyag kémiai szerkezete 1977 Rosalyn Yallow - Radio-immunoassay 1984 Niels K Jerne, Georeg JF Köhler, César Milstein – immunszabályozás és a monoklonális ellenanyagok előállítása 1987 Susumu Tonegawa – az ellenanyag diverzitás háttere


•

Immunológiai módszerek

•

Gyakorlati laboratóriumi medicina

• • •

Medicina kiadó, 2006 Szerk: Erdei Anna 13. fejezet (Pálóczi Katalin)

• • •

Literatura Medica kiadó, 2008 Szerk: Debreczeni Lóránd, Kovács L. Gábor 9. fejezet (Sipka Sándor, Lakos Gabriella)


Az immunológiai vizsgálatok helye a laboratóriumi medicinában

Recommend Documents