KALCIUM-ÉRZÉKELŐ RECEPTOROK ÉS AKVAPORINOK AZ EMBERI HASNYÁLMIRIGYBEN
Rácz Gábor
Ph.D. értekezés
témavezető: Varga Gábor, MTA doktora
MTA KOKI, Budapest, 2005. Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola A humán molekuláris genetika és géndiagnosztika alapjai Ph.D. program Opponensek: Dr. Darvas Zsuzsanna és Dr. Czakó László Szigorlati bizottság: Prof. Zelles Tivadar, Prof. Pap Ákos és Váradi András, MTA doktora
TARTALOMJEGYZÉK Tartalomjegyzék ........................................................................................................... 2 Rövidítések jegyzéke.................................................................................................... 5 Összefoglalás ................................................................................................................ 7 Summary....................................................................................................................... 8 Bevezetés és irodalmi áttekintés................................................................................... 9 Az emésztőrendszer.................................................................................................. 9 A hasnyálmirigy ....................................................................................................... 9 A hasnyálmirigy anatómiája................................................................................. 9 A hasnyálmirigy duktuszok folyadék- és ionszekréciója ................................... 11 A hasnyálmirigy duktuszok szekréciójának szabályozása: a G-protein kapcsolt receptorok szerepe .............................................................................................. 14 A kalcium-érzékelő receptor .................................................................................. 15 A kalcium szerepe az élettani folyamatokban .................................................... 15 A kalcium-érzékelő receptor klónozása ............................................................. 16 A CaR gén .......................................................................................................... 17 A CaR expressziója és szerepe a kalcium-homeosztázisban részt vevő szövetekben ........................................................................................................ 18 A CaR funkciója a kalcium-homeosztatikus rendszeren kívül........................... 19 A CaR-hoz kapcsolódó szignalizációs útvonalak............................................... 20 A CaR mutációk révén bekövetkező betegségek ............................................... 21 Az akvaporinok ...................................................................................................... 22 A víz mozgása a szövetekben............................................................................. 22 Az első akvaporin felfedezése ............................................................................ 23 Az akvaporin-1 szerkezete.................................................................................. 23 Akvaporin izoformák és élettani szerepük különböző szövetekben, köztük hasnyálmirigyben ............................................................................................... 24 Akvagliceroporin izoformák és élettani szerepük a különböző szövetekben..... 26 Az akvaporinok szerepe egyes betegségekben................................................... 27
2
A kalcium-érzékelő receptorok és az akvaporinok lehetséges szerepe a hasnyálmirigy folyadék- és ionhomeosztázisában ................................................. 28 Célkitűzések ............................................................................................................... 29 Anyagok és módszerek............................................................................................... 30 Szövetminták .......................................................................................................... 30 Sejttenyésztés ......................................................................................................... 30 RNS izolálása és reverz transzkripció .................................................................... 30 Polimeráz láncreakció az AQP1, -3, -4 és -8 kimutatására .................................... 31 AQP5 PCR.............................................................................................................. 31 CaR PCR ................................................................................................................ 32 A PCR-termékek vizsgálata ................................................................................... 32 A CaR teljes kódoló régiójának klónozása és szekvenálása................................... 33 Kontroll reakciók.................................................................................................... 33 A CaR RT–PCR kvantifikálása .............................................................................. 34 Antitestek................................................................................................................ 34 Immunhisztokémia ................................................................................................. 35 Az intracelluláris szabad kalciumion-koncentráció meghatározása....................... 37 A DNS-szintézis mérése......................................................................................... 38 Statisztikai módszerek ............................................................................................ 38 Eredmények ................................................................................................................ 39 Kalcium-érzékelő receptorok az emberi hasnyálmirigyben ................................... 39 A CaR mRNS expressziója ................................................................................ 39 Az emberi hasnyálmirigy CaR cDNS szekvenciájának meghatározása............. 41 A CaR immunhisztokémiai kimutatása .............................................................. 41 Az intracelluláris szabad kalciumszint változása ............................................... 43 Sejtosztódási vizsgálatok.................................................................................... 43 Kalcium-érzékelő receptorok az emberi hasnyálmirigyben: az eredmények összegzése........................................................................................................... 44 Akvaporinok az emberi hasnyálmirigyben............................................................. 45 Az akvaporinok expressziójának mRNS-szintű vizsgálata ................................ 45 Az AQP1 lokalizációjának immunhisztokémiai vizsgálata................................ 45 Az AQP1 és a CFTR kolokalizációja interkaláris duktuszokban....................... 48
3
AQP1 az emberi pankreász intra- és interlobuláris duktuszaiban ...................... 49 AQP1 a patkány hasnyálmirigyben .................................................................... 49 Az AQP5 immunhisztokémiai lokalizációja ...................................................... 50 Az AQP5 és a CFTR kolokalizációja interkaláris duktuszokban....................... 52 AQP5 a mucinózus duktuszokban és mirigyekben ............................................ 52 Egyéb akvaporinok ............................................................................................. 52 Akvaporin izoformák expressziója és lokalizációja emberi hasnyálmirigyben: az eredmények összegzése ...................................................................................... 54 Megbeszélés ............................................................................................................... 55 A kalcium-érzékelő receptor többféle sejttípusban kifejeződik az emberi hasnyálmirigyben ................................................................................................... 55 A CaR lehetséges élettani szerepe az emberi hasnyálmirigy külső elválasztású részének működésében ........................................................................................... 55 A CaR expressziója nem-exokrin sejtekben........................................................... 56 A Capan-1 sejtvonal mint a normál emberi duktuszsejt működésének modellje... 57 CaR expresszió a rákos hasnyálmirigyben ............................................................. 57 Az akvaporin izoformák és a CFTR lokalizációja az emberi hasnyálmirigy külső elválasztású részének különböző sejttípusaiban ..................................................... 58 Az AQP1 eloszlása az exokrin hasnyálmirigyben és lehetséges szerepe a duktális folyadékelválasztásban ........................................................................................... 59 Az AQP5 expressziója és kolokalizációja AQP1-gyel emberi hasnyálmirigyben . 60 Az AQP1 eloszlásának összehasonlítása emberi és patkány hasnyálmirigyben .... 61 Az AQP3, AQP4 és AQP8 eloszlása az emberi hasnyálmirigyben ....................... 61 Akvaporin expresszió emberi hasnyálmirigy rákban és daganatos sejtvonalakban62 Következtetések.......................................................................................................... 63 Köszönetnyilvánítás ................................................................................................... 65 Irodalomjegyzék ......................................................................................................... 66 Bibliográfia................................................................................................................. 82
4
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ADH
autoszómás domináns hipokalcémia
AE
anioncserélő
AM
acetoximetil észter
AQP
akvaporin
ATCC
American Type Culture Collection
ATP
adenozin-trifoszfát
bp
bázispár
BSA
marha szérumalbumin
Cai
a citoszól kalcium-koncentrációja
cAMP
ciklikus adenozin-monofoszfát
CaR
kalcium-érzékelő receptor
cDNS
komplementer (mRNS-ről visszaírt) dezoxi-ribonukleinsav
CFTR
cisztás fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor
CHIP
channel-like integral protein
cRNS
cDNS-ről átírt RNS
CTAL
a disztális vesetubulus kortikális szakasza
DIDS
4,4'-diizotiocianátsztilbén-2,2'-diszulfonsav
DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
dNTP
dezoxinukleotid-trifoszfát
DTT
ditiotreitol
ECD
extracelluláris domén
EIPA
5-(N-etil-N-izopropil)-amilorid
ERK
extracellular signal regulated kinase
FHH
familiális hipokalciuriás hiperkalcémia
GABA
gamma-amino-vajsav
Gi, Gq/11, Gs GTP-kötő fehérje alosztályok Glp
gliceroporin
GPCR
G-protein kapcsolt receptor
H2DIDS
dihidro-4,4’-diizotiocianátsztilbén-2,2’-diszulfonsav
HBSS
Hank's buffered saline solution
5
Ig
immunglobulin
IMCD
a vese gyűjtőcső medulla belső részére eső szakasza
M
mol/liter
mGluR
metabotróp glutamátreceptor
MIP
major intrinsic protein
mp
másodperc
mRNS
hírvivő ribonukleinsav
MTAL
a disztális vesetubulus medulláris szakasza
NBC
Na+-bikarbonát kotranszporter
NDI
nefrogén diabetes insipidus
NHE
Na+/H+ cserélő
NP
normál pankreász
NSHPT
neonatális súlyos hiperparatiroidizmus
PBS
phosphate buffered saline
PCR
polimeráz láncreakció
PKA
protein kináz A
PKC
protein kináz C
PLC
foszfolipáz C
PTH
paratiroid hormon
RT
reverz transzkripció
SEM
standard error of means
UTP
uridin-trifoszfát
UTR
nem transzlálódó régió
VR
vomeronazális receptor
6
ÖSSZEFOGLALÁS A kalcium-érzékelő receptor (CaR) fontos szerepet játszik az extracelluláris tér kalciumszintjének szabályozásában, így szerte a kalcium-homeosztatikus rendszerben kifejeződik. Ugyanakkor a CaR előfordul egyéb szövetekben is, ahol szerepe változatos lehet. Patkány hasnyálmirigyben is leírták. Az exokrin hasnyálmirigy nagy mennyiségű izotóniás nedvet termel, amely főleg a vezetékrendszerből ered. Hogy e folyamatban milyen szerepet játszanak az akvaporinok, az nem ismert. A CaR és az akvaporinok expresszióját, valamint a CaR lehetséges élettani szerepét egészséges
és
kóros
emberi
pankreász
mintákban,
valamint
hasnyálmirigy
sejtvonalakban vizsgáltuk. Az emberi hasnyálmirigy több sejttípusában azonosítottunk kalcium-érzékelő receptorokat: duktuszokban, acinusokban, erekben, idegekben és szigetsejtekben. A receptoroknak szerepük lehet a mirigy működésében: részt vehetnek a duktális folyadékszekréció, a sejtosztódás, valamint a szerv vérátáramlásának szabályozásában. A Capan-1 sejtvonal használható modellrendszernek ígérkezik a kalcium-érzékelő receptor pankreász duktuszsejtekben betöltött élettani szerepének vizsgálatára. Az AQP1 és az AQP5 nagy mennyiségben mutatható ki emberi exokrin pankreász interkaláris duktuszaiban. Kolokalizálnak a duktális elektrolitszekréció markereként számontartott CFTR-rel, és az interkaláris duktuszoktól távolodva mindhárom fehérje expressziója
csökken.
Ez
valószínűsíti,
hogy
emberi
hasnyálmirigyben
a
folyadékszekréció a duktuszfa végső ágaiban összpontosul, az AQP1 és az AQP5 pedig fontos szerepet játszik a vízáramlás és az ionszekréció összekapcsolásában. Saját munkánk és mások eredményei alapján fölvázolhatunk egy modellt, amelyben az akvaporinok és a kalcium-érzékelő receptorok egy hasnyálmirigy duktuszokban működő
homeosztatikus
mechanizmus
szereplői.
Az
acinusok
szekréciós
granulumainak exocitózisa révén lokálisan megnövekvő kalciumszint a duktuszok kezdeti szakaszán stimulálja a luminálisan elhelyezkedő kalcium-érzékelő receptorokat, amelyek
aktiválódva
a
bikarbonát-ionok
szekrécióját
fokozó
jelétviteli
mechanizmusokat indítanak be. A lumenbe kerülő ionokat a víz az ozmotikus grádiens irányában passzívan követi, a duktális epitéliumon át történő gyors vízmozgást a duktuszsejteken bazolaterálisan és apikálisan kifejeződő vízcsatornák teszik lehetővé.
7
SUMMARY Calcium-sensing receptor (CaR) plays a key role in the regulaton of calcium homeostasis and is therefore expressed throughout the calcium homeostatic system. However, CaR is expressed outside the calcium homeostatic system as well, where it has several different roles. CaRs have been shown in rat pancreas. The exocrine pancreas secretes a copious amount of isotonic fluid, originating mainly from ducts. The role of aquaporins in this process is unknown. We studied the expression of CaR and aquaporins, and the possible physiological role of CaR in normal and diseased human pancreas, and human pancreatic cancer cell lines. We detected the CaR in in multiple cell types in human pancreas: ducts, acini, vessels, nerves and islets of Langerhans. The receptors may have multiple roles in the physiology of the gland: they may be involved in the regulation of ductal fluid secretion, cell proliferation and organ blood flow. The Capan-1 cell line is a promising model system for studying the physiological role of CaR in ductal pancreatic cells. AQP1 and AQP5 are abundantly expressed in the intercalated ducts of of human exocrine pancreas. They colocalize with CFTR, a marker of ductal electrolyte secretion. Along the ductal tree, each of the three proteins is decreasingly expressed with distance from intercalated ducts. This implies that, in human pancreas, the major site of fluid secretion is probably the terminal branches of the ductal tree and AQP1 and AQP5 play major roles in coupling fluid movement to ion secretion. Based on our work and the results of others, we can propose a model wherein aquaporins and calcium-sensing receptors play key roles in a homeostatic mechanism operating in pancreatic ducts. Local increases in calcium level arising from the exocytosis of secretory granules from acini stimulates luminal calcium-sensing receptors in the initial segments of ducts. Stimulated receptors in turn activate signalling mechanisms that eventually increase bicarbonate secretion, and ions secreted into the lumen are passively followed by water along the osmotic gradient. Rapid transepithelial water movement is mediated by aquaporins expressed on the basolateral and luminal membranes of human pancreatic ducts.
8
BEVEZETÉS ÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS Az emésztőrendszer Emésztőrendszerünk az a szervrendszer, amely a környezetünkből fölvett táplálék fölaprítását, továbbítását, emésztését és a tápanyagok fölszívását végzi. Funkciója lényegében a táplálék makromolekuláinak (fehérjék, zsiradékok, keményítő) lebontása kismolekulákká
(aminosavak,
zsírsavak,
egyszerű
cukormolekulák),
majd
a
tápanyagmolekulák fölszívása és vérkeringésbe juttatása. Az emésztőrendszert leegyszerűsítve egy szájnyílástól a végbélnyílásig terjedő csővezetékként képzelhetjük el, amelynek egyes részei az adott feladatok ellátására specializálódtak. Táplálékunkat szájunkon át vesszük magunkhoz, itt történik annak mechanikai aprítása, valamint megkezdődik emésztése a nyálmirigyek által termelt, szénhidrátbontó amilázt tartalmazó közel semleges vegyhatású nyál révén. A táplálék ezután a nyelőcsövön keresztül a gyomorba kerül, ahol ideiglenesen tárolódik és a savas (pH=2) közegben a pepszin révén folytatódik emésztése. A következő állomás a vékonybél első szakasza, a patkóbél. Ide ürül a máj által termelt epe és az enyhén lúgos hasnyál. Az epében található epesavak apró zsírcseppekre emulgeálják a zsiradékokat. A pankreász által termelt hasnyál pedig semlegesíti a gyomortartalom savas kémhatását, valamint az emésztésben kulcsszerepet játszó amilázt, lipázt, tripszint, kimotripszint és egyéb enzimeket tartalmazza. Ezek az enzimek alakítják a táplálék makromolekuláit fölvehető kismolekulákká, amelyek aztán a vékonybélben szívódnak föl.
A hasnyálmirigy A hasnyálmirigy anatómiája A pankreász hosszúkás, rózsaszínes mirigy, amely a gyomor mögött, a patkóbéltől (duodenum) körülölelve található [133]. Termékét a duodenumba üríti. Vékony kötőszövetes tokja, a mirigyállományba szeptumokként benyúlva lebenykékre osztja azt. A mirigy működését tekintve két részre osztható. Az endokrin működésért a mirigyállományban elszórva található Langerhans-szigetek felelősek, amelyek a véráramba inzulint, glukagont és számos egyéb hormont választanak el. A hasnyálmirigy nagyobbik, exokrin része összetett tubuloacináris mirigy (1. ábra).
9
Az emésztőenzimeket szintetizáló és elválasztó sejtek acinusnak nevezett szőlőfürtszerű csoportokba rendeződnek, a nyálmirigyben látotthoz igen hasonló módon [89]. Az acinussejtek az emésztőenzimeket membránkötött szekretoros granulumokban tárolják. A granulumok tartalma exocitózissal jut az acinus lumenjébe. Az acinussejtekből származó enzimek egy faszerűen elágazó vezetékrendszeren keresztül végül a patkóbélbe ürülnek. A duktuszsejtek vizes, bikarbonátban gazdag nedvet választanak el, amely egyrészt az emésztőenzimeket szállítja a duktuszokon keresztül, másrészt a patkóbélbe érkező gyomortartalom savas kémhatását semlegesíti. 1. ábra: Az exokrin hasnyálmirigy felépítése. ID: interlobuláris duktusz; id: intralobuláris duktusz; d: interkaláris duktusz; ac: acinussejtek; ic: intercelluláris canaliculusok; C: centroacináris sejtek; Lu: az acinusok lumene; a: acinus Az ábra forrása: [89].
Méret és elhelyezkedés szerint négyféle duktuszt különböztetünk meg [42]. Az acinusok szekrétuma a lumenből közvetlenül az interkaláris duktuszokba kerül. Az interkaláris duktusz epitélium ellaposodó köbhámja egészen az acinus lumenébe felnyúlik, ezeket a sejteket centroacináris sejteknek nevezzük. Az intralobuláris duktuszok, ahogy nevük is mutatja, a lebenykéken belül helyezkednek el, klasszikus köbhám béleli őket, és az interkaláris duktuszok tartalmát szállítják tovább. Az
interlobuláris
duktuszok
a
kötőszövetes
szeptumokban
futnak,
méretük
meglehetősen változó. A kisebbeket köbhám, a nagyobbakat hengerhám béleli. Funkciójuk, hogy az intralobuláris duktuszok tartalmát továbbítják a fő hasnyálmirigy vezeték felé. A fő hasnyálmirigy vezeték (ductus pancreaticus major) a Vater-papillánál nyílik a patkóbélbe az epevezeték alatt vagy azzal együtt. A másik nagy kivezetőcső, a ductus pancreaticus accessorius, fölöttük torkollik a papilla duodeni minorba. A hasnyálmirigy duktuszait alaphártyán ülő, polarizált sejtekből álló egyrétegű epitélium béleli. A sejtek alaphártya felé néző részét bazolaterális oldalnak nevezzük, a lumen felőli részüket pedig apikális vagy luminális oldalnak. A sejtek junkcionális komplexszel kapcsolódnak egymáshoz, amely elválasztja egymástól az apikális és a
10
bazolaterális membránt. Így lehetővé válik a sejtek polaritása. A junkcionális komplexnek három alkotóeleme van: a zonula occludens (tight junction), a zonula adhaerens (intermediate junction), és a dezmoszóma. A zonula occludens szoros kapcsolatot biztosít a sejtek között, a nagy molekulákat egyáltalán nem engedi át, a kis molekulákat és az ionokat viszont az epitélium fajtájától függően engedi vagy nem engedi át. A szorosan záró epitélium megakadályozza, míg az áteresztő epitélium lehetővé teszi a kismolekulák, ionok paracelluláris, sejtek közötti transzportját. A hasnyálmirigyben áteresztő epitélium található. A hasnyálmirigy duktuszok folyadék- és ionszekréciója A duktuszfa nemcsak az acinusokból érkező enzimben gazdag nedvet vezeti el, hanem sejtjei nagy mennyiségű, közel izotóniás, bikarbonátban gazdag, enyhén lúgos kémhatású nedvet termelnek [21], amely az elválasztott hasnyál térfogatának döntő részét adja. A bikarbonátszekréció során a duktális epitélsejtek három feladatot hajtanak végre: a bazolaterális oldalról bikarbonátot vesznek föl, azt a lumen felé leadják, és onnan nem veszik föl újra [101]. A bazolaterális membránon át a duktuszsejtek kétféle módon veszik föl a bikarbonátot [71]. Egyrészt a sejtbe diffúzióval bejutó szén-dioxid szénsavanhidráz reakció révén szénsavvá alakul, majd az protonra és bikarbonátra disszociál: CO2 + H2O = H2CO3 = H+ + HCO3–. A sejtből a proton a bazolaterális Na+/H+ cserélőn (NHE1) keresztül távozik. Másrészt a bazolaterális Na+-HCO3– kotranszporteren (NBC1) át közvetlenül lép bikarbonát a sejtbe [67, 68]. Az NHE amiloriddal
vagy
5-(N-etil-N-izopropil)-amiloriddal
diizotiocianátsztilbén-2,2'-diszulfonsavval
(DIDS) (H2DIDS)
diizotiocianátsztilbén-2,2’-diszulfonsavval
(EIPA),
az
vagy gátolható.
NBC
4,4'-
dihidro-4,4’E
gátlószerek
alkalmazásával kimutatták, hogy a stimulált duktuszok bikarbonátszekréciójáért nagyobbrészt az NBC-, és csak kisebb mértékben az NHE-függő mechanizmus felelős, hozzájárulásuk aránya 3:1 [71]. A bazolaterális oldalról bekerült bikarbonátot a sejt a lumen felé adja le. Ennek mechanizmusa még nem teljesen tisztázott. Patkányokon végzett vizsgálatok eredményei alapján leírtak egy modellt [53, 100], ahol szekretin vagy egyéb stimuláció hatására kloridcsatornák nyílnak meg (cisztás fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor, CFTR) és klorid lép ki a sejtből a lumenbe.
11
A kloridionok ezután klorid/bikarbonát anioncserélőn keresztül visszakerülnak a sejtbe, cserében bikarbonát lép ki. A patkány duktuszok klorid- és bikarbonátionok elegyét választják el, a hasnyálban a bikarbonát koncentrációja 70 mM körül van [126]. Az előbbi modell kielégítő magyarázatot ad a patkány duktuszban tapasztalt 70 mM bikarbonátra, ám a tengerimalacban, macskában, sertésben és emberben mért 120– 150 mM koncentrációra [107] már nem. Kutatási eredményeik alapján Ishiguro és munkatársai [71] új modellt állítottak föl a tengerimalac duktuszok nyugalmi és stimulált szekréciójának magyarázatára. NBC és NHE a duktuszsejtekben csak a bazolaterális membránban található, míg anioncserélők mind bazolaterálisan, mind apikálisan. A bikarbonát felvétele bazolaterálisan nagyobbrészt NBC, kisebbrészt NHE révén történik. Bikarbonát efflux ugyanakkor mind bazolaterálisan, mind luminálisan történik a kloridfelvételért cserében, ám nyugalmi állapotban az anioncserélő aktivitás bazolaterálisan magasabb, mint luminálisan (2. ábra). Ez biztosítja a kloridionok felvételét a bazolaterális membránon át. Luminálisan kloridionok távoznak a sejtből egy anioncsatornán, valószínűleg a CFTR-en keresztül. E folyamatok kismértékű, spontán, kloridot és bikarbonátot is tartalmazó szekréciót eredményeznek.
BAZOLATERÁLIS OLDAL
LUMINÁLIS OLDAL
HCO3–
Na+
AE
NBC HCO3–
Cl –
2. ábra. Az anionok áramlása stimulálatlan tengerimalac pankreász duktuszban, ha a sejteket mindkét oldalon magas klorid- és alacsony bikarbonát-tartalmú folyadék veszi körül. Átrajzolva [71] alapján.
–
HCO3 AE Cl –
Cl –
CFTR
Szekretinnel vagy forskolinnal történő stimuláció hatására, ha a bazolaterális és luminális kloridionkoncentráció magas, a kloridionok intracelluláris szintje megnő, ami azt jelzi, hogy a stimuláció következtében megnövekedett, CFTR-en át történő apikális klorid-effluxnál nagyobb mértékben nő a klorid-influx (3. ábra). Stimulációt követően a kloridionok felvétele döntően a luminális membránban található anioncserélőn át történik. Stimuláció hatására a duktuszsejt a bazolaterális kloridfelvétel által hajtott, kis mennyiségű, kevert szekréció helyett bőséges, döntően bikarbonátot tartalmazó nedv
12
elválasztására
kapcsol
át,
melyhez
az
NBC
révén
történő
bazolaterális
bikarbonátfelvétel szolgáltatja a hajtóerőt. A cAMP serkenti az anioncserét a luminális membránon át, a bikarbonát a belépő kloridért cserében lép ki. Ehhez a folyamathoz a kloridionok utánpótlása főként a luminális folyadékból történik, hiszen a bazolaterális membránon át csekély a kloridfelvétel. Fiziológiás körülmények között azonban a luminális folyadék összetételét a sejtek szekréciós aktivitása határozza meg, ami azt jelenti, hogy idő elteltével és a duktuszfán a patkóbél felé haladva egyre több benne a bikarbonát. 70 mM luminális [HCO3–] fölött a luminális anioncserélőt hajtó [HCO3–]-grádiens megfordul. Ez megfordítaná az anioncserélőt, amely bikarbonátot venne föl, míg cserében kloridot adna le, ám ez nem következik be, mivel a lumen magas [HCO3–]-ja gátolja az anioncserélő működését [70]. Az intracelluláris [Cl–] csökken, mivel a luminális anioncserélő nem hoz kloridot a sejtbe (4. ábra). Ilyen körülmények között, 7,2-es pH-nál, ami 20 mM intracelluláris [HCO3–]-nak felel meg, a membránpotenciált –60 mV-nak mérték [70], ami még 125 mM luminális [HCO3–]-nál is azt jelenti, hogy bikarbonát effluxnak kedvező elektrokémiai grádiens áll fenn. A bikarbonát kiáramlásához mindössze megfelelően nagy bikarbonát-konduktanciára van szükség, amit biztosíthat a CFTR vagy egy másik anioncsatorna.
BAZOLATERÁLIS OLDAL
+
Na+
HCO3–
NBC HCO3–
+
–?
AE
Cl
–
–
HCO3
NBC
AE – HCO3
–
+
–
LUMINÁLIS OLDAL
SZEKRETIN
+
Na+
Cl HCO3
Cl –
BAZOLATERÁLIS OLDAL
LUMINÁLIS OLDAL
SZEKRETIN
–?
AE Cl
3. ábra: Az anionok áramlása szekretinnel stimulált tengerimalac duktuszsejtben, amelyet mindkét oldalról magas klorid- és alacsony bikarbonát-tartalmú folyadék vesz körül. Átrajzolva [71] alapján.
13
–
× AE
Cl
–
+
–
HCO3
CFTR
+
– HCO3
CFTR
–
HCO3
4. ábra: Az anionok áramlása szekretinnel stimulált tengerimalac duktuszsejtben, amelyet mindkét oldalról magas bikarbonát- és alacsony klorid-tartalmú folyadék vesz körül. Átrajzolva [71] alapján.
A hasnyálmirigy duktuszok szekréciójának szabályozása: a G-protein kapcsolt receptorok szerepe A hasnyálmirigy szekréciós aktivitásának szabályozásában fontos szerepet játszanak a gasztrointesztinális reguláló peptidek (pl. szekretin, kolecisztokinin, bombezin-szerű peptidek), a nukleotidok (pl. ATP, UTP), valamint különböző ionok (pl. az extracelluláris kalcium). A példaként felsorolt anyagok kémiai természete igen különböző, ám van egy közös tulajdonságuk: G-protein kapcsolt receptorokon keresztül hatnak. A hasnyálelválasztás elsősorban hormonális szabályozás alatt áll [48]. A szekretin enzimekben szegény, bőséges, lúgos nedv elválasztását idézi elő [71]. Hatását a kis duktuszok bikarbonát-szekretáló epitélsejtjein fejti ki. A szekretin receptora Gs fehérjén keresztül hatva adenilát-ciklázt aktivál és emeli a cAMP szintjét; az ennek révén aktiválódott protein kináz A pedig aktiválja az apikálisan elhelyezkedő CFTR kloridcsatornát. Az így létrejövő kloridáram szükséges a bikarbonát-szekrécióhoz. A kolecisztokinin az acinusokon fokozza a zimogén granulumok ürülését, így enzimekben gazdag hasnyál elválasztását okozza. A kolecisztokinin tengerimalacban a duktuszok szekrécióját is serkenti [132]. A kolecisztokinin intracellulárisan mind a cAMP, mind a Ca2+ szintjét képes növelni. Emberi pankreász duktuszsejtekben az intracelluláris kalcium a kalciumfüggő kloridcsatornát képes aktiválni, ami szintén kloridáramot és azon keresztül bikarbonát-szekréciót idéz elő [148]. A nukleotidok fontos szerepet játszhatnak a hasnyálmirigy acinusok és duktuszok szekréciós
aktivitásának
összehangolásában
[102].
A
patkány
pankreász
duktuszsejteken bazolaterálisan P2Y2 és P2Y4 G-protein kapcsolt purinoceptorok, luminálisan pedig P2X2 és P2X4 purinoceptor ioncsatornák vannak[58]. A bazolaterálisan ható UTP és ATP P2Y2 és P2Y4 receptorokon hatva intracelluláris Ca2+-felszabadulást és Ca2+-beáramlást okoz, ugyanakkor bezárja a bazolaterális K+csatornákat, ami gátolja a nedvszekréciót. Ezt tengerimalacban igazolták [69]. A luminális P2X2 és P2X4 receptrorok stimulációja Ca2+- és Na+-beáramláshoz vezet [58], ami önmagában
nem indítja be a szekréciót, viszont potenciálja a szekretin
hatását.
14
A hasnyálmirigy acinusok kolinerg stimuláció hatására emésztőenzimeket és ATP-t választanak el [102]. Az így a duktuszokba került ATP a fent leírt mechanizmus révén modulálhatja a szekretin nedvelválasztásra gyakorolt hatását. További fontos szabályozója a pankreász exokrin működésének az extracelluláris kalciumszint. Patkány hasnyálmirigyben mind az acinusokban, mind a duktuszokban kimutatták a kalcium-érzékelő receptort [18]. A receptor részletes jellemzése későbbi fejezetekben található.
A kalcium-érzékelő receptor A kalcium szerepe az élettani folyamatokban Az élőlények számos életműködéséhez szükségesek a kalciumionok. Intracellulárisan a kalciumionok fontos másodlagos hírvivők, valamint különböző enzimek kofaktoraiként szerepelnek [110]. A citoszól nyugalmi kalcium-koncentrációja (Cai) 100 nM körül van, ami stimuláció hatására 1 µM-ig emelkedhet az intracelluláris raktárakból történő Ca2+felszabadulás vagy az extracelluláris Ca2+ fölvétele révén [110]. Ezzel szemben az extracelluláris Ca2+-koncentráció mintegy tízezerszer magasabb, szintje nagyjából konstans, mintegy 1 mM [14]. A Ca2+ fontos szerepet játszik a véralvadásban, a vázrendszer integritásának fenntartásában, a neuromuszkuláris excitabilitásban és egyéb folyamatokban [14], ezért az extracelluláris Ca2+ szintjének stabilitása igen fontos az élőlények
számára.
Az
extracelluláris
Ca2+
szintjét
a
kalcium-homeosztázis
fenntartásában szereplő szervek sejtjei érzékelni képesek. A szervezet kalcium-háztartásának szabályozásában a mellékpajzsmirigy játssza a kulcsszerepet. A vér Ca2+-szintjének változása inverz módon befolyásolja a paratiroid hormon (PTH) elválasztását. A csökkenő Ca2+-szint hatására felszabaduló PTH rövid távon a vese proximális tubulusaiban csökkenti a foszfátionok, míg a disztális tubulusokban növeli a Ca2+-ok visszaszívását, a csontokban serkenti a kalcium mobilizációját. A PTH hosszabb távon a vese proximális tubulusaiban serkenti az 1,25dihidroxi-D-vitamin keletkezését, ami viszont a bélben növeli a kalcium-foszfát felszívását [14]. Mindezen folyamatok a vér Ca2+-szintjének normalizálódását segítik elő. A kalciumszint emelkedése ugyanakkor gátolja a PTH elválasztását.
15
A kalcium-érzékelő receptor klónozása Hogyan érzékelik a mellékpajzsmirigy sejtjei a kalciumszint emelkedését? Régóta megfigyelték, hogy az extracelluláris Ca2+-szint növekedése ugyanolyan Caiváltozásokat idéz elő, mint amikor egy hormon aktiválja a receptorát, ezért gyanították, hogy egy addig még ismeretlen receptor állhat az extracelluláris Ca2+-szint érzékelésének hátterében [14]. Marha mellékpajzsmirigy cDNS-klónokról átírt mRNS-t injektáltak afrikai karmosbéka petesejtekbe. A megfelelő klónról átírt mRNS kalciummal és más polikationokkal stimulálhatóvá tette a petesejteket. Azonosították a pozitív cDNS klónt, így 1993-ban megtalálták a keresett kalcium-érzékelő receptort (CaR) [15]. Azóta több fajban számos szövetből klónozták a receptort [16]. 5. ábra: Az emberi mellékpajzsmirigyből klónozott kalcium-érzékelő receptor topológiája. SP: szignálpeptid; HS: hidrofób szegmens. Az ábra forrása: [17].
konzervált cisztein
savas
glikoziláció PK C fo szforilác iós he ly
A CaR fehérje egy G-protein kapcsolt receptor, a polipeptidlánc három régióra osztható [17]: egy N-terminális, hatalmas, több, mint 600 aminosav alegységből álló extracelluláris doménre (ECD), egy központi, mintegy 250 aminosavból álló, hét transzmembrán hélixet tartalmazó szakaszra, valamint egy C-terminális, kb. 200 aminosav alegységet tartalmazó intracelluláris farokra (5. ábra). A Ca2+ az ECD-hez kötődik, amely több glikozilációs helyet is tartalmaz. A fehérje intracelluláris része (a transzmembrán hélixek közötti hurkok közül az intracellulárisan elhelyezkedők, valamint a C-terminális farok) több konszenzus protein kináz C és A (PKC és PKA) foszforilációs helyet tartalmaz.
16
A CaR a G-protein kapcsolt receptorok (GPCR) szupergéncsaládján belül a C családba sorolható. Ebbe a családba, amelyre jellemző, hogy tagjai ≥20% homológiát mutatnak a hét hélixet tartalmazó transzmembrán doménjük aminosavsorrendjében [78], legalább három alcsalád tartozik (6. ábra). Az I. csoport a metabotróp glutamátreceptorokat tartalmazza (mGluR 1–8). A II. csoportba tartozik a CaR és egy nemrégiben fölfedezett feromonreceptor alcsalád, a vomeronazális receptorok (VR) [85]. A III. csoportot a GABAB receptorok alcsaládja alkotja [74]. A C családba tartozó GPCR-ok extracelluláris ligandkötő doménje homológiát mutat a bakteriális periplazmatikus kötőfehérjével (periplasmic binding protein) [36]. A baktériumok periplazmatikus nutrienskötő fehérjéi szerves kismolekulákat, ill. szervetlen ionokat érzékelnek, amelyek a baktériumok számára tápanyagként szerepelhetnek vagy kemotaktikus választ váltanak ki. Valószínűnek tűnik, hogy a C családba tartozó GPCR-ok az evolúció során létrjött „fúziós proteinek”, amelyek egy ősi nutrienskötő fehérje Nterminális ECD-jét, valamint egy GPCR transzmembrán doménjét kódoló egy-egy génszakasz összeolvadásával keletkeztek [17].
II. csoport
I. csoport
6. ábra: A C családba tartozó ma ismert G-protein kapcsolt receptorok egymáshoz viszonyított homológiájának mértékét és a feltételezett evolúciós kapcsolatokat ábrázoló dendrogram. A törzsfa tövéhez minél közelebb ágazik el két receptor egymástól, annál távolabbi a rokonságuk. Az ábra forrása: [17].
III. csoport A CaR gén A CaR gén emberben a 3. kromoszóma hosszú karján található (3q21–q24) [34] és legalább hét exont tartalmaz [109]. Az első hat exon a receptor ECD-jét és 5’ nem transzlálódó régióját (5’ UTR) kódolja, míg a hetedik a transzmembrán régiót és a Cterminust. A gén szabályozó régióit még nem jellemezték. Több splice variáns CaR mRNS-t írtak le. Az egyik az ECD-ben tartalmaz egy 30 nukleotidnyi inzerciót [49]. Ez a 10 aminosavas inzerció nem befolyásolja a CaR
17
működését.
Egy
másik
variáns
jelenlétét
emberi
citotrofoblasztban
és
mellékpajzsmirigyben írták le, hiányzik belőle a 3. exon [12]. Erről az mRNS-ről csonka, valószínűleg inaktív fehérje transzlálódik. Oda és munkatársai [104] keratinocitákban találtak egy alternatív mRNS variánst, amelyből az 5. exon hiányzik. Bár a deléció nem tolja el a leolvasási keretet, a keletkező fehérje inaktív, sőt domináns negatívként a vele együtt kifejeződő normál fehérje funkcióját is gátolja. Leírták, hogy differenciációjuk során a keratinociták Ca2+-ra való válaszképessége csökken, és ez érdekes módon együtt jár a rövidebb variáns expressziójának megnövekedésével [104]. A CaR gén 5’ nem transzlálódó régiójában is lehetségesek splice variánsok. Pl. az emberi mellékpajzsmirigyben többféle átirat fordul elő, melyekben különbözik az 5’ UTR, ám a kódoló régió megegyezik [49]. A gén 5’ szabályozó régióiban bekövetkező alternatív splicingnak szerepe lehet a szövetspecifikus expresszióban vagy a gén szabályozásában. A CaR expressziója és szerepe a kalcium-homeosztázisban részt vevő szövetekben A CaR magas szinten fejeződik ki mellékpajzsmirigyben [15], a pajzsmirigy Csejtjeiben [50], a vese különböző sejttípusaiban [120], a vékony- és a vastagbél epitélsejtjeiben [26], valamint a csontképző oszteoblasztokban és a csontlebontó oszteoklasztokban [23, 60]. A paratiroid sejtek a fentebb már vázolt módon érzékelik az extracelluláris kalciumszint változásait, és annak megfelelően változatják inverz módon a PTH szekrécióját. A pajzsmirigy C-sejtjein ugyanolyan CaR-ok vannak, mint a mellékpajzsmirigyben. Ha megnő az extracelluláris kalciumszint, az megnöveli a C-sejtek kalcitoninszekrécióját [50], ami azután hipokalcémiás hatást fejt ki. A PTH és a kalcitonin szekrécióját tehát ugyanaz a receptor szabályozza, de ellentétes módon: a CaR aktiváció a PTH szekrécióját gátolja, míg a kalcitonin elválasztását serkenti. Vesében a CaR kulcsszerepet játszik a divalens kationok (Ca2+, Mg2+), egyéb elektrolitok (pl. Na+, K+, Cl–), valamint a víz forgalmának szabályozásában [44, 116, 120]. Felnőtt vesében a CaR majdnem a teljes nefron mentén kifejeződik: a proximális tubulus kanyarulatos és egyenes szakaszán apikálisan; a disztális tubulus medulláris (MTAL) és kortikális (CTAL) szakaszán, valamint a disztális kanyarulatos tubulusban a bazolaterális membránban; végül a gyűjtőcsőnek a medulla belső részére eső szakaszán (IMCD) luminálisan [121]. A bazolaterálisan elhelyezkedő CaR-nak a disztális
18
tubulusban az a szerepe, hogy érzékelve a magas peritubuláris kalcium- vagy magnéziumszintet, negatív visszacsatolással gátolja a divalens kationok paracelluláris visszaszívását. Az IMCD területén apikálisan elhelyezkedő CaR-ok szerepe pedig valószínűleg az, hogy érzékelve a vizelet magas kalciumszintjét, gátolják az AQP2 vazopresszin hatására bekövetkező transzlokációját az apikális membránba. Ez a homeosztatikus mechanizmus akadályozza meg, hogy dehidráció során a keringő vazopresszin
magasabb
szintje
hatására
túlzottan
megemelkedjék
a
vizelet
kalciumszintje, ami kalciumsók kicsapódásának és így vesekő kialakulásának veszélyével járna. A proximális tubulusban apikálisan elhelyezkedő CaR csökkenti a 25-hidroxi-D-vitamin átalakítását 1,25-dihidroxi-D-vitaminná a sejtekben [30]. A CaR expresszióját a bélben is leírták [26]. Kifejeződik a receptor a vékonybél villusaiban bazálisan és gyengébben apikálisan is; a vékonybél kriptákban bazálisan; a vastagbél Lieberkühn-kriptáiban pedig mind bazálisan, mind apikálisan. Megfigyelhető továbbá a CaR a vékony- és a vastagbél plexus myentericusában, valamint a Meissnerplexus régiójában a szubmukózában. A CaR szerepe a bélrendszerben még nem tisztázott. A bélidegrendszerben való jelenléte révén részt vehet a bélmotilitás szabályozásában,
a
villus
epitélsejtjeiben
pedig
a
kalciumfelvétel
negatív
visszacsatolásos szabályozásában [30]. A csontrendszer kulcsszerepet játszik a szervezet kalcium-homeosztázisában. A csontok folyamatos, dinamikus átépülésében az oszteoklasztok és az oszteoblasztok a meghatározó szereplők. Az oszteoklasztok bontják, az oszteoblasztok építik a csontokat. Mindkét sejten leírták a CaR-ok expresszióját. A magas extracelluláris Ca2+-szint szabályozza az oszteoblasztok kemotaxisát, proliferációját és differenciációját [117]. Oszteoklasztokban a külső Ca2+-szint emelkedése megváltoztatja a sejtek morfológiáját és gátolja a csontok reszorpcióját [122]. A CaR funkciója a kalcium-homeosztatikus rendszeren kívül A kalcium-érzékelő receptorokat megtalálták olyan szövetekben is, amelyek nem vesznek részt a szevezet kalcium-homeosztázisának szabályozásában. A CaR serkenti a Rat-1 fibroblaszt sejtek [87] és a petefészek epitélsejtek [86] osztódását, a keratinociták differenciációját [8], valamint a gyomor antrum G-sejtjeinek gasztrinszekrécióját [119]. Kimutatták, hogy a placenta citotrofoblasztban a CaR [12] szabályozhatja az anyai oldalról a magzatira irányuló kalciumtranszportot [80].
19
A receptor az agyban is számos területen előfordul: a szubfornikális szervben, a szaglógumóban, a hippocampusban, a striatumban, a kisagyban, a cinguláris kéregben, az agykamrák ependimális területein, valamint az agyi artériákat körülvevő perivaszkuláris idegekben [30]. Elképzelhető, hogy a szubfornikális szervben a CaR részt vesz a szervezet folyadék- és elektrolit-háztartásának központi szabályozásában. A hippokampuszban a szinaptikus áreában fordul elő a receptor, eloszlása hasonló a metabotróp és az ionotróp glutamátreceptorokéhoz, szerepe egyelőre ismeretlen. A CaR az agy területén nemcsak az idegsejtekben fejeződik ki. Megtalálták oligodendroglia sejtekben [27], mikrogliában [28]és az U87 emberi asztrocitóma sejtvonalban [29]. A CaR agonistái stimulálták a Ca2+-aktiválta káliumcsatornákat mindhárom sejttípusban. Ezek a sejtek részt vesznek az agyban a lokális ionhomeosztázis szabályozásában, amiben a CaR fontos szerepet játszhat: mivel az extracelluláris kalciumszint neuronális aktivitás miatt bekövetkező csökkenése az extracelluláris káliumszint emelkedésével jár, az oligodendroglia-sejteken található CaR-ok csökkent működése valószínűleg a Ca2+-aktiválta káliumcsatornák működését is csökkenti, ami megakadályohatja az extracelluláris kalciumszint további növekedését [30]. Az emberi szemlencse epitélsejtjeiben is kifejeződik a receptor [25]. Mivel a hipokalcémiát összefüggésbe hozták a szürkehályog kialakulásával, elképzelhető, hogy a receptor szerepet játszik a lencse ionhomeosztázisában. Patkány hasnyálmirigyben is megtalálták a CaR-t [18], acinusokban, duktuszokban és szigetekben egyaránt. Leírták, hogy a duktuszokban luminálisan elhelyezkedő receptor agonistával történő stimuláció hatására serkenti a folyadék- és bikarbonátszekréciót. A CaR-hoz kapcsolódó szignalizációs útvonalak Mellékpajzsmirigy sejtekben a CaR agonisták foszfolipáz C-t, -A2-t és -D-t aktiválnak. Elsődleges tenyészetben 3–4 nap után ez a válaszképesség erőteljesen csökken, párhuzamosan azzal, ahogy a sejtekben a CaR expressziója is csökken [75]. Az intracelluláris kalciumszint CaR agonisták által kiváltott tranziens emelkedése valószínűleg a foszfolipáz C (PLC) aktivációjának, és így a keletkező inozitoltriszfoszfátnak köszönhető. A PLC aktiválása valószínűleg Gq/11-en keresztül történik, ezt erősíti meg az is, hogy a folyamat pertusszisz toxinnal nem gátolható. Mellékpajzsmirigy sejtekben a CaR a Cai elhúzódó emelkedését is kiváltja Ca2+-influx
20
útvonalakon keresztül, nem-szelektív kationcsatornák kinyitása révén [143]. Szintén paratiroid sejtekben a CaR stimulálása pertusszisz toxinnal gátolható módon gátolja a cAMP akkumulációját, vagyis valószínűleg Gi-függő módon [75]. Az emberi gyomor antrális G-sejtjeiben az extracelluláris Ca2+-szint növelése megemeli az intracelluláris Ca2+-szintet és dózisfüggő módon serkenti a gasztrin elválasztását [119]. Patkány gyomor parietális sejtekben a CaR agonisták szintén megemelik a sejten belüli Ca2+-szintet [33]. Milyen jelátviteli útvonalakon keresztül szabályozza a CaR a sejtosztódást és a differenciációt? A receptor a rat-1 fibroblasztokban a proliferációt a p42/p44ERK mitogén-aktiválta protein kináz kaszkádon keresztül serkenti [87]. Ugyanakkor a CaR gátolja a mellékpajzsmirigy sejtek osztódását, ennek mechanizmusa viszont még nem ismert [30]. Az extracelluláris kalciumszint enelkedése, minden bizonnyal a CaR-on keresztül hatva, serkenti többféle sejttípus, így pl. a keratinociták differenciációját. Ennek a hatásnak a közvetítésében többféle szignáltranszdukciós útvonal is közreműködhet, így pl. az inozitolfoszfát-metabolizmusban bekövetkezett változások [104], valamint az intracelluláris kalciumszint megemelkedése sejten belüli raktárakból való felszabadulás, ill. nem-szelektív kationcsatornán át történő kalciumbeáramlás révén [143]. A CaR mutációk révén bekövetkező betegségek Számos, a kalcium-homeosztázist érintő örökletes betegség hátterében a CaR gén funkcióvesztéses vagy funkciónyeréses mutációja áll. Ilyen kórképek a familiális hipokalciuriás hiperkalcémia (FHH), a neonatális súlyos hiperparatiroidizmus (NSHPT), valamint az autoszómás domináns hipokalcémia (ADH). Az FHH autoszómás, dominánsan öröklődő betegség [24]. A CaR gén heterozigóta formában meglévő inaktiváló mutációjára vezethető vissza. Életen át tartó, enyhe vagy közepes,
általában
tünetmentes
hiperkalcémiával
jár.
A
beteg
egyének
hiperkalcémiásak, a PTH-szintjük ennek ellenére normális (nem szupprimált), vizeletükben kevés a kalcium. Mindezen tünetek oka az, hogy esetükben egyrészt túl magas szérum kalciumszint szükséges a PTH-szekréció gátlásához, másrészt a veséjükben túl magas a kalcium-visszaszívás, mivel a két szervben alacsony számban vannak jelen működő CaR-ok. A betegség általában enyhe lefolyású, mindössze fokozott megfigyelést tesz szükségessé.
21
A neonatális súlyos hiperparatiroidizmusban (NSHPT) szenvedő újszülötteknél súlyos hiperkalcémia és a szérum PTH abnormálisan magas szintje tapasztalható [111]. Ha nem történik meg a paratiroidektómia a születés után pár héten belül, az akár végzetes is lehet ezekben az újszülöttekben [24]. A magas halálozási arány oka a súlyos hiperkalcémia és a hiperparatiroidizmus, ami a csont demineralzációjához és csonttörésekhez vezethet. Ennek a súlyos kórképnek az oka a CaR gén mutációja homozigóta vagy compound heterozigóta formában; esetleg az egyik allél normális, de a mutáns domináns negatív hatása érvényesül. Az aktiváló CaR mutációk autoszómás domináns hipokalcémiát (ADH) vagy egy bizonyos fajta sporadikus hipokalcémiát okoznak, amelyek a hipoparatiroidizmusra emlékeztetnek.
ADH-ban
a
hiperkalciuria
általában
nagyobb
mérvű,
mint
hipoparatiroidizmusban [112]. Ez a betegség arra vezethető vissza, hogy mutáció folytán a CaR érzékenyebb lesz a kalciumra, ezért már alacsony szérum kalciumszint mellett is gátolja a mellékpajzsmirigy sejtek PTH-szekrécióját.
Az akvaporinok A víz mozgása a szövetekben Számos olyan epitélium van a szervezetben, amelyen keresztül működése során rendkívül nagy mennyiségű folyadék áramlása figyelhető meg. Ezen szervek közé tartozik a vese, vagy a gasztrointesztinális rendszeren belül a nyálmirigy, a gyomor, a hasnyálmirigy (szekréciós epitélium), ill. a bél (abszorpciós epitélium). A hámokon keresztül transzportálódó folyadékok vízből és benne oldott sókból állnak. Általános alapelv, hogy az ionok aktív vagy passzív transzporttal jutnak át a membránokon, majd azokat követi a víz az ozmotikus grádiens vagy a hidrosztatikai nyomás esésének irányában. A különböző ionok transzportjáért felelős csatornafehérjék, pumpák régóta ismertek. Mivel a víz diffúzióval átjut a sejtmembránokon, ill. nem túl szorosan záródó epitéliumok esetén paracellulárisan is, eleinte azt gondolták, hogy az ionokétól eltérően mozgásához nincs szükség transzportmolekulá(k)ra. Ám világossá vált, hogy intenzív folyadékmozgáshoz nagy vízáteresztő-képességű membrán szükséges [130], a diffúzió pedig önmagában nem magyarázza egyes membránok ezen sajátosságát. Nem meglepő
22
tehát, hogy a nagy áteresztő-képességű epitéliumokban a víz gyors transzcelluláris áramlását vízcsatornák, akvaporinok teszik lehetővé.
Az első akvaporin felfedezése Az első akvaporin felfedezése a véletlennek köszönhető. Az Rh vércsoportfehérje 32 kDa-os polipeptid komponensét próbálták tisztítani, melynek során egy 28 kDa nagyságú szennyező fehérjét különítettek el [2]. A fehérje rosszul oldódik az Nlauroilszarkozin
detergensben,
e
tulajdonságának
köszönhetően
sikerült
nagy
mennyiségben tisztítani. A 28 kDa-os fehérjéről kimutatták, hogy magas szinten fejeződik ki vörösvértestekben és vese proximális tubulusokban [40], melyekről köztudomású, hogy igen nagy a vízpermeábilitásuk. A fehérjéről kimutatták, hogy tetramer
integráns
membránproteinként
fordul
elő:
ez
a
szerkezet
számos
membráncsatornára jellemző [128]. Az N-terminális aminosavszekvencia alapján klónoztak egy 269 aminosavat kódoló cDNS-t [113], az erről transzlálódó fehérjét CHIP28-nak (28-kDa channel-like integral protein) nevezték el. A fehérjét a Wright és munkatársai [139] által kifejlesztett technika alkalmazásával afrikai karmosbéka (Xenopus laevis) petesejtjében fejezték ki CHIP28 cRNS (cDNS-ről átírt RNS) mikroinjekciójával (a karmosbéka petesejtjének membránja alig ereszti át a vizet). A következmény az lett, hogy a petesejtek hipotóniás közegben rohamos gyorsasággal
durrantak
ki,
míg
a
kontrollként
vízzel
injektált
petesejtek
vízpermeábilitása egy nagyságrenddel alacsonyabb volt [113]. Kitűnt tehát, hogy a vizsgált fehérje egy vízcsatorna. Utalva funkciójára, át is nevezték a fehérjét, és CHIP28-ból akvaporin-1 (AQP1) lett [3]. Az akvaporin-1 szerkezete Az AQP1 fehérje legnagyobbrészt a lipid kettősrétegben helyezkedik el [113]. Az AQP1 molekula N- és C-terminális fele egymással homológ, mindkettő tartalmazza az Asn-Pro-Ala (NPA) motívumot [138]. A molekula hat hidrofób transzmembrán hélixszel rendelkezik (7. ábra), köztük hurkokkal. A molekula két felét a C hurok köti össze. A hurkok közül kettő hidrofób (az ábrán B-vel és E-vel jelölve), e két hurok alkotja a vízáteresztő pórust [73]. A pórus szerkezete olyan, hogy vízre kitűnő szelektivitást és nagy áteresztőképességet biztosít, azon már egy protonált vízmolekula
23
(oxónium-ion) és egyéb töltött részecskék sem képesek áthaladni. Ez magyarázza pl., hogyan képes a vese naponta hektoliteres mennyiségben vizet visszaszívni, míg közben a savat kiválasztja. Az AQP1 működése higanyvegyületekkel gátolható, ennek támadáspontja az E hurkon található [114]. Az AQP1 molekula szerkezetét a molekula alakjára utaló, ún. homokóra-modellel írták le ([73], 7. ábra). Az AQP1 membránokban tetramerként fordul elő (8. ábra). Ám az ioncsatornáktól eltérően, ahol négy monomer vesz körül egyetlen pórust, az AQP1 mind a négy alegysége saját pórussal rendelkezik [5].
7. ábra: Az AQP1 homokóra-modellje. Fent: Egy AQP alegység hat transzmembrán hélixet tartalmaz. Az 1–3. és a 4–6. hélixet, valamint egy-egy NPA motívumot tartalmazó régió homológ, egy ősi génduplikáció eredménye. Lent: A C hurok mentén a molekula meghajlik, az NPA motívumok egymás mellé kerülnek, és létrehozzák a vízáteresztő pórust. Az ábra forrása: [99].
8. ábra: Az AQP1 tetramerként fordul elő a sejtmembránban. Minden monomernek megvan a saját pórusa. A négyből egy monomerhez glikánmolekula kapcsolódik. Az ábra forrása: [99].
Akvaporin izoformák és élettani szerepük különböző szövetekben, köztük hasnyálmirigyben Az AQP1 felfedezését követően még tíz másik akvaporin izoformát írtak le különböző emlős szövetekben, ahol a víztranszport fontos szerepet játszik ([4], 9. ábra). Az AQP2-t patkány vese gyűjtőcsőből klónozták [47]. Az AQP2 is megnövelte a karmosbéka petesejt vízpermeabilitását, működését pedig higanyvegyületekkel gátolni
24
lehetett. A fehérjét a gyűjtőcső fősejtjein mutatták ki, és leírták, hogy expressziója éhező patkányokban megemelkedik [94]. További vizsgálatokban [96] meghatározták az AQP2 elhelyezkedését és funkcióját a gyűjtőcsőben. Izolált, perfundált patkány gyűjtőcsövekben mid a víztranszportot, mind az AQP2 lokalizációját vizsgálták vazopresszinnel történő kezelés előtt, közben és után. Kezeletlen preparátumokban az AQP2 intracelluláris vezikulumokban található. Vazopresszin hatására az AQP2 az apikális membránba transzlokálódik, ami a vízpermeabilitás ötszörös emelkedését hozza. A kezelés megszüntetése után az AQP2 visszakerül a vezikulumokba, a gyűjtőcsövek vízáteresztő képessége pedig visszatér az alapértékre. Később kimutatták, hogy az AQP2 exocitózisát receptorfüggő módon a protein kináz A szabályozza Cterminális szerinfoszforiláción keresztül [35]. Akvaporinok
9. ábra: A csak vizet áteresztő akvaporinok, valamint a vizet és glicerint áteresztő akvagliceroporinok. Az AQP10-et még csak mRNS szinten azonosították. Az E. coli AQP homológok is fel vannak tüntetve (AqpZ és GlpF). Alul a vonal a genetikai távolságot jelöli a homológok között. Az ábra forrása: [5].
Akvagliceroporinok
Az AQP6-ot patkány vese gyűjtőcső savszekretáló alfa-interkaláris sejtjeiben írták le, ahol kimutatták, hogy intracelluláris vezikulumokban a H+-ATPázzal kolokalizálódik, a plazmamembránban pedig nem található meg [141, 142]. Az AQP6 igen érdekes akvaporin, mivel a karmosbéka petesejt vízpermeabilitását alig növeli meg. Ugyanakkor ez a hatás higany-kloriddal nem gátolható, sőt kis dózisban serkenthető [141]. Az AQP6 lokalizációja azt sugallja, hogy a fehérje a gyűjtőcső savszekretáló alfa-interkaláris sejtjeinek működésében tölthet be fontos szerepet. Még az akvaporinok felfedezése előtt azonosítottak szemlencsében egy csak ott kifejeződő, ismeretlen funkciójú proteint, amit akkor major intrinsic proteinnek (MIP)
25
neveztek el [52, 145]. Aztán az akvaporinok felfedezése után rájöttek, hogy a MIP ezekkel a fehérjékkel homológ. A MIP-et is kifejezték karmosbéka petesejtben, ahol enyhe,
higanyvegyületekkel
nem
gátolható
emelkedést
idézett
elő
a
vízpermeabilitásban, ezért AQP0-nak nevezték el [90]. Az AQP0 szerepe a szemlencsében valószínűleg a víz eltávolítása. Ugyanakkor az is elképzelhető, hogy a fehérjének sejt-sejt adhéziós molekulaként lehet szerepe [43]. Az AQP4-et patkány agyból klónozták [72], ahol nagy mennyiségben fordul elő. Ez az akvaporin nem gátolható higanyvegyületekkel [57], de az AQP1-hez hasonlóan konstitutívan aktív. Az AQP4 az asztroglia-sejtekben perivaszkulárisan helyezkedik el, szerepe valószínűleg a fölösleges víz eltávolítása, ami különösen agyödémában lehet kulcskérdés [98]. Az AQP4 szintén megtalálható az ozmoszenzoros agyterületeken (pl. nucleus
supraopticus)
a
vazopresszin-szekretáló
neuronokat
körülvevő
gliasejtrétegekben, ahol valószínűleg ozmoreceptorként működik [98], valamint előfordul a cerebrospinális folyadékkal töltött üregeket körülvevő ependima-sejtekben is [45]. Retinában és látóidegben különösen sok az AQP4 az üvegtesttel szomszédos Müller-sejtek végtalpaiban és az ér endotéliumban [92]. Az AQP4 a vese gyűjtőcsövek fősejtjeinek bazolaterális membránjában is előfordul [99]. Az AQP5-öt patkány nyálmirigyből klónozták [118]. Expressziója az apikális membránban
figyelhető
meg
alveoláris
pneumocitákban,
nyálmirigyben
és
könnymirigyben. Valószínűleg fontos a szerepe a légutak nedvesítésében, valamint a nyál- és könnyelválasztásban [97]. Az AQP8 cDNS-t patkány heréből [65], valamint patkány hasnyálmirigyből és májból [81] izolálták. Patkány hasnyálmirigyben az acinusok apikális membránján található, szerepe hasonló lehet az AQP5 nyálmirigyben betöltött szerepéhez: a vízáramlás fő útját jelentheti az apikális membránon át történő izotóniás, kloridban gazdag nedv szekréciója során [63]. Az AQP8 mRNS-t kimutatták vastagbélben, nyálmirigyben és egyéb szövetekben is [10]. Akvagliceroporin izoformák és élettani szerepük a különböző szövetekben Eddig olyan akvaporinokról esett szó, amelyek szelektíven kizárólag vizet eresztenek át. Az akvaporin család bizonyos tagjai glicerint, ureát, egyéb kismolekulájú anyagokat is átereszthetnek, ezek az akvagliceroporinok ([10], 7. ábra). Az első klónozott akvagliceroporin az AQP3 volt. Leírták vesében [41], légutakban [97], bőrben [93] és
26
szemben [55]. A vesében a gyűjtőcsövek fősejtjeinek bazolaterális membránjában fordul elő, a vízvisszaszívásban játszik szerepet. Az apikális membránon található AQP2-vel alkotja együttesen a transzcelluláris útvonalat, amelyen keresztül a víz a vese gyűjtőcső lumenjéből az intersticiumba távozik. Az AQP7-et zsírszövetben találták meg és kimutatták, hogy vizet és glicerint képes átereszteni [64, 76]. A zsírsejtekben található AQP7 a trigliceridek lebontásakor keletkezett
glicerin
számára
biztosíthat
kiutat
a
sejtből
[5].
Az
AQP9-et
fehérvérsejtekből klónozták [66], májban is kimutatták [136]. Vizet, glicerint és több egyéb kismolekulájú anyagot is szállít. Az AQP9 biztosíthatja a belépési lehetőséget a glicerin számára a hepatocitákba, ahol a glükoneogenezis történik [5]. Az akvaporinok szerepe egyes betegségekben Találtak olyan embereket, akikben mindkét AQP1 allél hibás, vagyis AQP1 null fenotípust mutatnak [115]. Meglepő módon a mindennapi életben ezek az emberek teljesen tünetmentesek. Részletes klinikai vizsgálatokban ugyanakkor kimutatták, hogy ezek a páciensek vizeletkoncentráló képessége csökkent, ami dehidráció esetén fokozott veszélybe sodorhatja őket. Ennek oka a Henle-kacs leszálló ágának, valamint a vasa rectának
csökkent
víztranszportja,
ami
miatt
nem
lehetséges
a
medulláris
hiperozmolaritás és ezzel a hatékony ellenáramú koncentráló mechanizmus kialakulása. A nefrogén diabetes insipidus (NDI) olyan betegség, amelyről korábban kimutatták, hogy V2 vazopresszin-receptor génjében bekövetkezett mutáció okozza [7]. Ám más kutatók találtak olyan NDI pácienseket, akiknek nem volt V2 mutációjuk.
Róluk
kiderítették, hogy az AQP2 génjük transzmembrán és pórus régiójában vannak mutációk [39], amelyek hatására a fehérje abnormális feltekeredése miatt az endoplazmatikus retikulumban marad. Az AQP2 expressziója a vazopresszin-hiány miatt kialakuló klasszikus diabetes insipidusban is alacsony [5]. Az AQP5 fontos élettani szerepet játszik az emberi szemben. Kifejeződik a szaruhártya epitéliumban a szem felszínén [55], ahol valószínűleg hozzájárul az epitélium hidrációjához és átlátszóságához, valamint szerepet játszhat a sebgyógyulásban. Megfigyelték, hogy Sjögren-szindrómás betegek könnymirigyeiben a fehérje sejten belüli transzportja abnormális [135]: Sjögren-szindrómás betegek acinussejtjeiben apikális helyett citoplazmatikus lokalizációt mutat. Ennek pontos jelentősége egyelőre
27
nem ismert. Az AQP5 hozzájárulhat a hiper- vagy hipohidrózis bizonyos formáihoz, mivel AQP5 -/- egerekben drámaian csökkent a működő verejtékmirigyek száma [93].
A kalcium-érzékelő receptorok és az akvaporinok lehetséges szerepe a hasnyálmirigy folyadék- és ionhomeosztázisában A hasnyálmirigy acinussejtjeinek szekretoros granulumaiból az emésztőenzimekkel együtt jelentős mennyiségű kalcium ürül az acinusok lumenébe. Az acinusokból a duktuszokba kerülő folyadéknak ezért lokálisan igen magas lehet a kalciumszintje, ami magában hordozza a kalciumsók kicsapódásának veszélyét. A duktuszok által termelt bőséges folyadék kulcsszerepet játszik nemcsak az emésztőenzimek szállításában, hanem térfogata révén a kalcium kihígításában is. Leírták, hogy patkányban a hasnyálmirigy duktuszokban luminálisan elhelyezkedő kalcium-érzékelő receptor agonistával történő stimuláció hatására serkenti a folyadékés bikarbonátszekréciót [18]. Ez egy homeosztatikus mechanizmus jelenlétére utal. Akvaporinokat is találtak a patkány hasnyálmirigy duktuszaiban [46, 63, 77]. E vízcsatornák az epitéliumon keresztül történő vízmozgást teszik lehetővé, így fontos szerepet játszanak a CaR-ok aktivációja által beindított folyadékszekrécióban. Amennyiben sikerülne emberi hasnyálmirigyben is kimutatni mind a kalcium-érzékelő receptorok, mind az akvaporinok jelenlétét a duktuszokon, az valószínűsítené, hogy emberben is hasonló homeosztatikus rendszer működik, mint patkányban.
28
CÉLKITŰZÉSEK Céljaink az alábbiak voltak: 1. A
kalcium-érzékelő
receptor
mRNS
és
fehérje
expressziójának
és
lokalizációjának vizsgálata egészséges és daganatos emberi hasnyálmirigymintákban, pankreász adenokarcinóma sejtvonalban, valamint emberi exokrin hasnyálmirigy sejtek primér tenyészeteiben; 2. A
receptorok
működésének
és
proliferációra
gyakorolt
hatásának
tanulmányozása; 3. Az akvaporin izoformák expressziójának és lokalizációjának tanulmányozása emberi hasnyálmirigyben, valamint az emberi és a rágcsáló hasnyálmirigy összehasonlítása; 4. Az akvaporinok és a CFTR kolokalizációjának meghatározása révén azonosítani a duktuszfa azon szegmenseit, amelyek elsődleges szerepet játszanak a folyadékszekrécióban. Vizsgálataink révén mélyebb betekintést reméltünk a hasnyálmirigy duktális működésének
szabályozásába,
valamint
kulcsfontosságú folyamataiba.
29
az
ion-
és
folyadékhomeosztázis
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Szövetminták A kóros hasnyálmirigy szövetminták daganat vagy krónikus pankreátitisz, az agyminták epilepszia miatt operált betegekből származnak. Egészséges hasnyálmirigy mintákhoz szervdonoroktól vagy trauma miatt részleges mirigyeltávolításon átesett egyénektől jutottunk hozzá. A nyálmirigy minták egészséges önkéntesektől származnak. Élő páciens esetén tájékoztatást követően annak előzetes írásos beleegyezésével, minden esetben megfelelő etikai engedély birtokában történt a mintavétel. Az RNS-preparálásra szánt mintákat folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, majd a feldolgozásig –70°C-on tároltuk. A később immunhisztokémiával vizsgált mintákat formalinban fixáltuk, majd paraffinba beágyaztuk.
Sejttenyésztés A sejtvonalakat az „American Type Culture Collection”-től (ATCC) szereztük be. A Capan-1 és a Capan-2 jól differenciált sejtvonalak, egy 40 és egy 56 éves europid férfiből származnak. A differenciálatlan MiaPaCa-2 egy 65 éves, a gyengén differenciált Panc-1
egy 56 éves europid férfiból származik. Az HPAF jól
differenciálódott, ám heterogén sejtvonal. A sejteket 10% fötális borjú szérumot, 100 U/ml penicillint és 100 µg/ml streptomicint tartalmazó RPMI 1640 (Sigma, Egyesült Államok) tápfolyadékban (Capan-1, Capan-2), illetve Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM; Sigma, Egyesült Államok) tápfolyadékban (HPAF, MiaPaCa-2 és Panc-1) tenyésztettük. A kultúrákat tenyésztő palackokban tartottuk fenn és 37°C-on 100% relatív páratartalom mellett, 5% CO2-dal dúsított levegővel ellátott termosztátban inkubáltuk. A tápfolyadékot 3 naponként cseréltük. Az összes műveletet steril körülmények között végeztük.
RNS izolálása és reverz transzkripció Az emberi szövetmintákból és a sejtvonalakból a teljes RNS-t a TRI Reagens (Sigma, Budapest) segítségével izoláltuk a gyártó útmutatásai alapján. A normális emberi
30
exokrin hasnyálmirigy sejtek tenyészeteiből, valamint az azok immortalizálásával előállított M540 sejtvonalból preparált RNS Dr. Francisco Real (Institut Municipal d’Investigacio Medica, Barcelona, Spanyolország) ajándéka. A reverz transzkripciót (RT) 5 µg teljes RNS-ből végeztük SuperScriptII reverz transzkriptáz (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) segítségével a gyártó utasítása alapján. A 20 µl végtérfogatú reakcióelegy 1–5 µg RNS-t, 0,5 µg oligo(dT)12-18-t, 50 mM Tris-HCl-t (pH=8,3), 75 mM KCl-ot, 3 mM MgCl2-ot, 10 mM DTT-t, a négyfajta dezoxinukleotid trifoszfátból egyenként 0,5 mM-t, valamint 200 egység (U) SuperSriptII-t tartalmazott. A vízzel hígított RNS-t 70°C-on 15 percig denaturáltuk, majd jégen lehűtöttük. Ezután 2 percig 42°C-on inkubáltuk az oldatot, majd a reverz transzkriptáz bemérése után 50 perc következett 42°C-on, végül 10 perc 70°C-on.
Polimeráz láncreakció az AQP1, -3, -4 és -8 kimutatására A reakcióelegy 20 µl végtérfogatban 0,5 U TaKaRa ExTaq polimerázt (Takara, Shiga, Japán), 10 mM TrisHCl-t, 50 mM KCl-ot, 1,5 mM MgCl2-ot, minden dNTP-ből 0,2 mM-t tartalmazott, valamint 500 nM koncentrációban a primereket (AQP1: 5’-GTC TTC ATC AGC ATC GGT TC-3' (sense), 5’-GTC GGC ATC CAG GTC ATA CT-3' (anti-sense), termékméret: 701 bp; AQP3: 5’-CCT TTG GCT TTG CTG TCA CTC-3' (sense) 5’-ACG GGG TTG TTG TAA GGG TCA-3' (anti-sense), termékméret: 373 bp; AQP4: 5’-TCC CTT TGC TTT GGA CTC AG-3' (sense) 5’-TTC CCC TTC TTC TCC TCT CC-3' (anti-sense), termékméret: 719 bp; AQP8: 5’-GGT ACG AAC GGT TTG TGC AG-3' (sense), 5’-CCA TCT CCA ATG AAG CAC CT-3' (anti-sense), termékméret: 667 bp). 94°C-on történő 3 perc kezdeti denaturáció után 30 ciklust végeztünk a következő hőmérsékleti profillal: 94°C, 30 mp; 63°C, 45 mp; 72°C, 60 mp AQP1, -4 és -8-ra; 94°C, 30 mp; 65°C, 45 mp; 72°C, 60 mp AQP3-ra. Az amplifikációt 10 perces inkubáció zárta 72°C-on.
AQP5 PCR 0,5 U Promega Taq polimerázt (Promega, Madison, Wisconsin, USA) használtunk 0,3 U Pfu polimerázzal (Promega) együtt 20 mM Tris HCl (pH 8,8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1% Triton X-100, 0,1 mg/ml nukleázmentes marha
31
szérumalbumin (BSA), 0,2 mM dNTP, valamint mindkét primerből (5’-CTT CCT CAA GGC CGT GTT C-3' (sense), 5’-GCT GGA AGG TCA GAA TCA GC-3' (anti-sense), termékméret: 398 bp) 500 nM jelenlétében. A 94°C-on történő 3 perces kezdeti denaturáció utáni 30 ciklus hőmérsékleti profilja: 94°C, 30 mp; 63°C, 30 mp; 72°C, 120 mp. Az amplifikációt 10 perces inkubáció zárta 72°C-on.
CaR PCR A reakcióelegy 25 µl végtérfogatban a cDNS mellett 0,5 U Taq és 0,3 U Pfu polimerázt (Promega, Madison, Wisconsin, USA), 20 mM Tris HCl-t (pH 8,8), 10 mM KCl-t, 10 mM (NH4)2SO4-ot, 2 mM MgSO4-ot, 0,1% Triton X-100-at, 0,1 mg/ml nukleázmentes BSA-t, 0,2 mM dNTP-t tartalmazott, valamint 200 nM koncentrációban a két primert: CaR864-21F (5'-GGT CAG TTA TGC CTC CTC CAG-3'), sense primer a 3. exonból, il. CaR2123-22R (5'-TTG TTA CAG GCA CTG GCA TCT G-3'), anti-sense primer a 7. exonból). 95°C-on 2 percig denaturáltuk a mintákat, majd amplifikáció következett 30 cikluson keresztül: 96°C 10 mp (denaturáció), primer kötődés, majd 72°C-on 1 perc/1000 bp amplikon hossz (szintézis). Az első 5 ciklus alatt a primerek kötődése 58°C-on 20 mp-ig történt. A következő 10 ciklus során a kötődés hőmérséklete 58°C-ról indult, majd ciklusonként 0,8°C-kal csökkent. A kötődés időtartama 20 mp-ről indult, majd ciklusonként 2 mp-cel nőtt. Az utolsó 15 ciklus folyamán a kötődési lépés 50°Con 40 mp-ig tartott. A 30 ciklus végeztével a mintákat 72°C-on inkubáltuk 5 percig.
A PCR-termékek vizsgálata Az amplifikációs reakciók termékeit méretüknek megfelelő töménységű, etidiumbromidot tartalmazó agaróz gélen futtatuk meg. Utána egyrészt lúgos blottolással nejlon membránra vittük őket, majd radioaktívan jelölt specifikus próbával történő hibridizációval azonosítottuk őket. Másrészt a megfelelő méretű csíkokat kivágtuk, és specifitásukat restrikciós hasítással vagy szekvenálással ellenőriztük, amelyhez a PRISM BigDye Terminator v3.0 szekvenáló kitet (Applied Biosystems, Foster City, California, USA) használtuk.
32
A CaR teljes kódoló régiójának klónozása és szekvenálása Egészséges emberi hasnyálmirigyből származó RNS-ről reverz transzkripcióval cDNS-t írtunk át, majd erről amplifikáltuk az mRNS teljes fehérjekódoló régiójának megfelelő cDNS szakaszt a fentebb leírt körülmények alkalmazásával: a reakcióelegy 25 µl végtérfogatban a cDNS mellett 0,5 U Taq és 0,3 U Pfu polimerázt, 20 mM Tris HCl-t (pH 8,8), 10 mM KCl-t, 10 mM (NH4)2SO4-ot, 2 mM MgSO4-ot, 0,1% Triton X-100-at, 0,1 mg/ml nukleázmentes BSA-t, 0,2 mM dNTP-t tartalmazott, valamint a két primert 200 nM koncentrációban. A primereket az emberi mellékpajzsmirigyben leírt szekvencia [49] alapján terveztük, 5’ szakaszukra a klónozás megkönnyítésére restrikciós enzimek hasítóhelyeit iktattuk be. A következő két oligonukleotidot használtuk: „HindIII SalI CaR179-22F” (5'-TAT CAA GCT TCC GTC GAC GAC CAC CCA CAT TAC AAG TCT G-3') és „XbaI NotI CaR3633-21R” (5'-CAT GTC TAG AGC GGC CGC CTA GCC CAG TCT TCT CCT TCC-3'). A hőmérsékleti profil ugyanaz volt, mint amit a CaR PCR-ben alkalmaztunk, mindössze a ciklusok 72°C-os extenziós lépésének hosszát növeltük meg 3 és fél percre a nagyobb termékméretnek megfelelően. A PCR-ben a várt hosszúságú (3455 bp) terméket kaptuk, ezt elektroforézist követően az agarózból kivágtuk, megtisztítottuk, NotI és SalI enzimekkel megemésztettük, majd pBluescriptII KS vektorban (Stratagene, La Jolla, California, USA) klónoztuk. A kapott „pBluescriptII KS hpCAR” klónokat kék-fehér szelekcióval izoláltuk, majd génspecifikus és vektorspecifikus szekvenáló primerek segítségével nukleotidsorrendjüket meghatároztuk.
Kontroll reakciók A vizsgálatok során az XS13 savas riboszomális foszfoprotein cDNS-ét amplifikáltuk belső kontrollként, a bevitt cDNS mennyiségének és minőségének ellenőrzésére. Az XS13-ról kimutatták, hogy azonos szinten
fejeződik ki normál, rákos és gyulladt
hasnyálmirigyben, valamint emberi hasnyálmirigy daganatos sejtvonalakban [137]. Az általánosan referenciaként alkalmazott gének körül a glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenázról [125] és a béta-aktinról [106] kimutatták, hogy expressziójuk az egészséges szövethez képest hasnyálmirigy daganatban megváltozik. Az XS13 amplifikációjára alkalmazott primerek: 5’-CTG GCT AAG TTG GTT GCT TT-3'
33
(sense) és 5’-GCA GCT GAT CAA GAC TGG A-3' (anti-sense), a termékméret: 500 bp. Körülmények: 94°C 30 mp; 58°C 60 mp; 72°C 120 mp, 19 ciklus. A korábbi amplifikációkból származó, szennyezésként a reakciókba bevitt PCRtermékek amplifikációjának elkerülését úgy demonstráltuk, hogy beiktattunk olyan kontroll reakciókat, amikor cDNS helyett vizet vittünk templátként a reakciókba. Az RNS preparátumok gyakran genomi DNS-sel szennyezettek. Ez lehetőséget ad fals pozitív eredményekre, amit úgy küszöböltünk ki, hogy egyrészt primerjeinket úgy terveztük, hogy a primerpár két tagja ne ugyanarra az exonra essék, így a genomi termék hosszabb és így jobban elkülöníthető legyen, másrészt „RT-negatív” kontroll reakciókat végeztünk, ahol a reakcióelegyből kihagytuk a reverz transzkriptázt.
A CaR RT–PCR kvantifikálása Kétféle módon hasonlítottuk össze a vizsgált mintákban a CaR mRNS mennyiségét. Egyrészt ugyanabból a mintából, ugyanannyi cDNS bemérésével, XS13 és CaR PCR-t egyaránt végeztünk. A csíkok intenzitását denzitometriásan meghatároztuk és a CaR denzitásokat XS13-ra normalizáltuk, majd az egyes minták normalizált értékeit hasonlítottuk össze. Másrészt duplex reakcióban koamplifikáltuk a CaR-t és az XS13-at. A CaR PCR-re optimalizált körülmények XS13-ra is megfelelőnek bizonyultak, az XS13 primereket pedig csak az utolsó 19 ciklusra mértük be a reakcióba. Futtatás után a gélt blottoltuk, a csíkok intenzitását hibridizációt követő autoradiográfiát követően határoztuk meg. Ebben az esetben a CaR amplifikációjára a következő primereket használtuk: CaR 2055-23F (5'-CTG CTT TGA GTG TGT GGA GTG TC-3') a 6. exonból és CaR 3024-20R (5'-AGC CAC CTT GAA AGC GTG AG-3') a 7. exonból.
Antitestek A következő elsődleges antitesteket használtuk: nyúl poliklonális anti-AQP1 (specifitás: egér, patkány, ember, marha; az epitóp semmilyen más ismert eukarióta fehérjével nem homológ) (Alpha Diagnostic International); nyúl anti-patkány AQP3, LL178AP21 [41]; nyúl anti-patkány AQP4, LL182AP22 [134]; nyúl anti-patkány AQP5 (az epitóp 80% homológiát mutat az emberi fehérje megfelelő szakaszával, ám más homológia, keresztreaktivitás nem ismert) (Alpha Diagnostic International, San Antonio, Texas,
34
USA); nyúl anti-humán AQP5 (Peter Agre és Landon King ajándéka, Johns Hopkins University Medical School) [93]; nyúl anti-humán AQP8, 2669AP, házi ekőállítású antitest; monoklonális egér anti-humán CFTR (egyéb keresztreaktivitás nem ismert) (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA). A preimmun IgG és a preimmun nyúl szérum a Dako-tól (Glostrup, Dánia) származott. A CaR kimutatására a patkány receptorban a 12–27. pozícióban található aminosavakból álló peptid ellen nyúlban termelt poliklonális antitestet használtunk (az antitestnek egyéb keresztreaktivitása nem ismert) (Affinity Bioreagents, Golden, Colorado, USA).
Immunhisztokémia Az AQP izoformák kimutatására a paraffinba ágyazott emberi hasnyálmirigy blokkok az Aarhusi Egyetemi Kórház Patológiai Osztályáról származtak. A 2 µm vastag metszeteket éjszakán át xilolban deparaffináltuk. 99%-os etanolban háromszor 10 percen, majd 96%-os etanolban kétszer 10 percen át rehidráltuk a metszeteket. 30 percen át 0,5% hidrogén-peroxidot tartalmazó abszolút metanolban blokkoltuk az endogén peroxidázokat, majd 70%-os etanolban további 10 percen át rehidráltuk a metszeteket. A metszeteket 0,5 mM EGTÁ-t és 1 mM Tris-t (pH 9,00) tartalmazó oldatban 10 percen át mikrohullámú sütőben forraltuk, majd lehűtöttük. 50 mM NH4Cl-ot tartalmazó 0,01 M PBS-ben (pH 7,4) 30 percig inkubáltuk a metszeteket, majd az aspecifikus antitestkötőhelyek blokkolására háromszor 10 percen át 1% BSA-t, 0,05% szaponint és 0,2% zselatint tartalmazó PBS-ben mostuk őket. Utána 0,1% BSA-t és 0,3% Triton-X100-at tartalmazó PBS-ben hígított elsődleges ellenanyagokkal éjszakán át 4°C-on inkubáltunk a metszeteket. A következő hígításokat alkalmaztuk: patkány AQP1 1:800, patkány AQP3 1:800, patkány AQP4 1:10, ember AQP4 1:10, és ember AQP5 1:1600. Másnap háromszor 10 percen át 0,1% BSA-t, 0,05% szaponint és 0,2% zselatint tartalmazó PBS-ben mostuk a metszeteket, majd 1:100 hígítású, torma-peroxidázzal jelölt kecske másodlagos antitesttel (Dako) inkubáltuk egy órán át szobahőmérsékleten. Utána háromszor 10 perc mosás következett ugyanolyan összetételű oldattal, mint amilyet az elsődleges ellenanyag utáni mosáshoz használtunk. A festődést 1 µg/ml diaminobenzidint tartalmazó 30%-os hidrogén-peroxidban jelenítettük meg. Utána a metszeteket
35
háromszor 10 percig PBS-ben mostuk, majd Mayer-féle hematoxilinnel is festettük, s ezt követően 20 percen át folyó csapvízzel mostuk. Végül a metszeteket 70%-os, 96%os, majd 99%-os etanolban dehidráltuk, xilollal mostuk. A felhúzást Eukitt mounting medium alkalmazásával végeztük. Fluoreszcens mikroszkópiára Alexa Fluor 488-cal jelölt kecske anti-nyúl IgG-t (Molecular Probes) használtunk (AQP1-hez és -5-höz), valamint Alexa Fluor 546-tal jelölt kecske anti-egér IgG-t (CFTR-hez). A metszeteket Leica SP2 konfokális lézer mikroszkóppal vizsgáltuk. A szövetmintákat fagyasztásos szubsztitúcióval készítettük elő az elektronmikroszkópos vizsgálatokra, korábban részletezett módszer szerint [63]. A 60 nm-es ultravékony metszeteket nyúl anti-patkány AQP1 ellenanyaggal inkubáltuk éjszakán át. Másodlagos ellenanyagként kolloid arannyal jelölt kecske anti-nyúl IgG-t alkalmaztunk (BioCell Research Laboratories, Cardiff, NBr.). A kontroll metszeteket immunizálás nélkül nyert IgG-vel (hígítás: 0,2 µg/ml) inkubáltuk. A metszeteket uranil-acetáttal festettük 10 percen át és Philips CM100 elektronmikroszkópon vizsgáltuk. A CaR kimutatására az egészséges és rákos emberi hasnyálmirigyből készült kriosztátos metszeteket Dr. Francisco X. Real biztosította (Institut Municipal d’Investigacio Medica, Barcelona, Spanyolország). Az 5 µm vastag kriosztátos metszeteket szárítottuk, majd –20°C-on 10 percen át acetonban fixáltuk. PBS-ben történő mosásokat követően 30 percen át 5% sovány tejport tartalmazó PBS-ben blokkoltuk az aspecifikus kötőhelyeket. Ezután éjszakán át 4ºC-on blokkolóban 1:200 arányban hígított elsődleges CaR ellenanyaggal inkubáltuk a metszeteket. Mosást követően blokkolóban 1:100 arányban hígított, torma-peroxidázzal jelölt másodlagos ellenanyag került a sejtekre, majd a festődést az ABC metodikát alkalmazva diamino-benzidinnel (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, California, USA) vagy a Vector VIP szubsztráttal (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, California, USA) jelenítettük meg, a gyártó utasításait követve. A metszeteket hematoxilinnel is festettük. A képeket Nikon digitális kamerával, Nikon mikroszkópon, 40-szeres nagyítású objektívvel készítettük. Elektronmikroszkópos immuncitokémiához a Capan-1 sejteket PBS-ben mostuk, majd 30 percen át szobahőmérsékleten 4% paraformaldehidet tartalmazó PBS-ben fixáltuk. Az aspecifikus kötőhelyeket 5% sovány tejport tartalmazó PBS-ben blokkoltuk 30 percen át. Blokkolóban 1:200 hígításban oldttuk az elsődleges CaR ellenanyagot, abban inkubáltuk a sejteket 4ºC-on éjszakán át. Mosást, másodlagos antitesttel történő
36
inkubációt, majd ismételt mosást követően ABC-reakcióval, diamino-benzidin szubsztráttal (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, California, USA) hívtuk elő a reakciót a gyártó útmutatásai alapján. A sejteket ozmium-tetroxid (Taab, Aldermaston, Berkshire, NBr.) 1%-os vizes oldatában posztfixáltuk 30 percen át; dehidráltuk, uranilacetáttal festettük, majd TAAB812-be (Taab) ágyaztuk őket. Ultravékony metszeteket vizsgáltunk Hitachi 2001 transzmisszós elektronmikroszkóppal.
Az intracelluláris szabad kalciumion-koncentráció meghatározása Az intracelluláris kalcium-koncentráció változás méréséhez a Capan-1 sejteket 24x40 mm-es fedőlemezekre ültettük ki. A letapadt sejteket pufferelt Hepes oldattal (HBSS: 136,7 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 0,34 mM Na2HPO4, 0,44 mM KH2PO4, 4 mM NaHCO3, 5,55 mM glükóz és 20 mM Hepes (pH=7,4)) mostuk. Ezt követően a sejteket 10 µM fura-2 AM (metoxi-acetát-észter; Teflabs, Egyesült Államok)
fluoreszcens
kalcium-indikátorral
töltöttük fel
37oC-on,
széndioxid
termosztátban, 45 percen keresztül. A sejt észteráz aktivitása révén a vegyület sejtbe kerülése után rövid időn belül megtörténik a metoxi-észter hidrolízise. Az így keletkező fura-2 szabad sav a sejtmembránon keresztül már nem tud kidiffundálni, ezért a sejten belül tartós kalcium-kelátorként működik. A fura-2 kalciumhoz kötött formája 340 nmen, a szabad forma 380 nm-en mutat emissziós maximumot. Töltés után a sejteket szuperfúziós rendszerben újra mostuk a HBSS oldattal egy 37ºC-ra termosztált kamrában. A feltöltött sejteken az intracelluláris szabad kalciumszint változását Nikon TDM Diaphot inverz epifluoreszcens mikroszkóp (40-szeres fluor objektív; NA:0.85, Nikon,
Japan)
segítségével,
mikrospektro-fluorometriával
(D-104
Microscope
2+
Photometer, PTI, Egyesült Államok) mértük. Az agonistát (4 mM Ca , ill. 1 mM Gd3+) a mosást követően perfúziós pumpával 5 percen keresztül juttattuk el a kamrába. A töltött sejtekből kibocsátott fluoreszcens fény intenzitását fotosokszorozóval 340 és 380 nm
gerjesztőfény
alkalmazása
mellett
520
nm-en
detektáltuk.
A
kalcium
citoplazmatikus koncentrációjának változását a 340 és 380 nanométer hullámhosszon gerjesztett emisszió-értékek hányadosaként adtuk meg.
37
A DNS-szintézis mérése A CaR aktivációjának sejtosztódásra gyakorolt hatását vizsgáltuk Capan-1 sejteken. A változásokat a DNS-szintézis során a láncba beépülő [3H]-timidin kontrollhoz viszonyított értékével, százalékban adtuk meg. A kísérleti időpontot 24 órával megelőzően a tápfolyadékot szérummentes médiumra cseréltük. Így a sejteket szinkronizáltuk. A CaR agonistákat (4 mM Ca2+, ill. 1 mM Gd3+ a tápfolyadékban) a tápfolyadék cseréjével adtuk a sejtekhez. A sejteket 24 órán át kezeltük. A DNSszintézis mértékét a következő módon határoztuk meg: a 24 órás kezelést követően tápfolyadékban oldva 1 µCi/ml [3H]-timidint mértünk a sejtekre. 1 óra múlva a sejteket jéghideg foszfátpufferrel (pH=7,2) kétszer mostuk, 10%-os triklórecetsavval kicsaptuk, majd szobahőmérsékleten megszárítottuk (10 perc). A csapadékot 400 µl 1M NaOHban oldottuk, melyből 100-100 µl-t 3 ml szcintilláló koktéllal (Opti Phase HeSafe II, Pharmacia, Németország) kevertünk össze. A mintákba beépült trícium radioaktivitását Wallac 1409 típusú folyadékszcintillátorral mértük meg. A timidin beépülés mértékét minden esetben a kezelést nem kapott kontroll százalékában adtuk meg (átlag ± SEM).
Statisztikai módszerek Az egészséges és rákos emberi hasnyálmirigy szövetminták CaR mRNS expresszióját kétmintás t-próbával hasonlítottuk össze. A Ca2+ és a Gd3+ CaR agonisták DNS-szintézisre gyakorolt hatását szóráselemzéssel vizsgáltuk, majd Dunnett-próba segítségével egyenként a kontrollhoz hasonlítottuk. Három független kísérletet végeztünk, az összes elemszám a kontrollra 19, a Ca2+-ra és a Gd3+-ra pedig 17–17.
38
EREDMÉNYEK Kalcium-érzékelő receptorok az emberi hasnyálmirigyben A CaR mRNS expressziója A CaR mRNS expresszióját egészséges, daganatos és idült hasnyálmirigy-gyulladásból származó
emberi
szövetmintákból
egyaránt
kimutattuk
RT–PCR-rel.
Agaróz
gélelektroforézissel vizsgálva a termékeket, a hasnyálmirigy adenokarcinóma sejtvonalak közül csupán a Capan-1-ben figyeltük meg a CaR mRNS expresszióját, Panc-1-ben, Capan-2-ben és HPAF-ban nem (10. ábra). MiaPaca-2 sejteken végzett amplifikációt követően csak radioaktívan jelölt szondával végzett hibridizáció segítségével sikerült kimutatni a CaR-ra jellemző PCR-terméket (az adatokat nem mutatjuk be). A 10. ábrán bemutatott reprezentatív vizsgálatban az HPAF sejtekből (a 3. minta az adenokarcinóma sejtvonalak közül) kevesebb XS13 terméket kaptunk. Ez kétségbe vonhatja, hogy a sejtvonalban valóban nincs CaR mRNS expresszió, ám további vizsgálatok során még reamplifikációt követő radioaktív hibridizációval sem sikerült HPAF sejtekben CaR mRNS-t kimutatni (az adatokat nem mutatjuk be). Egészséges emberi exokrin hasnyálmirigy sejtek elsődleges tenyészeteiben is kimutattuk a CaR mRNS-t, ám annak szintje a kiültetés napjától kezdve az ötödik tenyésztési napig fokozatosan csökkent, emberi exokrin hasnyálmirigy sejtek elsődleges tenyészetéből immortalizálással előállított M540 sejtvonalban pedig nem volt kimutatható (10. ábra). Az RT–PCR-ben kapott csíkok denzitometriája után mintánként a CaR denzitásokat a megfelelő XS13 denzitásokkal elosztva a következő eredményeket kaptuk: normál hasnyálmirigy: 3,5; tenyészet 1. napja: 1,9; 2. nap: 1,3; 3. nap: 0,9; M540: 0. A CaR mRNS kifejeződésében hasonló csökkenés figyelhető meg marha mellékpajzsmirigy sejtek elsődleges tenyészeteiben, ami a CaR stimulációra való válaszképesség drámai csökkenését okozza [88]. A kezdeti RT–PCR vizsgálatokban nem mutatkozott jelentős különbség a rákos és egészséges hasnyálmirigy minták között a CaR mRNS szintjében, ám az erőteljesen csökkent vagy el is tűnt a pankreász adenocarcinoma sejtvonalakban. Korábban kimutatták, hogy más G protein-kapcsolt receptorok – pl. az SST2 szomatosztatinreceptor – szintje hasnyálmirigy rákban csökken [20]. Ezért egészséges és rákos emberi
39
hasnyálmirigy szövetben meghatároztuk a CaR mRNS szintjét. Erre kvantitatív RT– PCR-t alkalmaztunk: a CaR és belső standardként a konstitutívan kifejeződő XS13 savas riboszomális foszfoprotein cDNS-ét koamplifikáltuk közös reakcióban, majd Southern hibridizációval detektáltuk a termékeket (11. ábra). E mérések azt mutatták, hogy nincs expressziós különbség a normál és rákos minták között (kétmintás t-próba, n=5, p=0,75).
hasny.m. idült h. normál pankreász daganat gyulladás
adenokarcinóma sejtvonalak
primér hasny.m. tenyészet
tumor
0,35 n. sz.
0,30
CaR/XS13 arány
Gél
marker
normál
10. ábra: A kalcium-érzékelő receptor (CaR) mRNS kimutatása RT–PCR-rel emberi pankreászból, tenyésztett emberi pankreász exokrin sejtekből, valamint humán hasnyálmirigy adenokarcinóma sejtvonalakból (a szerző munkája). (A) CaR mRNS expresszió normál hasnyálmirigyben, pankreász rákban, idült hasnyálmirigy-gyulladásban és a Capan-1 (1), Panc-1 (2), HPAF (3), MiaPaca-2 (4), és Capan-2 (5) sejtvonalakban. M: 100 bp DNS marker; –: negatív kontroll; +: pozitív kontroll (CaR plazmid). A felső nyíl az 1259 bp CaR terméket jelöli, az alsó a konstitutívan kifejeződő XS13 génnek megfelelő terméket. (B) A CaR mRNS kimutatása normál emberi pankreász exokrin sejtek primer tenyészeteiben. NP: normál pankreász; 1, 2, 5: tenyészetben töltött napok a feldolgozás előtt; M540: tenyésztett hasnyálmirigy exokrin sejtek SV40 vírussal történő immortalizálásából származó sejtvonal; M: 1 kb DNS marker.
0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00
normál
tumor
normál
tumor
40
11. ábra: A CaR expresszió összehasonlítása normál és rákos emberi pankreászban kvantitatív RT–PCR-rel (a szerző munkája). (A) Fent (’Gél’): duplex CaR-XS13 PCR normál és rákos mintából, lent (’Blot’): a gélből készült Southern hibridizáció (reprezentatív képek 5 kísérletből). (B) Az egyes mintákból kapott CaR és XS13 csíkok intenzitásaiból képezett hányadosok átlaga ± SEM 5–5 egészséges és rákos emberi hasnyálmirigy szövetmintából. ’n. sz.’: nem szignifikáns.
Az emberi hasnyálmirigy CaR cDNS szekvenciájának meghatározása Mellékpajzsmirigyben, citotrofoblasztban és keratinocitákban a CaR különböző splice variánsait figyelték meg [49, 12, 104]. Annak vizsgálatára, hogy emberi hasnyálmirigyben található-e valamilyen splice variáns, az „Anyagok és módszerek” c. fejezetben leírt módon klónoztuk a CaR cDNS teljes fehérjekódoló szakaszát, majd meghatároztuk nukleotidsorrendjét, amelyről kiderült, hogy megegyezik az emberi mellékpajzsmirigyben leírt szekvenciával [49], splice variánst tehát nem találtunk.
A CaR immunhisztokémiai kimutatása Immunhisztokémiával tanulmányoztuk a CaR fehérje lokalizációját egészséges és daganatos emberi hasnyálmirigy szövetmintákban. Normál hasnyálmirigy vizsgálatakor exokrin, endokrin szövetekben, valamint idegekben is kimutattuk a CaR fehérjét (12. ábra C, D). A duktuszokban erős, az acinusokban halványabb, de egyértelmű festődést észleltünk. A rákos szövet sem a duktuszok, sem az acinusok festődésében nem mutatott lényeges különbséget. Patkány hasnyálmirigyben kapott korábbi eredményekhez hasonlóan [18], a szigetekben szintén erőteljes CaR festődést tapasztaltunk. A hasnyálmirigyben futó erekben is kimutattuk a CaR-t. A simaizomsejteken erőteljes, az endotél sejteken gyengébb festődést tapasztaltunk (12. ábra C). Végül a pankreászban futó idegek is erős CaR festődést mutattak. Patkány hasnyálmirigyben kapott korábbi eredményekkel összhangban [18], mind az acinus, mind a duktusz sejtekben észleltünk CaR festődést a citoplazmában. Patkány hasnyálmirigyben a duktusz sejtek apikális membránján is kimutatható a CaR [18]. Nagyobb nagyítással vizsgálva a duktuszokat emberi pankreász szövetből készült kriosztátos metszeteken, a duktusz sejtek apikális felszínén látható festődés (12. ábra C, F). Ám, mivel a festődés a duktusz sejtek teljes citoplazmájára kiterjedt, teljes biztonsággal nem állítható, hogy a CaR egyértelműen az apikális membránra lokalizálódik. Capan-1 sejtekben is kimutattuk a CaR fehérjét fénymikroszkópos immuncitokémiával (12. ábra I). Elektronmikroszkóppal vizsgálva a CaR-ok membrán lokalizációt mutattak (13. ábra). Ugyanakkor eredményeink semmit nem árulnak el arról, hogy a receptor az
41
apikális vagy a bazolaterális membránon található-e, mivel a vizsgálatokhoz használt sejteket nem polarizált epitéliumként tenyésztettük, hanem üveglemezen. 12. ábra: A kalcium-érzékelő receptor (CaR) kimutatása egészséges emberi hasnyálmirigyben, duktális pankreász adenokarcinómában és Capan-1 sejtekben immunhisztokémiával (Dr. Kittel Ágnes munkája). Emberi hasnyálmirigyből származó, 5 µm vastag kriosztátos mintákat elsődleges nyúl anti-CaR, majd anti-nyúl másodlagos ellenanyaggal inkubáltunk. A festődést diaminobenzidinnnel (A, D–I), ill. Vector VIP szubsztráttal (B, C) vizualizáltuk. A vonalak 200 µm-t (A, D és F–H) vagy 50 µm-t (B, C, E) jelölnek. (A) Elsődleges antitest nélkül végzett kontroll festés (összehasonlítható pl. a D ábrával). (B) Preabszorpciós kontroll (a C ábrával hasonlítandó össze). (C, D, F) Egészséges emberi pankreászból készült metszetek ("D"=pankreász duktusz, "A"=acinus, "V"=ér). (G, H) Humán pankreász adenokarcinóma szövetből készült metszetek ("D"=abundáns duktális struktúrák, "I"=sziget, "N"=ideg). A vonalak 200 µm-t jelölnek. (E) A G ábrán mutatott adenokarcinóma részletének nagyítása a duktális struktúrák erőteljes festődésének szemléltetésére. (I) A CaR fehérje kimutatása Capan-1 sejtekben immuncitokémiával. A vonal 10 µm-t jelöl.
13. ábra: Elektronmikroszkópos immuncitokémia a kalcium-érzékelő receptorok (CaR) kimutatására Capan-1 sejtek felszínén (Dr. Kittel Ágnes munkája). Diaminobenzidin csapadék (folyamatos nyíl) mutatja a CaR immunreaktivitást (A). Ha az elsődleges antitestet kihagytuk a reakcióból, nem kaptunk festődést (szaggatott nyíl, B). A vonalak 0,15 µm-t jelölnek.
42
Az intracelluláris szabad kalciumszint változása Funkcionális CaR-ok jelenlétének kimutatására receptor agonistáival történő stimulációt követően mértük a sejten belüli szabad kalciumszint változását fura-2 fluorofórral feltöltött Capan-1 sejtekben. Agonistaként Ca2+-ot és Gd3+-ot alkalmaztunk; utóbbi a CaR specifikus agonistája, és megvan az az előnye, hogy kalciumcsatornákon keresztül nem lép be a sejtekbe. Mind 4 mM Ca2+, mind 1 mM Gd3+ az intracelluláris szabad kalciumszint gyors, átmeneti enelkedését okozta (14. ábra). Ez összhangban áll más, a CaR-t natívan kifejező vagy azzal transzfektált sejtvonalakban kapott eredményekkel, és azt valószínűsíti, hogy az emberi hasnyálmirigyben a receptor Gq fehérjéken keresztül
arány
arány
foszfolipáz Cβ-t aktivál.
idő (mp)
idő (mp)
14. ábra: 1 mM Gd3+ (A) és 4 mM extracelluláris Ca2+ (B) hatása az intracelluláris szabad kalciumszintre ([Ca2+]i) 10 darab Capan-1 sejtben egyetlen látótérben (Barabás Kornélia munkája). Fedőlemezen tenyésztett Capan-1 sejteket 10 µM fura-2 acetoxi-metilészterrel töltöttünk föl. A kalcium-érzékelő receptor agonistákat a perfúziós folyadék tartalmazta. A kezelt sejtekből emittált fura-2 fluoreszcenciát 520 nm-en mértük 340 és 380 nm-en váltakozva történő gerjesztés során. A [Ca2+]i változásait 340 és 380 nm-en mért fluoreszcenciák hányadosában bekövetkezett változás szemlélteti.
Sejtosztódási vizsgálatok Az extracelluláris kalciumszint változása számos sejttípusban hatást gyakorol a sejtproliferációra [62, 87, 140], amely hatásokról kimutatták, hogy a CaR közvetíti őket. Ezért a [3H]-timidininkorporáció mérésével vizsgáltuk, hogy CaR agonisták milyen hatást gyakorolnak a Capan-1 sejtek osztódására. Mind 1 mM Gd3+, mind 4 mM Ca2+ szignifikánsan, de csak csekély, 20% körüli mértékben gátolta a DNS-szintézist Capan1 sejtekben (15. ábra). (A [3H]-timidininkorporáció átlag ± SEM értékei kontroll
43
sejtekben: 100 ± 4%, n=19; Gd3+-mal kezelt sejtekben: 81 ± 4%, n=17, p<0,05; Ca2+mal kezelt sejtekben: 75 ± 7%, n=17, p<0,05; ANOVA, majd Dunnett-próba.)
a kontroll %-a
*
15. ábra: CaR agonisták hatása a Capan-1 sejtek osztódására (Barabás Kornélia munkája). A sejteket szérummentes, alacsony [Ca2+]-jú médiumban tartottuk 24 órán át, majd üres médiummal (kontroll), 4 mM Ca2+-mal, vagy 1 mM Gd3+-mal kezeltük őket 24 órán át. 1 órás, [3H]-timidinnel történő pulzusjelölés után folyadékszcintillációs módszerrel mértük a beépült radioaktivitást. Az eredményeket a kontroll sejtek timidinbeépülésének %-ában ± SEM adjuk meg. *p<0,05.
*
kontroll
Kalcium-érzékelő receptorok az emberi hasnyálmirigyben: az eredmények összegzése Összegzésül elmondhatjuk, hogy egészséges, daganatos és idülten gyulladt emberi hasnyálmirigyben, exokrin sejtek elsődleges tenyészeteiben, valamint a Capan-1 pankreász adenokarcinóma sejtvonalban egyaránt kimutattuk a kalcium-érzékelő receptor mRNS expresszióját. Primer tenyészetben az mRNS szintje a tenyészetben eltöltött idővel arányosan csökken. A CaR fehérje kifejeződik erekben, idegekben, szigetsejtekben, acinusokban, valamint duktuszokban is. Capan-1 sejtekben a CaR fehérje membrán lokalizációt mutat, a receptor stimulálása emeli a sejten belüli szabad kalciumszintet és gátolja a sejtek osztódását.
44
Akvaporinok az emberi hasnyálmirigyben Az akvaporinok expressziójának mRNS-szintű vizsgálata Az akvaporin izoformák mRNS-szintű expressziójának vizsgálatát reverz transzkriptáz– polimeráz láncreakcióval végeztük, erre a célra tervezett specifikus primerek felhasználásával, emberi hasnyálmirigy cDNS-ekből. Az XS13 savas riboszomális foszfoprotein [137] cDNS-ét amplifikáltuk belső kontrollként. Egészséges emberi pankreászból AQP1, -3, -4, -5, és -8 izoformákra specifikus primerek használatával a várt méretű PCR-termékeket kaptunk (16. ábra). Az összes kapott termék nukleotidsorrendje legalább 98%-ban megegyezett az egyes emberi izoformákból nyert cDNS-ek megfelelő szakaszainak publikált szekvenciájával. A kifejeződés szintje az egyes mintákban változó volt (16. ábra). Az AQP1 mRNS kimutatható volt normál és rákos emberi hasnyálmirigyben, ám Capan-1, Capan-2 és HPAF sejtvonalban nem. Az AQP3 és -4 mRNS expressziója normál és rákos emberi pankreászban magas volt, míg a sejtvonalakban alacsony. Az AQP5 mRNS az összes vizsgált mintában csak alacsony szinten volt kimutatható, ezért az XS13 konstitutív génre kapott eredmények alapján meghatározott cDNS mennyiség háromszorosát mértük be. Az AQP8 egészséges emberi hasnyálmirigyben és a vizsgált két rákos minta egyikében kifejeződik, ám a sejtvonalakban nem. Az AQP1 lokalizációjának immunhisztokémiai vizsgálata Az AQP1-et egészséges emberi hasnyálmirigyek paraffinos metszeteiből imunperoxidáz jelöléssel mutattuk ki, specifikus elsődleges antitest felhasználásával (17.A ábra). Ha az elsődleges antitestet a felhasználás előtt az immunizáláshoz használt peptiddel inkubáltuk, a jelölődés teljesen eltűnt, mutatva a felhasznált antitest specifitását (17.B ábra). A 17.A ábrán AQP1-re jelölődött sejtek láthatók csoportosulva, helyenként pedig magukban, a lobuláris exokrin szövet acinusai között. Az acinusokban található szekretoros sejtek közül, amelyek az apikális pólusuknál található zimogén granulumok alapján azonosíthatók, egyik sem festődött. A számos acinus közepében található, és néhol az acinusok határáig terjedő centroacináris sejtek membránján ugyanakkor erős festődés látható (17.C–F).
45
Az interkaláris duktuszok szintén erősen festődtek (17.A ábra). Ezek megnyúlt és néhol elágazó sejtcsoportokként látszódnak hosszanti metszetben (17.G ábra), ill. szekérkerékszerű struktúrákként keresztmetszetben (17.E, F ábra). Az apikális és a bazolaterális plazmamembrán egyaránt jelölődött AQP1-re, és némi diffúz festődést a citoplazma is mutatott. A nem festődő acinussejtekből az erősen jelölődő interkaláris duktuszsejtekbe való hirtelen átmenet különösen szembeszökő (17.G ábra). Az AQP1 kimutatható volt a hajszálerekben és egyéb kisméretű vérerekben, ám a nagyobb erekben és a Langerhans-szigetek belső elválasztású sejtjeiben nem fordult elő (18.B ábra).
16. ábra: RT–PCR az akvaporinok (AQP) kimutatására emberi hasnyálmirigyben, pankreász tumorokban és duktális sejtvonalakban (a szerző munkája). Etidium-bromiddal festett agaróz géleken mutatjuk be az emberi szövetmintákból és a sejtvonalakból preparált RNSből kapott termékeket XS13-ra, AQP1-re, -3-ra, -4-re, -5-re és 8-ra. Az AQP5 esetében háromszoros mennyiségű cDNSt vittünk be a PCR reakcióba. A nyilak a publikált cDNSszekvenciák alapján várt termékméreteket jelölik. PN: egészséges pankreász; PT: hasnyálmirigy daganat; Capan-1, Capan2, HPAF: sejtvonalak; S: parotis nyálmirigy; M: marker; B: pozitív kontrollként használt emberi agyszövet (hippocampus)
46
17. ábra: Az akvaporin 1 (AQP1) immunlokalizációja centroacináris és interkaláris duktuszsejtekben emberi hasnyálmirigyben (Dr. Burghardt Bea munkája). A–G: Emberi pankreászból készült 2 µm vastag paraffinos metszeten alkalmazott immunperoxidázos jelölés AQP1-re. A: Kis nagyítású áttekintő kép jelölt sejtek elszórt csoportjaival, melyek némelyike egyértelműen interkaláris vagy intralobuláris duktuszként azonosítható kereszt(nyílhegy) vagy hosszmetszeti (nyíl) nézetben. B: Hasonló metszeten, az immunizáló peptiddel preabszorbeált első antitest felhasználásával kapott kép. C–E: A centroacináris sejtek (ca) jelölődése. Némelyikük a szomszédos acinussejtek között egészen az acinus pereméig elnyúlik (nyilak). Laterális felszínükön erős festődés látható. Mások kiterjedten elágazó morfológiát mutatnak, több acinussejt közé betüremkedő interdigitációkkal (D). F, G: Apikális és bazolaterális festődést mutató interkaláris duktuszsejtek (ic) keresztmetszetben (F) és hosszmetszetben (G). Az interkaláris duktuszok kis átmérőjük (<20 µm), a körülvevő sejtek kis száma (keresztmetszetben jellemzően 3–7 sejtmag), és az igen szűk luminális tér alapján azonosíthatók. Az F ábrán AQP1 festődést mutató centroacináris sejtek láncolata húzódik egy tubuláris szerkezetű acinus ürege mentén. H–J: Immunfluoreszcens jelölés normál emberi pankreász paraffinos metszeten. H: Az interkaláris duktuszsejtek apikális és bazolaterális AQP1 jelölődése (zöld), I: apikális festődés cisztás fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor (CFTR) fehérjére (piros), J: a H és I ábrák szuperpozíciójával sárgán látható az AQP1–CFTR kolokalizáció az apikális membránon. Az interkaláris duktuszok lumenjének igen kis átmérője miatt a CFTR festődés többnyire izolált pontokként látható a keresztben elmetszett duktuszokban, és csak helyenként hosszanti profilban.
47
18. ábra: Az AQP1 immunlokalizációja emberi (A–H) és patkány (I–J) pankreász intraés interlobuláris duktuszaiban (Dr. Burghardt Bea munkája). A, B: Az intralobuláris duktuszok (id) apikális és bazolaterális membránjainak immunperoxidázos festése hosszmetszetben (A) és keresztmetszetben (B). Az intralobuláris duktuszok az interkalárisoknál nagyobbak, jól látható lumenjük van, amit keresztmetszetben szemlélve 8–14 kicsi, kuboidális sejt vesz körül. A Langerhans-szigetek (L) nem jelölődnek (B ábra). C–E: Intralobuláris duktuszok (id) immunfluoreszcens jelölése AQP1 antitesttel (C, zöld) és CFTR-rel (D, piros), valamint a két kép szuperpozíciója (E, sárga pontok). Míg az AQP1 festődés egyenletes az apikális és bazolaterális membránok mentén (C), a CFTR jel az apikális membránon foltokban jelentkezik (nyílhegyek, D). F–H AQP1 immunperoxidáz jelölés interlobuláris és fő duktuszokon. A jel főként az apikális membránon látható a kisebb interlobuláris duktuszokban (nyilak, F), viszont a nagyobb interlobuláris duktuszokból (G) és a fő pankreászvezetékből (md, H) gyakorlatilag hiányzik. A hajszálerek (c, G) és a centroacináris sejtek (ca, H) erősen festődnek, így belső kontrollként alkalmazhatók. I, J: AQP1 immunperoxidázos jelölés patkány hasnyálmirigyben. A lebenykéken belül (I) festődés látható a kapillárisokban (c), venulákban (v), és intralobuláris duktuszokban (id). A duktuszfán belül a festődés az interlobuláris duktuszokra korlátozódik (ID, J) és az epitélsejtek apikális és laterális felszínein némileg erősebb, mint bazálisan.
Az AQP1 és a CFTR kolokalizációja interkaláris duktuszokban Fölvetődött a kérdés, hogy az AQP1 oda lokalizálódik-e, ahol a duktális folyadékszekréció történik. Ezért immunfluoreszcens kettős jelöléssel vizsgáltuk az AQP1, valamint a duktális folyadékszekréció funkcionális markereként a CFTR
48
kolokalizációját. A 17.H ábrán látható a zölden jelölt AQP1 lokalizációja, ez egyértelműen ugyanazt a mintázatot követi, mint a 17.A ábrán. A 17.I ábrán a pirossal jelölt CFTR kevésbé kiterjedt eloszlása látható ugyanazon a metszeten. A CFTR az interkaláris duktuszok apikális membránján, valamint az acinussejteken figyelhető meg. A két képet egymásra helyezve (17.J ábra) egyértelmű az AQP1 és a CFTR kolokalizációja az interkaláris duktuszokban apikálisan. A CFTR jelölés (piros) egy-két helyen pontszerűen nem esik egybe az AQP1-gyel a 17.J ábrán, ez az acinussejtek apikális membránján jelölődő CFTR. Azok a nagyobb területek pedig (zöld), ahol nem esik egybe az AQP1 jelölés a CFTR-rel, egyértelműen az interkaláris duktuszok bazolaterális membránrégiói, ahol a CFTR hiányzik, ám az AQP1 megtalálható.
AQP1 az emberi pankreász intra- és interlobuláris duktuszaiban Bár az interkaláris duktuszoknál kisebb számban, de helyenként intralobuláris duktuszokat is megfigyelhettünk a lebenykéken belül az acinusok között. Ezek festődtek AQP1 antitesttel mind az apikális, mind a bazolaterális membránjukon, bár bazolaterálisan gyengébben (18.A, B ábra). A 18.C–E ábrákon bemutatott immunfluoreszcens képek egy öt intralobuláris duktuszból álló csoportot mutatnak, valószínűleg közel összefutásuk pontjához, ahol kilépnek a lebenyke hilusából. Mindegyikükön látható AQP1 festődés az apikális és bazolaterális membránokon (18.C ábra). Az apikális plazmamembrán domének CFTR festődése (18.D ábra) itt sokkal gyengébb, mint az interkaláris duktuszokban, amelyek a metszet többi részén láthatók. A nagyobb, a lebenykék közti kötőszövetes szeptumokban elhelyezkedő interlobuláris duktuszok sokkal gyengébb AQP1 festődést mutattak (18.F–H ábra). A kicsi és közepes méretű interlobuláris duktuszokban az AQP1-et az apikális membránokon észleltük, míg a bazolaterális membránokon ritkán (18.F, G ábra). A nagyobb interlobuláris duktuszokban (18.H ábra) a duktusz epitél nem mutatott AQP1 jelölődést.
AQP1 a patkány hasnyálmirigyben Gyenge
AQP1
festődést
mutattunk
ki
patkány
hasnyálmirigy
interlobuláris
duktuszaiban (18.J ábra). A mirigy lebenykéin belül ugyanakkor AQP1 expresszió csak
49
a vérér endotélen volt kimutatható, míg acinusokban és intralobuláris duktuszokban egyáltalán nem (18.I ábra).
Az AQP5 immunhisztokémiai lokalizációja Immunperoxidázos festéssel kimutattuk, hogy az AQP5 az interkaláris duktuszsejtek apikális membránján található (19. ábra). A centroacináris sejtek nem festődtek AQP5re. Bár hosszmetszetben az interkaláris duktuszok igen szűk lumenje csak néhol látható, a 19.A ábra két acinus felől konvergáló egy-egy interkaláris duktuszt mutat, amelyek apikális membránjukon erősen festődnek AQP5-re. Ugyanezen a metszeten látható keresztmetszetben egy csoport acinussejt és interkaláris duktuszsejt egy közös lumen körül, valamint egy további keskeny interkaláris duktusz. Mindkét struktúra erőteljes apikális AQP5 festődést mutat. A 19.B ábrán további pozitívan jelölődő interkaláris duktuszok láthatók. Az AQP5 az intralobuláris duktuszok apikális membránján is megfigyelhető (19.I ábra), ám az interlobuláris duktuszokból hiányzik (19.J ábra).
50
19. ábra: az AQP5 immunlokalizációja emberi hasnyálmirigy interkaláris és intralobuláris duktuszaiban (Dr. Burghardt Bea munkája). A, B: AQP5 immunperoxidáz jelölés az interkaláris duktuszok (ic) apikális membránján hosszmetszetben (nyilak) és keresztmetszetben (nyílhegyek). Patkány és ember AQP5 ellen termeltetett ellenanyagokkal ugyanazt a festődési mintázatot kaptuk. Az A ábrán szereplő látótér a 2G ábrának felel meg, amely egy konszekutív metszetben AQP1 festést mutat. C: Immunfluoreszcens AQP5 jelölés (zöld) látható az interkaláris duktuszok apikális membránján. D: Ugyanazon a metszeten a CFTR jel (piros) hasonló lokalizációt mutat (nyilak), valamint az acinusok lumenjében is megfigyelhető (nyílhegyek). E: Az AQP5-re és a CFTR-re kapott képek szuperpozíciója kolokalizációjukat mutatja az interkaláris duktuszok apikális membránján (sárga). F: Az AQP5 (zöld) és a CFTR (piros) kolokalizációja egy acinusból kiinduló interkaláris duktusz (ic) lumenében. Az acinussejtek (a) apikális membránjában megfigyelhető a CFTR, ám AQP5 nem látható. G: Emberi szubmandibuláris nyálmirigy acinussejtekben apikális membrán és szekretoros canaliculusok AQP5 festése az antitest specifitásának ellenőrzésére. H: Emberi pankreász metszet immunizáláshoz használt peptiddel preabszorbeált antitesttel festve. I: AQP5 immunperoxidázos jelölés intralobuláris sejtek apikális membránján, a duktuszok hosszmetszeti képe látható. J: Az interlobuláris duktuszok (ID) nem festődnek AQP5-re. Ugyanazon a metszeten az interkaláris és intralobuláris duktuszok (nyilak) erős jelölődést mutatnak.
51
Az AQP5 és a CFTR kolokalizációja interkaláris duktuszokban Ismét kettős fluoreszcens jelölést alkalmaztunk az AQP5 és a CFTR festődési mintázatának összehasonlítására. Az AQP5 jelölés az interkaláris duktuszsejtek apikális membránjára korlátozódott (19.C ábra), ahol kolokalizációt mutatott a CFTR-rel (19.D, E ábra). Az acinusok közepében mutatkozó CFTR jelölés nem társult AQP5 jelöléssel. Ez a 19.F ábrán is látszik, ahol egy acinusba torkolló interkaláris duktusz látható. A CFTR festődés jól láthatóan tovább nyúlik az acinusba, mint az AQP5.
AQP5 a mucinózus duktuszokban és mirigyekben Az emberi pankreász metszetekben néhol mucinózus mirigyeket is azonosítottunk (20.A ábra). E mirigyek szekretoros sejtjei lapos, bazálisan elhelyezkedő magokkal rendelkeznek, valamint megnövekedett apikális régióval. Amint a 20.A ábrán látszik, a luminális membránon erős AQP5 festődés figyelhető meg. Egy konszekutív metszeten ezek a sejtek nem mutatnak AQP1 festődést (20.B ábra). Néhány nagyobb duktusz, amelyet hasonló sejtek határolnak, szintén határozott apikális jelölődést mutatott AQP5re (20.C ábra), míg AQP1-re nem (20.D ábra).
Egyéb akvaporinok Az AQP3 és AQP4-re RT–PCR-rel kapott pozitív eredmények ellenére expressziójukat immunhisztokémiával nem sikerült kimutatni. Egy nyálmirigyben korábban pozitív eredményt adó [54] AQP3 antitestet alkalmazva emberi hasnyálmirigyben nem kaptunk plazmamembrán festődést. AQP4 antitesttel szintén negatív eredményt kaptunk (az adatokat nem mutatjuk be). Emberi AQP8 elleni antitesttel egyértelmű festődést tapasztaltunk az acinussejtek apikális
membránján
a
zimogén
granulumok
szomszédságában
(20.E
ábra).
Az expressziós mintázat hasonló volt a korábban patkány pankreászban kapotthoz [63], intracellulárisan vagy más sejttípusokon pedig nem észleltünk jelölődést. A specifikus immunfelismerés kontrolljaként immunizálatlan állatból származó szérummal vagy abból tisztított IgG-vel végzett festések negatív eredményt adtak (20.F ábra).
52
20. ábra: A–D: Az AQP5 és az AQP1 immunlokalizációja duktusz-asszociált mucinózus mirigyekben; E: AQP8 lokalizáció emberi hasnyálmirigy acinussejtjeiben; F: immunizálás nélkül nyert IgG felhasználásával készült kontroll jelölés emberi hasnyálmirigyben (Dr. Burghardt Bea munkája). A, C: AQP5 immunperoxidáz festés egy mucinózus mirigy (A) és egy nagy mucinózus duktusz (C) glikoproteint szekretáló sejtjein (nyilak). B, D: A konszekutív metszeten a mucinózus sejtek nem festődnek AQP1-re. Jellemző azonban a B ábrán látható erős AQP1 jelölődés a mucinózus miriggyel asszociált interkaláris duktuszban (ic). A mucinózus duktusz epitélium (C, D) morfológiája eléggé különböző volt az interlobuláris duktuszokra jellemző hengeres epitélium (A3G, A3H ábra) morfológiájától. E: AQP8 immunperoxidáz festés (nyilak) az acinussejtek apikális pólusán emberi hasnyálmirigyben. F: Immunizálás nélkül nyert IgG-vel végzett immunreakció emberi pankreász metszeten. Nem kaptunk festődést, a nyilak az acinussejteket jelölik.
53
Akvaporin izoformák expressziója és lokalizációja emberi hasnyálmirigyben: az eredmények összegzése Eredményeink összegzéseként elmondhatjuk, hogy emberi hasnyálmirigyben az AQP8 kizárólag acinussejtekben fejeződik ki, az AQP1 és az AQP5 pedig nagymértékű expressziót mutat a valószínűleg a folyadékszekréció fő színterét jelentő interkaláris duktuszsejtekben (1. táblázat). 1. táblázat: Az akvaporin (AQP) vízcsatornák és a cisztás fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor (CFTR) eloszlása az emberi hasnyálmirigyben
CFTR AQP1 AQP5 AQP8
Acinussejtek AP BL ++ ++ -
Centroacináris sejtek ? ++ -
interkaláris AP BL ++ ++ ++ ++ -
intralobuláris AP BL + ++ + ++ -
Duktuszok kis interlobuláris AP BL + -
AP: apikális (luminális membrán; BL: bazolaterális membrán
54
nagy interlobuláris AP BL -
MEGBESZÉLÉS A kalcium-érzékelő receptor többféle sejttípusban kifejeződik az emberi hasnyálmirigyben Az emberi hasnyálmirigy külső elválasztású részében mi vizsgáltuk elsőként a kalciumérzékelő receptorok (CaR) expresszióját. RT–PCR segítségével vizsgáltuk a CaR mRNS expresszióját, immunhisztokémiával pedig kimutattuk, hogy a CaR acinusokban, duktuszsejtekben, valamint különböző nem-exokrin szövetekben, pl. szigetsejtekben, vérerekben és idegekben is kifejeződik. Ez azt valószínűsíti, hogy a CaR többféle szerepet játszik az emberi pankreászban.
A CaR lehetséges élettani szerepe az emberi hasnyálmirigy külső elválasztású részének működésében Az emberi pankreászon belül az exokrin duktuszokban tapasztaltuk a legerőteljesebb expressziót. Ez összhangban van egy patkány hasnyálmirigyben Bruce és munkatársai által korábban kapott hasonló eredménnyel [18]. Patkány hasnyálmirigyben a CaR megtalálható a duktuszok luminális membránján, stimulációja növeli a duktális bikarbonát-, és így valószínűleg egyben a folyadékszekréciót. Bruce és munkatársai elképzelése szerint ez egy visszacsatolásos mechanizmus létezésére utal, melynek során a lumen megemelkedett kalciumszintje a receptoron keresztül hatva serkenti a duktális folyadékszekréciót, hogy így csökkentse a kalciumsók kicsapódásának, ezzel a kőképződésnek, sőt akár a pancreatitis kialakulásának veszélyét. Hogy emberben létezik-e ilyen homeosztatikus mechnizmus, azt nem tudjuk. Tetszetős elgondolás, hogy valóban létezik, mivel a CaR fehérje nagy mennyiségben fejeződik ki emberi pankreász duktuszokban, a kőképződés pedig viszonylag ritka, holott a hasnyál kémhatása lúgos, és nagy koncentrációban található benne Ca2+. Mindemellett egyéb mechanizmusok szerepe is fölvetődött a kőképződés hatásos ellenszereként. Leírták pl., hogy a hasnyálban található egy litosztatin nevű anyag, amely a CaCO3 kristályok képződésének hatákony inhibitora [38]. A CaR acinussejtek működésében játszott szerepe sem világos. Akárcsak patkányban [18], az emberi acinussejtek citoszóljában is CaR festődést tapasztaltunk. A citoszól
55
pozitivitására két magyarázat kínálkozik [18]. Egyrészt a hasnyálmirigy acinussejtjeiben intenzív exocitózis figyelhető meg a lumen felé (zimogén szekréció). Az exocitózist a membránreciklálási folyamat részeként endocitózis kíséri. Így már érthető, hogy amennyiben a CaR jelen van az acinussejt apikális membránján, az immunfestés a receptor reciklálódása következtében intracelluláris lokalizációt is mutat [18]. A másik lehetőség az intracelluláris lokalizáció magyarázatára a receptor gyors bioszintézise, vagy
a
receptor
membránba
történő
inzerciója
előtt
bekövetkező
jelentős
poszttranszlációs módosítások. Az előbb leírtak ugyanakkor nem zárják ki a CaR jelenlétét a plazmamembránon. Valószínűnek tűnik, hogy a patkányban kapott eredmények analógiájára, legalább némi CaR jelen lehet az emberi acinussejtek plazmamembránján.
A CaR expressziója nem-exokrin sejtekben CaR expressziót figyeltünk meg emberi pankreászban a Langerhans-szigeteken, a mirigyben futó idegekben és vérerekben. A szigetek CaR festődése összhangban van Goebel és munkatársai munkájával [51]. Érdekes, hogy Goebel és munkatársai nem tapasztaltak CaR festődést az exokrin szövetben. Megjegyzendő azonban, hogy az általuk közölt cikkben szereplő pankreász metszetekben duktuszok nem láthatók, holott a mi eredményeink szerint az emberi hasnyálmirigyben a CaR expresszió a duktuszokban a legerősebb. Acinusokon is kaptunk egyértelmű, ám halvány festődést, amit Goebel és munkatársai nem mutattak ki. Ezt az eltérést többféle ok is magyarázhatja: a mintaelőkészítéskor, fixáláskor alkalmazott eljárások, vagy akár az alkalmazott antitestek érzékenységének különbözősége. A pankreászban futó idegekben és vérerekben is kimutattuk a CaR-t. A receptor jelenléte az idegvégződéseken emlékeztet a duodenumban és vesében futó idegeken kapott hasonló eredményekre [26, 121]. E két szervben fölvetődött, hogy az intersticiális kalciumkoncentrációban bekövetkezett változások a szerv érrendszerét szabályozó lokális reflexeken kersztül megváltoztathatják a szerv vérátáramlását [91]. A pankreászban futó idegek festődése tehát egy hasonló mechanizmus működését veti föl hasnyálmirigyben is.
56
A Capan-1 sejtvonal mint a normál emberi duktuszsejt működésének modellje A normál emberi exokrin hasnyálmirigy sejteken szisztematikusan végzett funkcionális vizsgálatok gyakorlatilag nem lehetségesek, mivel az egészséges emberi szövethez való rendszeres, egyenletes minőségben való hozzájutást igen nehéz lenne megoldani. Viszont a hasnyálmirigy élettanának és patofiziológiájának tanulmányozására széles körben használják a hasnyálmirigy adenokarcinóma sejtvonalakat. A sejtvonalaknál visszatérő kérdés, hogy kielégítően reprodukálják-e az eredeti szövet élettani folyamatait. Mi ezért több ismert hasnyálmirigy sejtvonalban tanulmányoztuk a CaR expresszióját. A vizsgált sejtvonalak közül a Capan-1-ben volt a legmagasabb a CaR mRNS relatív szintje. A CaR protein expresszióját mind fénymikroszkópos, mind elektronmikroszkópos immuncitokémiával kimutattuk a sejtek felszínén. A receptor működését funkcionálisan igazoltuk: CaR agonisták hatására a Capan-1 sejtekben az intracelluláris szabad kalciumszint átmeneti emelkedését figyeltük meg, ami azt valószínűsíti, hogy a receptorok Gq proteinen keresztül foszfolipáz Cβ-t aktiválnak, amint az a CaR-ra jellemző [17]. Eredményeink alapján valószínűsíthető, hogy a Capan-1 sejtek használható modellrendszernek bizonyulnak majd a CaR élettanának tanulmányozására emberi hasnyálmirigyben. A Capan-1 sejtvonalnak számos előnyös tulajdonsága van, amely lehetővé teszi, hogy a hasnyálmirigy duktuszsejt modelljeként használjuk:
polarizált
rétegben
növeszthető,
valamint
kifejez
különböző
iontranszportereket, ioncsatornákat és receptorokat, amelyeket natív rágcsáló sejtekben a duktális szekréciós apparátus tagjaiként írtak le [31, 32, 127].
CaR expresszió a rákos hasnyálmirigyben Immunhisztokémiai vizsgálatokban egészséges és rákos pankreászban hasonló CaR festődést kaptunk. Kvantitatív RT–PCR-rel és Southern hibridizációval kimutattuk, hogy a rákos transzformáció nem eredményez egyértelmű növekedést vagy csökkenést a CaR mRNS szintjében. Azonban a CaR expresszió egyértelműen lecsökkent, ill. el is tűnt a hasnyálmirigy adenokarcinóma sejtvonalakban, a 15. ábra pedig azt mutatja, hogy a CaR hatással van a duktális sejtek proliferációjára. Lehetséges tehát, hogy a CaR gátolja a duktuszsejtek osztódását, hasonló módon, mint azt szomatosztatin-receptorok
57
esetében fölvetették [20]. Egyéb szövetekben, sejttípusokban számos bizonyíték támasztja alá, hogy a CaR-ok részt vesznek a sejtosztódás és a differenciáció szabályozásában. Az extracelluláris kalciumszint növekedése több epitél sejtvonalban gátolja az osztódást, serkenti a differenciációt [9, 19, 103, 104, 144]. Ugyanakkor fibroblasztokban a magas extracelluláris kalciumszint a CaR-ok stimulálása révén serkenti a proliferációt [61, 87]. Vizsgálataink során az extracelluláris kalciumszint növelése vagy Gd3+-mal történő kezelés egyértelműen gátolta a Capan-1 sejtek osztódását. A két kation megegyező hatása egyértelműen azt valószínűsíti, hogy a hatások hátterében a CaR-ok aktiválása áll. A kezelések hatása drámainak éppen nem nevezhető, de ezt magyarázhatja a Capan-1 sejtek alacsony szintű CaR expressziója. A hasnyálmirigy duktális adenokarcinómája félelmetes, rendkívül agresszív daganat, a túlélés aránya jelenleg siralmasan alacsony. Új gyógymódok kifejlesztéséhez kulcsfontosságú,
hogy
megismerjük
a
daganatsejtek
osztódását
szabályozó
mechanizmusokat [13]. Sok hasnyálmirigy adenokarcinóma sejtvonalon találhatók a sejtosztódás szabályozásában részt vevő reguláló peptideket érzékelő G-protein kapcsolt receptorok, ami azt a reményt sugallja, hogy e receptorok működésének befolyásolásával terápiás eredményt lehet elérni [124]. Eredményeink azt mutatják, hogy azokban a daganatsejtekben, ahol a receptor kifejeződik, aktiválódva képes lehet a sejtosztódás gátlására. Bár a CaR az általunk vizsgált sejtvonalak közül csak az egyikben fejeződött ki, a vizsgált daganatos emberi minták többségében jelen volt. A CaR szerepének mélyebb megértése az emberi pankreász duktuszsejtek működésének szabályozásában további vizsgálatokat igényel.
Az akvaporin izoformák és a CFTR lokalizációja az emberi hasnyálmirigy külső elválasztású részének különböző sejttípusaiban Az AQP1, -5, -8, valamint a CFTR lokalizációját vizsgáltuk emberi exokrin hasnyálmirigyben. Eredményeinket az 1. táblázatban foglaltuk össze. Az, hogy az AQP1 az interkaláris duktuszsejtek apikális és bazolaterális membránjában, valamint a centroacináris sejtekben is kifejeződik, arra utal, hogy az említett sejttípusok az epitéliumon át zajló vízáramlás fő helyszínét alkotják. Ugyanakkor mi, eltérően
58
Hasegawa és mtsai eredményeitől [56], nem találtunk AQP1-et az acinussejtekben. Az interkaláris duktuszsejtek luminális membránjában, kolokalizáltan a CFTR-rel és az AQP1-gyel, AQP5 festődést tapasztaltunk, ami azt mutatja, hogy a hasnyálmirigy folyadékelválasztásában az AQP5 is részt vesz.
Az AQP1 eloszlása az exokrin hasnyálmirigyben és lehetséges szerepe a duktális folyadékelválasztásban Szekretinnel történő stimuláció hatására az exokrin pankreász nagymennyiségű, izotóniás, bikarbonátban gazdag, viszonylag kis enzimaktivitással bíró folyadékot termel [21]. Hollander és Birnbaum már 1952-ben fölvetette, hogy ez a folyadék nem acinussejtekből, hanem „lapos centroacináris és terminális duktuszsejtekből” származik [59]. Hogy a bikarbonátban gazdag folyadék duktális eredetű, azt későbbi vizsgálatok is megerősítették: leírták, hogy súlyos acinussejt-atrófiában szenvedő patkányokban megmarad a folyadékelválasztás [129], valamint hogy patkány és tengeri malac pankreászból
izolált
rövid
interlobuláris
duktuszszegmensekben
folyadék-
és
bikarbonát-szekréciót lehet kiváltani [6, 68]. A külső elválasztású mirigyekben a folyadékszekrécióban normálisan részt vevő akvaporinok az apikális membránon az AQP5 és -8, bazolaterálisan pedig az AQP3 és 4 [54, 97]. A legtöbb ilyen mirigy AQP1-et is kifejez, de ez általában a vérerek endotéljére korlátozódik [95]. Így meglepőnek tűnhet, hogy a hasnyálmirigy duktális epitélsejtjein apikálisan és bazolaterálisan is AQP1-et találtunk. Másrészt viszont a máj vezetékrendszerében is található AQP1, az itt leírthoz hasonló eloszlásban. Az epecsatornákat szegélyező epitélsejtek, a kolangiociták, számos közös vonást mutatnak a hasnyálmirigy duktuszsejtekkel [11], megfigyelhető bennük az AQP1 az apikális és a bazolaterális membránon [95, 123], valamint diffúzan a sejten belül [82, 83]. Marinelli és munkatársai szerint kolangiocitákban szekretin hatására az AQP1 az intracelluláris membránokból az apikális membránba transzlokálódik [82, 83]. Az általunk interkaláris duktuszokban megfigyelt citoplazmatikus festődés az AQP1 hasonló szabályozott transzlokációjára utalhat a hasnyálmirigyben. Az, hogy a centroacináris és az interkaláris duktuszsejtek egyaránt festődnek AQP1-re, azt az általánosan elfogadott nézetet támasztja alá, hogy a két sejttípus hasonló
59
fenotípust mutat [42, 146]. A centroacináris sejteket valószínűleg az acinus lumenébe benyúló,
terminális
interkaláris
sejteknek tekinthetjük. Eredményeink azt is
megmutatták, hogy a centroacináris sejtek mélyen, néhol akár az alaphártyáig behatolnak a szomszédos acinussejtek közé. Ez azt az érdekes kérdést is fölveti, hogy vajon van-e a centroacináris sejteknek funkcionálisan elkülönülő apikális és bazolaterális membránjuk [105]. A duktuszfán lejjebb haladva az AQP1 expresszió csökken (1. tábázat). Ez azt valószínűsíti, hogy míg az interkaláris és intralobuláris duktuszok a transzepitél vízáramlás fő színterét jelentik, az interlobuláris duktuszok és a fő hasnyálmirigy vezeték elsődleges szerepe a hasnyál duodenumba vezetése. Ha összehasonlítjuk az AQP1 lokalizációját a CFTR-ével, amelynek fontos a szerepe a bikarbonátszekrécióban, az alátámasztja ezt az elképzelést. Korábbi vizsgálatokkal összhangban [37, 84, 131], az interkaláris duktuszok apikális részén találtunk CFTR-t, ám az interlobuláris duktuszokban jellemzően nem (1. táblázat). Az AQP1 és a CFTR kolokalizációja a kis duktuszokban azt jelzi, hogy mind az elektrolitok szekréciója, mind az ozmotikus vízáramlás főleg itt történik. Az acinussejtek apikális membránján szintén találtunk CFTR-t, ahogy azt rágcsálókban is leírták [79, 147]. Megfigyeléseink ugyanakkor ellentmondanak mások korábban kapott eredményeinek, amelyek azt mutatták, hogy az emberi pankreász acinusokban nincs CFTR [37, 84]. Ugyanakkor az AQP1 teljesen hiányzott az acinussejtekből.
Az
AQP5
expressziója
és
kolokalizációja
AQP1-gyel
emberi
hasnyálmirigyben Emberi pankreászban kapott eredményeink közül igen lényegesnek tűnik az AQP1 és -5 koexpressziója az interkaláris duktuszsejtek apikális membránján. Bár az AQP5 festődés az AQP1-hez képest gyengének tűnik, ez részben abból ered, hogy az interkaláris sejt lumenje rendkívül szűk, részben pedig abból, hogy az AQP5, az AQP1gyel ellentétben, nem fejeződik ki a bazolaterális membránban, amelynek sokkal nagyobb a területe. Eredményeink ettől függetlenül azt valószínűsítik, hogy az interkaláris duktuszok igen kicsiny apikáls felszínén keresztül történő víztranszportban két akvaporin izoforma is közreműködik. Ez a redundancia magyarázhatja azt, hogy
60
AQP1-deficiens emberekben a fehérje hiánya semmilyen látható elváltozást nem okoz [115]. Az emberi hasnyálmirigy mucoid mirigyeiben is erős AQP5 festődést figyeltünk meg, a sejtek apikális és laterális felszínén egyértelmű volt az AQP5 expresszió (20.A ábra). Ezeket a mucoid mirigyeket a Brunner-mirigyekhez hasonlították [42]. Érdekes, hogy az általunk vizsgált mucoid mirigyekben az AQP5 ugyanolyan szubcelluláris lokalizációt mutat, mint a patkány duodenum Brunner-mirigyeiben [108].
Az
AQP1
eloszlásának
összehasonlítása
emberi
és
patkány
hasnyálmirigyben Egy patkány hasnyálmirigyen végzett korábbi vizsgálatban az AQP1-et kimutatták a vérerekben, ám a duktuszrendszerben nem [63]. Ugyanakkor nemrég leírták a patkány pankreász interlobuláris duktuszaiban az AQP1 expresszióját, bár alacsony szinten [46, 77]. Most nagyobb töménységű AQP1 antitest alkalmazásával ezt megerősítettük (18.J ábra). Ugyanakkor lényeges különbség van az AQP1 eloszlásában az emberi és a rágcsáló hasnyálmirigy között. Patkány hasnyálmirigy centroacináris sejtekben, interkaláris és intralobuláris duktuszokban nincs AQP1, ám a kicsi és közepes interlobuláris duktuszokban előfordul [46]. Emberben ugyanakkor a centroacináris sejtekben, valamint az interkaláris és az intralobuláris duktuszokban megfigyelhető erős festődés az interlobuláris ductsok mentén haladva a távolsággal gyengül. Ez arra utal, hogy az ember és a rágcsálók közt különbség lehet a transzepitél vízáramlásban a duktuszfa mentén. Ugyanakkor természetesen arról is szó lehet, hogy egyszerűen a mirigyek különböző méretei miatt az emberi pankreász nagyobb lebenykéiben nagyobb kiterjedésű intralobuláris vezetékrendszer található.
Az AQP3, AQP4 és AQP8 eloszlása az emberi hasnyálmirigyben Amint valószínűsíthető volt patkányon végzett korábbi megfigyelésekből [63], AQP8-ra csak az acinussejtek apikális része volt pozitív a zimogén granulumok közvetlen szomszédságában (20.E ábra). Az AQP8 tehát valószínűleg az enzimszekrécióval együttjáró, kis mennyiségű, kloridban gazdag nedv termeléséhez járul hozzá. Az RT– PCR vizsgálatokban pozitív eredményt adó AQP3 és AQP4 egyike sem volt
61
kimutatható egészséges emberi hasnyálmirigyben immunhisztokémiával az akkor rendelkezésre álló antitestek segítségével. Ha igen kis mennyiségben jelen vannak is, nem valószínű, hogy jelentősen hozzájárulnának a pankreász nedvelválasztásához.
Akvaporin
expresszió
emberi
hasnyálmirigy
rákban
és
daganatos
sejtvonalakban A két hasnyálmirigy adenokarcinóma minta RT–PCR vizsgálatokban hasonló akvaporin expressziós mintázatot mutatott, mint az egészséges pankreász (16. ábra). Ugyanakkor csak az egyikben mutattunk ki AQP8 mRNS-t. Mivel az AQP8 az acináris fenotípusra jellemző, és a legtöbb hasnyálmirigy rák duktális eredetű, nem meglepő, hogy az egyik mintából nem tudtuk kimutatni az AQP8-at. Lehetséges, hogy a másik mintában kimutatott AQP8 mRNS a rákos mintával kimetszett egészséges szövet acinusaiból származik. Érdekes, hogy a hasnyálmirigy daganatos sejtvonalakban nem tudtunk RT–PCR-rel AQP1 mRNS-t kimutatni. Feltételezik, hogy számos jól differenciálódott „duktális” pankreász adenokarcinóma a nagyobb interlobuláris duktuszok epitéliumából származik [1]. Mivel azok a duktuszok nem fejeznek ki AQP1-et, nem tűnik meglepőnek, hogy a sejtvonalakból hiányzik ez az izoforma. Különös azonban, hogy mindhárom vizsgált sejtvonal kifejezi az AQP5 mRNS-t. A mi kezünkben az AQP5 festődés a normál pankreászban jórészt az interkaláris duktuszokra korlátozódott, amelyek ugyanakkor nagy menyiségben fejeznek ki AQP1-et. Capan-1 sejtekben pedig kimutatták a CFTR expresszióját [22], ami szintén az interkaláris és az intralobuláris duktuszokra, nem pedig a nagyméretű interlobuláris duktuszokra jellemző. Eredményeink együttesen azt mutatják, hogy a sejtvonalak fenotípusa nem egyezik meg teljes mértékben a duktuszfa egyetlen szakaszáéval sem.
62
KÖVETKEZTETÉSEK Az emberi hasnyálmirigy több sejttípusában azonosítottunk kalcium-érzékelő receptorokat: duktuszokban, acinusokban, erekben, idegekben és szigetsejtekben. A receptoroknak számos, élettani és kórélettani szempontból fontos szerepük lehet a mirigy működésében: részt vehetnek a duktális folyadékszekréció, a sejtosztódás, valamint esetleg a szerv vérátáramlásának szabályozásában. Az élettani funkciókra gyakorolt hatásuk mechanizmusának tisztázására további kutatások szükségesek. A Capan-1 sejtvonal használható modellrendszernek ígérkezik a kalcium-érzékelő receptor pankreász duktuszsejtekben betöltött élettani szerepének vizsgálatára. Az AQP1 és az AQP5 nagy mennyiségben mutatható ki emberi exokrin pankreász interkaláris duktuszaiban. Kolokalizációt mutatnak a duktális elektrolitszekréció markereként számontartott CFTR-rel, és mindhárom fehérje expressziója csökken a duktuszfán a duodenum felé haladva, az interkaláris duktuszoktól távolodva. Ez azt valószínűsíti, hogy emberi hasnyálmirigyben a duktális folyadékszekréció a duktuszfa végső ágaiban összpontosul, és mind az AQP1, mind az AQP5 fontos szerepet játszik a víz áramlása és az elektrolitszekréció összekapcsolásában. Saját munkánk és mások eredményei alapján fölvázolhatunk egy modellt, amelyben az akvaporinok és a kalcium-érzékelő receptorok egy hasnyálmirigy duktuszokban működő homeosztatikus mechanizmus szereplői (21. ábra). Az acinusok szekréciós granulumainak exocitózisa révén lokálisan jelentősen megnőhet a kalciumszint a duktuszok kezdeti szakaszán. Ez stimulálja a luminálisan elhelyezkedő kalcium-érzékelő receptorokat, amelyek aktiválódva a bikarbonát-ionok szekrécióját fokozó jelétviteli mechanizmusokat indítanak be. A lumenbe kerülő ionokat a víz az ozmotikus grádiens irányában passzívan követi, a duktális epitéliumon át történő gyors vízmozgást a duktuszsejteken bazolaterálisan és apikálisan kifejeződő vízcsatornák teszik lehetővé.
63
H2O rec
H2O
AQP1
AQP8 rec
AQP1, -5
HCO3− H2O
+
CaR
rec
H2O
AQP8
↑ [Ca 2+ ]
↑[Ca 2+ ]
↑ [Ca 2+ ]
CaR AQP1, -5 H O H2O 2
rec
szekretagóg
Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+Ca2+ 2+ Ca2+ Ca2+ Ca 2+ Ca2+ Ca2+ Ca Ca2+ Ca2+ Ca2+
AQP1
H2O
+
HCO3−
21. ábra: A kalcium-érzékelő receptor és az akvaporinok szerepe a duktális ion- és vízszekrécióban.
64
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Varga Gábornak, az MTA doktorának, akitől mind szakmai, mind emberi vonatkozásban sok önzetlen segítséget kaptam. Hálával tartozom Dr. Kittel Ágnesnek a kalcium-érzékelő receptorról szóló cikkben végzett munkájáért. Köszönöm Dr. Burghardt Beátának, hogy társszerző lehettem az akvaporinokról szóló cikkében, valamint hálával tartozom neki a csoportban eltöltött évek során nyújtott folyamatos szakmai és emberi támogatásáért. Köszönöm Dr. Martin C. Steward-nak és Dr. Austin C. Elliott-nak szakmai segítségüket. Hálával gondolok volt és jelenlegi munkatársaimra, Barabás Kornéliára, Dr. Barta Adriennre, Demeter Irmára, Harasztiné Jacsó Mártára, Dr. Kádár Kristófra, Dr. Kisfalvi Krisztinára, Dr. Kisfalvi Istvánra, Dr. Kordás Krisztinára, Dr. László Ferencre, Dr. Molnár Bálintra, Dr. Morschl Évára, Dr. Nagy Ákosra, Dr. Nagy Krisztiánra, Dr. Nemcsik Jánosra, Óvári Gabriellára, Dr. Szalmay Gáborra, Szlávik Vandára, Dr. Szűcs Ákosra. Köszönetet mondok a SE FOK Orálbiológiai Tanszék dolgozóinak. Köszönöm Kovács Krisztinának, az MTA doktorának a tőle kapott szakmai és emberi támogatást,
számtalan
segítséget,
valamint
szeretnék
köszönetet
mondani
munkatársainak is. Hálás vagyok Dr. Katona Istvánnak az értekezés kéziratának áttanulmányozásáért és kritikai észrevételeiért. Hálával tartozom Dr. Szabó Gábornak szakmai támogatásáért, segítségéért. Jó szívvel gondolok vissza munkatársaira is. Köszönöm szüleimnek, Rácz Lászlónak és Palkovits Editnek, hogy fölneveltek, taníttattak és jelenleg is sok támogatást kapok tőlük. Köszönöm öcsémnek, Rácz Norbertnek, hogy elviselt és szeretett engem. Végül a legforróbb köszönet feleségemet, Ráczné Fehér Zsuzsannát és gyermekeinket, Gábort és Balázst illeti mindazért a szeretetért, amit nyújtanak és a megértésért, amit munkám és tanulmányaim iránt tanúsítanak.
65
IRODALOMJEGYZÉK 1.
Adler, G. and H.F. Kern, The human exocrine pancreas in health and disease., in Ultrastructure of the Extraparietal Glands of the Digestive Tract., A. Riva and P.M. Motta, Editors. 1990, Kluwer: Boston. p. 115-46.
2.
Agre, P., A.M. Saboori, A. Asimos, and B.L. Smith, Purification and partial characterization of the Mr 30,000 integral membrane protein associated with the erythrocyte Rh(D) antigen. J Biol Chem, 1987. 262(36): p. 17497-503.
3.
Agre, P., S. Sasaki, and M.J. Chrispeels, Aquaporins: a family of water channel proteins. Am J Physiol, 1993. 265(3 Pt 2): p. F461.
4.
Agre, P., M. Bonhivers, and M.J. Borgnia, The aquaporins, blueprints for cellular plumbing systems. J Biol Chem, 1998. 273(24): p. 14659-62.
5.
Agre, P., L.S. King, M. Yasui, W.B. Guggino, O.P. Ottersen, Y. Fujiyoshi, A. Engel, and S. Nielsen, Aquaporin water channels--from atomic structure to clinical medicine. J Physiol, 2002. 542(Pt 1): p. 3-16.
6.
Argent, B.E., S. Arkle, M.J. Cullen, and R. Green, Morphological, biochemical and secretory studies on rat pancreatic ducts maintained in tissue culture. Q J Exp Physiol, 1986. 71(4): p. 633-48.
7.
Bichet, D.G., Nephrogenic diabetes insipidus. Am J Med, 1998. 105(5): p. 43142.
8.
Bikle, D.D., A. Ratnam, T. Mauro, J. Harris, and S. Pillai, Changes in calcium responsiveness and handling during keratinocyte differentiation. Potential role of the calcium receptor. J Clin Invest, 1996. 97(4): p. 1085-93.
9.
Black, B.L. and J.E. Smith, Regulation of goblet cell differentiation by calcium in embryonic chick intestine. Faseb J, 1989. 3(14): p. 2653-9.
10.
Borgnia, M., S. Nielsen, A. Engel, and P. Agre, Cellular and molecular biology of the aquaporin water channels. Annu Rev Biochem, 1999. 68: p. 425-58.
11.
Boyer, J.L., Bile duct epithelium: frontiers in transport physiology. Am J Physiol, 1996. 270(1 Pt 1): p. G1-5.
12.
Bradbury, R.A., K.L. Sunn, M. Crossley, M. Bai, E.M. Brown, L. Delbridge, and A.D. Conigrave, Expression of the parathyroid Ca(2+)-sensing receptor in
66
cytotrophoblasts from human term placenta. J Endocrinol, 1998. 156(3): p. 42530. 13.
Brand, R.E. and M.A. Tempero, Pancreatic cancer. Curr Opin Oncol, 1998. 10(4): p. 362-6.
14.
Brown, E.M., Extracellular Ca2+ sensing, regulation of parathyroid cell function, and role of Ca2+ and other ions as extracellular (first) messengers. Physiol Rev, 1991. 71(2): p. 371-411.
15.
Brown, E.M., G. Gamba, D. Riccardi, M. Lombardi, R. Butters, O. Kifor, A. Sun, M.A. Hediger, J. Lytton, and S.C. Hebert, Cloning and characterization of an extracellular Ca(2+)-sensing receptor from bovine parathyroid. Nature, 1993. 366(6455): p. 575-80.
16.
Brown, E.M., M. Pollak, and S.C. Hebert, The extracellular calcium-sensing receptor: its role in health and disease. Annu Rev Med, 1998. 49: p. 15-29.
17.
Brown, E.M. and R.J. MacLeod, Extracellular calcium sensing and extracellular calcium signaling. Physiol Rev, 2001. 81(1): p. 239-297.
18.
Bruce, J.I., X. Yang, C.J. Ferguson, A.C. Elliott, M.C. Steward, R.M. Case, and D. Riccardi, Molecular and functional identification of a Ca2+ (polyvalent cation)-sensing receptor in rat pancreas. J Biol Chem, 1999. 274(29): p. 205618.
19.
Buras, R.R., M. Shabahang, F. Davoodi, L.M. Schumaker, K.J. Cullen, S. Byers, R.J. Nauta, and S.R. Evans, The effect of extracellular calcium on colonocytes: evidence
for
differential
responsiveness
based
upon
degree
of
cell
differentiation. Cell Prolif, 1995. 28(4): p. 245-62. 20.
Buscail, L., N. Saint-Laurent, E. Chastre, J.C. Vaillant, C. Gespach, G. Capella, H. Kalthoff, F. Lluis, N. Vaysse, and C. Susini, Loss of sst2 somatostatin receptor gene expression in human pancreatic and colorectal cancer. Cancer Res, 1996. 56(8): p. 1823-7.
21.
Case, R.M. and B.E. Argent, Pancreatic Duct Secretion: Control and Mechanisms of Transport, in The Pancreas: Biology, Pathobiology, and Disease, V.L.W. Go, et al., Editors. 1993, Raven Press: New York, NY, USA. p. 301-50.
67
22.
Chambers, J.A. and A. Harris, Expression of the cystic fibrosis gene and the major pancreatic mucin gene, MUC1, in human ductal epithelial cells. J Cell Sci, 1993. 105 ( Pt 2): p. 417-22.
23.
Chang, W., C. Tu, T.H. Chen, L. Komuves, Y. Oda, S.A. Pratt, S. Miller, and D. Shoback, Expression and signal transduction of calcium-sensing receptors in cartilage and bone. Endocrinology, 1999. 140(12): p. 5883-93.
24.
Chattopadhyay, N., A. Mithal, and E.M. Brown, The calcium-sensing receptor: a window into the physiology and pathophysiology of mineral ion metabolism. Endocr Rev, 1996. 17(4): p. 289-307.
25.
Chattopadhyay, N., C. Ye, D.P. Singh, O. Kifor, P.M. Vassilev, T. Shinohara, L.T. Chylack, Jr., and E.M. Brown, Expression of extracellular calcium-sensing receptor by human lens epithelial cells. Biochem Biophys Res Commun, 1997. 233(3): p. 801-5.
26.
Chattopadhyay, N., I. Cheng, K. Rogers, D. Riccardi, A. Hall, R. Diaz, S.C. Hebert, D.I. Soybel, and E.M. Brown, Identification and localization of extracellular Ca(2+)-sensing receptor in rat intestine. Am J Physiol, 1998. 274(1 Pt 1): p. G122-30.
27.
Chattopadhyay, N., C.P. Ye, T. Yamaguchi, O. Kifor, P.M. Vassilev, R. Nishimura, and E.M. Brown, Extracellular calcium-sensing receptor in rat oligodendrocytes: expression and potential role in regulation of cellular proliferation and an outward K+ channel. Glia, 1998. 24(4): p. 449-58.
28.
Chattopadhyay, N., C. Ye, T. Yamaguchi, M. Nakai, O. Kifor, P.M. Vassilev, R.N. Nishimura, and E.M. Brown, The extracellular calcium-sensing receptor is expressed in rat microglia and modulates an outward K+ channel. J Neurochem, 1999. 72(5): p. 1915-22.
29.
Chattopadhyay, N., C.P. Ye, T. Yamaguchi, P.M. Vassilev, and E.M. Brown, Evidence for extracellular calcium-sensing receptor mediated opening of an outward K+ channel in a human astrocytoma cell line (U87). Glia, 1999. 26(1): p. 64-72.
30.
Chattopadhyay, N., Biochemistry, physiology and pathophysiology of the extracellular calcium-sensing receptor. Int J Biochem Cell Biol, 2000. 32(8): p. 789-804.
68
31.
Cheng, H.S., P.Y. Leung, S.B. Cheng Chew, P.S. Leung, S.Y. Lam, W.S. Wong, Z.D. Wang, and H.C. Chan, Concurrent and independent HCO3- and Clsecretion in a human pancreatic duct cell line (CAPAN-1). J Membr Biol, 1998. 164(2): p. 155-67.
32.
Cheng, H.S., W.S. Wong, K.T. Chan, X.F. Wang, Z.D. Wang, and H.C. Chan, Modulation of Ca2+-dependent anion secretion by protein kinase C in normal and cystic fibrosis pancreatic duct cells. Biochim Biophys Acta, 1999. 1418(1): p. 31-8.
33.
Cheng, I., I. Qureshi, N. Chattopadhyay, A. Qureshi, R.R. Butters, A.E. Hall, R.R. Cima, K.V. Rogers, S.C. Hebert, J.P. Geibel, E.M. Brown, and D.I. Soybel, Expression of an extracellular calcium-sensing receptor in rat stomach. Gastroenterology, 1999. 116(1): p. 118-26.
34.
Chou, Y.H., E.M. Brown, T. Levi, G. Crowe, A.B. Atkinson, H.J. Arnqvist, G. Toss, G.E. Fuleihan, J.G. Seidman, and C.E. Seidman, The gene responsible for familial hypocalciuric hypercalcemia maps to chromosome 3q in four unrelated families. Nat Genet, 1992. 1(4): p. 295-300.
35.
Christensen, B.M., M. Zelenina, A. Aperia, and S. Nielsen, Localization and regulation of PKA-phosphorylated AQP2 in response to V(2)-receptor agonist/antagonist treatment. Am J Physiol Renal Physiol, 2000. 278(1): p. F2942.
36.
Conklin, B.R. and H.R. Bourne, Homeostatic signals. Marriage of the flytrap and the serpent. Nature, 1994. 367(6458): p. 22.
37.
Crawford, I., P.C. Maloney, P.L. Zeitlin, W.B. Guggino, S.C. Hyde, H. Turley, K.C. Gatter, A. Harris, and C.F. Higgins, Immunocytochemical localization of the cystic fibrosis gene product CFTR. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991. 88(20): p. 9262-6.
38.
De Caro, A., L. Multigner, H. Lafont, D. Lombardo, and H. Sarles, The molecular characteristics of a human pancreatic acidic phosphoprotein that inhibits calcium carbonate crystal growth. Biochem J, 1984. 222(3): p. 669-77.
39.
Deen, P.M., M.A. Verdijk, N.V. Knoers, B. Wieringa, L.A. Monnens, C.H. van Os, and B.A. van Oost, Requirement of human renal water channel aquaporin-2
69
for vasopressin-dependent concentration of urine. Science, 1994. 264(5155): p. 92-5. 40.
Denker, B.M., B.L. Smith, F.P. Kuhajda, and P. Agre, Identification, purification, and partial characterization of a novel Mr 28,000 integral membrane protein from erythrocytes and renal tubules. J Biol Chem, 1988. 263(30): p. 15634-42.
41.
Ecelbarger, C.A., J. Terris, G. Frindt, M. Echevarria, D. Marples, S. Nielsen, and M.A. Knepper, Aquaporin-3 water channel localization and regulation in rat kidney. Am J Physiol, 1995. 269(5 Pt 2): p. F663-72.
42.
Egerbacher, M. and P. Bock, Morphology of the pancreatic duct system in mammals. Microsc Res Tech, 1997. 37(5-6): p. 407-17.
43.
Fotiadis, D., L. Hasler, D.J. Muller, H. Stahlberg, J. Kistler, and A. Engel, Surface tongue-and-groove contours on lens MIP facilitate cell-to-cell adherence. J Mol Biol, 2000. 300(4): p. 779-89.
44.
Friedman, P.A., Calcium transport in the kidney. Curr Opin Nephrol Hypertens, 1999. 8(5): p. 589-95.
45.
Frigeri, A., M.A. Gropper, F. Umenishi, M. Kawashima, D. Brown, and A.S. Verkman, Localization of MIWC and GLIP water channel homologs in neuromuscular, epithelial and glandular tissues. J Cell Sci, 1995. 108 ( Pt 9): p. 2993-3002.
46.
Furuya, S., S. Naruse, S.B. Ko, H. Ishiguro, T. Yoshikawa, and T. Hayakawa, Distribution of aquaporin 1 in the rat pancreatic duct system examined with light- and electron-microscopic immunohistochemistry. Cell Tissue Res, 2002. 308(1): p. 75-86.
47.
Fushimi, K., S. Uchida, Y. Hara, Y. Hirata, F. Marumo, and S. Sasaki, Cloning and expression of apical membrane water channel of rat kidney collecting tubule. Nature, 1993. 361(6412): p. 549-52.
48.
Ganong, W.F., A gyomor-bél rendszer mûködése, in Az orvosi élettan alapjai. 1990, Medicina: Budapest. p. 483-94.
49.
Garrett, J.E., I.V. Capuano, L.G. Hammerland, B.C. Hung, E.M. Brown, S.C. Hebert, E.F. Nemeth, and F. Fuller, Molecular cloning and functional
70
expression of human parathyroid calcium receptor cDNAs. J Biol Chem, 1995. 270(21): p. 12919-25. 50.
Garrett, J.E., H. Tamir, O. Kifor, R.T. Simin, K.V. Rogers, A. Mithal, R.F. Gagel, and E.M. Brown, Calcitonin-secreting cells of the thyroid express an extracellular calcium receptor gene. Endocrinology, 1995. 136(11): p. 5202-11.
51.
Goebel, S.U., P.L. Peghini, P.K. Goldsmith, A.M. Spiegel, F. Gibril, M. Raffeld, R.T. Jensen, and J. Serrano, Expression of the calcium-sensing receptor in gastrinomas. J Clin Endocrinol Metab, 2000. 85(11): p. 4131-7.
52.
Gorin, M.B., S.B. Yancey, J. Cline, J.P. Revel, and J. Horwitz, The major intrinsic protein (MIP) of the bovine lens fiber membrane: characterization and structure based on cDNA cloning. Cell, 1984. 39(1): p. 49-59.
53.
Gray, M.A., J.R. Greenwell, and B.E. Argent, Secretin-regulated chloride channel on the apical plasma membrane of pancreatic duct cells. J Membr Biol, 1988. 105(2): p. 131-42.
54.
Gresz, V., T.H. Kwon, P.T. Hurley, G. Varga, T. Zelles, S. Nielsen, R.M. Case, and M.C. Steward, Identification and localization of aquaporin water channels in human salivary glands. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2001. 281(1): p. G247-54.
55.
Hamann, S., T. Zeuthen, M. La Cour, E.A. Nagelhus, O.P. Ottersen, P. Agre, and S. Nielsen, Aquaporins in complex tissues: distribution of aquaporins 1-5 in human and rat eye. Am J Physiol, 1998. 274(5 Pt 1): p. C1332-45.
56.
Hasegawa, H., S.C. Lian, W.E. Finkbeiner, and A.S. Verkman, Extrarenal tissue distribution of CHIP28 water channels by in situ hybridization and antibody staining. Am J Physiol, 1994. 266(4 Pt 1): p. C893-903.
57.
Hasegawa, H., T. Ma, W. Skach, M.A. Matthay, and A.S. Verkman, Molecular cloning of a mercurial-insensitive water channel expressed in selected watertransporting tissues. J Biol Chem, 1994. 269(8): p. 5497-500.
58.
Hede, S.E., J. Amstrup, B.C. Christoffersen, and I. Novak, Purinoceptors evoke different electrophysiological responses in pancreatic ducts. P2Y inhibits K(+) conductance, and P2X stimulates cation conductance. J Biol Chem, 1999. 274(45): p. 31784-91.
71
59.
Hollander, F. and D. Birnbaum, The role of carbonic anhydrase in pancreatic secretion. Trans N Y Acad Sci, 1952. 15(2): p. 56-8.
60.
House, M.G., L. Kohlmeier, N. Chattopadhyay, O. Kifor, T. Yamaguchi, M.S. Leboff, J. Glowacki, and E.M. Brown, Expression of an extracellular calciumsensing receptor in human and mouse bone marrow cells. J Bone Miner Res, 1997. 12(12): p. 1959-70.
61.
Huang, S., V.M. Maher, and J.J. McCormick, Extracellular Ca2+ stimulates the activation of mitogen-activated protein kinase and cell growth in human fibroblasts. Biochem J, 1995. 310 ( Pt 3): p. 881-5.
62.
Hulla, W., E. Kallay, W. Krugluger, M. Peterlik, and H.S. Cross, Growth control of human colon-adenocarcinoma-derived Caco-2 cells by vitamin-D compounds and extracellular calcium in vitro: relation to c-myc-oncogene and vitamin-D-receptor expression. Int J Cancer, 1995. 62(6): p. 711-6.
63.
Hurley, P.T., C.J. Ferguson, T.H. Kwon, M.L. Andersen, A.G. Norman, M.C. Steward, S. Nielsen, and R.M. Case, Expression and immunolocalization of aquaporin water channels in rat exocrine pancreas. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2001. 280(4): p. G701-9.
64.
Ishibashi, K., M. Kuwahara, Y. Gu, Y. Kageyama, A. Tohsaka, F. Suzuki, F. Marumo, and S. Sasaki, Cloning and functional expression of a new water channel abundantly expressed in the testis permeable to water, glycerol, and urea. J Biol Chem, 1997. 272(33): p. 20782-6.
65.
Ishibashi, K., M. Kuwahara, Y. Kageyama, A. Tohsaka, F. Marumo, and S. Sasaki, Cloning and functional expression of a second new aquaporin abundantly expressed in testis. Biochem Biophys Res Commun, 1997. 237(3): p. 714-8.
66.
Ishibashi, K., M. Kuwahara, Y. Gu, Y. Tanaka, F. Marumo, and S. Sasaki, Cloning and functional expression of a new aquaporin (AQP9) abundantly expressed in the peripheral leukocytes permeable to water and urea, but not to glycerol. Biochem Biophys Res Commun, 1998. 244(1): p. 268-74.
67.
Ishiguro, H., M.C. Steward, A.R. Lindsay, and R.M. Case, Accumulation of intracellular HCO3- by Na(+)-HCO3- cotransport in interlobular ducts from guinea-pig pancreas. J Physiol, 1996. 495 ( Pt 1): p. 169-78.
72
68.
Ishiguro, H., S. Naruse, M.C. Steward, M. Kitagawa, S.B. Ko, T. Hayakawa, and R.M. Case, Fluid secretion in interlobular ducts isolated from guinea-pig pancreas. J Physiol, 1998. 511 ( Pt 2): p. 407-22.
69.
Ishiguro, H., S. Naruse, M. Kitagawa, T. Hayakawa, R.M. Case, and M.C. Steward, Luminal ATP stimulates fluid and HCO3- secretion in guinea-pig pancreatic duct. J Physiol, 1999. 519 Pt 2: p. 551-8.
70.
Ishiguro, H., S. Naruse, M. Kitagawa, A. Suzuki, A. Yamamoto, T. Hayakawa, R.M. Case, and M.C. Steward, CO2 permeability and bicarbonate transport in microperfused interlobular ducts isolated from guinea-pig pancreas. J Physiol, 2000. 528 Pt 2: p. 305-15.
71.
Ishiguro, H., S. Naruse, J.I. San Roman, M. Case, and M.C. Steward, Pancreatic ductal bicarbonate secretion: past, present and future. Jop, 2001. 2(4 Suppl): p. 192-7.
72.
Jung, J.S., R.V. Bhat, G.M. Preston, W.B. Guggino, J.M. Baraban, and P. Agre, Molecular characterization of an aquaporin cDNA from brain: candidate osmoreceptor and regulator of water balance. Proc Natl Acad Sci U S A, 1994. 91(26): p. 13052-6.
73.
Jung, J.S., G.M. Preston, B.L. Smith, W.B. Guggino, and P. Agre, Molecular structure of the water channel through aquaporin CHIP. The hourglass model. J Biol Chem, 1994. 269(20): p. 14648-54.
74.
Kaupmann, K., K. Huggel, J. Heid, P.J. Flor, S. Bischoff, S.J. Mickel, G. McMaster, C. Angst, H. Bittiger, W. Froestl, and B. Bettler, Expression cloning of GABA(B) receptors uncovers similarity to metabotropic glutamate receptors. Nature, 1997. 386(6622): p. 239-46.
75.
Kifor, O., R. Diaz, R. Butters, and E.M. Brown, The Ca2+-sensing receptor (CaR) activates phospholipases C, A2, and D in bovine parathyroid and CaRtransfected, human embryonic kidney (HEK293) cells. J Bone Miner Res, 1997. 12(5): p. 715-25.
76.
Kishida, K., H. Kuriyama, T. Funahashi, I. Shimomura, S. Kihara, N. Ouchi, M. Nishida, H. Nishizawa, M. Matsuda, M. Takahashi, K. Hotta, T. Nakamura, S. Yamashita, Y. Tochino, and Y. Matsuzawa, Aquaporin adipose, a putative glycerol channel in adipocytes. J Biol Chem, 2000. 275(27): p. 20896-902.
73
77.
Ko, S.B., S. Naruse, M. Kitagawa, H. Ishiguro, S. Furuya, N. Mizuno, Y. Wang, T. Yoshikawa, A. Suzuki, S. Shimano, and T. Hayakawa, Aquaporins in rat pancreatic interlobular ducts. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2002. 282(2): p. G324-31.
78.
Kolakowski, L.F., Jr., GCRDb: a G-protein-coupled receptor database. Receptors Channels, 1994. 2(1): p. 1-7.
79.
Kopelman, H., E. Ferretti, C. Gauthier, and P.R. Goodyer, Rabbit pancreatic acini express CFTR as a cAMP-activated chloride efflux pathway. Am J Physiol, 1995. 269(3 Pt 1): p. C626-31.
80.
Kovacs, C.S., C.L. Ho-Pao, J.L. Hunzelman, B. Lanske, J. Fox, J.G. Seidman, C.E. Seidman, and H.M. Kronenberg, Regulation of murine fetal-placental calcium metabolism by the calcium-sensing receptor. J Clin Invest, 1998. 101(12): p. 2812-20.
81.
Koyama, Y., T. Yamamoto, D. Kondo, H. Funaki, E. Yaoita, K. Kawasaki, N. Sato, K. Hatakeyama, and I. Kihara, Molecular cloning of a new aquaporin from rat pancreas and liver. J Biol Chem, 1997. 272(48): p. 30329-33.
82.
Marinelli, R.A., L. Pham, P. Agre, and N.F. LaRusso, Secretin promotes osmotic water transport in rat cholangiocytes by increasing aquaporin-1 water channels in plasma membrane. Evidence for a secretin-induced vesicular translocation of aquaporin-1. J Biol Chem, 1997. 272(20): p. 12984-8.
83.
Marinelli, R.A., P.S. Tietz, L.D. Pham, L. Rueckert, P. Agre, and N.F. LaRusso, Secretin induces the apical insertion of aquaporin-1 water channels in rat cholangiocytes. Am J Physiol, 1999. 276(1 Pt 1): p. G280-6.
84.
Marino, C.R., L.M. Matovcik, F.S. Gorelick, and J.A. Cohn, Localization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in pancreas. J Clin Invest, 1991. 88(2): p. 712-6.
85.
Matsunami, H. and L.B. Buck, A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals. Cell, 1997. 90(4): p. 775-84.
86.
McNeil, L., S. Hobson, V. Nipper, and K.D. Rodland, Functional calciumsensing receptor expression in ovarian surface epithelial cells. Am J Obstet Gynecol, 1998. 178(2): p. 305-13.
74
87.
McNeil, S.E., S.A. Hobson, V. Nipper, and K.D. Rodland, Functional calciumsensing receptors in rat fibroblasts are required for activation of SRC kinase and mitogen-activated protein kinase in response to extracellular calcium. J Biol Chem, 1998. 273(2): p. 1114-20.
88.
Mithal, A., O. Kifor, I. Kifor, P. Vassilev, R. Butters, K. Krapcho, R. Simin, F. Fuller, S.C. Hebert, and E.M. Brown, The reduced responsiveness of cultured bovine parathyroid cells to extracellular Ca2+ is associated with marked reduction in the expression of extracellular Ca(2+)-sensing receptor messenger ribonucleic acid and protein. Endocrinology, 1995. 136(7): p. 3087-92.
89.
Motta, P.M., G. Macchiarelli, S.A. Nottola, and S. Correr, Histology of the exocrine pancreas. Microsc Res Tech, 1997. 37(5-6): p. 384-98.
90.
Mulders, S.M., G.M. Preston, P.M. Deen, W.B. Guggino, C.H. van Os, and P. Agre, Water channel properties of major intrinsic protein of lens. J Biol Chem, 1995. 270(15): p. 9010-16.
91.
Mupanomunda, M.M., B. Tian, N. Ishioka, and R.D. Bukoski, Renal interstitial Ca(2+). Am J Physiol Renal Physiol, 2000. 278(4): p. F644-9.
92.
Nagelhus, E.A., M.L. Veruki, R. Torp, F.M. Haug, J.H. Laake, S. Nielsen, P. Agre, and O.P. Ottersen, Aquaporin-4 water channel protein in the rat retina and optic nerve: polarized expression in Muller cells and fibrous astrocytes. J Neurosci, 1998. 18(7): p. 2506-19.
93.
Nejsum, L.N., T.H. Kwon, U.B. Jensen, O. Fumagalli, J. Frokiaer, C.M. Krane, A.G. Menon, L.S. King, P.C. Agre, and S. Nielsen, Functional requirement of aquaporin-5 in plasma membranes of sweat glands. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(1): p. 511-6.
94.
Nielsen, S., S.R. DiGiovanni, E.I. Christensen, M.A. Knepper, and H.W. Harris, Cellular and subcellular immunolocalization of vasopressin-regulated water channel in rat kidney. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(24): p. 11663-7.
95.
Nielsen, S., B.L. Smith, E.I. Christensen, and P. Agre, Distribution of the aquaporin CHIP in secretory and resorptive epithelia and capillary endothelia. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(15): p. 7275-9.
96.
Nielsen, S., C.L. Chou, D. Marples, E.I. Christensen, B.K. Kishore, and M.A. Knepper, Vasopressin increases water permeability of kidney collecting duct by
75
inducing translocation of aquaporin-CD water channels to plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995. 92(4): p. 1013-7. 97.
Nielsen, S., L.S. King, B.M. Christensen, and P. Agre, Aquaporins in complex tissues. II. Subcellular distribution in respiratory and glandular tissues of rat. Am J Physiol, 1997. 273(5 Pt 1): p. C1549-61.
98.
Nielsen, S., E.A. Nagelhus, M. Amiry-Moghaddam, C. Bourque, P. Agre, and O.P. Ottersen, Specialized membrane domains for water transport in glial cells: high-resolution immunogold cytochemistry of aquaporin-4 in rat brain. J Neurosci, 1997. 17(1): p. 171-80.
99.
Nielsen, S., J. Frokiaer, D. Marples, T.H. Kwon, P. Agre, and M.A. Knepper, Aquaporins in the kidney: from molecules to medicine. Physiol Rev, 2002. 82(1): p. 205-44.
100.
Novak, I. and R. Greger, Properties of the luminal membrane of isolated perfused rat pancreatic ducts. Effect of cyclic AMP and blockers of chloride transport. Pflugers Arch, 1988. 411(5): p. 546-53.
101.
Novak, I., Keeping up with bicarbonate. J Physiol, 2000. 528 Pt 2: p. 235.
102.
Novak, I., ATP as a signaling molecule: the exocrine focus. News Physiol Sci, 2003. 18: p. 12-7.
103.
Ochieng, J., Q.S. Tahin, C.C. Booth, and J. Russo, Buffering of intracellular calcium in response to increased extracellular levels in mortal, immortal, and transformed human breast epithelial cells. J Cell Biochem, 1991. 46(3): p. 2504.
104.
Oda, Y., C.L. Tu, S. Pillai, and D.D. Bikle, The calcium sensing receptor and its alternatively spliced form in keratinocyte differentiation. J Biol Chem, 1998. 273(36): p. 23344-52.
105.
Orci, L., A. Perrelet, and R. Montesano, Differential filipin labeling of the luminal membranes lining the pancreatic acinus. J Histochem Cytochem, 1983. 31(7): p. 952-5.
106.
Paciucci, R., G. Berrozpe, M. Tora, E. Navarro, A. Garcia de Herreros, and F.X. Real, Isolation of tissue-type plasminogen activator, cathepsin H, and nonspecific cross-reacting antigen from SK-PC-1 pancreas cancer cells using subtractive hybridization. FEBS Lett, 1996. 385(1-2): p. 72-6.
76
107.
Padfield, P.J., A. Garner, and R.M. Case, Patterns of pancreatic secretion in the anaesthetised guinea pig following stimulation with secretin, cholecystokinin octapeptide, or bombesin. Pancreas, 1989. 4(2): p. 204-9.
108.
Parvin, M.N., K. Tsumura, T. Akamatsu, N. Kanamori, and K. Hosoi, Expression and localization of AQP5 in the stomach and duodenum of the rat. Biochim Biophys Acta, 2002. 1542(1-3): p. 116-24.
109.
Pearce, S.H., D. Trump, C. Wooding, G.M. Besser, S.L. Chew, D.B. Grant, D.A. Heath, I.A. Hughes, C.R. Paterson, M.P. Whyte, and et al., Calcium-sensing receptor
mutations
in
familial
benign
hypercalcemia
and
neonatal
hyperparathyroidism. J Clin Invest, 1995. 96(6): p. 2683-92. 110.
Pietrobon, D., F. Di Virgilio, and T. Pozzan, Structural and functional aspects of calcium homeostasis in eukaryotic cells. Eur J Biochem, 1990. 193(3): p. 599622.
111.
Pollak, M.R., E.M. Brown, Y.H. Chou, S.C. Hebert, S.J. Marx, B. Steinmann, T. Levi, C.E. Seidman, and J.G. Seidman, Mutations in the human Ca(2+)-sensing receptor gene cause familial hypocalciuric hypercalcemia and neonatal severe hyperparathyroidism. Cell, 1993. 75(7): p. 1297-303.
112.
Pollak, M.R., E.M. Brown, H.L. Estep, P.N. McLaine, O. Kifor, J. Park, S.C. Hebert, C.E. Seidman, and J.G. Seidman, Autosomal dominant hypocalcaemia caused by a Ca(2+)-sensing receptor gene mutation. Nat Genet, 1994. 8(3): p. 303-7.
113.
Preston, G.M. and P. Agre, Isolation of the cDNA for erythrocyte integral membrane protein of 28 kilodaltons: member of an ancient channel family. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991. 88(24): p. 11110-4.
114.
Preston, G.M., J.S. Jung, W.B. Guggino, and P. Agre, The mercury-sensitive residue at cysteine 189 in the CHIP28 water channel. J Biol Chem, 1993. 268(1): p. 17-20.
115.
Preston, G.M., B.L. Smith, M.L. Zeidel, J.J. Moulds, and P. Agre, Mutations in aquaporin-1 in phenotypically normal humans without functional CHIP water channels. Science, 1994. 265(5178): p. 1585-7.
116.
Quamme, G.A., Control of magnesium transport in the thick ascending limb. Am J Physiol, 1989. 256(2 Pt 2): p. F197-210.
77
117.
Quarles, L.D., Cation sensing receptors in bone: a novel paradigm for regulating bone remodeling? J Bone Miner Res, 1997. 12(12): p. 1971-4.
118.
Raina, S., G.M. Preston, W.B. Guggino, and P. Agre, Molecular cloning and characterization of an aquaporin cDNA from salivary, lacrimal, and respiratory tissues. J Biol Chem, 1995. 270(4): p. 1908-12.
119.
Ray, J.M., P.E. Squires, S.B. Curtis, M.R. Meloche, and A.M. Buchan, Expression of the calcium-sensing receptor on human antral gastrin cells in culture. J Clin Invest, 1997. 99(10): p. 2328-33.
120.
Riccardi, D., J. Park, W.S. Lee, G. Gamba, E.M. Brown, and S.C. Hebert, Cloning
and
functional
expression
of
a
rat
kidney
extracellular
calcium/polyvalent cation-sensing receptor. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995. 92(1): p. 131-5. 121.
Riccardi, D., A.E. Hall, N. Chattopadhyay, J.Z. Xu, E.M. Brown, and S.C. Hebert, Localization of the extracellular Ca2+/polyvalent cation-sensing protein in rat kidney. Am J Physiol, 1998. 274(3 Pt 2): p. F611-22.
122.
Riccardi, D., Calcium ions as extracellular, first messengers. Z Kardiol, 2000. 89 Suppl 2: p. 9-14.
123.
Roberts, S.K., M. Yano, Y. Ueno, L. Pham, G. Alpini, P. Agre, and N.F. LaRusso, Cholangiocytes express the aquaporin CHIP and transport water via a channel-mediated mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A, 1994. 91(26): p. 13009-13.
124.
Ryder, N.M., S. Guha, O.J. Hines, H.A. Reber, and E. Rozengurt, G proteincoupled receptor signaling in human ductal pancreatic cancer cells: neurotensin responsiveness and mitogenic stimulation. J Cell Physiol, 2001. 186(1): p. 5364.
125.
Schek, N., B.L. Hall, and O.J. Finn, Increased glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene expression in human pancreatic adenocarcinoma. Cancer Res, 1988. 48(22): p. 6354-9.
126.
Sewell, W.A. and J.A. Young, Secretion of electrolytes by the pancreas of the anaestetized rat. J Physiol, 1975. 252(2): p. 379-96.
78
127.
Shumaker, H., H. Amlal, R. Frizzell, C.D. Ulrich, 2nd, and M. Soleimani, CFTR drives Na+-nHCO-3 cotransport in pancreatic duct cells: a basis for defective HCO-3 secretion in CF. Am J Physiol, 1999. 276(1 Pt 1): p. C16-25.
128.
Smith, B.L. and P. Agre, Erythrocyte Mr 28,000 transmembrane protein exists as a multisubunit oligomer similar to channel proteins. J Biol Chem, 1991. 266(10): p. 6407-15.
129.
Smith, P.A., J.P. Sunter, and R.M. Case, Progressive atrophy of pancreatic acinar tissue in rats fed a copper-deficient diet supplemented with Dpenicillamine or triethylene tetramine: morphological and physiological studies. Digestion, 1982. 23(1): p. 16-30.
130.
Spring, K.R., Routes and mechanism of fluid transport by epithelia. Annu Rev Physiol, 1998. 60: p. 105-19.
131.
Strong, T.V., K. Boehm, and F.S. Collins, Localization of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator mRNA in the human gastrointestinal tract by in situ hybridization. J Clin Invest, 1994. 93(1): p. 347-54.
132.
Szalmay, G., G. Varga, F. Kajiyama, X.S. Yang, T.F. Lang, R.M. Case, and M.C. Steward, Bicarbonate and fluid secretion evoked by cholecystokinin, bombesin and acetylcholine in isolated guinea-pig pancreatic ducts. J Physiol, 2001. 535(Pt 3): p. 795-807.
133.
Szentágothai, J. and M. Réthelyi, Funkcionális Anatómia. 2002, Budapest: Medicina.
134.
Terris, J., C.A. Ecelbarger, S. Nielsen, and M.A. Knepper, Long-term regulation of four renal aquaporins in rats. Am J Physiol, 1996. 271(2 Pt 2): p. F414-22.
135.
Tsubota, K., S. Hirai, L.S. King, P. Agre, and N. Ishida, Defective cellular trafficking of lacrimal gland aquaporin-5 in Sjogren's syndrome. Lancet, 2001. 357(9257): p. 688-9.
136.
Tsukaguchi, H., C. Shayakul, U.V. Berger, B. Mackenzie, S. Devidas, W.B. Guggino, A.N. van Hoek, and M.A. Hediger, Molecular characterization of a broad selectivity neutral solute channel. J Biol Chem, 1998. 273(38): p. 2473743.
137.
Wallrapp, C., F. Muller-Pillasch, S. Solinas-Toldo, P. Lichter, H. Friess, M. Buchler, T. Fink, G. Adler, and T.M. Gress, Characterization of a high copy
79
number amplification at 6q24 in pancreatic cancer identifies c-myb as a candidate oncogene. Cancer Res, 1997. 57(15): p. 3135-9. 138.
Wistow, G.J., M.M. Pisano, and A.B. Chepelinsky, Tandem sequence repeats in transmembrane channel proteins. Trends Biochem Sci, 1991. 16(5): p. 170-1.
139.
Wright, E.M., M.A. Hediger, M.J. Coady, B. Hirayama, and E. Turk, Molecular biology of Na+/glucose cotransport. Biochem Soc Trans, 1989. 17(5): p. 810-1.
140.
Yamaguchi, T., N. Chattopadhyay, O. Kifor, R.R. Butters, Jr., T. Sugimoto, and E.M. Brown, Mouse osteoblastic cell line (MC3T3-E1) expresses extracellular calcium (Ca2+o)-sensing receptor and its agonists stimulate chemotaxis and proliferation of MC3T3-E1 cells. J Bone Miner Res, 1998. 13(10): p. 1530-8.
141.
Yasui, M., A. Hazama, T.H. Kwon, S. Nielsen, W.B. Guggino, and P. Agre, Rapid gating and anion permeability of an intracellular aquaporin. Nature, 1999. 402(6758): p. 184-7.
142.
Yasui, M., T.H. Kwon, M.A. Knepper, S. Nielsen, and P. Agre, Aquaporin-6: An intracellular vesicle water channel protein in renal epithelia. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999. 96(10): p. 5808-13.
143.
Ye, C., K. Rogers, M. Bai, S.J. Quinn, E.M. Brown, and P.M. Vassilev, Agonists of the Ca(2+)-sensing receptor (CaR) activate nonselective cation channels in HEK293 cells stably transfected with the human CaR. Biochem Biophys Res Commun, 1996. 226(2): p. 572-9.
144.
Yuspa, S.H., A.E. Kilkenny, P.M. Steinert, and D.R. Roop, Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro. J Cell Biol, 1989. 109(3): p. 120717.
145.
Zampighi, G.A., J.E. Hall, G.R. Ehring, and S.A. Simon, The structural organization and protein composition of lens fiber junctions. J Cell Biol, 1989. 108(6): p. 2255-75.
146.
Zelander, T., R. Ekholm, and Y. Edlund, The ultrastructural organization of the rat exocrine pancreas. III. Intralobular vessels and nerves. J Ultrastruct Res, 1962. 7: p. 84-101.
147.
Zeng, W., M.G. Lee, M. Yan, J. Diaz, I. Benjamin, C.R. Marino, R. Kopito, S. Freedman, C. Cotton, S. Muallem, and P. Thomas, Immuno and functional
80
characterization of CFTR in submandibular and pancreatic acinar and duct cells. Am J Physiol, 1997. 273(2 Pt 1): p. C442-55. 148.
Zsembery, A., M. Strazzabosco, and J. Graf, Ca2+-activated Cl- channels can substitute for CFTR in stimulation of pancreatic duct bicarbonate secretion. Faseb J, 2000. 14(14): p. 2345-56.
81
Bibliográfia A doktori értekezés alapját képező közlemények: 1: Burghardt B, Elkaer ML, Kwon TH, Rácz GZ, Varga G, Steward MC, Nielsen S. Distribution of aquaporin water channels AQP1 and AQP5 in the ductal system of the human pancreas. Gut. 2003 Jul;52(7):1008-16. IF.: 6.17 2: Rácz GZ, Kittel A, Riccardi D, Case RM, Elliott AC, Varga G. Extracellular calcium sensing receptor in human pancreatic cells. Gut. 2002 Nov;51(5):705-11. IF.: 6.17 A doktori értekezéshez szorosan nem kapcsolódó egyéb közlemények: 1: Paldi-Haris P, Rácz G, Nemeth K, Foldi J. Single-tube multiplex PCR and capillary electrophoresis for the detection of bcl2-IgH chimeras. Haematologia (Budap). 2002;31(4):313-7. 2: Kisfalvi K, Rácz G, Zsirka-Klein A, Pelosini I, Scarpignato C, Varga G. Different affinity states of CCK(1) receptors on pancreatic acini and gastric smooth muscle in the rat. J Physiol Paris. 2001 Jan-Dec;95(1-6):391-8. IF.: 1.34 3: Kisfalvi I Jr, Rácz G, Balint A, Mate M, Olah A, Zelles T, Vizi ES, Varga G. Effects of putative galanin antagonists M35 and C7 on rat exocrine pancreas. J Physiol Paris. 2001 Jan-Dec;95(1-6):385-9. IF.: 1.34 4: Burghardt B, Wenger C, Barabas K, Rácz G, Olah A, Flautner L, Coy DH, Gress TM, Varga G. GRP-receptor-mediated signal transduction, gene expression and DNA synthesis in the human pancreatic adenocarcinoma cell line HPAF. Peptides. 2001 Jul;22(7):1119-28. IF.: 2.137
82
