AZ EXCITÁTOROS IONOTROP RECEPTOROK MODULÁCIÓJÁNAK ELEKTROFIZIOLÓGIAI VIZSGÁLATA. POTENCIÁLIS TARGETEK AZ ABÚZUS TERÁPIÁJÁBAN

SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA

AZ EXCITÁTOROS IONOTROP RECEPTOROK MODULÁCIÓJÁNAK ELEKTROFIZIOLÓGIAI VIZSGÁLATA. POTENCIÁLIS TARGETEK AZ ABÚZUS TERÁPIÁJÁBAN

Doktori (Ph.D.) értekezés

DR. KÖLES LÁSZLÓ

Témavezető: Dr. Fürst Zsuzsanna, D. Sc.

Semmelweis Egyetem Farmakológiai és Farmakoterápiás Intézet Budapest, 2002.

Szigorlati bizottság: Elnök:

Dr. Tekes Kornélia Ph.D.

Tagok:

Dr. Török Tamás D.Sc. Dr. Varró András D.Sc.

Hivatalos bírálók: Dr. Szentmiklósi József Ph.D. Dr. Wenger Tibor D.Sc.

2

TARTALOMJEGYZÉK 1. ÖSSZEFOGLALÓ

5

1.1. Summary

6

2. BEVEZETÉS

7

3. IRODALMI HÁTTÉR

9

3.1 A glutamát receptorok fiziológiai és patofiziológiai szerepe

9

3.2 Az extracelluláris purinok transzmitter és modulátor szerepe

12

3.3 A prefrontális cortex fiziológiai és patofiziológiai szerepe

15

3.4 A striatum fiziológiai és patofiziológiai szerepe

16

3.5 Az alkoholok hatásai az ionotrop receptorokra

18

4. CÉLKITŰZÉSEK

20

5. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

23

5.1 Az ionotrop glutamát receptorok modulációjának vizsgálata a prefrontális cortex V. rétegének piramissejtjein

23

5.2 Az ionotrop glutamát receptorok modulációjának vizsgálata a striatum "medium spiny" interneuronjain

26

5.3 Az etanol ionotrop glutamát receptorokra kifejtett hatásának vizsgálata primer cortikális sejttenyészeten

29

5.4 Az etanol és a triklóretanol P2X3 receptorokra kifejtett hatásainak vizsgálata humán P2X3 receptorokkal transzfektált HEK 293 sejteken

31

5.5 Statisztika

32

6. EREDMÉNYEK

33

6.1 Az ionotrop glutamát receptorok modulációja a prefrontális cortex V. rétegének piramissejtjein

33

6.2 Az ionotrop glutamát receptorok modulációja a striatum "medium spiny" interneuronjain

39

3

6.3 Az etanol ionotrop glutamát receptorokra kifejtett hatása primer cortikális sejttenyészeten

47

6.4 Az etanol és a triklóretanol P2X3 receptorokra kifejtett hatásai humán P2X3 receptorokkal transzfektált HEK 293 sejteken 7. MEGBESZÉLÉS

51 53

7.1 Az ionotrop glutamát receptorok modulációja a prefrontális cortex V. rétegének piramissejtjein

53

7.2 Az ionotrop glutamát receptorok modulációja a striatum "medium spiny" interneuronjain

57

7.3 Az etanol ionotrop glutamát receptorokra kifejtett hatása primer cortikális sejttenyészeten

62

7.4 Az etanol és a triklóretanol P2X3 receptorokra kifejtett hatásai humán P2X3 receptorokkal transzfektált HEK 293 sejteken

64

8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

65

9. IRODALOMJEGYZÉK

67

10. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT SAJÁT KÖZLEMÉNYEK BIBLIOGRÁFIAI ADATAI

89

10.1 Teljes cikkek

89

10.2 Megjelent előadások

90

10.3 Egyéb közlemények

90

4

1. ÖSSZEFOGLALÓ AZ EXCITÁTOROS IONOTROP RECEPTOROK MODULÁCIÓJÁNAK ELEKTROFIZIOLÓGIAI VIZSGÁLATA. POTENCIÁLIS TARGETEK AZ ABÚZUS TERÁPIÁJÁBAN. Szerző: Dr. Köles László

Témavezető: Dr. Fürst Zsuzsanna

Semmelweis Egyetem, Gyógyszertudományok Doktori Iskola Budapest, 2002. Az excitátoros ionotrop receptorok, elsősorban a központi idegrendszeri ionotrop glutamát receptorok, alapvető fontosságúak a kognitív funkciókban, funkcionális zavaraik azonban neurodegeneratív betegségek és az abúzus patomechanizmusában játszanak szerepet. Két dopaminerg beidegzésű agyterületen, a prefrontális cortexben, és a striatumban, vizsgáltuk azt, hogy a dopamin lehetséges kotranszmittere az ATP, illetve lebomlási termékei hogyan befolyásolják a glutamáterg transzmissziót. Emellett az alkoholok excitátoros ionotrop receptorokra kifejtett hatásait is vizsgáltuk. Agyszeleten végzett "whole cell" patch clamp kísérletek segítségével megállapítottuk, hogy a patkány prefrontális cortex V. rétegének piramissejtjei funkcionális metabotrop P2Y purinoceptorokat tartalmaznak, amelyek pozitív interakciót mutatnak az NMDA típusú glutamát receptorokkal. Megállapítottuk azt is, hogy a patkány striatum "medium spiny" interneuronjainak egy szubpopulációján (striatopallidális neuronok) funkcionális A2A adenozin receptorok találhatók, amelyek valószínűleg a foszfolipáz C/inozitol triszfoszfát/kalmodulin/kalmodulin kináz II rendszeren keresztül negatívan modulálják az NMDA receptor csatornát, míg az AMPA receptorokra nincs ilyen hatásuk. "Whole cell" patch clamp és "single-cell" mikrofluorimetria segítségével tisztáztuk, hogy az etanol nem nyitott csatorna blokkolóként, és a membránpotenciáltól nem függő módon gátolja az NMDA receptorokat primer cortikális sejttenyészeten, valamint hogy a triklóretanol az etanolnál lényegesen erősebben gátolja a P2X3 purinoceptor funkciót humán

P2X3

receptorokkal

transzfektált

HEK

293

sejteken.

Eredményeink

farmakológiai jelentőségét az adhatja, hogy elvezethetnek a Parkinson-kór, és egyéb neurodegeneratív betegségek, a memóriazavarok, a kábítószerabúzus, a schizophrenia, vagy a fájdalommal járó állapotok újszerű terápiás megközelítéséhez, kiegészítve és tökéletesítve a jelenlegi kezelési eljárásokat.

5

1.1. SUMMARY ELECTROPHYSIOLOGICAL STUDIES ON THE MODULATION OF EXCITATORY IONOTROPIC RECEPTORS. POTENTIAL TARGETS ON THE THERAPY OF DRUG ABUSE. Author: Dr. Köles László

Theme leader: Dr. Fürst Zsuzsanna

Semmelweis University, Doctoral School of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences Budapest, 2002. Excitatory ionotropic receptors, especially ionotropic glutamate receptors in the central nervous system, are of vital importance in cognitive functions, however, their functional disturbances play an important role in the pathomechanism of neurodegenerative disorders as well as drug abuse. The influence of ATP, the possible cotransmitter of dopamine, and its breakdown products were investigated on glutamatergic transmission in prefrontal cortex and striatum, two brain areas known to receive dopaminergic input. The effects of alcohols on excitatory ionotropic receptors were also investigated. Whole cell patch clamp experiments carried out in brain slices demonstrated, that the layer V pyramidal cells of rat prefrontal cortex possess functional metabotropic P2Y purinoceptors potentiating NMDA type of glutamate receptors. It was also demonstrated, that in a subpopulation of striatal medium spiny interneurons (striatopallidal neurons) functional adenosine A2A receptors are expressed, which via the phospholipase C/inositol trisphosphate/calmodulin/calmodulin kinase II pathway negatively modulate the NMDA receptor channels, but do not influence AMPA receptor functions. By means of whole cell patch clamp and single-cell microfluorimetry it was cleared, that ethanol as a non open channel blocker, in a voltage independent manner, inhibits NMDA receptors in primary cultures of cortical neurons. Furthermore, trichlorethanol inhibitied P2X3 purinoceptor functions much stronger than ethanol in HEK 293 cells transfected by human P2X3 receptors. The main pharmacological importance of our results is, that they might lead to new therapeutic approaches of Parkinson's disease or other neurodegenerative disorders, memory deficits, drug abuse, schizophrenia, and painful states, completing and improving the recent pharmacological treatments.

6

2. BEVEZETÉS Amikor 1996 őszén úgy döntöttem, hogy az adódó lehetőséget kihasználva hosszabb lipcsei tanulmányúton veszek részt, sejtettem, hogy a következő évek meghatározóak lesznek tudományos pályafutásom szempontjából. Ugyanakkor nem tagadom, hogy közben jelentős kétségek is gyötörtek. Korábban, a Semmelweis Orvostudományi Egyetem Gyógyszertani Intézetében, annak fő kutatási irányainak megfelelően, viselkedésfarmakológiai vizsgálatokat végeztem, opioidok és egyéb abúzusszerek hatásait tanulmányoztam in vivo. Tudtam, hogy Lipcsében új metodikákat fogok alkalmazni, és egy korábban klinikusnak készülő, kezdő farmakológus számára kissé elvontnak tűnő szinten, pA-es nagyságrendű áramokat elemezve, vizsgálok majd központi idegrendszeri transzmitterrendszereket. Tartottam a ridegnek hitt német mentalitástól is. Aztán kiderült, hogy félelmeim alaptalanok voltak: munkatársaim barátságosan fogadtak, ráadásul főnököm, Illés Péter professzor, aki tudományos pályafutását budapesti munkahelyemen kezdte, minden segítséget megadott ahhoz, hogy minél hasznosabban teljen el a kint töltött két év. Közben világossá vált számomra, hogy az in vitro metodikák alkalmazása nem feltétlenül jelenti azt, hogy a részletekbe merülve a kutató elveszti az áttekintést az egészet illetően, éppen ellenkezőleg: segít közelebb jutni a folyamatok lényegének a megértéséhez. Kutatási témáim szerencsére úgy alakultak, hogy egyáltalán nem kellett eltávolodnom eredeti érdeklődési körömtől, az abúzusszerek kívánatos és nem kívánatos hatásainak vizsgálatától, sőt új megközelítési szempontokat adtak a fenti témához. Erre alapozva, és Fürst Zsuzsanna tanszékvezető egyetemi tanár támogatását élvezve, lehetőségem nyílt arra, hogy visszatérve a régi, de közben új nevet kapott munkahelyemre, a Semmelweis Egyetem Farmakológiai és Farmakoterápiás Intézetébe, folytassam kint elkezdett kísérleteimet és kiépítsek egy elektrofiziológiai laboratóriumot. Mindemellett nagy örömömre aktív résztvevője lehettem az Illés professzor munkacsoportjával kialakult intézményes együttműködésnek is. Disszertációmat ezért azokra a kutatásokra szeretném alapozni, amelyeket 1997-ben Lipcsében kezdtem, majd később Budapesten folytattam. Mindezek a kutatások az abúzusszerek szerteágazó hatásaiban, és az abúzus mechanizmusában fontos szerepet betöltő transzmitterrendszerek, elsősorban az excitátoros ionotrop

7

receptorok vizsgálatára irányulnak. Patch clamp technika alkalmazása segítségével két különböző agyterületen (prefrontális cortex és striatum) feltárt interakciók, valamint az alkoholok ionotrop receptorokra kifejtett hatásaival kapcsolatos új eredmények kerülnek részletezésre dolgozatomban. Mindezek farmakológiai-toxikológiai jelentőségét az adja, hogy az új ismeretek potenciális új megközelítési lehetőségeket jelenthetnek egyes betegségek, mint például a Parkinson kór, valamint az abúzus mechanizmusának megértésében, és terápiájában.

8

3. IRODALMI HÁTTÉR 3.1 A glutamát receptorok fiziológiai és patofiziológiai szerepe A glutaminsav a legfontosabb excitátoros transzmitter a központi idegrendszerben (113). Szinaptikus hatásait két fő receptortípuson fejti ki: az ionotrop és a metabotrop glutamát receptorokon (72). Az ionotrop receptorok ligand által szabályozott kation csatornák, amelyek gyors excitátoros posztszinaptikus potenciált kiváltva az idegsejtek depolarizációjához vezetnek. A metabotrop receptorok G-proteinhez kapcsoltak, és valószínűleg moduláló szerepük van a neurotranszmisszióban (44, 121). 15 ismert gén felelős a három farmakológiailag megkülönböztethető ionotrop glutamát receptor molekuláris összetételéért: N-metil-D-aszpartát (NMDA: NR1, NR2A, NR2B, NR2C, NR2D, NR3A alegységek), a-amino-3-hidroxi-5-metil-4-izoxazol propionsav (AMPA: GluR1, GluR2, GluR3 és GluR4 alegységek), valamint kainát receptorok (GluR5, GluR6, GluR7, KA1 és KA2 alegységek) (119, 176). A glutamát receptorok nagyfokú expressziót mutatnak a központi idegrendszerben, elsősorban az agykéregben, valamint a limbikus területeken és a bazális ganglionokban (72, 117, 150). Az ionotrop glutamát receptorok közös vonása, hogy permeabilisek Na+ és K+ ionokra. A Ca2+ ionokra elsősorban az NMDA receptorok permeabilisek, az AMPA és a kainát receptorok esetében a Ca2+ permeabilitás általánosan nem jellemző, csak bizonyos esetekben figyelhető meg (133, 169). A glutamát által kiváltott excitatorikus potenciálokat elemezve két komponens különíthető el: egy gyorsabb, elsősorban AMPA receptor aktiváláshoz kapcsolható, és egy lassúbb, NMDA receptorok által mediált. Nyugalomban levő sejtekben az NMDA receptorokat az extracelluláris Mg2+ ionok blokkolják, csökkentve az NMDA receptorok részvételét a szinaptikus áramokban (126). Amikor a sejt depolarizálódik (pl. kolokalizált AMPA vagy kainát receptorok által), a feszültségfüggő Mg2+-blokk oldódik, és lehetségessé válik a lassabban aktiválódó NMDA receptorok részvétele a szinaptikus áramokban. Az NMDA receptorokon beáramló Ca2+ pedig kinázokat vagy foszfatázokat aktiválva, az intracelluláris jelátviteli mechanizmust triggerelve hosszan tartó változásokat idézhet elő a neuronális funkciókban (44). A glutamáterg szinapszis tehát rendelkezik azzal a különleges képességgel, hogy agonista hatására nemcsak rövid izgalmi állapottal

9

válaszoljon, hanem a szinaptikus transzmisszió hatékonyságát is megváltoztassa. Ezek a változások akár napokig is tarthatnak, mint pl. az ún. "long-term potentiation" (LTP), és a "long-term depression" (LTD) (17). Valószínűsíthető, hogy a szinaptikus aktivitásban bekövetkező ilyen tartós változások, és a kialakulásukért nagymértékben felelős glutamát receptorok kritikus szerepet játszanak a fejlődésben, tanulásban valamint az emlékezésben (72, 120). A glutamát receptorok túlzott aktiválódása azonban excitotoxicitáshoz, neuronális degenerációhoz vezethet (36). Az ilyenkor bekövetkező nem kontrollált Ca2+-beáramlás és az intracelluláris Ca2+-szint túlzott emelkedése az idegsejtek pusztulását hozhatja létre,

és

szerepet

játszhat

olyan

patológiás

állapotok

létrehozásában

vagy

fenntartásában, mint pl. a stroke, az epilepszia, és különböző neurodegeneratív betegségek (Parkinson kór, Alzheimer kór, Huntington chorea) (53, 103). Az ionotrop glutamát receptorok funkcióváltozásai ezenkívül szerepet játszhatnak az alkoholizmus és a kábítószerabúzus patofiziológiájában, az elvonási tünetek létrehozásában (86, 166). Központi idegrendszerünk tehát ambivalens viszonyban áll a glutamáterg transzmisszióval: míg a jól szabályozott glutamáterg aktivitás alapvető szerepet játszik a magasabb rendű kognitív funkciókban, addig a szabályozás felborulása patológiás eltérésekhez, a kontroll teljes elvesztése pedig idegsejtpusztuláshoz vezet, hozzájárulva ezzel különböző patológiás állapotok és betegségek kialakulásához és fenntartásához. Ezért az ionotrop glutamát receptorok funkcióinak és komplex szabályozásának tisztázása nemcsak az alapvető agyi folyamatok, mint pl. a tanulás és a memória jobb megértéséhez járulhat hozzá, hanem megteremtheti az alapot különböző betegségek racionális

kezeléséhez,

és

a

kábítószerabúzus

problémájának

hatékonyabb

befolyásolásához is. Az NMDA receptorok különböző alegységekből álló hetero-pentamerek, vagy hetero-tetramerek. Az NR1 alegység alapvető fontosságú a receptor funkcióhoz, az NR2A-D és az NR3A alegységek ezt befolyásolhatják, miáltal az alegységösszetétel döntő szerepet játszhat az adott receptor funkcionális jellemzőinek kialakításában (44, 77). A natív NMDA receptorokat a glutaminsav mikromoláris koncentrációban aktiválja,

szelektív

aktivátoruk

az

NMDA,

antagonistájuk

a

D-2-amino-5-

foszfopentánsav (72, 113). A receptor figyelemre méltó tulajdonsága, hogy egy koagonista, a glicin kötődése is szükséges a receptor aktiválásához. A glicin kötőhelye

10

valószínűleg az NR1 alegységen van, míg a glutamát feltehetőleg az NR2 alegységhez kötődik. A receptor aktiválása antagonizálható mindkét felismerési helyen (44, 71, 93). Az NMDA receptor egyedülálló tulajdonságát a ligand által szabályozott ioncsatornák között az adja, hogy funkciója kettős kontroll alatt áll: függ az agonisták kötődésétől, és a membránpotenciáltól is. Normál nyugalmi potenciál értéknél az NMDA receptort a Mg2+ ionok blokkolják, és ez a gátlás a membrán depolarizálásával oldódik (44, 126). Az agonista, a koagonista, és a Mg2+ kötőhely mellett az NMDA receptor számos egyéb regulációs hellyel rendelkezik, mint pl. a poliamin kötőhely, és a fenciklidin típusú ún. nyitott csatorna blokkolók kötőhelye (116, 169). Az NMDA receptor további ismert modulátorai a Zn2+, a hisztamin, az ún. redox modulátorok, és az extracelluláris H+ koncentráció (44). Az NMDA receptorok szoros kapcsolata különböző intracelluláris proteinekkel (hírvivő, regulátor és struktúrfehérjékkel) az elmúlt évtizedben vált ismertté. Ezek a fehérjék képesek befolyásolni a receptor "targeting"-et és "clustering"-et, modulálhatják a receptor aktivitást és a receptor-effektor kapcsolódási mechanizmust (44, 179, 186). Az NMDA receptorok olyan konszenzus szekvenciákat tartalmaznak, amelyeket különböző kinázok (protein kináz C, protein kináz A, tirozin kinázok, szerin/treonin kinázok, Ca2+/kalmodulin dependens protein kináz) foszforilálni képesek (32, 69, 84, 96, 118, 147, 163, 164, 174). Az NMDA receptorok funkciójának pozitív modulálása összefüggésbe hozható a receptor foszforilálásával, sőt a receptort foszforiláló kinázok az LTP kialakulásában is szerepet játszhatnak (11, 44, 146, 163). Ezzel szemben a szerin/treonin (pl. kalcineurin), vagy a tirozin protein foszfatázok úgy tűnik, hogy negatívan modulálják a receptor funkciót (102, 175). A protein foszfatázok gátlása az NMDA receptor funkció fokozódásához vezet (15, 157). Különböző G-protein kapcsolt receptorok az NMDA receptorok foszforilálása által fokozzák az NMDA receptor funkciót: muszkarin típusú acetilkolin receptorok, b-adrenerg receptorok, metabotrop glutamát receptorok, opioid receptorok, 5-HT2 szerotonin receptorok (4, 16, 31, 80, 107, 146, 162). További közlemények szintén arról számolnak be, hogy G-protein kapcsolt receptorok (dopamin, acetilkolin) fokozzák az NMDA receptor funkciót, bár ezekben esetekben a receptor foszforilációt nem vizsgálták (26, 70, 112). A dopamin esetében azonban úgy tűnik, hogy míg a D1 receptor aktiválás az NMDA receptor funkció fokozódásához, addig a D2 receptor aktiválás az NMDA receptor funkció gátlásához

11

vezethet különböző agyi régiókban (26, 188). Mindezek alapján az NMDA receptor funkció szabályozásában valószínűleg kiemelkedő jelentőséggel bír a receptor foszforiláltságának a mértéke. 3.2 Az extracelluláris purinok transzmitter és modulátor szerepe Az egyik első kutató, aki leírta, hogy az extracelluláris purinok és pirimidinek jelentős biológiai hatással rendelkeznek, Szent-Györgyi Albert volt, már az 1930-as években (47). A 60-as, 70-es években került ismét az érdeklődés előterébe, hogy az ATP-nek nemcsak energiatároló és szolgáltató funkciója van a sejten belül, hanem az extracelluláris térbe jutva - a központi idegrendszerben is - transzmitter funkciót tölthet be (22, 73). Mára közismert ténnyé vált, hogy az extracelluláris purinok (adenozin, adenozin 5'-difoszfát és adenozin 5'-trifoszfát - ADP és ATP), és pirimidinek (uridin 5'-difoszfát, és uridin 5'-trifoszfát - UDP és UTP) fontos transzmitter molekulák, jellemző biológiai hatásokkal, melyeket a purin receptorokra (purinoceptorokra) hatva fejtenek ki. A purin receptoroknak két nagy családja van: az adenozin, vagy P1 receptorok, és az ATP-t, ADP-t, UTP-t és UDP-t felismerő P2 receptorok (145). Az adenozin (P1) receptor család négy fő receptor típusból áll, amelyeket molekuláris, biokémiai és farmakológiai módszerekkel karakterizálva - A1, A2A, A2B és A3 receptornak neveztek el. Mindegyikük 7 transzmembrán domént tartalmazó, metabotrop, azaz G-proteinhez kapcsolt receptor. Míg az A1 és az A3 receptorok az adenilciklázhoz negatívan kapcsoltak, addig az A2A és A2B receptorok esetén a kapcsolat az adenilciklázhoz pozitív (59). Neuronális struktúrákon elsősorban az A1 és az A2A receptorok találhatók meg, amelyek az adenozin alacsony koncentrációira aktiválódva sokrétű fiziológiai hatást váltanak ki a központi idegrendszerben (78). Szemben az A1 receptorok diffúz lokalizációjával, az A2A receptorok inkább körülírt eloszlást mutatnak az agyban. Elsősorban a striatumban és a nucleus accumbensben (dopaminban gazdag struktúrákban) koncentrálódnak, bár kisebb denzitással diffúzan is megtalálhatók (131). A receptorok nem szelektív agonistája az adenozin, illetve az N-etilkarboxamidoadenozin (NECA), nem szelektív antagonistáik a xantinok, többek között a jól ismert koffein és teofillin. Az egyes receptortípusok szelektív agonisták és antagonisták segítségével farmakológiailag jól karakterizálhatók (83). Az adenozin receptorok

12

lehetséges központi idegrendszeri szerepe a neurotranszmisszió finom szabályozása, az A1 receptorok potenciálisan gátló, míg az A2A receptorok potenciálisan serkentő neuromodulátor funkciójával (41, 152). Ez a szerep többek között tetten érhető a kognitív funkciók alapját képező szinaptikus plaszticitás (LTP, LTD) szabályozásában (114). Emellett egyre nagyobb figyelem fordul az adenozin potenciális szerepére a striatális transzmisszió modulálása és a neurodegeneratív betegségek, valamint azok potenciális adenozinerg befolyásolása vonatkozásában (74, 110). A nukleotidokat (ATP, ADP, UTP, UDP) felismerő P2 receptorok fiziológiai jelentőségét mutatja, hogy szinte minden sejt rendelkezik ilyen receptorral. Molekuláris szerkezetük, és szignál transzdukciós mechanizmusuk alapján a P2 receptorokat két további nagy családra osztották, amelyet később a P2 receptor proteinek klónozása is igazolt: P2Y és P2X receptorokra (2, 145). A P2Y receptorok hét transzmembrán hélixet tartalmazó klasszikus G-protein kapcsolt receptorok, míg a P2X receptorok az ionotrop receptor családba tartoznak. 13 P2Y-szerű protein szekvenciát klónoztak gerinces fajokból, ezekből 5 (hP2Y1,2,4,6,11) található meg emberben (82, 145). A P2Y receptorok jellemzően a foszfolipáz C/inozitol triszfoszfát/Ca2+ rendszerhez kapcsoltak, bár az adenilcikláz, a foszfolipáz A2 és D effektor szerepe is felmerült egyes esetekben (18, 48, 82). Bár radioligand kötési tanulmányokkal (154), és immunhisztokémiailag (115) is kimutatták, hogy a különböző P2Y receptorok nagyfokú expressziót mutatnak neuronális struktúrákon, ezen receptorok szinaptikus transzmisszióban betöltött prevagy posztszinaptikus funkcionális szerepéről keveset tudunk. Valószínűsíthető, hogy gyors, könnyebben kimutatható direkt hatás hiányában neuromodulátor funkcióval rendelkeznek. Több tudományos dolgozatban is azt közölték, hogy gyors, posztszinaptikus ATP által mediált szignál váltható ki a központi idegrendszer különböző területén elhelyezkedő neuro-neuronális szinapszisoknál, mint pl. a habenula (50, 158), a locus coeruleus (124), a hippocampus (134), és a gerincvelő hátsó szarva (7). A gyors excitátoros ATP válaszokat az ionotrop P2X receptorok közvetítik, amelyek agonista hatására néhány ezredmásodpercen belül kationok (Na+, K+, és Ca2+) nem szelektív áramát teszik lehetővé a receptor intrinsic csatornáján keresztül (160). A P2X receptoroknak

7

altípusát

különböztették

meg

(P2X1-7),

amelyek

általában

megtalálhatók neuronális struktúrákon is. A P2X1, P2X2, P2X4 és a P2X6 receptorok

13

meglehetősen diffúz expressziót mutatnak, míg a P2X3 és P2X5 receptorok neuronális lokalizációja inkább körülírt. A P2X3 receptorok jellemzően a szenzoros rendszerben, a gerincvelő hátsó szarvában valamint a nucleus tractus solitariiban, és a szupraoptikus magban találhatók meg. Lokalizációjuk alapján felvetődött a nocicepcióban betöltött lehetséges szerepük (35, 127). A P2X7 receptorok neuronális lokalizációja nem jellemző, és fiziológiai jelentőségük sem ismert (145). A P2X receptorok farmakológiai differenciálását, funkcionális jellemzőinek és in vivo szerepének tisztázását nehezíti az a tény, hogy a szervezetben jellemzően nem homomer, hanem heteromer formában találhatók meg, pl. P2X2/P2X3, P2X4/P2X6, illetve P2X1/P2X5 receptorok (125, 145). Sem a P2Y, sem a P2X receptorok esetében nem állnak rendelkezésünkre megfelelő szelektivitást mutató agonisták és antagonisták az egyes receptor altípusok tekintetében, sőt az általánosan alkalmazott P2 receptor antagonista suramin jelentős gátló hatást fejt ki pl. a glutamáterg transzmisszióra is (145). Ez a tény jelen pillanatban komoly nehézséget okoz a receptorok funkcionális szerepének tisztázásában, és még inkább a feltételezett funkciók in vivo igazolásában és esetleges terápiás hasznosításában. Mindazonáltal egyértelmű, hogy az extracelluláris nukleotidok neuronális struktúrákon transzmitter és kotranszmitter funkciót töltenek be. Mindez a noradrenalinnal és az acetilkolinnal kapcsolatban bizonyított, de dopamin esetében is valószínűsíthető (23, 127, 172). Az ATP, mint endogén gyors excitátoros neurotranszmitter, neuronális struktúrákon az e tekintetben domináló glutamát mellett fontos szerepet játszhat, de ilyen irányú szerepének mértéke még vita és további vizsgálatok tárgyát képezi (19, 42). Sokkal egyöntetűbb a vélemény abban a tekintetben, hogy az extracelluláris purinerg struktúrák fontos modulátor szerepet játszanak más transzmitterrendszerek aktivitását befolyásolva. A somatodendritikus purin receptorokat (P2X vagy P2Y) excitátorosnak tekintik, míg a preszinaptikus receptorok lehetnek serkentőek (jellemzően P2X) illetve gátlóak (P2Y). Az ATP ektonukleotidázok által adenozinná történő lebontása (48) a P1 receptorok aktiválásához vezet, ami ugyancsak hozzájárulhat a sejtből kijutó ATP transzmissziót szabályozó általános funkcióihoz. Tekintve, hogy egy adott idegsejt a P2X, P2Y illetve a P1 receptorok változatos kombinációit tartalmazhatja, a transzmitter nukleotidok összesített reguláló hatása nagymértékben függ a szöveti nukleotidázok aktivitása mellett az adott sejt aktuális receptorkészletétől és azoknak az adott agonista iránti érzékenységétől. Mindezek

14

alapján az ATP és a nukleotid transzmitterek igen alkalmasnak látszanak a gyors excitátoros transzmitterhatás mellett egy lassúbb, finom-szabályozó szerep betöltésére (19, 42, 127). Nem meglepő tehát, hogy a purinerg mediátorok központi idegrendszeri hatásai szerteágazóak, ide sorolva a fájdalom transzmissziójában játszott szerepüket (35, 127), a mozgásszabályozást moduláló funkciójukat (74, 110), a szinaptikus plaszticitásra, azaz akár a kognitív funkciókra kifejtett hatásaikat is (60, 75, 114). Ezen ismeretek természetesen további kutatómunkát tesznek szükségessé, és akkor válnak farmakológiai értelemben is értékessé, ha nagy szelektivitású, in vivo is alkalmazható agonista és antagonista vegyületek birtokában a fenti funkciókat pontosabban tisztázni, és befolyásolni tudjuk. Ekkor talán lehetővé válik olyan problémák, mint a fájdalommal járó állapotok, a Parkinson-kór, a memóriazavarok, a kábítószerabúzus, vagy a schizophrenia kezelésének purinerg terápiás megközelítése, amely kiegészítheti és tökéletesítheti a hagyományos kezelési eljárásokat. 3.3 A prefrontális cortex fiziológiai és patofiziológiai szerepe A prefrontális cortex komplex intracortikális és subcortikális kapcsolatrendszerrel rendelkező agyterület. Különösen a mediodorzális thalamus illetve a ventrális tegmentális area felől érkező glutamáterg és dopaminerg innervációja jelentős (13, 45, 88, 129), de inputtal rendelkezik a noradrenerg locus coeruleus, a kolinerg bazális előagyi struktúrák és agytörzsi magvak, valamint a hippocampus, az amygdala, a substantia nigra, és egyéb agyterületek (somatosenzoros cortex, agranuláris insularis cortex, entorhinalis és egyéb kéregterületek) felől is (39, 54, 111, 161, 184). A prefrontális cortex neuronjai számos agyi struktúrába projiciálnak: nucleus accumbens, striatum, ventrális tegmentális area, substantia nigra, mediodorzális thalamus, subthalamikus magvak, raphe magvak, amygdala, és az agytörzs alsóbb területei (9, 25, 104, 141, 153). A prefrontális cortex és a fent említett agyterületek között fennálló reciprok kapcsolatok adják az anatómiai alapját olyan multiszinaptikus körök kialakulásának, amelyek alapját képezhetik kognitív, viselkedési és vegetatív funkcióknak, illetve azok szabályozásának (85, 104). Ezen komplex rendszerek funkcionális vagy anatómiai diszfunkciói feltehetőleg szerepet játszanak a kognitív deficit, a schizophrenia, vagy a kábítószerabúzus kialakulásában (86, 87, 98). Ezért az

15

elmúlt két évtized neurofiziológiai és neuropatológiai kutatásaiban nagy szerepet kapott annak tisztázása, hogy a prefrontális cortikális neuronok milyen módon vesznek részt a kognitív és viselkedési funkciókban, milyen transzmitterrendszerek szervezik és modulálják ezeket a folyamatokat. Jelentős tényanyag gyűlt össze arra vonatkozóan, hogy a prefrontális cortex a rövid távú memóriában alapvető szerepet játszik, és ezzel megteremti az alapját a célra irányuló magatartásminták szervezésének (61). Ezt az agyterületet tartják a rövid távú memória speciális típusa, az ún. "working" memória fő anatómai struktúrájának. A "working" memória az a fajta rövid távú emlékezés, amely felelős a magasabb rendű kognitív funkciók, mint pl. a tanulás, tervezés, probléma megoldás, fogalmazás, nyelvértés kialakítsához szükséges átmeneti információ tárolásért, és annak "online" feldolgozásáért (5, 63). Az egész agykéreget tekintve a prefrontális területen a legmagasabb a dopamin koncentráció (21). A mesoprefrontális dopaminerg aktivitást tartják a kognitív funkciók egyik fő bázisának (108, 178), de az NMDA típusú glutamát receptoroknak is nagy szerepet tulajdonítanak az információ feldolgozásban és a memória funkciókban (120). Mind a glutamáterg, mind a dopaminerg transzmitterrendszerek zavara károsíthatja a prefrontális cortex funkcióit (65, 167). Az abúzus kialakulásában és fenntartásában mindkét rendszer jelentős szerepet játszik (86). A két afferens transzmitterrendszer lehetséges találkozási pontja a prefrontális cortex glutamáterg piramissejtjei (64, 155), amelyek expresszálják mind az 5 dopamin receptor altípus mRNS-ét (101), valamint az NMDA receptorok mRNS-ét is (150). Figyelembe véve az ATP lehetséges transzmitter/kotranszmitter szerepét a központi idegrendszerben, felmerülhet a kérdés, hogy az ATP, a katekolaminok, így a dopamin lehetséges kotranszmittereként, befolyásolja-e a prefrontális cortexben a piramissejtek aktivitását, a glutamáterg transzmissziót, és így potenciálisan a korábban említett fiziológiás és patofiziológiás folyamatokat. 3.4 A striatum fiziológiai és patofiziológiai szerepe A striatum egy komplex előagyi struktúra, a bazális ganglionok egyik kulcseleme, a psychomotoros magatartás, a mozgáskoordináció szabályozásában döntő szerepet játszó

16

agyterület (3). Neuronjainak túlnyomó többsége (patkányon 90-95 %-a), GABAerg "medium spiny" interneuron (29), amely glutamáterg (cortex, thalamus) és dopaminerg (substantia nigra pars

compacta) inputtal

rendelkezik.

A

gyors excitátoros

neurotranszmisszióért ezen az agyterületen is az ionotrop glutamát receptorok a felelősek, míg a G-protein kapcsolt dopamin receptoroknak moduláló szerepet tulajdonítanak (3, 43). A "medium spiny" interneuronok anatómiai és biokémiai megfigyelések alapján két csoportba sorolhatók. Az egyik típus a substantia nigra pars reticulatába, és a globus pallidus belső szegmentjébe projiciál (striatonigrális neuronok), míg a másik a globus pallidus külső szegmentjébe (striatopallidális neuronok) (135). A striatonigrális neuronok D1 dopamin receptorokat expresszálnak, és P anyagot tartamaznak, míg a striatopallidális neuronok D2 dopamin receptorokat expresszálnak, és enkefalin-pozitívak (123, 156). A striatonigrális neuronok fokozzák, míg a striatopallidális neuronok gátolják a lokomotoros aktivitást. Az ionotrop glutamát receptorok nagyfokú expressziót mutatnak a striatumban (144). Striatális agyszeleten végzett kísérletek azt mutatták, hogy D1 dopamin receptorok aktiválása fokozta mind az NMDA, mind az AMPA receptorok által mediált válaszokat (26, 27, 144), míg a D2 dopamin receptorok aktiválása az AMPA receptorok funkcióit gátolta, az NMDA receptorok funkcióit pedig vagy gátolta, vagy nem befolyásolta (26, 27). A striatális excitátoros szinaptikus transzmisszió befolyásolásában tónusos kináz és foszfatáz aktivitás részvételét valószínűsítik (38). In vivo komplex interakció körvonalazódott az excitátoros aminosavak, a dopamin, és az adenozin között a motoros funkciók szabályozásában, amelyben a striatopallidális neuronok szerepe valószínűnek tűnt (55, 56). A négy ismert adenozin receptor közül az A2A receptorok agyi lokalizációja elsősorban a striatumra koncentrálódik, azon belül is az enkefalinpozitív striatopallidális neuronokra (79, 151). Előzetes irodalmi adatok felvetették a lehetőségét annak, hogy a striatum "medium spiny" interneuronjain az adenozin gátló hatást fejt ki az NMDA receptorokra (128). Mindezek ismeretében felmerül a kérdés, hogy a

motoros

funkciók

striatális

szabályozásában

ismert

szerepet játszó

transzmitterrendszerek (dopaminerg, kolinerg, glutamáterg) mellett milyen szerepet játszik

az

adenozin,

annak

hatása

milyen

módon

érinti

az

excitátoros

transzmitterrendszer aktivitását, és befolyásolhatja-e a receptorok foszforiláltsági szintjét a "medium spiny" interneuronokon. Ennek felderítése további adalékot jelenthet

17

a rendszert érintő neurodegeneratív elváltozások, és az egyéb, pl. az abúzusszerek által létrehozott funkciózavarok komplexebb megközelítéséhez, és esetleges farmakológiai befolyásolásához. 3.5 Az alkoholok hatásai az ionotrop receptorokra Az etanol hatásmechanizmusát tanulmányozva az első elképzelés az volt, hogy az alkoholok - hasonlóan az inhalációs narkotikumokhoz - nem specifikus módon, a biológiai membránok mikrofluiditását befolyásolva fejtik ki biológia hatásaikat (34). Napjainkban azonban egyre több kísérleti eredmény utal arra, hogy az etanol hatására kialakuló jellemző tünetek neurotranszmitterek receptoraival, és/vagy feszültségfüggő ioncsatornákkal létrejött interakciók következményei (40, 66, 106). Az etanol jellemző hatása a GABAA receptorok serkentése (40, 52), valamint az ionotrop glutamát receptorok blokádja (46, 166). Az alkoholok befolyásolhatják továbbá a glicin, a nikotinos acetilkolin, az 5-HT3 szerotonin és a P2X receptorok funkcióit is (106). Az excitátoros központi idegrendszeri receptorokat illetően a legtöbb tanulmány az etanol NMDA receptorokra kifejtett hatásaival foglalkozik, mindezek ellenére az etanol molekuláris hatásmechanizmusa részleteiben nem ismert. Mivel a korábban említettek szerint az excitátoros glutamát receptorok érzékenységének változása a dependenciát kísérő, vagy azt részben fenntartó jelenség lehet, az etanolnak ezen receptorokra kifejtett hatásai megkülönböztetett figyelmet érdemelnek, hiszen a hatás részleteinek és mechanizmusának tisztázása elősegítheti az abúzus terápiáját, az elvonási tünetek befolyásolását. Kevesebb adat áll rendelkezésre az alkoholoknak az ionotrop ATP receptorokra kifejtett hatásait illetően, mindazonáltal az etanol P2X receptorokra kifejtett gátló hatása ismeretes (99, 100, 177). Az etanol szerteágazó hatásmechanizmusának tisztázásához érdekes adalék, hogy az etanol, és származéka, a triklóretanol gátolja az ionáramokat béka szenzoros neuronjain (177), amelynek emlős megfelelői P2X3 receptorokat tartalmaznak (97). A triklóretanol hatása azért érdemel figyelmet, mert az enyhe analgetikus hatáskomponenssel is rendelkező (57) szedatohipnotikus hatású klorálhidrát fő metabolitja (20). Vizsgálata ezért nemcsak az alkoholok ioncsatornákra kifejtett

18

specifikus hatásának hatás-szerkezeti összefüggéseit segíthet tisztázni, hanem a klorálhidrát hatásmechanizmusához is adalékokat szolgáltathat.

19

4. CÉLKITŰZÉSEK Az értekezés fő célkitűtése annak vizsgálata, hogy milyen módon történik az abúzusban jelentős szerepet játszó excitátoros ionotrop receptorok, elsősorban az ionotrop glutamát receptorok működésének a szabályozása két - az abúzusszerek hatásainak szempontjából - kiemelt agyterületen: a prefrontális cortexben, amely a viselkedési hatásokban elsődleges jelentőséggel bíró mesocortikolimbikus rendszer részét képezi, valamint a striatumban, amely a mozgáskoordinációban alapvető fontosságú nigrostriatális rendszer egyik központi eleme. Tekintve, hogy ezek a területek egyben a legfontosabb dopaminerg pályarendszerek közé tartoznak az agyban, kísérleteinkben azt tűztük ki célul, hogy a dopamin potenciális kotranszmitterének, az ATP-nek, illetve lebomlási termékének, az adenozinnak az ionotrop glutamát receptorokra kifejtett hatásait vizsgáljuk. További célkitűzésünk az volt, hogy az etanol és más alkoholok ionotrop (NMDA és P2X) receptorokra kifejtett hatásait tanulmányozzuk. Az értekezés az alábbi négy témakörben végzett kísérletek leírását, az eredmények részletezését, és az azokból levont következtetéseket tartalmazza: 4.1. Patkány agyszeleten patch clamp módszer segítségével vizsgáltuk, hogy az ATP illetve az adenozin milyen hatást fejt ki az NMDA receptor funkcióra a prefrontális cortex V. rétegének piramissejtjein. -

Az irodalmi háttérben ismertettem, hogy a prefrontális cortex a vele kapcsolatban

álló struktúrákkal (nucleus accumbens, ventrális tegmentális area, mediodorzális thalamus, striatum, stb.) olyan multiszinaptikus kapcsolatrendszert alkot, amely alapvető jelentőséggel bír kognitív, viselkedési és vegetatív fukciókban, zavarai pedig szerepet játszanak különböző patológiás állapotok, mint pl. a schizophrenia és a kábítószerfüggőség kialakulásában. A dopaminról ismert, hogy befolyásolja az NMDA receptorok funkcióit ebben a régióban. Kísérleteinkben azt kívántuk tisztázni, hogy a dopamin lehetséges kotranszmittere, az ATP befolyásolja-e az NMDA által kiváltott áramokat.

20

4.2. Patkány agyszeleten patch clamp technika segítségével vizsgáltuk az adenozin hatását az NMDA és az AMPA receptorok funkcióira a striatum "medium spiny" interneuronjain. -

Közismert, hogy a striatum a mozgáskoordináció és a sztereotip magatartás

szabályozásában alapvető szerepet játszó komplex terület az előagyban. Jellemző sejttípusa a GABA-erg "medium spiny" interneuron, amely az agykéreg és a thalamus felől glutamáterg, a substantia nigra pars compacta felől pedig dopaminerg innervációval rendelkezik. Tekintettel arra, hogy a dopamin befolyásolja az excitátoros aminosav receptorok funkcióit ebben a régióban is, elképzelhetőnek tartottuk a lehetséges kotranszmitter ATP-nek, vagy lebomlási termékének, az adenozinnak moduláló szerepét. Az adenozin egyik receptortípusa az A2A receptor legerőteljesebb expressziót az agyban éppen ebben a struktúrában mutat. Kiindulási alapot jelentett kísérleteinkhez, hogy in vivo komplex kölcsönhatást írtak le az adenozin, az excitátoros aminosavak és dopamin között a motoros funkciók szabályozásában, illetve hogy in vitro az adenozin A2A receptor agonisták gátolták az NMDA receptorokon kialakuló hatásokat ebben a régióban. Kísérleteinkben ennek az utóbbi interakciónak a részleteit és mechanizmusát kívántuk tisztázni, valamint azt, hogy a másik excitátoros ionotrop receptor, az AMPA receptor tekintetében is kimutatható-e a tapasztalt kölcsönhatás. 4.3. Az etanol hatásait vizsgáltuk az NMDA receptor funkcióira patch clamp technika, illetve fura-2 mikrofluorimetria segítségével primer cortikális sejttenyészeten. -

Az irodalmi háttérben ismertettem, hogy a ligand által szabályozott ioncsatornák az

etanol molekuláris szintű hatásainak fontos helyét jelentik. A GABAA receptorokra kifejtett serkentő hatás közismert. Az etanol jól ismert, erős gátló hatást fejt ki az NMDA receptor funkcióra, ezen gátló hatás mechanizmusa azonban nem tisztázott. Ezt tanulmányoztuk a fenti vizsgálati rendszerekben.

21

4.4. Patch clamp techika segítségével azt vizsgáltuk, hogy az etanol és származéka, a triklóretanol milyen hatást fejt ki a P2X3 purinoceptorokra P2X3 receptorral transzfektált HEK 293 sejteken. -

Újabb adatok arra utalnak, hogy az alkoholok az ATP ionotrop (P2X) receptorait is

gátolják. A gátló hatás mértéke az egyes receptor altípusok esetében azonban nem tisztázott. Kísérleteink további farmakológiai vonatkozását - az alkohol toxikológiai és addiktológiai jelentősége mellett - az adja, hogy a triklóretanol a szedatohipnotikus hatású szer, a klorálhidrát aktív metabolitja.

22

5 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 5.1 Az ionotrop glutamát receptorok modulációjának vizsgálata a prefrontális cortex V. rétegének piramissejtjein 8-14 napos Wistar patkányokat dekapitáltunk, az agyat eltávolítottuk, és 95 % O2-vel, és 5 % CO2-vel szaturált jéghideg arteficiális cerebrospinális folyadékba (ACSF) helyeztük, amelynek összetétele a következő volt: NaCl 126; KCl 2,5; NaH2PO4 1,2; CaCl2 2,4; MgCl2 1,3; NaHCO3 26 és glükóz 10 mM; pH 7,4. Szeletelő berendezés segítségével (Vibratome 1000) 200 µm vastagságú koronális szeletet készítettünk az előagyból, amely tartalmazta a neocortex prefrontális területét. A szeletek ezután egy termosztátba kerültek, ahol a mérés idejéig, legalább 1 órán keresztül, 36 °C-on, oxigenizált ACSF-ben inkubálódtak. A méréseket patch clamp technikával végeztük, a szeleteket erre kialakított perfúziós kamrába helyeztük (300-400 µl űrtartalom), és a mérés során szobahőmérsékleten (22-25 °C-on), oxigenizált ACSF-fel folyamatosan perfundáltuk (3ml/min). A perfúzióhoz használt ACSF összetétele megegyezett a preparálás és az inkubáció során használt ACSF összetételével, kivéve azt az esetet, amikor Ca2+-mentes oldat hatását vizsgáltuk, ilyenkor az oldatból a CaCl2-t kihagytuk. Az egyes mérések kezdete előtt a mérőkamrába helyezett szeletek legalább 15 percig regenerálódtak. A prefrontális cortex V. rétegében található piramissejtek membránáramait az Edwards és mtsai. által leírt módon vizsgáltuk (51). A piramissejteket inverz mikroszkóp segítségével, 40x-es vízimmerziós objektívvel (Axioscope FS; Carl Zeiss) tettük láthatóvá a kísérletekhez. A mikroszkóp infravörös fényre érzékeny videokamerához csatlakozott (Newvicon C 2400-07-C; Hamamatsu). Mikropipetta húzó (Flaming-Brown P-97; Sutter) segítségével boroszilikát üvegkapillárisokból patch pipettákat készítettünk, amelyeket a következő összetételű intracelluláris oldattal töltöttünk fel: K-glükonát 140; NaCl 10; MgCl2 1; HEPES (N-(2-hidroxietil) piperazinN'-(2-etánszulfonsav))

10;

EGTA

(etilénglikol-bisz-(b-aminoetiléter)-N,N,N',N',-

tetraecetsav) 11; MgATP 1,5 és GTP 0,3 mM; pH 7,3-ra beállítva KOH-dal. A pipetták ellenállása 3-7 MW volt. A "liquid junction" potenciál (VLJ) Barry alapján (8) számítva az extracelluláris és a pipettaoldat között 22 °C-on 15,2 mV volt. Minden

23

membránpotenciál értéket ez alapján korrigálva határoztunk meg, és a sejtek - 80 mV-os "holding" potenciálját is ezt figyelembe véve állítottuk be a "voltage clamp" kísérletekhez. A piramissejtek membránpotenciálját, a patch clamp erősítőt (List EPC-7) "current clamp" funkcióra kapcsolva, közvetlenül a "whole cell" konfiguráció létrehozása után mértük meg. Ekkor a neuronok membránpotenciálja -60 és -80 mV közötti tartományban volt. Ezután 5-10 percet vártunk, hogy létrejöjjön a diffúziós egyensúly a patch pipetta és a sejt belseje között, majd "voltage clamp" funkcióban vizsgáltuk az NMDA hatására kialakuló áramokat. A kísérletekben a sejtek membránpotenciálja a "whole cell" konfigurációban történő mérés teljes időtartama alatt (40-50 perc) stabil maradt, amint ezt a kísérletek végén történő ismételt mérések igazolták. A sejtek membrán kapacitása és "series" rezisztencia értéke 38-54 pF illetve 23-36 MW volt. A mért jeleket 3-10 kHz-en szűrtük az EPC-7 erősítő beépített szűrője segítségével, és 0,15 kHz-en digitalizáltuk (Model 1401; Cambridge Electronic Devices). Az adatok elemzése ugyancsak a Cambridge Electronic Devices patch és "voltage clamp" szoftvere segítségével történt. Az egyes vizsgálati anyagokat a perfúziós oldatban adtuk, az oldatokat háromállású csapok segítségével cseréltük. 3 ml/min konstans áramlási sebesség mellett kb. 20 másodpercre volt szükség ahhoz, hogy a szerek elérjék a vizsgálati edényt. NMDA különböző koncentrációival (3-3000 µM) meghatároztuk az agonista koncentráció-hatás görbéjét. Az agonista ugyanazon koncentrációját háromszor adtuk, egyenként másfél percig (T1, T2, T3), közöttük mindig 10 perces szünetet tartva, amikor az agonistát nem tartalmazó ACSF-fel perfundáltunk. Tekintve, hogy az áramok magasabb NMDA koncentrációk esetén T1-ről T2-re, illetve T2-ről T3-ra szignifikánsan csökkentek, a további kísérletekhez 30 µM-os agonista koncentrációt választottunk, amely T2-T3 viszonylatban reprodukálható áramokat váltott ki. Adenozin (100 µM), ATP (300 µM), a,b metilén ATP (a,b-meATP; 30 µM), 2-metiltio ATP (2-MeSATP; 30 µM), UDP (100 µM), UTP (100 µM), vagy az adenozin-O-(2-tiodifoszfát) (ADP-b-S; 100 µM) a harmadik NMDA applikáció előtt (T3) 5 percig, és az alatt, folyamatosan jelen voltak az extracelluláris

oldatban.

Suramin

(30

µM),

piridoxál-foszfát-6-azofenil-2',4'-

diszulfonsav (PPADS; 30 µM), tetrodotoxin (TTX; 0.5 µM) vagy S(4-nitrobenzil)-6tioguanozin (NBTG; 30 µM) a mérés teljes időtartama alatt a perfúziós folyadékban

24

voltak. Egyes kísérletekben a GTP-t a pipettaoldatban guanozin 5'-O-(3-tiodifoszfáttal) (GDP-b-S; 300 µM) vagy guanozin 5'-O-(3-tiotrifoszfáttal) (GTP-g-S; 300 µM) helyettesítettük, ugyancsak a mérés teljes időtartama alatt. A Ca2+-mentes oldat hatását vizsgálva a szeleteket az inkubáció után a méréshez Ca2+-mentes ACSF-be helyeztük, és a méréseket ebben az oldatban végeztük. Minden agyszeletből egy sejtet regisztráltunk. Mivel az NMDA által kiváltott válaszok lényeges variabilitást mutattak, az értékelés során a T3 időpontban regisztrált áramokat a T2 időpontban mértekhez viszonyítva normalizáltuk. Mivel a P2 receptor agonisták az NMDA által indukált áramokat a piramissejteknek csak egy szubpopulációjában facilitálták, azokat a kísérleteket értékeltük, ahol a százalékos serkentés meghaladta az 5%-os limitet (a sejtek kb 70%-a). Hat kísérletben a patch clamp pipettákat biocitint tartalmazó oldattal töltöttük fel. A szeleteket avidinbiotinált-torma-peroxidáz komplexben (ABS Elite Kit; 1:50) inkubálva, a biocitin-jelölt sejtek nikkel/kobalt-intenzifikált diaminobenzidin reakció segítségével láthatóvá váltak. A négy ATP (300 µM) -érzékeny, illetve a két ATP (300 µM) -inszenzitív sejt hasonló, a piramissejtekre jellemző, tipikus morfológiát mutatott (187): vastag, felszálló apikális dendrittörzs, amelynek szerteágazó nyúlványai az I-II. rétegben érnek véget. Dendrittüskék megtalálhatók voltak mind az apikális, mind a bazális proximális dendriteken (1. ábra).

1. ábra A prefrontális cortex V. rétegében elhelyezkedő piramissejt morfológiája

Kísérleteink során a következő vizsgálati anyagokat használtuk: a,b-meATP, 2-MeSATP tetranátrium só, PPADS tetranátrium só, NBTG (RBI); adenozin

25

dinátrium só, ATP dinátrium só, ATP magnézium só, ADP-b-S, biocitin, 3,3'-diaminobenzidin tetrahidroklorid, GDP-b-S, GTP-g-S, GTP lítium só, NMDA nátrium só, tetrodotoxin, UDP nátrium só, UTP nátrium só (Sigma) avidin-biotinálttorma-peroxidáz komplex (ABC Elite Kit) (Vector Laboratories), suramin (Bayer), entellán (Merck). A vizsgálati anyagokból desztillált vízzel vagy dimetil szulfoxiddal (DMSO) törzsoldatokat (10-100 mM) készítettünk, amelyeket -20°C-on tároltunk. A további hígításokat naponta készítettük, a megfelelő intra- vagy extracelluláris oldatban. A DMSO végső koncentrációja soha nem haladta meg a 0,1 %-ot, amelynek ebben a koncentrációban önmagában nem volt hatása. 5.2 Az ionotrop glutamát receptorok modulációjának vizsgálata a striatum "medium spiny" interneuronjain A patkány agyszelet preparálása és inkubálása az 5.1 pontban leírt módon, és oldatokban történt, természetesen azzal a különbséggel, hogy ezúttal olyan szeleteket készítettünk, amelyek a neocortexet, a corpus callosumot, és a neostriatumot tartalmazták. Az inkubáció után a mérést ugyancsak az 5.1 pontban jellemzett perfúziós elrendezésben, az ott leírt űrtartalmú kamrában és perfúziós sebesség mellett végeztük. Az extracelluláris oldat összetétele, amikor az AMPA áramokat vizsgáltuk, megegyezett a preparáláshoz és az inkubációhoz használt ACSF-fel. Az NMDA áramok vizsgálatához Mg2+-mentes ACSF-et használtunk. A "whole cell" patch clamp kísérletek kivitelezése ugyancsak az 5.1 pontban leírt módon, az ott felsorolt berendezések segítségével, és az ott részletezett intracelluláris oldat alkalmazásával történt. Néhány kísérletben a 11 mM EGTA-t 5,5 mM (1,2-bisz (2-aminofenoxi)etán-N,N,N',N'-tetraecetsav) (BAPTA) és 5,5 mM K-glükonát, más kísérletekben a 140 mM K-glükonátot 125 mM Cs-metánszulfonát, 3 mM KCl és 4 mM NaCl helyettesítette, a pipettaoldat további összetételét nem változtatva. A pH-t az utóbbi esetben CsOH segítségével állítottuk be 7,3-ra. A pipetták ellenállása 3-7 MW volt, a VLJ standard pipettaoldat esetén 15,2 mV-nak bizonyult, míg a BAPTA tartalmú oldatnál 15,9 mV, a Cs-metánszulfonát tartalmúnál pedig 10,6 mV értéket kaptunk. Minden membrán potenciál értéket ennek alapján korrigáltunk, és a "voltage clamp"

26

során beállított -80, vagy +30 mV-os "holding" potenciálnál is figyelembe vettük ezen értékeket. A kísérleteket a striatum fő sejttípusán, a GABAerg "medium spiny" projekciós neuronokon végeztük, amely a teljes populáció 90-95 %-át teszi ki (29). Ezeket a sejteket kis sejttest (kb 13 µm átmérő), -60 mV-nál negatívabb nyugalmi potenciál, és in vitro körülmények között a spontán aktivitás hiánya jellemzi (24). A sejteket infravörös fényre érzékeny videokamerához kapcsolt (Newvicon C 2400-07-C; Hamamatsu) inverz mikroszkóp segítségével, 40x-es vízimmerziós objektívvel (Axioscope FS; Carl Zeiss) tettük láthatóvá. 30 szelektált neuron membránpotenciálját a patch clamp erősítő (List EPC-7) "current clamp" funkcióját használva közvetlenül a "whole cell" konfiguráció létrehozása után megmértük: átlagértékként -78,4±2,6 mV-ot kaptunk. Minden vizsgált sejt esetén 5-10 percet vártunk, hogy létrejöjjön a diffúziós egyensúly a patch pipetta és a sejt belseje között, majd "voltage clamp" funkcióban vizsgáltuk az NMDA és az AMPA hatására kialakuló áramokat. A kísérletekben a sejtek membránpotenciálja a "whole cell" konfigurációban történő mérés teljes időtartama alatt (40-50 perc) stabil maradt, amint ezt a szelektált neuronoknál a kísérletek végén történő ismételt mérések igazolták (-79,7±2,5 mV p>0,05). A sejtek membrán kapacitása és "series" rezisztencia értéke 38,6±2,1 pF illetve 28,0±1,5 MW volt. A mért jeleket 3-10 kHz-en szűrtük az EPC-7 erősítő beépített szűrője segítségével, és 0,15 kHz-en digitalizáltuk (Model 1401; Cambridge Electronic Devices). Az adatok elemzése ugyancsak a Cambridge Electronic Devices patch és "voltage clamp" szoftvere segítségével történt. Az 5.1-es pontban leírtakhoz hasonlóan az egyes vizsgálati anyagokat a fent részletezett feltételek szerint a perfúziós oldatban háromállású csapok segítségével cseréltük. NMDA (1-1000 µM) és az AMPA (0,3-30 µM) különböző koncentrációit adva meghatároztuk a koncentráció-hatás görbéiket. Az agonista ugyanazon koncentrációját kétszer, egyenként másfél percig (T1, T2) adagoltuk, közöttük mindig 10 perces szünetet tartva, amikor az agonistát nem tartalmazó ACSF-fel perfundáltunk. A további kísérletekhez azokat az agonista koncentrációkat választottuk (NMDA 10 µM, AMPA 3 µM), amelyek a fenti körülmények között a két adagolás során rendszeresen reprodukálható áramokat váltottak ki. Tekintve, hogy a detektált áramok nagysága az

27

egyes sejtekben jelentősen különbözött, az értékelés során a T2 időpontban regisztrált áramokat a T1 időpontban mértekhez viszonyítva normalizáltuk. Az NMDA-val végzett kísérletek során az adenozin A2A receptor agonista 2-p-(2-karboxietil) feniletilamino-5'N-etilkarboxamidoadenozin hidroklorid (CGS 21680; 0,1 µM) a második NMDA applikáció során, és az azt megelőző 5 percben folyamatosan jelen volt a perfúziós folyadékban. Azok az anyagok, amelyek az intracelluláris jelátviteli mechanizmust befolyásolják, az egész kísérlet során jelen voltak az extracelluláris folyadékban, vagy a pipettaoldatban. Az AMPA-val végzett kísérletekben az adenozin, valamint az A1 és az A2A receptorok szelektív agonistái az extracelluláris oldatban voltak jelen a második AMPA applikációt megelőző 5. perctől az AMPA applikáció végéig. A kísérletek során a következő vizsgálati anyagokat használtuk: kalmodulin kináz II inhibitor (281-309), citokalazin B, deltametrin, N-(6-aminohexil)-5-kloro-1naftalénszulfonamid hidroklorid (W-7) (Calbiochem-Novabiochem); PKI(14-24) amid (Peninsula), (S)-AMPA, 2-kloro-N6-ciklopentiladenozin (CCPA), heparin nátrium, CGS 21680,

(2S)-N6-(2-endo-norbornil)adenozin

(S(-)-ENBA),

NBTG,

2-(N-(4'-

metoxibenzénszulfonil))amino-N-(4'-klorofenil)-2-propenil-N-metilbenzil-amin foszfát (KN-92), N-(2-(((3-(4'-klorofenil)-2-propenil)metilamino)metil)fenil)-N-(2-hidroxietil)4'-metoxi-benzénszulfonamid foszfát (KN-93), forbol 12-mirisztát 13-acetát (PMA), Sp- és Rp-adenozin 3',5'-ciklikus monofoszfotioát trietilamin (Sp-cAMPS, Rp-cAMPS), staurosporin, 1-(6-(((17b)-3-metoxiesztra-1,3,5(10)-trién-17-il)amino)hexil)-1H-pirrol2,5-dion (U-73122), 1-(6-(((17b)-3-metoxiesztra-1,3,5(10)-trién-17-il)amino)hexil)-2,5pirrolidindion (U-73343) (RBI); adenozin dinátrium só, ATP magnézium só, GTP lítium só, N6,2'-O-dibutiriladenozin 3',5'-ciklikus monofoszfát (dibutiril cAMP), nifedipin, NMDA nátrium só, tetraetilammónium klorid, tetrodotoxin (Sigma). A vizsgálati anyagokból desztillált vízzel, 0,5 M HCl oldattal (AMPA esetében) vagy DMSO-val törzsoldatokat (10-100 mM) készítettünk, amelyeket -20°C-on tároltunk. A további hígításokat naponta készítettük, a megfelelő intra- vagy extracelluláris oldatban. Az oldószerek ekvivalens mennyiségei önmagukban nem rendelkeztek hatással.

28

5.3 Az etanol ionotrop glutamát receptorokra kifejtett hatásának vizsgálata primer cortikális sejttenyészeten 16 napos Wistar patkány embriók cerebrális cortikális neuronjaiból primer sejtkultúrát készítettünk. Tripszinnel (0,25%; Gibco BRL) történő disszociálás után a sejteket poli-L-lizinnel (Sigma) bevont 30 mm átmérőjű kerek üvegcsészékben tenyésztettük. A sejtsűrűség 100 000 sejt/cm2 volt. A kultúrákat a tenyésztés 6. napján 10 µg/ml citozin-D-arabinofuranoziddal (Sigma) inkubáltuk a glia proliferáció gátlása céljából. A gentamicin (50 µg/ml; Sigma) tartalmú tenyésztő médiumot (Dulbecco-féle módosított Eagle médium /Nutrient F12 1:1 arányú keveréke; DMEM/F12; Gibco) minden 5-7. napon cseréltük. A tenyészeteket a használat előtt 10-18 napig 35 °C-on és 5%-os CO2 koncentrációt biztosítva inkubáltuk. "Whole cell" patch clamp kísérleteket Axopatch 200B erősítő (Axon Instruments) segítségével szobahőmérsékleten végeztünk. 3-5 MW ellenállású pipettákat használtunk gigaseal létrehozására, és a "voltage clamp" mérések -70 mV "holding" potenciálon történtek. A jeleket az Axopatch 200B erősítő beépített szűrőjével 2 kHz-en szűrtük, 5 kHz-en digitalizáltuk, és Digidata 1200 interface valamint pClamp 6.0 vagy Axoscope szoftver segítségével (Axon Instruments) számítógépen tároltuk és dolgoztuk fel. Az extracelluláris oldat összetétele a következő volt (a koncentrációk mM-ban értendők): NaCl 135; KCl 4,5, CaCl2 2; HEPES 10; glükóz 10; tetrodotoxin 0,0005. A pH-t NaOH segítségével 7,4-re állítottuk be. Az NMDA áramok vizsgálatához 10 µM glicint adtunk az oldathoz. A pipettaoldat (mM-ban) a következő anyagokat tartalmazta: CsCl 140; MgCl2 2; CaCl2 1; HEPES 10; EGTA 11. A pH-t CsOH-dal állítottuk be 7,4re. Az NMDA-t és az etanolt az extracelluláris médiumban oldva túlnyomás segítségével adagoltuk, DAD12 szuperfúziós rendszer (Adams and List) segítségével. A sejteket egy túlnyomástól független szelepen keresztül standard extracelluláris oldattal folyamatosan perfundáltuk. Koncentráció-hatás görbe felvételéhez az NMDA-t emelkedő koncentrációban az adott neuronra 2 másodpercig adtuk túlnyomás segítségével, mindig másfél perc időintervallummal két applikáció között. A további kísérletekhez 100 µM NMDA koncentrációt választottunk, amelyet 2 másodpercig, másfél percenként ismételve adtunk, majd három kontroll applikáció után vizsgáltuk az

29

etanol NMDA áramokra kifejtett hatását. Ekkor a perfúziós oldat a következő NMDA adagot megelőző 90 másodpercben, majd az NMDA válasz alatt is tartalmazta az etanol adott, vizsgálni kívánt koncentrációját (20-200 mM). Egy sejten több etanol koncentráció is tesztelhető volt, mindig a kisebbel kezdve a méréseket. Az etanol hatás tesztelése után újabb kontroll méréseket végeztünk, és csak azokat a méréseket vettük figyelembe a kiértékelés során, ahol a kimosás után a válaszok visszatértek a kontroll értékre. A patch clamp kísérletek egy másik csoportjánál az etanol NMDA receptorokra kifejtett hatásának feszültségfüggését vizsgáltuk. Ebben az esetben 100 µM NMDA (2 másodpercig, túlnyomással alkalmazva, percenként) hatását vizsgáltuk etanol (100 mM) jelenlétében, és anélkül, különböző (-60 - + 60 mV) "holding" potenciál értékek mellett. A patch clamp kísérletek mellett az etanol hatását az NMDA által kiváltott válaszokra "single-cell" mikrofluorimetriás módszerrel is vizsgáltuk. Ilyenkor a sejteket fura-2 acetoximetil észter (5 µM) tartalmú oldatban 30 percig, 37 °C-on a tenyésztő médiumban inkubáltuk. Ezt egy újabb 30 perces inkubációs időszak követte szobahőmérsékleten (20-25 °C), amely során a következő összetételű fura-2 mentes oldatot használtuk, abból a célból, hogy a fluoreszcens festék extracelluláris maradványait eltávolítsuk (koncentrációk mM-ban): NaCl 133; KCl 4,8; KH2PO4 1,2; MgCl2 1; CaCl2 1,3; HEPES 10; D-glukóz 10; pH 7,4, NaOH-dal beállítva. Ezután a sejtek egy inverz fluoreszcens mikroszkópon (Diaphot 200, Nikon) elhelyezett perfúziós kamrába (250 µl űrtartalom) kerültek. A sejteket a kísérlet teljes időtartama alatt folyamatosan perfundáltuk (0,8 ml/min prefúziós sebességgel). NMDA-t (20 µM) másfél percig, 10 percenként adagoltunk, és részben kontroll kísérleteket végeztünk, részben az etanol (100 mM) hatását vizsgáltuk. Ez utóbbi esetben a perfúziós oldat etanolt tartalmazott az első NMDA applikációt követően egészen a következő NMDA applikáció végéig. A fluoreszcens hányadost egy kettős hullámhosszú spektrométer (váltakozó excitáció 340, illetve 380 nm-en) segítségével határoztuk meg. A fura-2 fluoreszcencia mérésére 510/520 nm-en egy mikroszkóp fotométert használtunk, amely egy fotomultiplier detektor rendszerhez csatlakozott (Radiomaster Syatem; PTI). Az adatok detektálásához és analíziséhez PTI FeliX Vers. 1.1 szoftvert használtunk. Az intracelluláris Ca2+ koncentráció kalibrálására 10 µM ionomicint és 25 mM EGTA-t

30

használtunk Grynkiewicz alapján (67), illetve annak változására a fluoreszcens hányados változásából következtettünk. Kísérleteink során a következő anyagokat alkalmaztuk: NMDA, etanol (Sigma); tetrodotoxin citrát (Biotrend). Az NMDA-ból desztillált vízben törzsoldatot készítettünk, amelyet - 20 °C-on tároltunk, a napi oldatokat ebből készítettük. 5.4 Az etanol és a triklóretanol P2X3 receptorokra kifejtett hatásainak vizsgálata humán P2X3 receptorokkal transzfektált HEK 293 sejteken Humán P2X3 receptor cDNS-t hordozó pcDNS-sel (Invitrogene) standard transzfekciós módszerrel transzfektált HEK 293 sejteket (European Collection of Cell Cultures) "Dulbecco's minimal essential (ME)" mediumban, 35 °C-on, 5% CO2 tartalom mellett, a méréseket megelőzően 1-4 napig tenyésztettünk. Szobahőmérsékleten (20-22 °C) "whole cell" patch clamp méréseket végeztünk Axopatch 200B erősítő (Axon Instruments) segítségével. 3-5 MW ellenállású pipettákat használtunk gigaseal létrehozására, és a "voltage clamp" mérések -70 mV "holding" potenciálon történtek. A jeleket az Axopatch 200B erősítő beépített szűrőjével 2 kHz-en szűrtük, 5 kHz-en digitalizáltuk, és Digidata 1200 interface valamint pClamp 6.0 vagy Axoscope szoftver segítségével (Axon Instruments) számítógépen tároltuk és dolgoztuk fel. Az extracelluláris oldat összetétele a következő volt (a mennyiségek mM-ban értendők): NaCl 135; KCl 4,5; CaCl2 2; MgCl2 2; HEPES 10; glükóz 10. A pH-t NaOH-dal 7,4-re állítottuk be. A pipettaoldat a következő összetevőket tartalmazta (mM-ban): CsCl 140; MgCl2 1; CaCl2 2; HEPES 10; EGTA 11. A pH-t CsOH-dal 7,4-re állítottuk be. A vizsgálati anyagokat az extracelluláris oldatban túlnyomás segítségével adagoltuk, DAD12 szuperfúziós rendszert (Adams and List) alkalmazva. A sejteket egy túlnyomástól független szelepen keresztül standard extracelluláris oldattal folyamatosan perfundáltuk. Az a,b-meATP-t 1 másodpercig adagoltuk, 5 percenként. Miután stabilan reprodukálható áramokat regisztráltunk, 3 perccel a legutolsó a,b-meATP applikáció után etanolt, vagy triklóretanolt tartalmazó oldattal folytattuk a perfúziót 7 percen keresztül, és 2 majd 7 perc múlva ismételten 1-1 másodpercig adagolva az a,b-meATP-t vizsgáltuk az alkoholok hatását. Mivel az egyes sejtek érzékenysége az

31

a,b-meATP-re lényegesen különbözött, az áramok jelentős variabilitást mutattak, ezért az eredményeket mindig az alkoholok adását megelőző kontroll áram (T2) százalékában fejeztük ki. A vizsgálatok során a következő anyagokat használtuk: a,b-meATP (Biotrend) etanol, triklóretanol (Sigma). 5.5 Statisztika Az adatokat n számú kísérleti eredmény átlagértéke ± az átlag szórása formájában értékeltük ki. Egyszempontos variancia analízis (ANOVA) került alkalmazásra a kontrollal történő többszörös összehasonlításra, amelyet vagy parametrikus Bonferroni féle t-teszt, vagy Kruskal Wallis analízist követő non-parametrikus Dunn féle teszt követett. Egy preparátumon kapott több eredmény összevetésére ANOVA, és azt követő Tukey

teszt

vagy

Wilcoxon-féle

teszt

volt

használatos.

Az

átlagértékek

összehasonlítására Kruskal Wallis ANOVA és azt követő Mann-Whitney teszt került alkalmazásra. Egyes esetekben a kontrollal történő összehasonlításra non-parametrikus Mann-Wilcoxon

tesztet,

vagy parametrikus

egymintás

Student

féle

t-tesztet

alkalmaztunk. Minden statisztikai analízist a SigmaStat 2.0 programmal (Jandel Scientific) végeztünk. Ha a P érték (szignifikancia határ) kisebb volt, mint 0,05, az eltérést statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

32

6. EREDMÉNYEK 6.1 Az ionotrop glutamát receptorok modulációja a prefrontális cortex V. rétegének piramissejtjein A kísérletek során vizsgált összesen 124, a kéreg V. rétegében elhelyezkedő piramissejt nyugalmi membrán potenciáljának átlagértéke -81,8±1,8 mV volt. -80 mV "holding" potenciálon 3-3000 µM NMDA-t adagolva meghatároztuk az agonista dózis-

Áram (pA)

hatás görbéjét (2. ábra).

2. ábra Az NMDA dózis-hatás görbéje a prefrontális cortex V. rétegének piramissejtjein

Egy-egy mérés során a vegyület azonos koncentrációját adtuk háromszor (T1, T2, T3) másfél percig, közöttük 10 perces perfúziós periódusokkal. Az NMDA, ahogyan ez várható volt, a fenti potenciálérték mellett, negatív, azaz a sejtbe irányuló kationáramot váltott ki. 100 µM vagy afölötti NMDA koncentrációk esetén a kiváltott áram lényegesen kisebb lett a második applikáció során az elsőhöz képest, és a harmadik mérés további csökkenést mutatott. Mivel a 30 µM NMDA-ra adott válasz, bár T2 - T1 viszonylatban enyhe, nem szignifikáns csökkenést mutatott, T2 - T3 összehasonlításban változatlan maradt (T2: -159±25,8 pA; T3: -156,8±25,3 pA; P>0,05), ezért a további kísérletek során a 30 mM NMDA által kiváltott T2 és T3 válaszokat

33

vettük figyelembe az értékeléskor. 300 µM ATP, amelyet T3 NMDA perfúzió során, és az azt megelőző 5 percben adtunk, szignifikáns mértékben potencírozta (50,99±10,2%) a 30 µM NMDA által kiváltott áramokat. Az ATP két strukturális analógja, a 2-MeSATP (30 µM), valamint az a,b-meATP (30 µM) szintén potencírozó hatást mutatott (39,96±13,8%, illetve 33,36±12,4%; 3. ábra).

A

Az NMDA által kiváltott áram serkentése (%)

B

3.ábra ATP és stabil ATP analógok hatása az NMDA által kiváltott áramokra a prefrontális cortex V. rétegének piramissejtjein. A/ Reprezentatív mérések B/ Összefoglaló diagram (* P<0,05, szignifikáns eltérés a kontrolltól)

34

Az UDP (100 µM) és az UTP (100 µM) szintén az NMDA áramokat fokozó hatást fejtett ki (36,53±10,5 ill.32,1±7,2 %), míg az ADP-b-S hatástalan maradt (4. ábra). NMDA + UTP 100 µM


50

*

NMDA + UDP 100 µM

NMDA + ADP-b-S 30 µM

*

40 30 20 10

4. ábra UTP, UDP, és ADP-b-S hatása az NMDA által kiváltott áramokra a prefrontális cortex V. rétegének piramissejtjein (* P<0,05, szignifikáns eltérés a kontrolltól)

Az ADP-b-S kivételével minden P2 receptor agonista megközelítőleg hasonló mértékben fokozta a 30 µM NMDA által kiváltott áramot. Említést érdemel azonban, hogy csak a piramissejtek kb 70%-át kitevő szubpopuláción bizonyultak hatékonynak. Amikor a P2 receptor antagonista suramin (30 µM) 20 perccel a T1-et megelőzően, és azt követően az egész kísérlet ideje alatt jelen volt a perfúziós folyadékban, az NMDA (30 µM) által kiváltott áramok kb. 30%-kal csökkentek (T2 normál médium esetén: -159,8±25,8 pA, suramin jelenlétében: -117,9±16,8 pA P<0,05). Ugyanez a hatás a másik P2 receptor antagonista, PPADS (30 µM) jelenlétében nem volt megfigyelhető. Az NMDA által kiváltott áramok azonban mindkét antagonista jelenlétében reprodukálhatók voltak (T3/T2 suramin jelenlétében 1,01±0,03; PPADS jelenlétében 1,00±0,04). Az ATP által kiváltott potencírozó hatás a T3 NMDA áramokra szignifikáns mértékben csökkent mind 30 µM suramin (9,23±2,2%), mind 30 µM PPADS (16,2±4,4%) jelenlétében (5. ábra) az antagonisták hiányában megfigyelt potencírozó hatáshoz (50,99±10,2%) képest (P<0,05).

35


5. ábra P2 receptor antagonisták hatása az ATP-NMDA interakcióra (* P<0,05, szignifikáns eltérés a kontrolltól; ** P<0,05, szignifikáns eltérés az ATP hatásától)

A vizsgált piramissejteket a környező interneuronoktól tetrodotoxinnal (0,5 µM) vagy Ca2+-mentes perfúziós oldattal szinaptikusan izolálva az ATP (300 µM) facilitáló hatása az NMDA (30 µM) által indukált áramokra hasonló mértékű volt (38,46±6,8%, illetve 41,16±6,6%), mint a szokásos perfúziós oldattal végzett kísérletek esetén


(6. ábra).

6. ábra A neuronok szinaptikus izolálásának hatása az ATP-NMDA interakcióra (* P<0,05, szignifikáns eltérés a kontrolltól)

36

A P2 receptor agonistákkal szemben a P1 receptor agonista adenozin (100 µM), amely potenciálisan felelős lehet egy olyan hatásért, amelyet az ATP adagolása után detektálunk, tekintve hogy annak fő lebomlási terméke, nem befolyásolta az NMDA áramokat. Sem az adenozin transzport inhibitor NBTG hiányában, sem annak jelenlétében (30 µM), nem mutatott hatást (7. ábra).

A

Normalizált áram (T3/T2)

B

7. ábra Adenozin hatása az NMDA áramokra a prefrontális cortex V. rétegének piramissejtjein A/ Reprezentatív mérések (kontroll ill. az adenozin hatásának hiánya) B/ Összefoglaló diagram

37

A G proteinek lehetséges szerepét vizsgálva a megfigyelt ATP-NMDA interakcióban, a GTP-t (300 µM) GDP-b-S-sel (300 µM) helyettesítettük a pipettaoldatban az egész kísérlet ideje alatt. A GDP-b-S a G protein mediált reakciók inhibitora. Ezen körülmények között az ATP (300 µM) potencírozó hatása az NMDA (30 µM) által kiváltott áramokra szignifikáns mértékben, 12,01±2,27%-ra csökkent. További kísérletekben a GTP-t egy nem hidrolizálódó GTP-analóggal, GTP-g-S-sel (300 µM) helyettesítettük az egész kísérlet során, amely a G proteinek aktivátora. Ebben az esetben is szignifikáns mértékben csökkent az ATP (300 µM) potencírozó hatása az


NMDA (30 µM) áramokra (15,21±3,4%) (8. ábra).

8. ábra G proteinekre ható vegyületek hatása az ATP-NMDA interakcióra a prefrontális cortex V. rétegének piramissejtjein (* P<0,05, szignifikáns eltérés a kontrolltól; ** P<0,05, szignifikáns eltérés az ATP hatásától)

A prefrontális cortexben végzett kísérleteinket összegezve, a következő eredmények emelhetők ki: 1. A patkány prefrontális cortex V. rétegének piramissejtjei G protein kapcsolt, metabotrop P2 receptorokat (P2Y receptorokat) tartalmaznak. 2. Ezek a receptorok pozitív interakciót mutatnak az azonos sejteken lokalizált NMDA típusú ionotrop glutamát receptorokkal. Az eredmények és jelentőségük részletes megbeszélésére a 7.1-es pontban kerül sor.

38

6.2 Az ionotrop glutamát receptorok modulációja a striatum "medium spiny" interneuronjain -80 mV "holding" potenciálon, Mg2+-mentes ACSF-ben 1-1000 µM NMDA-t adagolva meghatároztuk az agonista dózis-hatás görbéjét. Egy-egy mérés során a vegyület azonos koncentrációját adtuk kétszer (T1, T2) másfél percig, közöttük 10 perces perfúziós periódusokkal. Az NMDA, ahogyan ez várható volt a fenti potenciálérték mellett, negatív, azaz a sejtbe irányuló kationáramokat váltott ki, amelyek stabilan reprodukálhatók voltak alacsonyabb agonista koncentrációk esetén (£10 µM). Magasabb koncentrációknál a T2 áram csökkent a T1-hez képest. A maximális hatást T1-nél már 100 µM NMDA-val elértük, 300 illetve 1000 µM NMDA adása esetén az áramok nem voltak tovább fokozhatók (9. ábra). Az AMPA hatásait hasonló körülmények között, de Mg2+-ot tartalmazó ACSF-ben vizsgáltuk. Ebben az esetben a maximális hatást nem értük el T1-nél 30 µM AMPA koncentrációig. Reprodukálható áramokat (T1 és T2) ebben az esetben is csak viszonylag alacsony agonista koncentrációk adása esetén (£3 µM) tapasztaltunk (9. ábra). A fentiek alapján a

Áram (pA)

további kísérletekhez 10 µM-os NMDA és 3 µM-os AMPA koncentrációt választottunk.

9.ábra Az NMDA és az AMPA dózis-hatás görbéje a striatum "medium spiny" interneuronjain.

39

A 10 µM NMDA által kiváltott sejtbe irányuló áramok (T1: -344,3±67,1 pA, T2: 330,1±61,5 pA, n=17, P>0,05) stabilan reprodukálhatók voltak, azonban az NMDA-ra adott válasz mértékét illetően az egyes sejtek nagy variabilitást mutattak, ezért az áramokat nem abszolút értékben dolgoztuk fel, hanem azokat a T1-hez viszonyítva normalizáltuk. Az adenozin A2A receptor agonista CGS 21680 (0,1 µM) 11 neuronból 7 esetében csökkentette az NMDA által kiváltott áramokat, a maradék 4 sejt esetén


azonban nem bizonyult hatékonynak (10. ábra).

10.ábra CGS 21680 hatása az NMDA áramokra a striatum "medium spiny" interneuronjain a/ Reprezentatív mérések (kontroll ill. a CGS 21680 hatása) b/ Összefoglaló diagram (* P<0,05, szignifikáns eltérés a kontrolltól)

40

Korábbi vizsgálatok hasonló jelenséget írtak le (128): a striatális neuronok kb. 20 %-án nem volt kimutatható a CGS 21680 (0,1 µM) gátló hatása, és ezt annak tulajdonították, hogy ezek a sejtek nem expresszálnak adenozin A2A receptorokat. Ezért azokat a sejteket, amelyek nem reagáltak a CGS 21680-ra legalább 15%-os gátlással, nem vettük figyelembe a további viszgálatok során (természetesen kivéve azokat az eseteket, amikor a CGS 21680 hatásának antagonizálhatóságát vizsgáltuk). Annak megállapítására, hogy a CGS 21680 hatásában feszültségfüggő ionáramok is szerepet játszanak-e, "voltage clamp" kísérleteket végeztünk + 30 mV "holding"


potenciál mellett (11. ábra)

11. ábra CGS 21680 hatása +30 mV-ra beállított potenciálérték esetén a/ Reprezentatív mérések (kontroll, ill. a CGS 21680 hatása) b/ Összefoglaló diagram (* P<0,05, szignifikáns eltérés a kontrolltól)

41

+ 30 mV-ra beállított membránpotenciál a sejtbe irányuló feszültségfüggő ionáramok csökkenéséhez vezet. Ráadásul a K+ csatornák blokkolására 125 mM Cs+-ot tartalmazó pipettaoldatot, illetve a perfúziós oldatban 20 mM tetraetilammóniumot, a Na+ csatornák blokkolására 0,5 µM tetrodotoxint, az L-típusú Ca2+ csatornák blokkolására pedig 10 µM nifedipint használtunk. Ilyen körülmények között 10 µM NMDA kétszer másfél percig alkalmazva, a két adag között 10 perc szünetet tartva, reprodukálható, kifelé irányuló áramokat váltott ki (T1: 286,4±53,2 pA; T2: 273,8±56,1 pA; n=5, P>0,05). 0,1 µM CGS 21680-t adva az extracelluláris oldathoz 5 perccel T2 előtt, és a második NMDA applikáció során, a vizsgált 8 neuronból 6 esetében gátló hatást tapasztaltunk, kettőt nem befolyásolt az adenozin A2A receptor agonista. A gátló hatás mértéke hasonló volt -80 és +30 mV-on (10. és 11. ábrák). Az ezt követő kísérletek mindegyikét - 80 mV-ra beállított potenciálon végeztük, a korábban részletezett időrendben adva az NMDA-t és a CGS 21680-at. Az adenozin A2A receptorok transzdukciós mechanizmusában az adenilcikláz/protein kináz A (PKA) lehetséges szerepét vizsgáltuk dibutiril cAMP-t (100 µM), a cAMP membrán permeabilis analógját a CGS 21680-nal együtt adva. Míg a CGS 21680 (0,1 µM) a dibutiril cAMP hiányában csökkentette az NMDA áramot, addig a cAMP analóg jelenlétében nem volt ilyen hatása (12. ábra). Néhány kísérletben az NMDA-t (10 µM) harmadszor is adtuk, újabb 10 perc múlva, és a dibutiril cAMP NMDA áramokra kifejtett hatását vizsgáltuk (a CGS 21680 jelenléte nélkül). A dibutiril cAMP (100 µM) potencírozta az NMDA áramot T1-T2 (49,2±10,7%-kal), és T1-T3 (44,3±11,9%-kal, n=7, P<0,05 mindkét esetben) vonatkozásban is. Ezután Sp-cAMPS-t (30 µM), a cAMP-dependens protein kináz A aktivátorát, illetve Rp-cAMPS-t (30 µM), az enzim inhibitorát a pipettaoldathoz adva végeztünk kísérleteket. Míg az Sp-cAMPS meggátolta, addig az Rp-cAMPS nem befolyásolta a CGS 21680 (0,1 µM) NMDA áramokat csökkentő hatását. Az ugyancsak intracellulárisan alkalmazott protein kináz A gátló 14-24 amid (PKI(14-24)amid; 10 µM) sem befolyásolta a CGS 21680 hatását (12. ábra).

42

Az NMDA által kiváltott áram gátlása (%)

12. ábra Az adenilcikláz/protein kináz A szerepének vizsgálata az adenozin-NMDA interakcióban a striatum "medium spiny" interneuronjain (* P<0,05, szignifikáns gátló hatás a kontrollhoz képest;


** P<0,05, szignifikáns eltérés a CGS 21680 gátló hatásától)

13.ábra A foszfolipáz C és a protein kináz C szerepének a vizsgálata az adenozin-NMDA interakcióra a striatum "medium spiny" interneuronjain (* P<0,05, szignifikáns gátló hatás a kontrollhoz képest; ** P<0,05, szignifikáns eltérés a CGS 21680 gátló hatásától)

43

Amikor a pipettaoldatba foszfolipáz C (PLC) gátló U-73122-t (10 µM) tettünk, a CGS 21680 (0,1 µM) NMDA (10 µM) áramokat gátló hatása megszűnt. Az U-73122 inaktív szerkezeti analógjának, az U-73343-nak (10 µM) nem volt ilyen hatása (13. ábra). Az extracellulárisan alkalmazott forbol 12-mirisztát 13-acetát (PMA, 0,1 µM), amely aktiválja a protein kináz C-t (PKC), illetve staurosporin (0,1 µM), amely az enzim gátlószere nem antagonizálta a CGS 21680 gátló hatását (13. ábra). Önmagában egyik anyag sem befolyásolta az NMDA áramokat. A pipettaoldathoz 10 mg/ml heparint adva, amely antagonizálja az inozitol 1,4,5triszfoszfátot (InsP3), a CGS 21680 NMDA áramokat gátló hatása eltűnt (14. ábra). Az intracelluláris Ca2+-ot a szokásos EGTA (11 mM) helyett a hatékonyabb BAPTA-val (5,5 mM) pufferelve ugyancsak megszűnt a CGS 21680 gátló hatása, csakúgy mint az extracellulárisan adott kalmodulin antagonista W-7 (30 µM) jelenlétében. Továbbá a citokalazin B (10 µM), amely fokozza az aktin depolimerizációját, ugyancsak felfüggesztette a CGS 21680 gátló hatását (14. ábra). W-7 (30 µM) önmagában nem


befolyásolta az NMDA áramokat.

14. ábra Az inozitol triszfoszfát/kalcium/kalmodulin rendszer szerepének vizsgálata az adenozin-NMDA interakcióra a striatum "medium spiny" interneuronjain (* P<0,05, szignifikáns gátló hatás a kontrollhoz képest; ** P<0,05, szignifikáns eltérés a CGS 21680 gátló hatásától)

44

A kalcineurin gátló deltametrin (0,5 µM), extracellulárisan alkalmazva, nem befolyásolta a CGS 21680 hatását, míg az intracellulárisan adott kalmodulin kináz II gátló CaM kinase II (281-309) (10 µM) vagy az extracellulárisan alkalmazott KN-93 (3 µM), ugyancsak a kalmodulin kináz gátlószere antagonizálták azt (15. ábra). A KN-93 inaktív szerkezeti analógja, a KN-92 (3 µM) nem volt hatással a CGS 21680 által kiváltott gátlásra. A deltametrin (0,5 µM) vagy a KN-93 (3 µM) nem fejtettek ki


hatást az NMDA (10 µM) által kiváltott áramokra CGS 21680 hiányában.

15. ábra A kalcineurin ill. a kalmodulin kináz II. szerepe az adenozin-NMDA interakcióban a striatum "medium spiny" interneuronjain (* P<0,05, szignifikáns gátló hatás a kontrollhoz képest; ** P<0,05, szignifikáns eltérés a CGS 21680 gátló hatásától)

AMPA (3µM) ismételt (10 percenkénti), 90 másodpercig tartó applikációja, a sejtbe irányuló

áramokat váltott ki, amelyek nem változtak szignifikánsan T1-ről

(-314,3±58,5 pA) T2-re (-297,6±47,6 pA; n=18; P>0,05) (16. ábra). Az adenozin (100 µM) sem az adenozin transzport gátló NBTG (30 µM) jelenlétében, sem annak hiányában nem befolyásolta az AMPA (3 µM) által kiváltott áramokat. Az adenozin A2A receptor agonista CGS 21680 (0,1 µM), valamint az adenozin A1 receptor agonista CCPA (10 µM) és ENBA (10 µM) szintén hatástalannak bizonyultak (16. ábra).

45


16. ábra Adenozin receptor agonisták hatása azAMPA által kiváltott áramokra a striatum "medium spiny" interneuronjain a/ Reprezentatív mérések (kontroll, ill. a CGS 21680 hatásának a hiánya) b/ Összefoglaló diagram

Kutatócsoportunk

további

vizsgálatokat

végzett

konfokális

fluoreszcens

mikroszkóppal a striatális "medium spiny" neuronok jellemzésére. Minden neuron a striatális principális sejtek ("medium spiny" neuronok) tipikus morfológiáját mutatta. A vizsgálatban szereplő 7 sejtből 5 esetében gátolta a CGS 21680 (0,1 µM) az NMDA (10 µM) által kiváltott áramokat, 2 esetben nem volt ilyen hatása. Összhangban ezzel a fukcionális eredménnyel az A2A receptor immunreaktivitás csak a CGS 21680 szenzitív sejteken volt megfigyelhető.

46

A striatumban végzett kísérleteink eredménye a következő pontokban foglalható össze: 1. Patkány striatum "medium spiny" interneuronjainak egy szubpopulációján (striatopallidális enkefalin-pozitív neuronok) A2A adenozin receptorok találhatók. 2. Ezek a receptorok, valószínűleg a foszfolipáz C/inozitol triszfoszfát/kalcium/ kalmodulin/kalmodulin kináz II rendszeren keresztül, negatívan modulálják az azonos sejteken lokalizált NMDA receptor csatornát. 3. A striatális adenozin A2A receptorok gátló hatása az NMDA receptorokra szelektív, az AMPA típusú excitátoros ionotrop receptorok funkcióit nem gátolják. Az eredmények és jelentőségük részletes megbeszélésére a 7.2-es pontban kerül sor. 6.3 Az etanol ionotrop glutamát receptorokra kifejtett hatása primer cortikális sejttenyészeten "Whole cell" patch clamp módszerrel meghatároztuk az NMDA koncentráció-hatás

Áram (pA)

görbéjét (17. ábra).

17. ábra Az NMDA koncentráció-hatás görbéje primer cortikális sejttenyészet neuronjain

47

Az NMDA-t túlnyomással működő gyors applikációs rendszer segítségével másfél percenként 2-2 másodpercig, emelkedő koncentrációban (1-1000 µM), adtuk egy-egy cortikális neuronra. A "holding" potenciál -70 mV volt. Az NMDA befelé irányuló áramokat váltott ki, jellegzetes csúccsal, amelyet egy plateau fázis követett. Az Imax -425 pA, az EC50 39,5 µM volt. A további kísérletekhez 100 µM NMDA koncentrációt választottunk, amelyet 2 másodpercig, másfél percenként ismételve adtunk. Ha az NMDA-t etanol jelenléte nélkül applikáltuk, a kiváltott válaszok 10 percen keresztül stabilan reprodukálhatók maradtak (4,3±3,3 %-os csökkenés; n=5, P>0,05). Amikor azonban három kontroll NMDA applikáció után az etanol hatását vizsgáltuk az NMDA áramokra, az etanolt egyre emelkedő koncentrációban adva (20-200 mM), az NMDA áramok koncentráció függő gátlása volt tapasztalható (18. ábra). 200 mM etanol az NMDA áramokat 61,6±10,7 %-kal csökkentette. Az etanol az NMDA áramok két komponensét, az áram csúcsát, illetve a plateau fázist megközelítőleg hasonló mértékben gátolta, amint azt kutatócsoportunk későbbi, részletesebb vizsgálatai is messzemenően igazolták (182). Ha ezután 4 percen keresztül ismét etanol-mentes oldatot alkalmaztunk, az NMDA által kiváltott áramok ismét megközelítették a kiindulási kontroll értéket. A 200 mM feletti

Normalizált NMDA áram

etanol koncentrációkat farmakológiailag irrelevánsnak tekintettük, és nem vizsgáltuk.

18. ábra 20-200 mM etanol hatása az NMDA áramokra primer cortikális sejttenyészet neuronjain (* P<0,05, szignifikáns eltérés a kontrolltól)

48

Az etanol gátló hatásának esetleges feszültségfüggését tanulmányozva 100 µM NMDA (2 másodpercig túlnyomással alkalmazva percenként) hatását vizsgáltuk etanol (100 mM) jelenlétében, és anélkül, különböző (-60 - + 60 mV) "holding" potenciálok mellett. Az áram-feszültség (I-V) görbék közel lineárisak voltak, a megfordulási potenciál megközelítően 0 mV-nak bizonyult. Sem a görbék alakja, sem a megfordulási

NMDA által kiváltott áram (pA)

potenciál értéke nem mutatott érdemi változást etanol hatására (19. ábra).

19. ábra Az etanol NMDA áramokra kifejtett gátló hatásának feszültségfüggése primer cortikális sejttenyészet neuronjain

A NMDA receptor csatorna magas Ca2+ permeabilitásának tükrében az etanol NMDA receptorokra kifejtett hatását "single cell" mikrofluorimetriás módszerrel is vizsgáltuk. Az NMDA (1-100 µM, másfél percig adva 10 percenként), a koagonista glicin (10 µM) jelenlétében, koncentráció függően emelte az intracelluláris Ca2+ koncentrációt. Maximális hatást 30 µM NMDA-val lehetett kiváltani, az EC50 kb. 10 µM volt. Ha 20 µM NMDA-t Ca2+-mentes, EGTA-t (1 mM) tartalmazó oldatban adtunk, az intracelluláris Ca2+ koncentráció gyakorlatilag nem emelkedett. A feszültségfüggő

Na+-csatornák 2+

feszültségfüggő Ca

blokádja

0,3

µM

tetrodotoxinnal,

illetve

a

csatornák blokádja 1 µM nitrendipinnel nem befolyásolta az

NMDA választ. Mindezek alapján úgy tekintettük, hogy a kísérleteinkben tapasztalt intracelluláris Ca2+ koncentráció emelkedés teljes mértékben az NMDA receptor

49

csatornán keresztül történő Ca2+ beáramlásnak köszönhető. 100 mM etanol a 20 µM NMDA által kiváltott választ kb. 40 %-kal csökkentette (20. ábra). 30 mM etanol ennél kisebb mértékű, hozzávetőlegesen 20 %-os gátlást okozott.

20. ábra Az etanol (EtOH) NMDA receptor funkcióra kifejtett gátló hatásának vizsgálata "single-cell" mikrofluorimetria segítségével primer cortikális sejttenyészet neuronjain A/ Reprezentatív mérés B/ Összefoglaló diagram (** P<0,05, szignifikáns eltérés a kontrolltól)

Az etanol cortikális neuronokra kifejtett hatásainak vizsgálata során tapasztalt legfontosabb eredményeink összefoglalva: 1. Az etanol, mind patch clamp módszerrel, mind "single-cell" mikrofluorimetriával vizsgálva, gátolja az NMDA receptor funkciót. 2. A gátlás közel egyenlő mértékben érinti az NMDA által kiváltott áramok csúcsát és plateau komponensét. 3. Az etanol NMDA receptorokra kifejtett hatása nem függ a membránpotenciál értékétől.

50

Az eredmények és jelentőségük részletes megbeszélésére a 7.3-as pontban kerül sor. 6.4 Az etanol és a triklóretanol P2X3 receptorokra kifejtett hatásai humán P2X3 receptorokkal transzfektált HEK 293 sejteken "Whole cell" patch clamp kísérletekben, -70 mV-ra beállított potenciálérték mellett, a purinoceptor agonista α,β-meATP (3 és 10 µM) sejtbe irányuló áramokat váltott ki humán P2X3 receptorokkal transzfektált HEK 293 sejteken. Ismert, hogy a P2X3 receptorok gyors deszenzitizációt mutatnak (145). Kontroll kísérleteink alapján azonban világossá vált, hogy hat (T1-T6), egymást 5 percenként követő 1 másodpercig tartó a,b-meATP applikáció, a fenti koncentrációkban, stabilan reprodukálható áramokat eredményez. Mindazonáltal az egyes vizsgált sejtek nagyon eltérő érzékenységet mutattak az agonistára (25-1500 pA-es áram 3 µM, és 200-4000 pA-es áram 10 µM a,b-meATP esetén), ezért az egyes mérési eredményeket a második, az alkoholok adását megelőző kontroll áram (T2) százalékában fejeztük ki, és értékeltük. Az etanol (100 mM) nem gátolta szignifikáns mértékben a 10 µM a,b-meATP által kiváltott áramokat. Az agonista által kiváltott áram az utolsó kontroll áramhoz képest, 2 és 7 perccel az etanol adásának elkezdése után, 96,98±9,2% (T3) illetve 97,9±12,47% (T4) volt. Ezzel szemben 3 mM triklóretanol szignifikáns gátló hatást mutatott (T3-nál, illetve T4-nél az agonista által kiváltott áram a kontrollhoz képest 58,16±6,41% illetve 64,25±7,74%. 5 percig tartó kimosás után az áramok a kiindulási érték 86,38±5,52%-ára tértek vissza (21. ábra). Alacsonyabb (3 µM) a,b-meATP koncentráció esetén a triklóretanol (3 mM) gátló hatása még kifejezettebbnek bizonyult (az agonista által kiváltott áram a kontrollhoz képest

T3-nál

3,1±2,17%,

és

T4-nél

2±2,03%

volt,

azaz

a

gátlás

közel

100 %-os). 10 perc kimosás után a gátlás részleges megszűnése volt megfigyelhető (T6: 64,7±7,5% a kontroll százalékában). Bár az etanol (100 mM) 7 perc perfúzió után enyhén csökkentette az a,b-meATP által kiváltott áramot, ez a csökkenés nem bizonyult szignifikánsnak (T3: 100,08±7,42%; T4: 92,93±9,77%, a kontroll százalékában).

51

Áram (a T2 %-ában) Áram (a T2 %-ában)

21. ábra A triklóretanol (TCE) (A; reprezentatív mérés, és összefoglaló diagram; * P<0,05: szignifikáns eltérés T2 kontrolltól), és az etanol (B) hatása a P2X3 receptor funkcióra humán P2X3 receptorral transzfektált HEK 293 sejteken

Összefoglalva az etanol és a triklóretanol P2X3 receptorokra kifejtett hatásait vizsgáló kísérleteinket, megállapíthatjuk, hogy 1. a

triklóretanol

erőteljesen

csökkentette

a

humán

P2X3

receptorok

konduktanciáját HEK 293 sejtekben, és 2. az etanol nem fejtett ki ilyen erős gátló hatást. Az eredmények és jelentőségük részletes megbeszélésére a 7.4-es pontban kerül sor.

52

7. MEGBESZÉLÉS 7.1 Az ionotrop glutamát receptorok modulációja a prefrontális cortex V. rétegének piramissejtjein A kísérleteink alapján megállapítható legfontosabb tények: a patkány prefrontális cortex V. rétegének piramissejtjei funkcionális metabotrop P2Y receptorokat tartalmaznak, amelyek pozitív interakciót mutatnak az NMDA típusú ionotrop glutamát receptorokkal. Kísérleteinkben az ATP, amely szinaptikus hatásait P2 receptorokon keresztül fejti ki, potencírozta az NMDA által kiváltott áramokat. Közismert tény, hogy az ATP-t szöveti nukleotidázok lebontják (48). Jelen tanulmány is részletez egy olyan interakciót (128, 181), melyben az adenozin, az ATP fő metabolitja, A2A adenozin receptorokon keresztül, szelektíven befolyásolja az NMDA áramokat egy másik agyterületen, a striatumban. Jelen esetben azonban három további megfigyelés azt igazolta, hogy az ATP, és nem lebomlási terméke(i) felelősek a tapasztalt hatásért. Egyrészt az adenozin önmagában nem befolyásolta az NMDA által kiváltott áramokat a prefrontális cortexben, még abban az esetben sem, ha a nukleozid felvételi mechanizmusokat NBTG-vel gátoltuk. Erre azért volt szükség, mert ilyen felvételi helyek egyébiránt jelentős szerepet tölthetnek be a központi idegrendszerben, és jelentősen csökkenthetik az adenozin hatékonyságát (62). Másrészt mind az a,b-meATP, mind a 2-MeSATP, két olyan ATP-analóg, amelyek a szöveti hidrolízissel szemben az ATP-nél ellenállóbbak (145), az ATP-vel összemérhető nagyságú potencírozó interakciót mutattak. A harmadik érvet az ATP, és nem az adenozin által kiváltott hatás mellett akkor tapasztaltuk, amikor szelektív P2 receptor antagonisták hatását vizsgáltuk. Mind a suramin, mind a PPADS olyan szelektív antagonisták, amelyek segítségével nagy biztonsággal különbséget lehet tenni az ATP által aktivált P2 receptor mediált és az adenozin-szelektív P1 (A) receptorokon keresztül létrejött hatások között (49, 92). Mindazonáltal a suramin esetében irodalmi adatok azt jelzik, hogy a suramin a GABA és az NMDA receptorokra is gátló hatással van (6, 122, 137). Mindezt kísérleteinkben mi is tapasztaltuk: a suramin csökkentette az NMDA áramok amplitudóját a prefrontális cortex piramissejtjeiben. Ezért a suraminnal végzett kontroll kísérleteinket alapul véve

53

az ATP vizsgálatát olyan kísérleti elrendezés szerint végeztük, amikor a suramin már nincs további befolyással az NMDA áramokra, és így ez a hatás nem akadályozza a P2 és P1 receptorok közötti differenciálást. Az antagonisták alkalmazásával kapcsolatban problémát jelentett az is, hogy nagy dózisban további nem szelektív hatásokat írtak le mindkét vegyület esetében. A suramin a G-protein kapcsolt reakciókat befolyásolhatja (10), míg a PPADS az IP3 által kiváltott Ca2+-mobilizációt gátolhatja (168). Mindkét folyamat szerepet játszhat a purinoceptor jelátviteli mechanizmusban, ezért, hogy a fenti nem szelektív hatásokat elkerüljük, az antagonisták dózisát nem emeltük addig, amikor a fenti nem szelektív hatások már zavarhatják a receptorszelektivitás megítélését. Ez lehet a magyarázata annak, hogy - bár mindkét antagonista szignifikáns mértékben csökkentette az ATP potencírozó hatását az NMDA áramokra - annak teljes gátlását egyik antagonistával sem sikerült elérni. Mindazonáltal a suramin és a PPADS egyöntetű gátló hatása az ATP által kiváltott facilitációra, az adenozin hatásának hiánya, valamint a stabil ATP analógok hatásossága, együttesen erős érveket szolgáltatnak amellett, hogy a megfigyelt potencírozó szinergizmus az ATP és az NMDA között ATP által aktivált P2 purinoceptokon keresztül jön létre. A P2 purinoceptor agonisták prevagy posztszinaptikusan lokalizált receptoron keresztül is befolyásolhatják a glutamáterg transzmissziót. Több közleményben is leírták, hogy preszinaptikus P2X receptorok, a glutamáterg neuronok axon terminálisán elhelyezkedve, fokozzák a transzmitter felszabadulását (30, 76, 81). A glutamát felszabadulás fokozódását a Ca2+-ra permeábilis P2X receptorokon keresztül történő Ca2+

beáramlás

váltja ki (68). Nincs irodalmi adat esetleges glutamáterg

idegvégződésen elhelyezkedő preszinaptikus P2Y receptorról. Centrális noradrenerg, dopaminerg és szerotoninerg idegvégződéseken azonban leírtak gátló jellegű P2Y receptorokat (165, 170, 171). A fent említett irodalmi adatokhoz képest jelen kísérleteink facilitátoros posztszinaptikus P2 receptorok jelenlétét igazolták a prefrontális cortex V. rétegének glutamáterg piramissejtjein. Az ATP NMDA áramokra kifejtett facilitáló hatása akkor is megfigyelhető maradt, amikor a vizsgált piramissejtet tetrodotoxin, vagy Ca2+-mentes perfúziós oldat segítségével szinaptikusan izoláltuk a környező interneuronoktól. Ezért kijelenthetjük, hogy a moduláló funkciójú P2 receptorok is a piramissejteken találhatók, ahol kölcsönhatásba lépnek a környező NMDA receptorokkal.

54

Már a kísérletek kezdetétől nem tartottuk valószínűnek posztszinaptikus P2X receptorok részvételét a megfigyelt interakcióban, mivel az ATP, és analógjai nem befolyásolták a memrán potenciált, és az általunk alkalmazott mérési módszerrel nem váltottak ki detektálható áramot a prefrontális cortex piramissejtjein. Később sikerült a P2Y receptorok részvételét egyértelműen bizonyítani, amikor a GTP-t GDP-b-S-sel, vagy GTP-g-S-sel helyettesítettük a pipettaoldatban. A GDP-b-S a G-protein kapcsolt reakciók gátlója, míg a GTP-g-S egy nem hidrolizálódó GTP analóg, amely aktiválja a G proteineket (159). A GDP-b-S szignifikáns mértékben gátolta az ATP által az NMDA áramokra kifejtett potencírozó hatást, jelezve, hogy az G-protein kapcsolt receptoron keresztül jön létre. Mindezek alapján azt vártuk, hogy a pipettaoldatban a kísérlet teljes időtartama alatt jelen levő, GTP-g-S is hasonló hatással lesz, tekintettel arra, hogy a G-proteinek érintettsége esetén az ATP egy G-protein kapcsolt receptoron keresztül valószínűleg már nem tudja tovább fokozni az aktivált G-proteinek által már eleve fokozott NMDA áramokat. Kísérleteink ezt igazolták, hiszen a GTP-g-S jelenlétében az ATP által kiváltott hatás lényegesen kisebb volt a normál, GTP-tartalmú, pipettaoldattal megfigyelthez képest. Mindezek egyértelműen igazolták a P2Y purinoceptorok szerepét a megfigyelt potencírozó kölcsönhatásban. A metabotrop P2Y receptorok G-proteinhez kapcsolva elsősorban a foszfolipáz C-t aktiválják, inozitol 1,4,5-triszfoszfát képződéséhez, és az intracelluláris Ca2+ mobilizálásához vezetve (48). Néhány P2Y receptor esetén az adenilát ciklázhoz, a foszfolipáz D-hez, és a foszfolipáz A2-höz történő kapcsolódást is leírtak (82). Ezen transzdukciós mechanizmusok valamelyike lehet felelős az NMDA áramokat potencírozó hatásért a prefrontális cortex piramissejtjeiben. Az interakcióban résztvevő P2Y receptor altípus minden kétséget kizáró farmakológiai klasszifikálása - elsősorban nagy szelektivitású receptor altípus specifikus agonisták és antagonisták hiányában - nem volt lehetséges. Azt tartjuk a legvalószínűbbnek, hogy a vizsgált piramissejteken az ATP és az UTP szenzitív P2Y2 receptorok együtt vannak jelen az ATP és 2-MeSATP szenzitív P2Y1-szerű receptorokkal (173), amely utóbbiak azonban nem reagálnak ADP-b-S-re, a klasszikus agonistájukra (145). A PPADS gátló hatása szintén arra utal, hogy a P2Y1 receptor altípus szerepet játszik az interakcióban. További - nem várt - megfigyelés, hogy az a,b-meATP és a 2-MeSATP megközelítőleg egyformán hatékonynak bizonyultak. Az

55

a,b-meATP-ről az ismeretes irodalmi adatként, hogy rekombináns P2X1 és P2X3 homomereket (145), illetve P2X4/X6 heterooligomereket aktivál (94). Azonban újabb funkcionális adatok azt jelzik, hogy az a,b-meATP stimulálhat atípusos P2Y receptorokat is, pl. astrocytákban (1). A ligand által szabályozott kation csatornákról, mint az NMDA receptorról is, kimutatták, hogy protein foszforiláció szabályozza funkcióikat, és olyan konszenzus szekvenciákat tartalmaznak, amelyeket protein kinázok foszforilálni képesek (118, 163). Különböző G-protein kapcsolt receptorokról kimutatták, hogy az NR1 vagy az NR2 alegységet foszforilálva fokozzák az NMDA receptor funkciót. Dopamin a D1 receptorokon, a cAMP/PKA reguláló mechanizmuson keresztül fokozhatja az NMDA áramokat (38). Jelen kísérleteinkben nem vizsgáltuk a P2Y receptorok jelátviteli mechanizmusát, de a megfigyelt interakcióban lehetségesnek tartjuk a PKC vagy a kalmodulin kináz II részvételével történő foszforilációt is. Dopaminerg idegvégződésekből lehetséges az ATP és a dopamin együttes felszabadulása (89). A ventrális tegmentumból a prefrontális cortex V. rétegének piramissejtjei dopaminerg projekcióval rendelkeznek (91). A prefrontális cortex V. rétegének piramissejtjein a glutamáterg és a dopaminerg axon terminálisok közeli elhelyezkedése lehet a morfológiai alapja egyrészt egy esetleges kölcsönhatásnak az NMDA és a D1 receptorok között (27), másrészt az NMDA és a P2Y receptorok közötti interakciónak (jelen tanulmány). Az NMDA receptorok tónusos aktivitása kulcsszerepet játszhat a prefrontális cortex sokrétű működésében, mint ahogy a prefrontális cortex glutamáterg neurotranszmissziójának csökkenése a kognitív funkciók károsodásához vezet (167). Az LTP, a tanulás lehetséges sejtszintű modellje, az NMDA receptorok használatfüggő plaszticitását feltételezi és igényli (17). A prefrontális cortex az egyik olyan agyterület, ahol a legdrámaibb változások történnek a stimuláns és az opioid típusú kábítószerek által létrehozott ún. "reinforcing" hatás során (87). Mindezek értelmében a P2Y receptorok, a feltárt interakció révén, szerepet játszhatnak a magasabb rendű kognitív funkciók, mint a tanulás és a memória finom szabályozásában. Az interakció ismerete új utakat nyithat meg a prefrontális cortex működését is potenciálisan

érintő

kognitív

diszfunkciók,

valamint

a

gyógyszerabúzus

mechanizmusának pontosabb feltérképezésében és elvezethet a problémák új támadáspontokon történő farmakológiai megközelítéséhez. Az eredmények ismeretében

56

fontosnak tartjuk a prefrontális cortex piramissejtjeinek további morfológiai és funkcionális tipizálását, tekintve, hogy a megfigyelt interkcióban csak a piramissejtek egy szubpopulációja vett részt, és ez a tény eddig ismeretlen fiziológiai jelentőséggel bírhat. 7.2 Az ionotrop glutamát receptorok modulációja a striatum "medium spiny" interneuronjain Kísérleteinkben a striatális "medium spiny" interneuronokon mind az NMDA, mind az AMPA a sejtbe irányuló kation áramot hozott létre, de csak az NMDA hatását gátolta az adenozin A2A receptor agonista CGS 21680 (79). A CGS 21680 hatása az NMDA receptor csatorna direkt modulációjának a következménye volt, hiszen az agonista egyformán hatékony volt -80 mV-ra, és +30 mV-ra beállított membránpotenciál értékek esetén. + 30 mV-on feszültségfüggő áramok kevésbé befolyásolják az exogén NMDA által kiváltott válaszokat, ráadásul e potenciálérték mellett különböző csatorna blokkoló anyagokkal (intracelluláris Cs+, extracelluláris tetrodotoxin, tetraetilammónium és nifedipin) a feszültségfüggő K+, Na+ és az L-típusú Ca2+ csatornákat is blokkoltuk. Függetlenül a fenti kísérleti körülményektől a CGS 21680 nem bizonyult hatékonynak a vizsgált idegsejtpopuláció kb. 25 %-án. Konfokális fluoreszcens hisztokémia segítségével igazolható volt, hogy a CGS 21680-szenzitív sejtek tartalmaznak A2A receptorokat, míg a CGS 21680-inszenzitív sejtek valószínűleg nem rendelkeznek ezzel a receptortípussal (181). A hisztokémiai adatok, valamint a CGS 21680 hatásának antagonizálhatósága az A2A antagonista 8-(3-klorostiril) koffeinnel, de nem az A1 antagonista DPCPX-xel, egyértelműen igazolták a modulátoros A2A adenozin receptorok jelenlétét a striatális "medium spiny" neuronok egy részén (128). Ugyanakkor az adenozin A1 receptor agonisták nem modulálták az NMDA áramokat (128). Mivel az A2A receptorokról ismert, hogy csak a striatum striatopallidális output neuronjain vannak jelen (151), úgy gondoljuk, hogy a CGS 21680 ezen a sejtpopuláción hatott. Az NMDA által kiváltott áramokkal szemben az AMPA áramok nem voltak érzékenyek sem a CGS 21680-ra, sem két szerkezetileg eltérő adenozin A1 receptor agonistára, a CCPA-ra, illetve az ENBA-ra. Sőt az endogén agonista adenozin,

57

önmagában is hatástalannak bizonyult az AMPA áramokra, még akkor is, ha a nukleozid uptake gátló NBTG-vel kombináltuk. A transzport gátló vegyület alkalmazása szükséges volt az adenozin hatástalanságának bizonyításához, mivel a nukleozid uptake helyek nagy számban vannak jelen a striatumban, és nagymértékben csökkenthetik az agonista hatékonyságát (62). A G proteinek gátlása GDP-b-S-sel (159) felfüggesztette a CGS 21680 hatását az NMDA áramokra, jelezve, hogy az A2A receptor G proteinekhez kapcsolt (128). Az A2A receptorról ismert, hogy Gs típusú G proteinhez kapcsolt, amely az adenilcikláz/protein kináz A reakcióutat aktiválja (59). Ez lehet legtöbb központi idegrendszeri excitátoros hatásának a mechanizmusa (109). Kísérleteink azonban azt mutatták, hogy az adenozin A2A receptor NMDA receptor csatorna funkciót moduláló hatása a fentiektől különböző transzdukciós mechanizmuson keresztül jön létre. Mindazonáltal a receptor foszforilációja - mint ahogy ez a glutamát receptorok modulálása esetén gyakran megfigyelhető (lásd fent) - az interakcióban valószínűleg központi szerepet játszik. Kísérleteinkben azt tapasztaltuk, hogy a cAMP membrán permeabilis analógja, a dibutiril cAMP, amely aktiválja a protein kináz A-t, fokozta az NMDA áramot. A protein kináz C aktivátora, a PMA, illetve az enzim nem szelektív gátlószere, a staurosporin nem bizonyult hatásosnak. Tehát míg a protein kináz A pozitívan modulálja az NMDA áramokat a striatum "medium spiny" interneuronjain, addig a protein kináz C-nek nincs ilyen hatása. Egyik kináz sem volt azonban érintett a CGS 21680 gátló hatásában. Amennyiben a CGS 21680 az adenilcikláz/protein kináz A-n keresztül hatott volna kísérleteinkben, inkább potencíroznia, és nem gátolnia kellett volna az NMDA által kiváltott áramokat. Továbbá a dibutiril cAMP és a CGS 21680 kombinációjának additív, és nem antagonista hatást kellett volna kiváltania. Ezek a feltételek nem teljesültek, ami az adenilcikláz/protein kináz A részvétele ellen szólt a CGS 21680 hatásában. További eredményeink is ezt a feltételezést támogatták: a protein kináz A aktivátora, az Sp-cAMPS felfüggesztette a CGS 21680 NMDA áramot gátló hatását, míg az enzim két gátlószere, az Rp-cAMPS, és a PKI(14-24) amid, nem befolyásolták azt. Mivel sem a PMA, sem a staurosporin nem volt hatással a CGS 21680 által kiváltott gátlásra, a protein kináz C részvételét is kizártuk a transzdukciós folyamatban.

58

Figyelmet érdemel, és magyarázatot kíván, hogy míg a protein kináz C aktiválása nem befolyásolta, addig a protein kináz A aktiválása felfüggesztette a CGS 21680 hatását. Ez a megfigyelés annak a következménye lehet, hogy mind a dibutiril cAMP, mind az Sp-cAMPS fokozta az NMDA receptor csatorna konduktanciáját, míg a CGS 21680, bár más mechanizmussal, csökkentette azt. A tapasztalt összesített hatás tehát véleményünk szerint egy funkcionális antagonizmus eredményeként jött létre. További kísérleteink ugyanis arra derítettek fényt, hogy a striatumban található adenozin A2A receptorok valószínűleg a foszfolipáz C/inozitol triszfoszfát/Ca2+ kalmodulin/kalmodulin kináz II rendszeren keresztül modulálják az NMDA receptor csatornát (22. ábra). Mivel a foszfolipáz C gátlószere, az U-73122 felfüggesztette, míg inaktív analógja, az U-73343 nem befolyásolta a CGS 21680 NMDA áramokra kifejtett hatását, arra következtettünk, hogy első lépésként az adenozin A2A receptor aktiválás a foszfolipáz C G-protein mediált aktiválásához vezethet a striatum "medium spiny" interneuronjain. További vizsgálataink során a heparin, amely gátolja az inozitol triszfoszfát kötését annak kötőhelyéhez, valamint az intracelluláris Ca2+ hatékonyabb pufferolása EGTA helyett BAPTA-val felfüggesztette a CGS 21680 gátló hatását. Ebből arra következtettünk, hogy a foszfolipáz C aktiválása kísérleteinkben inozitol triszfoszfát képződésén keresztül az intracelluláris Ca2+ felszabadulásához vezetett. Az NMDA receptorok a plazmamembránhoz kötődve ún. "clusterek" formájában lokalizálódhatnak (179); az NR1 alegység a-aktinin-2 által történő kötődése az aktinhoz alapvető fontosságú a citoszkeletonnal történő interakcióhoz, és a megfelelő receptor funkcióhoz (186). Az NMDA receptorok Ca2+-függő inaktivációja (95), amelyet az aktin depolimerizációjának citokalazin B által kiváltott fokozódása elősegít (149), az aaktinin-2 a receptor NR1 alegységéről Ca2+/kalmodulin által történő kompetitív leszorításának a következménye lehet (186). Mindezekkel tökéletes összhangban kísérleteinkben mind a kalmodulin antagonista W-7, mind a citokalazin B felfüggesztette az NMDA áramok CGS 21680 által kiváltott gátlását. A Ca2+/kalmodulin azonban, a kalmodulin NR1 alegységen levő kötőhelyén kifejtett hatásán kívül, a kalmodulin kináz II-n keresztül, az NR2B alegység ezt követő foszforilációja által is befolyásolhatja az NMDA receptor funkciót (130). Összhangban ez utóbbi feltételezéssel, kísérleteinkben a kalmodulin kináz II két gátlója, a CaM kinase II (281-309) és a KN-93 felfüggesztette a CGS 21680 hatását, míg az inaktív szerkezeti

59

analóg, a KN-92 nem befolyásolta azt. Bár a kalmodulin kináz II foszforilációs helyét pontosan meghatározták az NMDA receptoron (130), nem ismert, milyen módon befolyásolja hatása annak funkcióit (28). Eredményeink azt mutatják, hogy az A2A receptor stimulálása a kalmodulin kináz II aktiválásához vezethet, amelynek következménye az NMDA receptor csatornán keresztüli kation konduktancia csökkenése (22. ábra). Adenozin Glutamát

22. ábra Az A2A adenozin receptorok NMDA receptorokat gátló hatásának jelátviteli mechanizmusa a striatum "medium spiny" interneuronjain. A receptor G proteinhez kapcsolt (GDP-b-S antagonista hatása); aktiválja a PLC/InsP3/Ca2+/kalmodulin /CaM kináz II reakcióutat (PLC gátló U-73122, InsP3 kötödését gátló heparin, Ca2+-ot megkötő BAPTA, kalmodulin antagonista W-7 és citokalazin B, valamint a kalmodulin kináz II-t gátló CaM kinase II 281-309 és KN-93 antagonista hatása); de nem aktiválja a PLC/DAG/PKC (a PKC aktivátor PMA és gátló staurosporin hatásának a hiánya), valamint az adenilcikláz/PKA (a cAMP analóg dibutiril cAMP és a PKA aktivátor Sp-cAMPS funkcionális antagonista hatása, a PKA gátló Rp-cAMPS és a PKI 14-24amid hatástalansága) reakcióutakat.

A Ca2+/kalmodulin rendszer protein foszfatázokat is aktiválhat. Közülük a legfontosabb, a kalcineurin, antagonizálhatja a protein kináz A NMDA receptort tónusos aktivitással foszforiláló és ezáltal konduktanciáját fokozó hatását (102, 146).

60

Jelen kísérleteinkben azonban a kalcineurin gátló deltametrin nem befolyásolta a CGS 21680 hatását, továbbá sem a deltametrin, sem a KN-93 nem befolyásolták az NMDA kiváltott áramokat, amikor CGS 21680 jelenléte nélkül vizsgáltuk az NMDA receptor funkcióra kifejtett hatásukat. Tehát eredményeink alapján a kalcineurin szerepét az A2A és az NMDA receptorok közötti interakcióban nem tartjuk valószínűnek, mint ahogy azt sem, hogy az általunk vizsgált sejtekben az NMDA receptorok a kalcineurin vagy a kalmodulin kináz II tónusos kontrollja alatt állnak. A striatum "medium spiny" neuronjain végzett patch clamp kísérleteink eredményeit összefoglalva azt állapíthattuk meg, hogy az adenozin A2A receptorok a neuronok striatopallidális csoportján találhatók meg, ahol gátolják az NMDA, de nem befolyásolják transzdukciós

az

AMPA

receptor

mechanizmusa

a

csatornák foszfolipáz

konduktanciáját. C/inozitol

Az

interakció

triszfoszfát/kalcium/

kalmodulin/kalmodulin kináz II útvonal. Az adenilcikláz/protein kináz A és a diacilglicerol/protein kináz C rendszerek nem érintettek a kölcsönhatásban. A striatum "medium spiny" interneuronjai két divergens efferens pályát hoznak létre a bazális ganglionok output magvai felé (a globus pallidus belső szegmense, és a substantia nigra pars reticularis; 135). Létezik egy direkt út, amelyet a P anyag pozitív sejtek hoznak létre, és egy indirekt pálya, amelyet az enkefalin pozitív sejtek alkotnak. Ez utóbbi rendszer további részét képezik a globus pallidus külső szegmensében levő, a subthalamikus magvakba projektáló neuronok, valamint a subthalamikus magvakat az output magvakkal összekötő rostok (135). A direkt pálya aktivitása fokozza, míg az indirekté csökkenti a lokomotoros viselkedést. A kísérleteinkben feltárt interakció alapján a striatális adenozin A2A receptorok agonistái valószínűleg szelektíven gátolják az enkefalin-pozitív "medium spiny" neuronokba (indirekt pálya) a kéreg felől érkező cortikostriatális serkentő excitátoros aminosav transzmissziót. Ezáltal csökkenthetik az extrapyramidális rendszer zavaraiban, pl. a Parkinson kórban kialakuló lokomotoros depressziót. Az A2A receptorok aktiválásának egy másik következménye lehet azonban a lokomotoros depresszió fokozása, mivel korábbi tanulmányok azt mutatták, hogy ezen receptorok ugyancsak antagonista interakciót mutatnak a, szintén az enkefalin-pozitív neuronokon lokalizált, D2 dopamin receptorokkal (56, 148). Mindezek alapján az adenozin receptorokon ható szerek potenciálisan új terápiás lehetőségeket nyithatnak meg az extrapyramidális rendszer betegségei, mint pl. a Parkinson kór (148)

61

kezelésében, és hozzájárulhatnak a rendszer zavarait létrehozó egyéb kóros állapotok (pl. opioidok hatása) farmakológiai befolyásolásához. Mivel azonban az adenozinnak, jelenlegi ismereteink birtokában, bonyolult finom-szabályozó szerepe van a bazális ganglionok transzmitterrendszereinek aktivitásában, és eredő hatása az egymással szemben ható moduláló funkciók egyensúlyán múlik, in vivo hatásainak felmérése fokozott körültekintést kíván. Mindazonáltal, ha a fenti moduláló funkciókat pontosabban megismerjük, az extrapyramidális rendszer kóros állapotaiban az ismert terápiás

lehetőségek

mellett

az

adenozin

transzmissziót

is

befolyásolva,

hozzájárulhatunk az eredeti funkciális aktivitás minél pontosabb helyreállításához. 7.3 Az etanol ionotrop glutamát receptorokra kifejtett hatása primer cortikális sejttenyészeten Kísérleteinkben primer cortikális idegsejttenyészet neuronjain az NMDA befelé irányuló áramokat hozott létre patch clamp kísérletekben, és az intracelluláris Ca2+ szint emlekedését váltotta ki "single cell" mikrofluorimetriás módszert alkalmazva. Mindkét módszerrel vizsgálva az etanol gátolta az NMDA által kiváltott válaszokat, amely összhangban van az irodalmi adatokkal (14, 106, 138, 140, 142, 185). Az NMDA receptoroknak az etanol gátló hatásával szembeni érzékenységét meghatározhatja a receptorok alegység összetétele. Az etanol gátló hatása korrelál a nem kompetitív NMDA antagonista ifenprodil hatásával, amelyről ismert, hogy az NR1 és NR2B alegységből alló NMDA receptorokon kialakult válaszokat gátolja, míg az NR1, NR2A összetételű receptorokra nem hat (105, 180). Rekombináns NMDA receptorokon végzett tanulmányok azt mutatták, hogy az etanol elsősorban olyan heteromereken hat, amelyek vagy az NR2A, vagy az NR2B alegységet tartalmazzák, szemben azokkal a receptorokkal, amelyekben az NR2C alegység van jelen (37, 90). Ez utóbbi eredményekkel tökéletes összhangban van az a megfigyelés, miszerint az általunk vizsgált cortikális idegsejttenyészet neuronjai szinte kizárólag NR2A és NR2B receptor alegységeket expresszálnak, ezzel szemben az NR2C alegység expressziója minimális (183). Irodalmi adatokból ismert, hogy az etanol valószínűleg nem a glutamát felismerési helyen fejti ki gátló hatását az NMDA receptor funkcióra, míg a glicin kötőhellyel

62

kapcsolatban ellentmondó közlemények láttak napvilágot (46). Ugyancsak ismert adat, hogy az etanol és a Mg2+ különböző helyen fejtik ki csatornát blokkoló hatásukat (37, 140). Létezik az NMDA antagonistáknak egy olyan csoportja, mint pl. a hallucinogén fenciklidin, az intravénás anesztetikum ketamin, valamint az amantadin, a memantin és a dizocilpin (MK-801), amelyeket ún. nyitott csatorna blokkolóknak nevezünk (44, 116, 169). "Single channel" patch clamp kísérletek azonban nem igazolták az etanol hasonló mechanizmussal létrejövő hatását (185). Saját "whole cell" kísérleteinknek eredményei szintén a nyitott csatorna blokád ellen szóltak. Amikor az NMDA-t patch clamp kísérleteinkben túlnyomásos rendszer segítségével adtuk, a kiváltott áramoknak két összetevője volt megfigyelhető: egy csúcs, és egy azt követő plateau fázis. A csúcs a csatorna nyitását közvetlenül követő, az ekvilibriumot megelőző állapotot jellemzi, amelynek amplitudóját különböző tényezők határozzák meg, mint pl. az agonista kötődése és disszociációja, a csatorna nyitás mértéke és a receptor deszenzitizáció kialakulásának kezdete (143). A steady-state áram mértéke a receptor csatorna nyitott, zárt, és deszenzibilizált állapotai közötti egyensúly függvénye (12). Egy nyitott csatorna blokkolóra az jellemző, hogy sokkal nagyobb mértékben gátolja az áram plateau komponensét, mint a csúcsát (136). Kísérleteinkben nem ezt tapasztaltuk, ahogy ezt a megfigyelést kutatócsoportunk későbbi, részletesebb vizsgálatai is igazolták (182). További kísérleteink azt mutatták, hogy az etanol NMDA receptorokra kifejtett gátló hatása nem függ a membránpotenciál értékétől. Az NMDA válaszok áramfeszültség összefüggése Mg2+-mentes környezetben etanol jelenléte nélkül gyakorlatilag lineáris volt, 0 mV körüli megfordulási potenciállal. Etanol nem változtatta meg sem a görbe alakját, sem a megfordulási potenciált. Az

NMDA

receptorok

szerepe

valószínűsíthető

olyan

etanol

hatások

kialakulásában, mint a kognitív deficit, a Wernicke-Korsakoff szindróma, a cerebelláris degeneráció, a cerebrális atrófia és a fetális alkohol szindróma. Az etanol függőség során kimutatható a glutamát receptorok upregulációja (166). Ezért az etanol ionotrop glutamát receptorokra kifejtett hatásmechanizmusának tisztázása további erőfeszítéseket kíván. Ez elvezethet olyan gyógyszerek kifejlesztéséhez, amelyek hatékonyabb farmakológiai beavatkozási lehetőséget jelenthetnek az alkoholizmus terápiájában. Ezek első képviselője lehet az acamprosat (NMDA receptor modulátor a poliamin kötőhelyen), amelynek alkalmazása az alkoholistákon végzett első tanulmányok alapján

63

szignifikánsan csökkenti a relapszus valószínűségét (33). 7.4 Az etanol és a triklóretanol P2X3 receptorokra kifejtett hatásai humán P2X3 receptorokkal transzfektált HEK 293 sejteken Kísérleteinkben a triklóretanol erőteljesen csökkentette a humán P2X3 receptorok konduktanciáját a HEK 293 sejtekben, míg az etanol nem rendelkezett ezzel a hatással. Korábbi irodalmi adatok is arra utalnak, hogy az etanol sokkal kevésbé hatékony a triklóretanolnál a ligand által aktivált csatornákra kifejtett hatást illetően (58, 139). Ez a különbség talán arra vezethető vissza, hogy a triklóretanol az etanolnál zsíroldékonyabb vegyület, és ezért nagyobb koncentrációt ér el a biológiai membránokban. A szedato-hipnotikumként még ma is használt gyógyszer, a klorálhidrát terápiás alkalmazását követően fő metabolitja, a triklóretanol szintje a vérben eléri a millimoláris nagyságrendet (132). Ezért a triklóretanol P2X3 receptorokat erőteljesen gátló hatásáról kijelenthetjük, hogy az farmakológiailag releváns koncentrációban következett be. Figyelmet érdemel, hogy a klorálhidrátról leírták azt, hogy említésre méltó analgéziát hoz létre, amely egyik lehetséges mechanizmusa a fájdalom transzmissziójának megszakítása a gerincvelő hátsó gyöki ganglionjaiban (57). Ezek a ganglionok nagy mennyiségben tartalmaznak P2X3 receptorokat, amelyek ezáltal a nocicepcióban is szerepet játszhatnak. A fenti hatásnak ez is fontos farmakológiai jelentőséget adhat.

64

8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Hálával tartozom mindenekelőtt Feleségemnek, aki mindig támogatott, türelemmel viseltetett irántam, amikor tudományos munkám során - különösképpen a németországi éveim alatt - nem tölthettem vele annyi időt, amennyit szerettem volna. Ezt a dolgozatot elsősorban Neki és születendő Gyermekünknek ajánlom. Köszönöm Szüleimnek a támogatást, amely segítségével a PhD cím elnyerésének a küszöbére érkeztem. Köszönöm mindekori főnökeimnek, Knoll József Professzor Úrnak, és elsősorban a Farmakológiai Intézet jelenlegi tanszékvezetőjének és témavezetőmnek Fürst Zsuzsanna Professzor Asszonynak, hogy mindig támogattak tudományos munkámban. Fürst Professzor Asszonynak hálával tartozom nemcsak azért, mert tudományos értelemben minden segítséget megadott, hanem azért is, mert döntéseiben, főnökként is, mindig elsősorban emberi szempontok vezérelték. Tapasztalhattam ezt akkor, amikor lehetőséget kaptam a németországi tanulmányútra, vagy amikor onnan hazatérve lehetőséget kaptam a kint megtanult - drága - módszer alkalmazására, de ez csak két példa a sok közül, amelyek felsorolása meghaladná egy tudományos dolgozat kereteit. Dr. Dalló Jánosnak köszönhetem azt, hogy tudományos kutatóként tett első lépéseimet vigyázta, hasznos tanácsokkal látott el és kutatói szemléletet adott. Minden kollégámnak hálával tartozom az elmúlt időszakban kapott bármilyen segítő szóért és jótanácsért. Dr. Szebeni Andrea és Dr. Friedmann Tamás voltak azok, akik kritikus szemmel ellenőrizték dolgozatomat, és segítettek a hibák kijavításában. Köszönöm Dr. Gyires Klára egyetemi tanárnak, és Dr. Timár Júlia egyetemi docensnek, hogy vállalkoztak arra, hogy házi bírálóként hivatalos véleményt alkotnak értekezésemről. Köszönöm a Doktori Iskola által felkért előbírálónak, hogy felhívta a figyelmemet annak a fontosságára, hogy a dolgozatban szereplő kémiai-biokémiai és gyógyszertani fogalmak a magyar tudományos nyelv szabályait követve, magyar helyesírással kerüljenek a szövegbe. Értekezésem ennek alapján átdolgozva nyerte el végleges formáját. Néhány ábrán azonban – technikai jellegű nehézségek miatt – sajnálatosan már nem állt módomban változtatni, ezért elnézést kérek. Végezetül, de nem utolsósorban külön szeretném kiemelni: köszönet és szívből jövő hála illeti Illés Péter Professzor Urat, akit a Németországban végzett kísérleteim ideje alatt irányította kutatásaimat. Lipcsében Dr. Kerstin Wirkner személyében olyan

65

kutató közvetlen irányításával végezhettem elektrofiziológiai munkámat, akihez mindig fordulhattam, bármilyen metodikai problémám volt. Az Illés Professzor által vezetett intézetben olyan légkör és tudományos lehetőségek fogadtak, amely hitet és önbizalmat adott a további tudományos munkámhoz, és hatását ma is érzem. Azt hiszem lehetetlen vállalkozás lenne néhány szóval érzékeltetni azt, hogy milyen sokat jelentett számomra, ahogyan Illés Professzor Úr és Családja fogadott, támogatott, és mindenben - nemcsak tudományos értelemben - segítséget nyújtott a kint töltött időszak alatt, és azóta is. Aki ismeri

Illés

Professzor

Urat,

minden

gondolkodásmódjának hatását ezen a dolgozaton.

66

bizonnyal

felismeri

tudományos

9. IRODALOMJEGYZÉK 1. Abbracchio, M.P., Brambilla, R., Ceruti, S., Cattabeni, F., 1999. Signalling by mechanisms involved in P2Y receptor-mediated reactive astrogliosis. Prog Brain Res 120:333-342. 2. Abbracchio, M.P., Burnstock, G., 1994. Purinoceptors: are there families of P2X and P2Y purinoceptors? Pharmacol Ther 64(3), 445-475. 3. Angulo, J.A., McEwen, B.S. 1994. Molecular apects of neuropeptide regulation and function in the corpus striatum and nucleus accumbens. Brain Res. Rev. 19:1-28. 4. Aniksztejn, L., Bregestovski, P., Ben-Ari, Y. 1991. Selective activation of quisqualate metabotropic receptor potentiates NMDA but not AMPA receptors. Eur. J. Pharmacol. 205:327-328. 5. Baddeley, A., 1992. Working memory. Science 255, 556-559. 6. Balcar, V.J., Dias, L.S., Li, Y., Bennett, M.R., 1995. Inhibition of [3H]CGP 39653 binding to NMDA receptors by a P2 antagonist, suramin. Neuroreport 7(1), 69-72. 7. Bardoni, R., Goldstein, P.A., Lee, C.J., Gu, J.G., MacDermott, A.B., 1997. ATP P2X receptors mediate fast synaptic transmission in the dorsal horn of the rat spinal cord. J Neurosci 17: 5297-5304. 8. Barry, P.H., 1994. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. J Neurosci Meth 51, 107-116. 9. Beckstead, R.M., 1979. Convergent prefrontal and nigral projections to the striatum of the rat. Neurosci Lett 12, 59-64.

67

10. Beindl, W., Mitterauer, T., Hohenegger, M., Ijzerman, A.P., Nanoff, C., Freissmuth M., 1996. Inhibition of receptor/G protein coupling by suramin analogs. Mol Pharmacol 50: 415-423. 11. Ben-Ari, Y., Aniksztejn, L., Bregestovski, P. 1992. Protein kinase C modulation of NMDA currents: an important link for LTP induction. Trends Neurosci. 15:333-339. 12. Benveniste, M., Clements, J., Vyklicky, L. Jr., Mayer, M.L., 1990. A kinetic analysis of the modulation of N-methyl-D-aspatic acid receptors by glycine in mouse cultured hippocampal neurones. J Physiol 428: 333-357. 13. Berger, B., Thierry, A.M., Tassin, J.P., Moyne, M.A., 1976. Dopaminergic innervation of the rat prefrontal cortex: a fluorescence histochemical study. Brain Res 106, 133-145. 14. Bhave, S.V., Snell, L.D., Tabakoff, B., Hoffman, P.L., 1996. Mechanism of ethanol inhibition of NMDA receptor function in primary cultures of cerebral cortical cells. Alcohol Clin Exp Res 20: 934-941. 15. Blank, T., Nijholt, I., Teichert, U., Kugler, H., Behrsing, H., Fienberg, A., Greengard, P., Spiess, J. 1997. The phosphoprotein DARPP-32 mediates cAMPdependent potentiation of striatal N-methyl-D-aspartate responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:14859-14864. 16. Blank, T., Zwart, R., Nijholt, I., Spiess, J. 1996. Serotonin 5-HT2 receptor activation potentiates N-methyl-D-aspartate receptor-mediated ion currents by a protein kinase C-dependent mechanism. J. Neurosci. Res. 45(2):153-160. 17. Bliss, T.V.P., Collingridge, G.L. 1993. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature 361:31-39.

68

18. Boyer, J.L:, Delaney, S.M., Villanueva, D., Harden, T.K., 2000. A molecularly identified P2Y receptor simultaneously activates phospholipase C and inhibits adenylyl cyclase and is nonselectively activated by all nucleoside triphosphates. Mol Pharmacol 57(4), 805-810. 19. Brake, A.J., Julius, D., 1996. Signaling by extracellular nucleotides. Annu Rev Cell Dev Biol 12: 519-541. 20. Breimer, D.D., 1977. Clinical pharmacokinetics of hypnotics. Clin Pharmacokinet 2, 93-109. 21. Brown, R.M., Crane, A.M., Goldman, P.S., 1979. Regional distribution of monoamines in the cerebral cortex and subcortical structures of the rhesus monkey: concentrations and in vivo synthesis rates. Brain Res 168, 133-150. 22. Burnstock, G. 1972. Purinergic nerves. Pharmacol Rev 24(3): 509-581. 23. Burnstock, G., 1999. Purinergic cotransmission. Brain Res Bull 50(5-6), 355-357. 24. Calabresi, P., Mercuri, N., Stanzione, P., Stefani, A., Bernardi, G., 1987. Intracellular studies on the dopamine-induced firing inhibition of neostriatal neurons in vitro: evidence for D1 receptor involvement. Neuroscience 20: 757-771. 25. Carter, C.J., 1982. Topographical distribution of possible glutamatergic pathways from the frontal cortex to the striatum and substantia nigra in rats. Neuropharmacology 21, 379-383. 26. Cepeda, C., Buchwald, N.A., Levine, M.S. 1993. Neuromodulatory actions of dopamine in the neostriatum are dependent upon the excitatory amino acid receptor subtypes activated. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:9576-9580.

69

27. Cepeda, C., Levine, M.S. 1998. Dopamine and N-methyl-D-aspartate receptor interactions in the neostriatum. Dev. Neurosci. 20:1-18. 28. Chandler, L.J., Harris, R.A., Crews, F.T., 1998. Ethanol tolerance and synaptic plasticity. Trends Pharmacol Sci 19: 491-495. 29. Chang, H.T., Wilson, C.J., Kitai, S.T. 1982. A Golgi study of rat neostriatal neurons: light microscopic analysis. J. Comp. Neurol. 208:107-126. 30. Chen, C.-C., Akopian, A.N., Sivilotti, L., Colquhoun, D., Burnstock, G., Wood, J.N., 1995. A P2X purinoceptor expressed by a subset of sensory neurons. Nature 377: 428-431. 31. Chen, L., Huang, L.Y. 1991. Sustained potentiation of NMDA receptor-mediated glutamate responses through activation of protein kinase C by a m opioid. Neuron 7(2):319-326. 32. Chen, S.J., Leonard, J. 1996. Protein tyrosine kinase-mediated potentiation of currents from cloned NMDA receptors. J. Neurochem. 67:194-200. 33. Chick, J., 1995. Acomprosate as an aid in the treatment of alkoholism. Alc Alcohol 30: 785-787. 34. Chin, J.H., Goldstein, D.B. 1977. Effects of low concentrations of ethanol on the fluidity of spin-labeled erythrocyte and brain membranes. Mol. Pharmacol. 13:435441. 35. Chizh, B.A., Illes, P., 2000. P2X receptors and nociception. Pharmacol Rev 53: 553568. 36. Choi, D.W. 1988. Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system. Neuron 1:623-634.

70

37. Chu, B., Anantharam, V., Treistman, S.N. 1995. Ethanol inhibition of recombinant heteromeric NMDA channels in the presence and absence of modulators. J. Neurochem. 65:140-148. 38. Colwell, C.S., Levine, M.S. 1995. Excitatory synaptic transmission in neostriatal neurons: regulation by cyclic AMP-dependent mechanisms. J. Neurosci. 15(3):1704-1713. 39. Conde, F., Maire-Lepoivre, E., Audinat, E., Crepel, F., 1995. Afferent connections of the medial frontal cortex of the rat.II. Cortical and subcortical afferents. J Comp Neurol 352, 567-593. 40. Crews, F.T., Morrow, A.L., Criswell, H., Breese, G. 1996. Effects of ethanol on ion channels. Int. Rev. Neurobiol. 39:283-367. 41. Cunha, R.A., 2001. Adenosine as a neuromodulator and as a homeostatic regulator in the nervous system: different roles, different sources and different receptors. Neurochem Int 38: 107-125. 42. Cunha, R.A., Ribeiro, J.A., 2000. ATP as a presynaptic modulator. Life Sci 68: 119137. 43. Di Chiara, G., Morelli, M., Consolo, S. 1994. Modulatory functions of neurotransmitters in the striatum: ACh/dopamine/NMDA interactions. Trends Neurosci. 17:228-233. 44. Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S.F. 1999. The glutamate receptor ion channels. Pharmacol. Rev. 51(1):7-61.

71

45. Divac, I., Björklund, A., Lindvall, O., Passingham, R.E., 1978. Converging projections from the mediodorsal thalamic nucleus and mesencephalic dopaminergic nucleus to the neocortex in three species. J Comp Neurol 180, 59-71. 46. Dodd, P.R., Beckmann, A.M., Davidson, M.S., Wilce, P.A. 2000. Glutamatemediated transmission, alcohol, and alcoholism. Neurochem. Int. 37:509-533. 47. Drury, A.N., Szent-Györgyi A. 1929. The physiological activity of adenine compounds with especial reference to their action upon the mammalian heart. J Physiol (London) 68: 213-237. 48. Dubyak, G.R., el-Moatassim, C., 1993. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am J Physiol 265(3), C577C606. 49. Dunn, P.M., Blakeley, A.G.H., 1988. Suramin: a reversible P2-purinoceptor antagonist in the mouse was deferens. Br J Pharmacol 93, 243-245. 50. Edwards, F.A., Gibb, A.J., Colquhoun, D., 1992. ATP receptor mediated synaptic currents in the central nervous system. Nature 359: 144-147. 51. Edwards, F.A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T., 1989. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflügers Arch 414, 600-612. 52. Faingold, C.L., N'Gouemo, P., Riaz, A. 1998. Ethanol and neurotransmitter interactions - from molecular to integrative effects. Prog. Neurobiol. 55(5):509-535. 53. Farooqui, A.A., Horrocks, L.A. 1991. Excitatory amino acid receptors, natural membrane phospholipid metabolism and neurological disorders. Brain Res. Rev. 16:171-191.

72

54. Ferino, F., Thierry, A.M., Glowinski, J., 1987. Anatomical and electrophysiological evidence for a direct projection from Ammon's horn to the medial prefrontal cortex in the rat. Exp Brain Res 65, 421-426. 55. Ferré, S., Fuxe, K., von Euler, G., Johansson, B., Fredholm, B.B. 1992. Adenosinedopamine interactions in the brain. Neuroscience 51:501-512. 56. Ferré, S., O'Connor, W.T., Fuxe, K., Ungestedt, U. 1993. The striatopallidal neuron: a main locus for adenosine-dopamine interactions in the brain. J. Neurosci. 13:54025406. 57. Field, K.J., White, W.J., Lang, C.M., 1993. Anaesthetic effects of chloral hydrate, pentobarbitone and urethane in adult male rats. Lab Anim 27, 258-269. 58. Fischer, W., Allgaier, C., Illes, P., 2000. Inhibition of chloral hydrate and trichloroethanol of AMPA-induced Ca2+ influx in rat cultured cortical neurons. Eur J Pharmacol 394: 41-45. 59. Fredholm, B.B., Abbracchio, M.P., Burnstock, G., Daly, J.W., Harden, T.K., Jacobson, K.A., Leff, P., Williams, M. 1994. Nomenclature and classification of purinoceptors. Pharmacol. Rev. 46(2):143-156. 60. Fujii, S., Kato, H., Kuroda, Y., 1999. Extracellular adenosine 5’-triphosphate plus activation of glutamatergic receptors induces long-term potentiation in CA1 neurons of guinea pig hippocampal slices. Neuriosci Lett 276, 21-24. 61. Fuster, J.M., 1985. The prefrontal cortex, mediator of cross-temporal contingencies. Hum Neurobiol 4, 169-179.

73

62. Geiger, J.D., Nagy, J.I., 1990. Adenosine deaminase and [3H]nitrobenzylthioinosine as markers of adenosine metabolism and transport in central purinergic systems. In Adenosine and adenosine receptors ed. Williams, M., pp 225-287, Clifton: Humana Press. 63. Goldman-Rakic, P.S., 1995. Cellular basis of working memory. Neuron 14, 477485. 64. Goldman-Rakic, P.S., Leranth, C., Williams, S.M., Mons, N., Geffard, M., 1989. Dopamine synaptic complex with pyramidal neurones in primate cerebral cortex. Proc Natl Acad Sci USA 86: 9015-9019. 65. Goldstein, M., Deutsch, A.Y., 1992. Dopaminergic mechanisms in the pathogenesis of schizophrenia. FASEB Journal 6: 2413-2421. 66. Gonzales, R.A., Hoffman, P.L. 1991. Receptor-gated ion channels may be selective CNS targets for ethanol. Trends Pharmacol. Sci. 12(1):1-3. 67. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R.Y., 1985. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem 260: 34403450. 68. Gu, J.G., MacDermott, A.B., 1997. Activation of ATP P2X receptors elicits glutamate release from sensory neuron synapses. Nature 389: 749-753. 69. Hall, R.A., Soderling, T.R. 1997. Differential surface expression and phosphorylation of the N-methyl-D-aspartate receptor subunits NR1 and NR2 in cultured hippocampal neurons. J. Biol. Chem. 272:4135-4140. 70. Harvey, J., Lacey, M.G. 1997. A postsynaptic interaction between dopamine D1 and NMDA receptors promotes presynatic inhibition in the rat nucleus accumbens via adenosine release. J. Neurosci. 17(14):5271-5280.

74

71. Hirai, H., Kirsch, J., Laube, B., Betz, H., Kuhse, J. 1996. The glycine binding site of the N-methyl-D-aspartate receptor subunit NR1: Identification of novel determinants of co-agonist potentiation in the extracellular M3-M4 loop region. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:6031-6036. 72. Hollmann, M., Heinemann, S. 1994. Cloned glutamate receptors. Annu. Rev. Neurosci. 17:31-108. 73. Holton, F.A., Holton, P. 1953. The possibility that ATP is a transmitter at sensory nerve endings. J Physiol 119: 50P-51P. 74. Impagnatiello, F., Bastia, E., Ongini, E., Monopoli, A. 2000. Adenosine receptors in neurological disorders. Emergic Therapeutic Targets 4(5): 635-664. 75. Inoue, K., Koizumi, S., Ueno, S., 1996. Implication of ATP receptors in brain functions. Prog Neurobiol 50(5-6), 483-492. 76. Inoue, K., Nakazawa, K., Fujimori, K., Watano, T., Takanaka, A., 1992. Extracellular adenosine 5'-triphosphate-evoked glutamate release in cultured hippocampal neurons. Neurosci Lett 134: 215-218. 77. Ishii, T., Moriyoshi, K., Sugihara, H., Sakurada, K., Kadotani, H., Yokoi, M., Akazawa, C., Shigemoto, R., Mizuno, N., Masu, M. 1993. Molecular characterization of the family of the N-methyl-D-aspartate receptor subunits. J. Biol. Chem. 268(4):2836-2843. 78. Jacobson, K.A. 1996. Specific ligands for the adenosine receptor family. Neurotransmission 12: 1-6.

75

79. Jarvis, M.F., Williams, M. 1989. Direct autoradiographic localization of adenosine A2 receptors in the rat brain using the A2-selective agonist [ 3H]CGS 21680. Eur. J. Pharmacol. 168:243-246. 80. Kelso, S.R., Nelson, T.E., Leonard, J.P. 1992. Protein kinase C-mediated enhancement of NMDA currents by metabotropic glutamate receptors in Xenopus oocytes. J. Physiol. 449:705-718. 81. Khakh, B.S., Henderson, G., 1998. ATP receptor-mediated enhancement of fast excitatory neurotransmitter release in the brain. Mol Pharmacol 54, 372-378. 82. King, B.F., Townsend-Nicholson, A., Burnstock, G., 1998. Metabotropic receptors for ATP and UTP: exploring the correspondence between native and recombinant nucleotide receptors. Trends Pharmacol Sci 19(12), 506-514. 83. Klotz, K-N. 2000. Adenosine receptors and their ligands. Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol 362: 382-391, 2000. 84. Kolaj, M., Cerne, R., Cheng, G., Brickey, D.A., Randic, M. 1994. Alpha subunit of calcium/calmodulin-dependent protein kinase enhances excitatory amino acid and synaptic responses of rat spinal dorsal horn neurons. J. Neurophysiol. 72(5):25252531. 85. Kolb, B., 1984. Functions of the frontal cortex of the rat: a comparative review. Brain Res 320, 65-98. 86. Koob, G.F., Bloom, F.E., 1988. Cellular and molecular mechanisms of drug dependence. Science 242(4879), 715-723. 87. Kornetsky, C., Porrino, L.J., 1992. Brain mechanisms of drug-induced reinforcement. Res Publ Assoc Res Nerv Ment Dis 70, 59-77.

76

88. Krettek, J.E., Price, J.L., 1977. The cortical projections of the mediodorsal nucleus and adjacent thalamic nuclei in the rat. J Comp Neurol 171, 157-192. 89. Krügel, U., Kittner, H., Illes, P., 2001. Mechanisms of adenosine 5'-triphosphateinduced dopamine release in the rat nucleus accumbens in vivo. Synapse 39: 222232. 90. Kuner, T., Schoepfer, R., Korpi, E.R. 1993. Ethanol inhibits glutamate-induced currents in heteromeric NMDA receptor subtypes. Neuroreport 5:297-300. 91. Kuroda, M., Murakami, K., Igarashi, H., Okada, A., 1996. The convergence of axon terminals from the mediodorsal thalamic nucleus and ventral tegmental area on pyramidal cells in layer V of the rat prelimbic cortex. Eur J Neurosci 8, 1340-1349. 92. Lambrecht, G., Friebe, T., Grimm, U., Windscheif, U., Bungardt, E., Hildebrandt, C., Baumert, H.G., Spatz-Kumbel, G., Mutschler, E., 1992. PPADS, a novel functionally selective antagonist of P2 purinoceptor-mediated responses. Eur J Pharmacol 217(2-3), 217-219. 93. Laube, B., Hirokazu, H., Sturgess, M., Betz, H., Kuhse, J. 1997. Molecular determinants of agonist discrimaination by NMDA receptor subunits: analysis of the glutamate binding site on the NR2B subunit. Neuron 18:493-503. 94. Le, K.-T., Babinski, K., Seguela, P., 1998. Central P2X4 and P2X6 channel subunits coassamble into a novel heteromeric ATP receptor. J Neurosci 18: 7152-7159. 95. Legendre, P., Rosenmund, C., Westbrook, G.L. 1993. Inactivation of NMDA channels in cultured hippocampal neurons by intracellular calcium. J. Neurosci. 13:674-684.

77

96. Leonard, A.S., Hell, J.W. 1997. Cyclic AMP-dependent protein kinase and protein kinase C phosphorylate N-methyl-D-aspartate receptors at different sites. J. Biol. Chem. 272:12107-12115. 97. Lewis, C., Neidhart, S., Holy, C., North, R.A., Buell, G., Surprenant, A., 1995. Coexpression of P2X2 and P2X3 receptor subunits can account for ATP-gated currents in sensory neurons. Nature 377, 432-435. 98. Lewis, D.A., Hayes, T.L., Lund, J.S., Oeth, K.M., 1992. Dopamine and the neural circuitry of primate prefrontal cortex: implications for schizophrenia research. Neuropsychopharmacology 6, 127-134. 99. Li, C., Aguayo, L., Peoples, R.W., Weight, F.F., 1993. Ethanol inhibits a neuronal ATP-gated ion channel. Mol Pharmacol 44, 871-875. 100. Li, C., Peoples, R.W., Weight, F.F., 1998. Ethanol-induced inhibition of a neuronal P2X purinoceptor by an allosteric mechanism. Br J Pharmacol 123, 1-3. 101. Lidow, M.S., Wang, F., Cao, Y., Goldman-Rakic, P.S., 1998. Layer V neurons bear the majority of the mRNAs encoding the five distinct dopamine receptor subtypes in the primate prefrontal cortex. Synapse 28, 10-20. 102. Lieberman, D.N., Mody, I. 1994. Regulation of NMDA channel function by endogenous Ca2+-dependent phosphatase. Nature 369:235-239. 103. Lipton, S.A., Rosenberg, P.A. 1994. Excitatory amino acids as a final common pathway for neurological disorders. N. Engl. J. Med. 330:613-622. 104. Loewy, A.D., 1991. Forebrain nuclei involved in autonomic control. Prog Brain Res 87, 253-268.

78

105. Lovinger, D.M. 1995. Developmental decrease in ethanol inhibition of N-methylD-aspartate receptors in rat neocortical neurons: relation to the actions of ifenprodil. J. Pharmacol. Exp. Ther. 274:164-172. 106. Lovinger, D.M. 1997. Alcohols and neurotransmitter gated ion channels: past, present and future. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 356(3):267-282. 107. Lu, W.Y., Xiong, Z.G., Lei, S., Orser, B.A., Dudek, E., Browning, M.D., MacDonald, J.F. 1999. G-protein-coupled receptors act via protein kinase C and Src to regulate NMDA receptors. Nat. Neurosci. 2(4):331-338. 108. Luciana, M., Collins, P.F., 1997. Dopaminergic modulation of working memory for spatial but not object cues in normal humans. J Cognit Neurosci 9, 330-347. 109. Lupica, C.R., Cass, W.A., Zahniser, N.R., Dunwiddie, T.V., 1990. Effects of the selective adenosine A2A receptor agonist CGS 21680 on in vitro electrophysiology, cAMP formation and dopamine release in rat hippocampus and striatum. J Pharmacol Exp Ther 252: 1134-1141. 110. Mally, J., Stone, T.W. 1998. Potential of adenosine A2A receptor antagonists in the treatment of movement disorders. CNS Drugs 10(5): 311-320. 111. Mantz, J., Milla, C., Glowinski, J., Thierry, A.M., 1988. Differential effects of ascending neurons containing dopamine and noradrenaline in the control of spontaneous activity and of evoked responses in the rat prefrontal cortex. Neuroscience 27, 517-526. 112. Markram, H., Segal, M. 1992. The inositol 1,4,5-trisphosphate pathway mediates cholinergic potentiation of rat hippocampal neuronal responses to NMDA. J. Physiol. 447:513-533.

79

113. Mayer, M.L., Westbrook, G.L. 1987. The physiology of excitatory amino acids in the vertebrate central nervous system. Prog. Neurobiol. 28(3):197-276. 114. Mendoca, A., Ribeiro, J.A. 2001. Adenosine and synaptic plasticity. Drug Develop Res 52: 283-290. 115. Moore, D., Chambers, J., Waldvogel, H., Faull, R., Emson, P., 2000. Regional and cellular distribution of the P2Y(1) purinergic receptor in the mammalian brain: striking neuronal localisation. J Comp Neurol 421(3), 374-384. 116. Mori, H., Mishina, M. 1995. Structure and function of the NMDA receptor channel. Neuropharmacology 34: 1219-1237. 117. Moriyoshi, K., Masu, M., Ishii, T., Shigemoto, R., Mizuno, N., Nakanishi, S. 1991. Molecular cloning and characterization of the rat NMDA receptor. Nature 354:3137. 118. Moss, S.J., Smart, T.G. 1996. Modulation of amino acid-gated ion channles by protein phosphorilation. Int. Rev. Neurobiol. 39:1-52. 119. Myers, S.J., Dingledine, R., Borges, K. 1999. Genetic regulation of glutamate receptor ion channels. Annu. Rev. Pharmacol. Tox. 39:221-241. 120. Nakanishi, S. 1992. Molecular diversity of glutamate receptors and implications for brain function. Science 258:597-603. 121. Nakanishi, S., Nakajima, Y., Masu, M., Ueda, Y., Nakahara, K., Watanabe, D., Yamaguchi, S., Kawabata, S., Okada, M. 1998. Glutamate receptors: brain function and signal transduction. Brain. Res. Brain. Res. Rev. 26(2-3):230-235.

80

122. Nakazawa, K., Inoue, K., Ito, K., Koizumi, S., Inoue, K., 1995. Inhibition by suramin and reactive blue 2 of GABA and glutamate receptor channels in rat hippocampal neurons. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 351(2), 202-208. 123. Nicola, S.M., Surmeier, D.J., Malenka, R.C. 2000. Dopaminergic modulation of neuronal excitability in the striatum and nucleus accumbens. Annu. Rev. Neurosci. 23:185-215. 124. Nieber, K., Poelchen, W., Illes, P., 1997. Role of ATP in fast excitatory synaptic potentials in locus coeruleus neurones on the rat. Br J Pharmacol 122(3), 423-430. 125. North, R.A., Surprenant, A., 2000. Pharmacology of cloned P2X receptors. Annu Rev Pharmacol Toxicol 40: 563-580. 126. Nowak, L., Bregestowski, P., Ascher, P., Herbet, A., Prochiantz, A. 1984. Magnesium gates glutamate-activated channels in mouse central neurones. Nature 307:462-465. 127. Nörenberg, W., Illes, P., 2000. Neuronal P2X receptors: localisation and functional properties. Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol 362:324-339. 128. Nörenberg, W., Wirkner, K., Illes, P., 1997. Effect of adenosine and some of its structural analogues on the conductance of NMDA receptor channels in a subset of rat neostriatal neurones. Br J Pharmacol 122: 71-80. 129. Oades, R.D., Halliday, G.M., 1987. Ventral tegmental (A10) system: neurobiology. 1. Anatomy and connectivity. Brain Res 434, 117-165. 130. Omkumar, R.V., Kiely, M.J., Rosenstein, A.J., Min, K.-T., Kennedy, M.B. 1996. Identification of a phosphorylation site for calcium/calmodulin dependent protein kinase II in the NR2B subunit of the N-methyl-D-aspartate receptor. J. Biol. Chem. 271:31670-31678.

81

131. Ongini, E., Fredholm, B.B. 1996. Pharmacology of adenosine A2A receptors. Trends Pharmacol Sci 17: 367-372. 132. Owen, B.E., Taberner, P.V., 1980. Studies on the hypnotic effects of chloral hydrate and ethanol and their metabolism in vivo and in vitro. Biochem Pharmacol 29, 3011-3016. 133. Ozawa, S., Kamiya, H., Tsuzuki, K. 1998. Glutamate receptors in the mammalian central nervous system. Prog. Neurobiol. 54:581-618. 134. Pankratov, Y., Castro, E., Miras-Portugal, M.T., Kristhal, O., 1998. A purinergic component of the excitatory postsynaptic current mediated by P2X receptors in the CA1 neurons of the rat hippocampus. Eur J Neurosci 10: 3898-3902. 135. Parent, A., Hazrati, L.-N. 1993. Anatomical aspects of information processing in primate basal ganglia. Trends Neurosci. 16:111-116. 136. Parsons, C.G., Gruner, R., Rozental, J., Millar, J., Lodge, D., 1993. Patch clamp studies on the kinetics and selectivity of N-methyl-D-aspartate receptor antagonism by memantin (1-amino-3,5-dimethyladamantan). Neuropharmacology 32: 13371350. 137. Peoples, R.W., Li, C., 1998. Inhibition of NMDA-gated ion channels by the P2 purinoceptor antagonists suramin and reactive blue 2 in mouse hippocampal neurons. Br J Pharmacol 124, 400-408. 138. Peoples, R.W., Weight, F.F., 1992. Ethanol inhibition of N-methyl-D-aspartateactivated current in mouse hippocampal neurons is not competitive with glycine. Brain Res. 571:342-344.

82

139. Peoples, R.W., Weight, F.F., 1994. Trichloroethanol potentiation of gammaaminobutyric acid-activated chloride current in mouse hippocampal neurones. Br J Pharmacol 113(2), 555-563. 140. Peoples, R.W., White, G., Lovinger, D.M., Weight, F.F., 1997. Ethanol inhibition of N-methyl-D-aspartate-activated current in mouse hippocampal neurones: "whole cell" patch clamp analysis. Br J Pharmacol 122: 1035-1042. 141. Phillipson, O.T., 1979. Afferent projections to the ventral tegmental area of Tsai and interfascicular nucleus: a horseredish peroxidase study in the rat. J Comp Neurol 187, 117-143. 142. Popp, R.L., Lickteig, R., Browning, M.D., Lovinger, D.M., 1998. Ethanol sensitivity and subunit composition of NMDA receptors in cultured striatal neurons. Neuropharmacol 37: 45-56. 143. Popp, R.L., Lickteig, R.L., Lovinger, D.M., 1999. Factors that enhance ethanol inhibition of N-methyl-D-aspartate receptors in cerebellar granule cells. J Pharmacol Exp Ther 289: 1564-1574. 144. Price, C.J., Kim, P., Raymond, L.A. 1999. D1 dopamine receptor-induced cyclic AMP-dependent protein kinase phosphorylation and potentiation of striatal glutamate receptors. J. Neurochem. 73:2441-2446. 145. Ralevic, V., Burnstock, G., 1998. Receptors for purines and pyrimidines. Pharmacol Rev 50, 413-492. 146. Raman, I.M., Tong, G., Jahr, C.E. 1996. b-adrenergic regulation of synaptic NMDA receptors by cAMP-dependent protein kinase. Neuron 16:415-421.

83

147. Raymond, L.A., Blackstone, C.D., Huganir, R.L. 1993. Phosphorylation of amino acid neurotransmitter receptors in synaptic plasticity. Trends Neurosci. 16(4):147153. 148. Richardson, P.J., Kase, H., Jenner, P.G., 1997. Adenosine A2A receptor antagonists as new agents for the treatment of Parkinson's disease. Trends Pharmacol Sci 18: 338-344. 149. Rosenmund, C., Westbrook, G.L. 1993. Calcium-induced actin depolymerization reduces NMDA channel activity. Neuron 10: 805-814. 150. Scherzer, C.R., Landwehrmeyer, G.B., Kerner, J.A., Counihan, T.J., Kosinski, C.M., Standaert, D.G., Daggett, L.P., Velicelebi, G., Penney, J.B., Young, A.B. 1998. Expression of N-methyl-D-aspartate receptor subunit mRNAs in the human brain: hippocampus and cortex. J. Comp. Neurol. 390:75-90. 151. Schiffmann, S.N., Jacobs, O., Vanderhaeghen, J.-J. 1991. Striatal restricted adenosine A2 receptor (RCD8) is expressed by enkephalin but not by substance P neurons: an in situ hybridization histochemistry study. J. Neurochem. 57:1062-1067. 152. Sebastiao, A.M., Ribeiro, J.A. 2000. Fine-tuning neuromodulation by adenosine. Trends Pharmacol Sci 21:341-346. 153. Sesack, S.R., Pickel, V.M., 1992. Prefrontal cortical efferents in the rat synapse on unlabeled neuronal targets of catecholamine terminals in the nucleus accumbens septi and on dopamine neurons in the ventral tegmental area. J Comp Neurol 320, 145-160. 154. Simon, J., Webb, T.E., Barnard, E.A. 1995. Characterization of a P2Y purinoceptor in the brain. Pharmacol Toxicol 76, 302-307.

84

155. Smiley, J.F., Levey, A.I., Ciliax, B.J., Goldman-Rakic, P.S., 1994. D1 dopamine receptor immunoreactivity in human and monkey cerebral cortex: predominant and extrasynaptic localization in dendritic spines. Proc Natl Acad Sci USA 91: 57205724. 156. Smith, A.D., Bolam, J.P. 1990. The neural network of the basal ganglia as revealed by the study of synaptic connections of identified neurones. Trends Neurosci. 13:259-265. 157. Snyder, G.L., Fienberg, A.A., Huganir, R.L., Greengard, P. 1998. A dopamine/D1 receptor/protein kinase A/dopamine- and cAMP-regulated phosphoprotein (Mr 32 kDa)/protein phosphatase-1 pathway regulates dephosphorylation of the NMDA receptor. J. Neurosci. 18(24):10297-10303. 158. Sperlagh, B., Kittel, A., Lajtha, A., Vizi, E.S., 1995. ATP acts as fast neurotransmitter in rat habenula: neurochemical and enzymecytochemical evidence. Neuroscience 66(4), 915-920. 159. Sternweis, P.C., Pang, I.H., 1990. The G protein channel connection. Trends Neurosci 13, 122-126. 160. Surprenant, A., 1996. Functional properties of native and cloned P2X receptors. In: Chadwick, D.J., Goode, J.A. (eds) P2 purinoceptors: localization, function and transduction mechanisms. Wiley, Chichester, pp 208-222. 161. Swanson, L.W., 1981. A direct projection from Ammon's horn to prefrontal cortex in the rat. Brain Res 217, 150-154. 162. Swope, S.L., Moss, S.I., Raymond, L.A., Huganir, R.L. 1999. Regulation of ligandgated ion channels by protein phosphorylation. Adv. Second Messenger Phosphoprotein Res. 33:49-78.

85

163. Swope, S.L., Moss, S.J., Blackstone, C.D., Huganir, R.L. 1992. Phosphorylation of ligand-gated ion channels: a possible mode of synaptic plasticity. FASEB J. 6(8):2514-2523. 164. Thomas, S.M., Brugge, J.F. 1997. Cellular functions regulated by Src family kinases. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 13:513-609. 165. Trendelenburg, A.U., Bültmann, R., 2000. P2 receptor-mediated inhibition of dopamine release in rat neostriatum. Neuroscience 96(2): 249-252. 166. Tsai, G., Coyle, J.T. 1998. The role of glutamatergic transmission in the pathophysiology of alcoholism. Annu. Rev. Med. 49:173-184. 167. Verma, A., Moghaddam, B., 1996. NMDA receptor antagonists impair prefrontal cortex function as assessed via spatial delayed alternation performance in rats: modulation by dopamine. J Neurosci 16(1), 373-379. 168. Vigne, P., Pacaud, P., Urbach, V., Feolde, E., Breittmayer, J.P., Frelin, C., 1996. The effect of PPADS as an antagonist of inositol (1,4,5)triphosphate induced intracellular calcium mobilization. Br J Pharmacol 119, 360-364. 169. Vodianoy, V. 1995. Glutamate-activated ion channels. Pages 127-142, in Stone T.W. (ed) CNS neurotransmitters and neuromodulators, glutamate, CRC Press, Boca Raton. 170. Von Kügelgen, I., Koch, H., Starke, K., 1997. P2-receptor-mediated inhibition of serotonin release in the rat brain cortex. Neuropharmacol 36: 1221-1227. 171. Von Kügelgen, I., Späth, L., Starke, K., 1994. Evidence for P2-purinoceptormediated inhibition of noradrenaline release in rat brain cortex. Br J Pharmacol 113(3): 815-822.

86

172. Von Kügelgen, I., Starke, K., 1991. Noradrenaline-ATP co-transmission in the sympathetic nervous system. Trends Pharmacol Sci 12(9), 319-324. 173. Von Kügelgen, I., Wetter, A., 2000. Molecular pharmacology of P2Y-receptors. Naunyn Schmiedeberg's Arch Pharmacol 362:310-323. 174. Wang, Y.T., Salter, M.W. 1994. Regulation of NMDA receptors by tyrosine kinases and phosphatases. Nature 369(6477):233-235. 175. Wang, Y.T., Yu, X., Salter, M.W. 1996. Ca2+-independent reduction of N-methylD-aspartate channel activity by protein tyrosine phosphatase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93(4):1721-1725. 176. Watkins, J.C., Krogsgaard-Larsen, P., Honore, T. 1990. Structure-activity relationships in the development of excitatory amino acid receptor agonists and competitive antagonists. Trends Pharmacol. Sci. 11:25-33. 177. Weight, F.F., Li, C., Peoples, R.W., 1999. Alcohol action on membrane ion channels gated by extracellular ATP (P2X receptors). Neurochem Int 35, 143-152. 178. Weinberger, D.R., Berman, K.F., Chase, T.N., 1988. Mesocortical dopaminergic functions and human cognition. Ann N Y Acad Sci 537, 330-338. 179. Whatley, V.J., Harris, R.A. 1996. The cytoskeleton and neurotransmitter receptors. Int. Rev. Neurobiol. 39:113-143. 180. Williams, K. 1993. Ifenprodil discriminates subtypes of N-methyl-D-aspartate receptor: selectivity and mechanisms at recombinant heteromeric receptors. Mol. Pharmacol. 44:851-859.

87

181. Wirkner K., Assmann, H., Köles, L., Gerevich, Z., Franke, H., Nörenberg, W., Illes, P., 2000. Inhibition by adenosine A2A receptors of NMDA but not AMPA currents in rat neostriatal neurons. Br J Pharmacol 130: 259-269. 182. Wirkner, K., Eberts, C., Poelchen, W., Allgaier, C., Illes, P. 2000. Mechanism of inhibition by ethanol of NMDA and AMPA receptor channel functions in cultured rat cortical neurons. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 362:568-576. 183. Wirkner, K., Poelchen, W., Köles, L., Mühlberg, K., Scheibler, P., Allgaier, C., Illes, P. 1999. Ethanol induced inhibition of NMDA receptor channels. Neurochem. Int. 35:153-162. 184. Woolf, N.J., Eckenstein, F., Butcher, L.L., 1984. Cholinergic systems in the rat brain. I. Projections to the limbic forebrain. Brain Res Bull 13, 751-784. 185. Wright, J.M., Peoples, R.W., Weight, F.F., 1996. Single-channel and whole-cell analysis of ethanol inhibition of NMDA-activated currents in cultured mouse cortical and hippocampal neurons. Brain Res 738: 249-256. 186. Wyszynski, M., Lin, J., Rao, A., Nigh, E., Beggs, A.H., Craig, A.M., Sheng, M. 1997. Competitive binding of a-actinin and calmodulin to the NMDA receptor. Nature 385:439-442. 187. Yang, C.R., Seamans, J.K., Gorelova, N., 1996. Electrophysiological and morphological properties of layers V-VI principal pyramidal cells in rat prefrontal cortex in vitro. J Neurosci 16(5), 1904-1921. 188. Zheng, P., Zhang, X.X., Bunney, B.S., Shi, W.X. 1999. Opposite modulation of cortical N-methyl-D-aspartate receptor-mediated responses by low and high concentrations of dopamine. Neuroscience 91(2):527-535.

88

10. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT SAJÁT KÖZLEMÉNYEK BIBLIOGRÁFIAI ADATAI 10.1 Teljes cikkek Wirkner K., Poelchen W., Köles L., Mühlberg K., Scheibler, P., Allgaier C., Illes P.: Ethanol-induced inhibition of NMDA receptor channels. Neurochem Int 35: 153-162, 1999. Wirkner, K., Assmann, H., Köles, L., Gerevich, Z., Franke, H., Nörenberg, W., Böhm, R., Illes, P.: Inhibition by adenosine A2A receptors of NMDA but not AMPA currents in rat neostriatal neurons. Brit J Pharmacol 130: 259-269, 2000. Köles, L., Wirkner, K., Fürst, S., Wnendt, S., Illes, P.: Trichloroethanol inhibits ATP-induced membrane currents in cultured HEK 293P2X(3) cells. Eur J Pharmacol 409(3): R3-R5, 2000. Köles, L., Wirkner, K., Illes, P.: Modulation of ionotropic glutamate receptor-channels by protein phosphorylation. Neurochem Res 26: 925-932, 2001. Wirkner, K., Köles, L., Thümmler, S., Luthardt, J., Poelchen, W., Franke, H., Fürst, S., Illes, P.: Interaction between P2Y and NMDA receptors in layer V pyramidal neurons of the rat prefrontal cortex. Neuropharmacology 42:476-488, 2002.

89

10.2 Megjelent előadások Köles L., Wirkner K., Richter M., Abmann H., Nörenberg W., Illes P.: Adenosine receptor-mediated inhbition of N-methyl-D-aspartate (NMDA) and aamino-3-hydroxy-5-methyl-isoxazole-4-propionic acid (AMPA) receptor channels in rat neostriatum. Naunyn Schmied Arch Pharmacol 358(1), No1: R126, 1998. Köles L., Wirkner K., Thümmler S., Fürst S., Illes P.: Interaction between N-methyl-D-apartate (NMDA)- and P2-receptors in rat prefrontal cortical slices. Naunyn Schmied Arch Pharmacol 358(3) No4: R781, 1998. Köles, L., Wirkner, K., Thümmler, S., Fürst, S., Illes, P.: P2Y purinoceptor-mediated potentiation of N-methyl-D-aspartate (NMDA) currents in rat prefrontal cortex. Fundam. Clin. Pharmacol. 13(1): 263s, 1999. Köles, L., Wirkner, K., Fischer, W., Fürst, S., Wnendt, S., Illes, P.: Trichloroethanol inhibits membrane currents and elevation of intracellular Ca2+ caused by ATP in cultured HEK 293-hP2X3 cells. Drug Develop Res 50(1): 79, 2000. 10.3 Egyéb közlemények Köles, L.: Nucleotides and their receptors in the nervous system. CNS Drug Reviews, 4(3):291-300, 1998. (meeting report)

90

AZ EXCITÁTOROS IONOTROP RECEPTOROK MODULÁCIÓJÁNAK ELEKTROFIZIOLÓGIAI VIZSGÁLATA. POTENCIÁLIS TARGETEK AZ ABÚZUS TERÁPIÁJÁBAN

Recommend Documents